Planta (Berl.) 85, 213--227 (1969)

Translokation und biochemisches Verhahen von D- und L-Phenylalanin bei Viciafaba* WALTER ESCHRICH u n d THOMAS ~IAlCTMAI~N Pharmakognostisches Institut der Universit~t Bonn Eingegangen am 18. Dezember 1968

Translocation and Biochemical Behaviour o/ D- and L-Phenylalanine in Vicia /aba Summary. D,L-Phenylalanine (phe) ~pplied to the first primary leaf of a young Vicia ]aba plant moves into the sieve tubes and appears in the honey dew of aphids feeding on the third primary leaf. Ethanol extracts of the treated leaf contain labeled phe and an acidic compound which could be identified as N-malonyl-D-phe. D-phe-1-14C was obtained pure by enzymatic dec~rboxylation of the L-isomer of commercially available D,L-phe-l-laC, using an enzyme from red algae (I-IAI~T~A~r 1967). The uptake of the D-isomer of phe by the sieve tubes is independent of the age of the treated leaf. L-phe applied to a young leaf is completely incorporated into protein; L-phe taken up by an older leaf is translocated in considerable amounts. Pulse-labeling with the two isomers shows that D-phe entering the sieve tube system is quickly removed to the parenchyma where it is acylated with malonic acid to the phloem immobile N-malonyl-D-phe. L-phe does not react with malonic acid at all. It is translocated to the centers of protein synthesis.

Einleitung Zur Biosynthese der ,,unnatfirlich" konfigurierten D-Aminos/~uren sind n u r wenige Spezialisten u n t e r den niederen P f l a n z e n f~hig. Alle proteinogenen Aminos/~uren liegen i n der L - K o n f i g u r a t i o n vor. Die durch mikrobielle T/s i m B o d e n e n t s t e h e n d e n D-Aminos/~uren werden offenbar y o n den meisten P f l a n z e n a u f g e n o m m e n (KIcKUT~ u n d ALDAO, 1967; SCH]~Fg]~R et al., 1967; BOI,LI, 1967). Ffir ihre W e i t e r v e r a r b e i t u n g i n der Pflanzenzelle wurde bisher n u r ein Weg b e k a n n t , der allerdings im Pflanzenreich weir verbreitet zu sein scheint, die N-Acylierung m i t Malons/s oder m i t Essigs~ure (Good u n d A~DUEA~, 1957; Z n ~ x u n d SC~EUF, 1963, 1964; ROSA u n d N]~IS~, 1968). N u r einige B a k t e r i e n u n d Prize scheinen zur Racemisierung der optischen I s o m e r e n y o n A m i n o s ~ u r e n befKhigt zu sein ( T r y p t o p h a n ; ZE~K u n d SCH~RF, 1964). * Herrn Prof. Dr. MAXIMILIA~STEI~E~ zum 65. Geburtstag gewidmet. 15 PIanta(Berl.),/3d.85

214

W. Escm~ic~ und T. I-IAI~TMANN:

Ffir viele Probleme der Transportphysio]ogie ist es erforderlich, Tracer zu besitzen, die zwar i n der SiebrShre ge]eitet, aber n i c h t i n den Stoffwechsel der Pflanzenzelle einbezogen werden. Da wir bereits nachweisen k o n n t e n , daI~ Phenylalanin-14C (als R a c e m a t appliziert) i n die SiebrShren y o n Vicia/aba (EscHaICH, 1967) u n d Tradescantia albi/lora (ttwysE~, 1968) a u f g e n o m m e n u n d i m PflanzenkSrper verteilt wird, schien es y o n Interesse, zu erfahren, ob die optischen A n t i p o d e n des P h e n y l a l a n i n s U n t e r s c h i e d e i n i h r e m T r a n s l o k a t i o n s v e r h a l t e n zeigen. Die ersten Ergebnisse dieser U n t e r s u e h u n g e n werden i n der folgenden A r b e i t mitgeteilt. Material u n d Methoden

1. Allgemeine Methoden Versuchspflanze. Viola /aba L. (Zwