Flanta (BEE.) 73, 50--61 (1967)

VIRUSPARTIKEL IM SIEBROHRENSAFT VON C U C U M I S S A T I V U S L. N A C H I N F E K T I O N D U R C H D A S C U C U M I S V I R U S 2 A l~Al~FRED KLUG]~ $

Botanisches Institut der Technischen I-Iochschule Darmstadt Eingegangen am 19. September 1966 VIRUS PARTICLES IN PHLOEM EXUDATE FROM CUCUMIS SATIVUS L. AFTER INFECTION BY CUCUMIS VIRUS 2 A Summary. Sieve tube sap obtained from cucumber plants infected by Cucumis Virus 2A induced the typical mosaic disease when it was inoculated into healthy plants of the same species. The infectious factor could not be removed by dialysis or by treatment with phosphodiesterase. Therefore it is improbable that the virus is transported in the sieve tubes as low moleclar units or as an unprotected RNA. Rod shaped particles (345 • 23 m~) were found in the infectious sieve tube sap when it was investigated by electron microscopy. The same particles could be found in the sap extracted from infected leaves, but never in sieve tube sap obtained from healthy plants. There is reason to suppose that the Cucumis Virus 2A is transported in the sieve tubes as complete particles. Obwohl der T r a n s p o r t von Viren in d e r infizierten W i r t s p f l a n z e bereits G e g e n s t a n d zahlreicher U n t e r s u c h u n g e n w a r (Zusammenfassungen u. a. BW~NWTT, 1956; ESAU, 1956, ]961; C~AFTS, 1961), ist es bis h e u t e noch n i c h t mSglich, eine widerspruchsfreie E r k l s der diesem Vorgang z u g r u n d e liegenden M e c h a n i s m e n zu gcben. Diese F e s t s t e ] l u n g grit ffir die A u s b r e i t u n g des Virus fiber kleine D i s t a n z e n - - etwa y o n Zelle zu Zelle - - gleichermal~en wie ffir den F e r n t r a n s p o r t des infekti5sen Agens. Beide Vorg/~nge zeichnen sich d u r c h verschiedene Geschwindigk e i t e n aus. B e n S t i g t das Virus zur U b e r b r i i c k u n g auch n u r k]einer Strekk e n z. B. i m B l a t t p a r e n c h y m r e l a t i v lange Zeit, so wird es aul~erordentlich schnell in v o m I n f e k t i o n s o r t weir e n t f e r n t liegende Organe d e r Pflanze v e r f f a c h t e t , wenn es in die L e i t b a h n e n g e l a n g t ; u n d es k a n n h e u t e m i t ziem]icher Sicherheit gesagt werden (siehe die oben z~tierte L i t e r a t u r ) , daG d e r F e r n t r a n s p o r t des infektiSsen Agens an die SiebrShren des Phloems g e b u n d e n ist (siehe jedoch HOUSTOn, ESAU u. LEWITT, 1947; SCHNEIDER U. WO~Lu 1959). Diesen r e c h t g u t f u n d i e r t e n Vorstellungen fiber die Orte des F e r n t r a n s p o r t e s s t e h t die vSllig ungekl~rte F r a g e gegenfiber, in welcher F o r m Viren - - sei es y o n Zelle zu Zelle oder in den SiebrShren fiber weite D i s t a n z e n - - t r a n s p o r t i e r t werden kSnnen. Besonders e i n l e u c h t e n d ist die A n n a h m e , dal3 die V i r u s p a r t i k e l zur E r l e i c h t e r u n g der T r a n s l o k a t i o n * Einige Ergelonisse dieser Arbeit sind Tell einer Dissertation der Technischen Hoehschule Darmstadt~(D 17, 1964).

Viruspartikel im Siebr6hrensaft

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in ,,handliche" Transporteinheiten zerlegt werden (ZEcs, 1952). Eine solche Itypothese w/irde durch die Tatsache, dab sich die Proteinhfille des Virus und die Nucleinsgure (als die eigentlich infekti6se Struktur) experimentell trennen lassen, gestfitzt. Das Virus k6nnte also vielleicht in Form einer infektiSsen Nucleins~ure verfrachtet werden. Ob ]edoch ein derartiges Transportprinzip bei der Ausbreitung der Viren in der Pflanze tats~chlich verwirklicht ist, kann ohne weitere Belege nieht entschieden werden. Am leichtesten scheint der Virustransport in den SiebrShren dem Experiment zuggnglich, n~mlich durch die Analyse des Siebr6hreninhaltes selbst. I n dem hier diskutierten Zusammenhang finden sieh bisher sehr wenige Untersuehungen dieser Art. So wits B]~N~ETT (1934) ira Ph]oemexsudat vir6ser (,,curly-top"-Virus) Zuckerrfiben hohe Infektivit~t nach, die ausgepr/~gter war als die des Wurzel- und BlattpreBsaftes. VA~ SoEsT und MESSTsR-MA~c~ CATS (1956) untersuchten den SiebrShrensaft, der aus den in den Siebzellen verbliebcnen abgeschnittenen Saugr/isseln yon Blattl/~usen austrat, wenn die Insckten aus TMV-infizierten Tabakpflanzen Nahrung aufgenommen batten. Mit diesen Exsudaten konntcn jedoch weder Neuinfektionen induziert werden, noch gelang ein serologischer oder clektronenmikroskopischer Virusnachweis. Allerdings rechnen die Autoren selbst mit der M6glichkeit, dab bei der Saftgewinnung mit Blattlausr~sseln die Viruspartikel - - oder deren Transporteinheiten - - v o n d e r den Rfissel im Pflanzengewebe umgebenden Speichelscheide zurfickgehalten und so schliel]lich nur ,,gefilterter", virusfreier SiebrShrensaft erhalten wird. Es schien uns lohnend, hier anzukniipfen, und so gait es vor allem ein Objekt zu finden, das ,,ungefilterten" Siebr6hrensaft in ffir chemische und elektronenmikroskopisehe Untersuehungen ausreichenden Mengen liefert, d~s auBerdem aber auch mit einem systemisehen Virus infizierbar sein mul~. Dieses Virus sollte zudem im Elektronenmikroskop gut nachweisbar sein. Dera,rtige Forderungen werden yon Cucumis sativus L. in Verbindung mit dem Cucumisvirus 2A (Gurkenmosaikvh~us) wei~gehcnd erffillt. An diesem Objekt fiihrten wir deshalb unsere Untersuchungen fiber die Form des in den SiebrShren verfrachteten virSsen Prinzips durch. Die LSsung dieses Problems ist nicht nur fiir das Verst~ndnis des Virus-Wirt-Verhs yon ]~edeutung, sondern l~l~t zudem wichtige Hinweise ffir das Verst~ndnis der Mechanik des Stofftransportes in den Siebr6hren fibcrhaupt erhoffen. Herrn Prof. Dr. I-I. Zr]~GL]SRdanke ieh fiir viele sehr wer~volle Anregungen und fiir die groBzfigige F6rderung dieser Arbeit. Frau D. B]SNK]Sl~Tund Frgulein G. KRAPF sei ffir technische J:Iilfe, tIerrn Oartenmeister H. H-4FNERfiir die Betreuung der Versuchspflanzen gedankt. Die Untersuchungen wurden yon der Deutschen Fors ehungsgemeinschaft unterstiitzt. 4*

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M. KLUGE :

I. Material and allgemeine Methoden a) Die Gewinnung des SiebrSh,rensa]tes. SiebrShrensaf/0 wurde yon virusinfizierten Pflanzen der ,Deutschen Schlangengurke" gewonnen, die deutlich die Symptome der systemisehen Virose (s. unten) aufwiesen. Die Methode folgt im wesentlichen den Angaben EscHalC~S (1963). Der SproB wurde mit einer t~asierklinge abgeschnitten, die Schnittflgche mit 500 ml Wasser aus einer Spritzflasche mit scharfem Strahl grfindlichst abgespfilt und sofort mit Kleenex-Papier trockengetupft. Aus beiden Phloemteilen der bikollateralen Leitbfindel traten nun Safttr5pfehen aus, die sich bei weiterer Volumenzunahme zun~chst fiber den ganzen Leitbfindelquerschnitt, sehlieBlich auch fiber das benaehbarte Stengelparenchym ausbreiteten. Der austretende SiebrThrensait wurde jedoch mit einer sehr rein ausgezogenen Schmelzpunktcapillare aufgesaugt, ehe es zu einer Ausbreitung fiber die Leitbfindelfliiche hinaus kam. Eine Berfihrung der Schnittfl~che mit der Glascapfllare wurde gewissenhaft vermieden, um nach dem Abspfilen kein Parenehym zu verletzen. Bei dem so (vorwiegend yon apikalen Schnittfl~chen) gewonnenen Material handelt es sich ohne Zweifel um Exsudate des Phloems (Kontrolle unter dem Stereomikroskop; s. auch C~AFTS, 1936). Blutungssaft tritt nicht aus, wenn am Stumpf der abgesehnittenen Pflanze noeh einige Laubbl~itter verbleiben. Andererseits lieB sich B]utungssaft leicht erhalten, wenn der Sprogstumpf bis auf wenige Zentimeter fiber den Wurzelansatz zurfiekgesehnitten wurde. Die nun aus dem Xylem austretende Flfissigkeit zeigt im Gegensatz zum SiebrShrensaft geringe Viscosit~t, erstarrt nicht, und ihre FSrderung h~lt fiber mehrere Tage an, w~ihrend SiebrShrensaft nur wenige Minuten ausfliei~t, wenn die Schnittfl~che nicht erneuert wird. b) Virologische Methoden. Wir verwendeten fiir unsere Versuche, wie erw~hnt, Cueumisvirus 2AL Nuch Angaben yon KS~LER (1954) und KLI~KOWSKI (1958) ist das Virus mit dem Tabakmosaikvirus morphologisch und serologisch verwandt. Es erzeugt auf d e r " Deutschen ScMangengurke", die bei unseren Versuchen sowohl als Virusdonator Ms auch ffir Infektionstest diente, eine systemische Erkrankung, die sich als gelbes oder weifles Blattmosaik manifestierL. Bei unseren Tests wurden nut Pflanzen mit deutlich ausgepr~gten Krankheitssymptomerl Ms infiziert angesprochen, und nut solche Pilanzen dienten ~ls Spender ffir Siebr5hrens~fte. Die Auspragung des Krankheitsbildes erfolgte je naeh Jahreszeit am 15.--20. Tag nach der Beimpiung. Die Anzucht der Versuchspflanzen und die Infektionstests wurden im Gewi~chshaus durchgeffihrt, wobei auf Temperaturkonstanz verzichtet werden mul~te. WSchentliehes Besprfihen mit einem systemisehen Insecticid schfitzte die Versuchspflanzen vor tierischen Virusvektoren. Bei allen Arbeiten mit virSsem Material wurden die beiKLI~:ows~:I (1958) empfohlenen MaBnahmen beachtet. Die Beimpfung derTestpflanzen erfolgte naeh der vTlligen Entfaltung des ersten Laubblattes. Dabei wurden die Versuchspflanzen leicht mit Carborundpuder eingest~,ubt, die virushaltige LSsung entweder auf das erste Laubblatt oder auf die beiden Keimbliitter mit einem Glasspatel aufgerieben und die Impfstelle sofort mit feuchtem FlieBpapier abgedeckt (vgl. KLINKOWSKI, 1958). AUe Versuche wurden in den Monaten April bis September der Jahre 1963--1966 durchgeffihl~.

II. Ergebnisse 1. Ist der SiebrShrensa/t viruskranker P/lanzen in/elctiSs ? D i e s e F r ~ g e g~lt es Ms erstes zu fiberprfifen. W i r v e r f u h r e n d a b e i wie folgt: 1 Den Herren Prof. Dr. I. P. VAN n~R WA~DT (Wageningen) und Dr. W. VAN SO,ST (l~aaldwijk) danken wir ffir die ~berlassung des Stammes.

Viruspartikel im SiebrShrensaft

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SiebrShrensaft wurde in Phosphatpuffer (0,07 M; pH 7,0) aufgenommen (je nach Anzahl der zu beimpfenden Testpflanzen in 1--2 ml Puffer/200 mg SiebrShrensaft), indem die den Salt enthMtenden Spitzen der Glascapillaren abgesehnitten und in ein Zentrifugenglas iiberfiihrt wurden. Unter Puffer wurden sie hier mit einem dieken Glasstab zerstol~en und sehr rein verrieben. Dis aus Proteinfl6ckchen und Glasmehl bestehende Suspension wurde zum Infektionstest am Tage der Saftentnahme verTabelle 1. Nachweis der In/ektiositgt impft. Als Kontrolle des Reaktionsverdes SiebrShrensaftes virus]cranker m6gens der Testpflanzen, des Einflusses Gurkenp/lanzen der Aul~enbedingungen auf die Symotomausprggung und zum Beweis der VirusZahi Zahl der cter TestInfekerkrankung der Spenderpflgnze wurde pfla.nzen tionen virSser Bl~ttpreflsaft parallel verimpft. Die Tabelle 1 g i b t das E r g e b n i s zweier d e r a r t i g e r Versuche wieder. Diese E x p e r i m e n t e zeigten eindeutig, dal3 der S i e b r 5 h r e n s a f t der vir6sen G u r k e n N e u i n f e k t i o n e n hervorzurufen vermochte.

Versuch vom 1.4. 63 SiebrShrensaft 14 Blattpregsaf~ 14

6 7

Versuch yore 17.5. 63 Siebr6hrensaft 12 Blattpregsaft 12

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2. Die Natur des in/e]ctiSsen Prinz@s im SiebrShrensa]t W i r stehen nun vor der z e n t r a l e n F r a g e , wie das i m SiebrShrensMt naehgewiesene infektiSse Agens beschaffen ist. Es ergeben sich folgende D e n k m 6 g l i e h k e i t e n : a ) Das Virus w a n d e r t i m P h l o e m als vollst~ndiges P a r t i k e l . b) Das Virus wird in kleinere T r a n s p o r t e i n h e i t e n zerlegt (s. aueh Z~CH, 1952). Als solehe k o m m t - - wie bereits in der E i n l e i t u n g d i s k u t i e r t w u r d e - - die y o n d e r sohfitzenden Eiweil~htille befreite infektiSse Nucleinsgure in F r a g e ; z u m a n d e r n k 6 n n t e m a n a n n e h m e n , d a b die Viren z u m T r a n s p o r t in sehr kleine, niedermo]ekulare T r a n s p o r t e i n h e i t e n aufgeteilt werden. Die l e t z t g e n a n n t e A r b e i t s h y p o t h e s e e n t b e h r t schon y o n v o r n h e r e i n aller W a h r s e h e i n l i e h k e i t , d e n n wh- wissen heute, d~13 die Virusnucleins'gnre ~ ~ns m i n d e s t e n s 6000 M o n o n u e l e o t i d e i n h e i t e n m i t einem Molekul a r g e w i e h t yon 1,94 • i06 bestehen mul3, u m infekti6s zu sein. Das virSse P r i n z i p i m SiebrShrensaft mfiBte also - - vorausgesetzt, es h a n d e l t sieh d a b e i wirklieh n m eine Nueleins/~ure - - m i n d e s t e n s diese m o l e k u l a r e D i m e n s i o n haben. Die V e r f r a e h t u n g kfirzerer, selbst n i e h t m e h r infekti6ser E i n h e i t e n erscheint aus t h e o r e t i s e h e n Grfinden unm6glieh, d e n n es ist sehwer vorstellbar, wie bei solch w e i t g e h e n d e r Zerlegung die I n f o r m a t i o n ffir die S y n t h e s e k o m p l e t t e r V i r u s p a r t i k e l n g e w a h r t u n d fiber groge 2 Wir legen bei den folgenden Uberlegungen die physikalisehen Daten der Nueleinsgure des TMV (aus AAc~) zugrunde. Bedingt dureh die nahe Verwandtsehaft zwischen Cueumisvirus 2A und dem TMV sind wohl sehr ghnliehe physikalische GrSl~en zu erwarten.

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M. KLuGE:

Entfernungen weitergegeben werden kann. Nur der Transport einer intakten, vollsti~ndigen Matrize gew~hr]eistet fehlerfreie Neusynthese an anderen Orten als dem der prim~ren Infektion. Trotz der groI3en Unwahrscheinlichkeit sollte die Frage, ob nicht doch sehr kleine, niedermolekulare Bruchstficke die Transportform des Virus darstellen, nachgepriift werden. Dabei wurde yon der Annahme ausgegangen, dab Virusmateria] mit niedrigem Molekulargewicht sich vielleicht durch Dialyse aus dem SiebrShrensaft entfernen und dessen Infektiosit~t sich dadurch beseitigen ]iel3e. 0,2337 g SiebrShrensaft wurde in 2 ml Puffer aufgenommen und in einem Dialysiersehlaueh der Fa. Kalle ,,Cellophan" bei 4~ unter st~digem Rfihren gegen 1000 ml ~qua dest. dialysiert (24 Std). Als Kontrolle wurden gleiehe Mengen virSsen Bl~ttpre~saftes ebenso behandelt. Die Dialysate wurden wie fiblieh auf Testpflanzen verimpft. Tabelle 2 gibt das Ergebnis dieses Versuches wieder. T~belle 2. Nachweis der In/ektiosit~it des dialysierten Siebrghrensa/tes virSser Gut/sen Zahl der Zahl der Testpflanzen Infektionen Versueh vom 21.5. 63 Siebr5hrensaft (dialysiert) BlattpreBsaft (dialysiert)

12 12

10 10

Der Versuch zeigt, dai3 es durch Dialyse nicht gelingt, das infektiSse Agens aus dem SiebrShrensaft zu entfernen. Da die obere Grenze der Durchlgl~igkeit der von uns benutzten Dialysiermembran bei einem Molekulargewicht yon 15000 liegt (Mitteilung der Fa. Ka]le), so kSnnen wir fiberschlagen, wie groI~ das Molekfil des virSsen Prinzips mindestens sein mu•, damit es yon der Dia]ysiermembran gerade noch znrfickgehalten werden kann. Wieder hypothetisch vorausgesetzt, dab eine Nucleinsgure verfrachtet wird und unter Verwendung der oben zitierten physikalischen Werte berechnet sich die Kettenlgnge eines solchen Molekiils als aus 46 Mononuc]eotideinheiten bestehend. Unser Versuch hat gezeigt, dal3 das virSse Prinzip im SiebrShrensaft grSBer sein mul3. Nachdem niedermolekulare Bruchstficke als Transporteinheiten ansscheiden, haben wir nur noch zwischen der Annahme der Verfrachtung einer infektiSsen Nucleinsgure nnd der einer Translokation ganzer Viruspartikel zu entscheiden. Sollte tatsgchlich der erste Fall verwirklicht sein, so ist zu erwarten, dab bei Inkubation des SiebrShrensaftes mit RNS abbauenden Enzymen die Infektivitgt aufgehoben wird. Anch diese Frage wnrde experimentell fiberpriift. Dem wie ublich in Phosphatpuffer aufgenommenen SiebrShrensaft (ca. 100mg/ml Puffer) wurde ein weiterer ml Phosph~tpuffer (0,07 M, pH 7,0) zugesetzt, der 100y

Viruspartikel im Siebr6hrensaft

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Phosphodiesterase aus Schlangengift (Worthington Biochem. Corp.) enthielt. ([Jber die Vorteile der Phosphodiesterase gegentiber l~NA-se aus Pankreas bei derartigen Versuehen s. DIE~SR, 1961.) Ein weiterer Ansatz enthielt entspreehend mit Puffer verdfinnten SiebrShrensaft ohne Enzymzusatz. Blattprel3saf~ wurde gleiehfalls mit und ohne Enzym ilxkubiert. Die Inkubationszeit betrug 4 Std bei Zimmertemperatur (s. DIESr~s~, 1961). Ansehliegend wurden die Ans~tze auf Testpflanzen verimpft. Alle 12 Versuehspflanzen, die m i t p h o s p h o d i e s t e r a s e b e h a n d e l t e m Siebr6hrensaft b e i m p f t wurden, e r k r a n k t e n ; ebenso alle Ans~tze m i t unb e h a n d e l t e m SiebrShrensaft u n d die K o n t r o l l e n m i t BlattpreBsaft. Das infekti6se P r i n z i p im SiebrShrensaft ist also offensichtlieh n i e h t ungeschfitzt den Angriffen des R N S s p a l t e n d e n E n z y m s ausgesetzt, u n d so dfirfen w i t a n n e h m e n , d a b die Viren - - wenn f i b e r h a u p t - - so doeh n i c h t

Abb. 1. Cucumisvirus 2A im BlattpreBsaft infizierter Gurkenpflanzen

ausschlie61ich als ungeschfitzte Nueleinsaure im S i e b r 6 h r e n i n h a l t vorliegen. Mit diesem E r g e b n i s g e w a n n jedoeh die H y p o t h e s e , dal] kompletge V i r u s p a r t i k e l n die T r a n s p o r t f o r m darstellen, sehr an Wahrsehehllichkei~. D e r endgfiltige Beweis hierfiir w a r d u t c h elektronenop~ische U n t e r s u e h u n g e n des P h l o e m e x s u d a t s zu ffihren. Die Preparation der Siebr6hrensXfte in hinreiehend diinner Sehieht fiir die Elektronenmikroskopie ist ersehwert, da das Material sehnell erstarrt und sieh nieht verdiinnen lggg, ohne auszufloeken. Folgendes Verfahren hat sieh sehlieglieh bew/~hrt: Befilmte Objekttr~ger fiir das EM wurden derart mit ca. 5 ~xl aqua bidest. besehiekt, dab der Tropfen stehenblieb. In ihn wurde vorsiehtig aus einer tIaareapillare h6ehstens 0,5 mg Siebr6hrensafg (diese Gewiehtsangabe beruht auf einigen orientierenden W~gungen) eingeblasen. SoforC ansehliel3end saugten wir den Tropfen seitlieh ab. Dabei breitete sieh der SiebrShrensaft in einem gut durehstrahlbaren l~ilm fiber das Netzehen aus. Prel]s~tfte und Blutungssaft lieBen sich ohne Sehwierigkeiten in hinreiehender Verdfinnung auf 0bjekttr~Lger auftrocknen. Alle Proben warden mit Chrom unter einem Winkel yon 150 bedampft. Mikroskopiert wurde mi~ dem EM 9 der Fa. geiss. U m zun/~ehst Aufsehl/isse fiber die Morphologie der in den B1/~t~ern vorliegenden V i r u s p a r t i k e l zu erhalten, w u r d e n Blatgprel]s/~fte u n t e r sueht. Erwartungsgem/~13 zeig~en sich s~/~bchenf6rmige P a r t i k e l y o n 345 m~z L/inge u n d 23 m~z Breite, die m e i s t einzeln, sehr oft a b e t auch zu A g g r e g a t e n vereinigt (Abb. 1) b e o b a e h t e t werden k o n n t e n . Die gleichen

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M. KLUGE:

Partikeln waren aueh in allen yon uns untersuehten Proben virSser SiebrShrens/~fte in hoher Teilehendiehte zu linden (Abb. 2), nie jedoeh im Siebr6hrensaft gesunder Pflanzen. U m die M6gliehkeit auszusehliegen, da[~ der Siebr6hrensaft mit Viruspartikel kontaminiert war, die aus den angesehnittenen Zellen des Stengeldarenehyms stammten, wurde Phloemexsudat einer gesunden Pflanze auf vorher griindliehst abgesp/iltes Parenehym (s. unsere Methode der Saftgewinnung) eines ca. 3 m m dieken Sprogquersehnittes einer virus~ kranken Pflanze in kleinen Trbpfehen aufgesetzt. Dieser Siebr6hrensaft

Abb. 2. Viruspartikel im Siebrghrensaf~ infizierter Gu_rkenpflanzen. a Par~ikel normaler Lange. b kurze Partikel

wurde ansehliegend wie besehrieben auf Netzehen pr/~pariert. Aueh in derargigen Kontrollproben konnten vA_rkeine tier typisehen Partikel auflinden, obwohl clas Homogenat des Parenehymseheibehens reich an Virusstgbehen war. Wit diirfen daher annehmen, dab unsere Metbode der Saftgewinnung die Gefahr einer Kontamination des Untersuehungsmaterials auf ein geringes MaB herabgesetzt, dab also die im Phloemexsudat beobaehteten Teflehen nieht aus dem Stengelparenehym in die Probe gelangt sein k6nnen. Wir glauben uns augerdem zu der Annahme bereehtigt, dab wir in den st/~behenf6rmigen Partikeln das infektiSse Agens des Siebr6hrensaftes vor uns haben. Es besteht demnaeh aus komplettem Virus. Die yon uns im SiebrShrensaft beobaehteten St~behen lassen sieh hinsiehtlieh ihrer L/~ngsabmessung in zwei Gruppen einteilen. Partikel

Viruspartikel im SiebrShrensaft

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mit einer Lgnge yon 345 m~ (entsprechend dem Virus im Blattprel3saft) sind ungef~h r doppelt so hi~ufig wie kfirzere Teilchen mit einer L~ngsausdehnung yon 262 m~ (Abb. 2). I n einem Pri~parat fiel eine ganze Anzahl merkwfirdiger Bls auf, die entweder einzelne Viruspartikel (Abb. 3 b) oder aueh ganze Bfindel der Sti~bchen bargen (Abb. 3 a). Die Viruspartike] in diesen Einschlfissen entsprachen in ihrer L/~nge den kurzen St~bchen im SiebrShrensa~t. Die B1/~sehen selbst zeichneten sieh durch eine auffallend einheitliche Gr513e aus (Durchmesser 410 m~). Diese Tatsache spricht nicht daffir, dal3 es sieh um Pr/~parationsartefakte handelte. Da in einzelnen Fi~llen Virustransport im Xylem beobachtet wurde ( S C H N E I D E R tl. W O R L Y , 1954; HOUSTON, ESAV u. HEWITT, 1947), haben

Abb. 3a u. b. Virushaltige Bl~schen aus dem SiebrShrensaft infizierter Gurkenpflanzen. a Bl~ischen mit mehreren Partikeln. b ]Mfischen mit einzelnen Partikeln

wir bei unserem Objekt auch im Blutungssaft nach Viruspartikeln gesucht. Obwohl auch dieses Material unter den beschriebenen VorsichtsmaBregeln entnommen wurde, I/il3t sich nut schwer ausschlieBen, ob es nicht in der ersten Phase des Saftflusses - - also bald nach dem Abschneiden des Sprosses - - zu einer Vermischung mit dem gleichzeitig austretenden SiebrShrensaft kommen kann. Der Befund, dal3 sich im Blutungssaft viele Viruspartikel finden lassen, wenn man die Probe 15 min nach dem Abschneiden des Sprosses entnimmt, ist deshalb ohne Aussagewert. 3 und 12 Std sparer entnommener Blutungssaft enthielt kein Virus mehr. III. Diskussion Welehe Schl/isse k6nnen wir auf Grund unserer Ergebnisse im Hinblick auf das Problem des Virustransportes ziehen ? Da wir Viruspartikel im Siebr6hreninhalt selbst - - um solchen handelt es sich bei dem yon uns untersuchten Material sicherlieh (CRAFTS, 1 9 3 6 ) - nachgewiesen haben, k6nnen wir wohl auch annehmen, dab diese Partikel im Siebr6hrensaft verfrachtet werden. Dabei stellen die Poren der Siebfelder wahrscheinlich

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I~.KLUGE:

keine uniiberwindliehen tIindernisse dar (EsAu, CU~RIEI% u. CHEADLE, 1957), da sie j~ gerade bei den Cueurbitaeeen Weiten erreiehen, die sie sogar der liehtmikroskopischen Untersuchnng zugs maehen. Ungekls and durch unsere Ergebnisse besonders aktuell geworden ist die Frage, wie ein Viruspartikel in die SiebrShren einzudringen vermag, aber aueh, wie es aus den SiebrShren heraus und in die angrenzenden Gewebe gelangen kann. Vielleicht w~re die Annahme eytopemptiseher Vorg~nge also die ,,transzelluls Passage" in Bl~schen eingeseh]ossener KSrper (s. STAUBa~SA~D, 1965) - - eine brauehbare Arbeitshypothese. In die Vorstellung einer Cytopempsis zwischen Geleitzelle (oder Phloemparenehym) und umgekehrt ]iel3e sieh auch das Auftreten der vir6sen Bls einigermal3en sinnvoll einordnen, wenn man diese KSrper als zum transze]lul~ren Transport fertig verpaektes Virus deutet. -

-

Denkbar wgre aueh, dal3 die Viruspartikel durch Pinoeytose in die SiebrShren gelangen and diese auf dem gleichen Weg wieder verlassen k6nnen. Dag SiebrShren - - zumindest in Entwicklung begriffene - - zu Pinoeytose Ighig sind, wurde yon BUVAT (1963) wahrscheinlich gemacht. Solange jedoeh keine weiteren cytologischen Befunde vorliegen, sind wir bei der Betrachtung des ganzen Fragenkomplexes auf reine Vermutungen angewiesen. Sehr unwahrseheinlich, vor allem im Hinblick auf den Kernverlust und die damit sicher]ieh verbundene reduzierte (oder spezialisierte) Syntheseleistung der SiebrShren, erscheint die Annahme, die Viruspartikel in den SiebrShren kSnnten an Ort und Stelle aus niedermolekularen Bausteinen aufgebaut werden. Bezeiehnenderweise Iehlen in den SiebrShren in den meisten der bisher beobachteten F~]le ViruseinschlugkSrper (Z~cH, 1952; ESALr, 1956; jedoch lgEscH, 1958), die doeh wohl Depots ffir im l~bermal3 synthetisiertes Virusnueleoproteid darstellen und die sonst in allen Geweben der viruskranken Pflanze gefunden werden k6nnen. Die yon ZEC~ (1952) postulierte Zerlegung des Virus in kleine Einheiten bei der Verfraehtung konnten wir bei unserem Objekt, an dem wir ja nur die Verhgltnisse beim Ferntransport im Auge hatten, nicht feststellen. Zwar warden Partikel beobaehtet, die um etwa ein Drittel kfirzer waren als die Normalform, doeh bewegen wir uns hier immer noch in der gleiehen Gr6Benordnung. Die Tatsache, daB die kurzen 8tgbehen die gleichen Abmessungen haben wie die in den Bls eingeschlossenen, l~Bt die MSglichkeit offen, daB es sieh hier um gerade aus der ,,Verpackung" frei gewordenes Virus handelt. Die Annahme, dab die Infektiosit~t des SiebrShrensaftes auch yon einer infektiSsen Nucleins~iure ohne EiweiBhiille bewirkt wird, kann unser Experiment, bei dem SiebrShrensaft mit Phosphodiesterase inkubiert

Viruspartikel im SiebrShrensaft

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wurde, zwar nicht widerlegen, doch zeigt der Versuch, dal~ zumindest nicht ausschliel~lich ungesehiitzte Nueleinsiiure vorliegen kann. Trotzdem bleibt die Hypothese, dab eine Nueleins~ure die Transportform des Virus sei, wertvoll, zumindest bei der Diskussion der Virusausbreitung yon Zelle zu Zelle. Immerhin gibt es Belege (S~NGER und BRANDENBURG, 1961) fiir die Tatsaehe, dab Virus in Bl~ttern fast ~ussehliel~lich als freie Nucleins~ure vorliegen kann. Die negativen Ergebnisse der Suche naeh Virus in Exsud~ten aus Rfisseln yon Blattls (v. SOEST u. MEESTEn-MANGER CATS, 1956) ist nach unseren Ergebnissen verstiindlieh. Sollte tats~ehlich der Fall verwirklieht sein, dab der Saugrfissel der Aphiden im Blatt- und Stengelgewebe allseitig yon einer Speiehelseheide umgeben ist (eine bisher noeh keineswegs unwidersproehene Annahme), so f~nden wit hier unseren Dialyseversuch im Mikromai3stab wiederholt. Das infekti6se Agens vermoehte unsere Dialysiermembran nicht zu passieren, ebensowenig wegsam ist mSglieherweise die n~eh der zitierten Vorstellung eine Mikrodialysierhiilse darstellende Speichelseheide. Es sei in diesem Zusammenhang darauf hingewiesen, dab es sieh bei den hier zuletzt disku~ierten Befunden um einen Spezialfall handeln dfirfte, da ja eben ein grol~er Tell der phytopathogenen Viren gerade dureh Blattl/~use iibertragen wird, und es erscheint lohnend, derartige Beispiele in dem hier interessierenden Zusammenhang zu untersuehen. Betrachten wir unsere Resultate unter dem Aspekt der Mechanik des Stofftransportes im Phloem iiberhaupt, so stellt sieh die Frage, welch andere Theorie als die einer MassenstrSmung in den SiebrShren einer Verfrachtung solch riesiger ,Molekfile" wie die des Cueumisvirus einigermaBen gereeht werden kann. Wir wissen jedoch, dab wit aueh bei Annahme einer Massenstr6mung yon einem vSlligen Versti~ndnis des Virustransportes in den SiebrShren noeh welt entfernt sind. Ob unsere Ergebnisse, die ja an einer Pflanze gewonnen wurden, die wie alle Cucurbitaeeen hinsichtlieh des Transportes im Phloem eine Sonderstellung einzunehmen seheint, allgemeine Giiltigkeit haben, l~Bt sieh vorl~ufig nieht fiberblieken. Es ist denkbar, dab andere Virustypen beim Transport in den Siebr6hren in anderer Form vorliegen als es beim Cueumisvirus 2A der Fall ist. Immerhin erseheint es uns wiehtig, wenigstens in einem Fall das virSse Agens im Siebr6hreninhalt selbst charakterisiert und gezeigt zu haben, dab in den Siebr6hren komplette Viruspartikeln vorliegen und wohl aueh transportiert werden kSnnen. Zusammenfassung 1. Der SiebrShrensaft mit Cucumisvirus 2A infizierter Gurkenpflanzen ist infekti6s.

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M. KLVGE:

2. Das infektiSse Prinzip li~I~t sich weder d u t c h Dialyse noch durch I n k u b a t i o n m i t Phosphodiesterase aus dem SiebrShrensaft entfernen. Die Infektiositi~t k a n n daher n i c h t durch niedermolekulare E i n h e i t e n u n d n i c h t durch eine ungeschiitzte Nucleins~urc v e r u r s a c h t sein. 3. I m SiebrShrensaft infizierter G u r k e n p f l a n z e n k 6 n n e n m i t dem E l e k t r o n e n m i k r o s k o p Viruspartikeln gefunden werden, die d e n e n im vir6sen Blattprei~saft gleichen. I m SiebrShrensaft gesunder P f l a n z e n t r e t e n diese P a r t i k e l n n i c b t auf. Das infekti6se Agens im P h l o e m e x s u d a t b e s t e h t also offensichtlich aus k o m p l e t t c m Virus, u n d wir k S n n e n a n n e h m e n , dM~ dieses beim F e r n t r a n s p o r t m i t dem Assimilatstrom wandert.

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Viruspartikel im Siebr6hrensaft

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[Virus particles in phloem exudate from Cucumis sativus L. after infection by Cucumis Virus 2 A].

Sieve tube sap obtained from cucumber plants infected by Cucumis Virus 2 A induced the typical mosaic disease when it was inoculated into healthy plan...
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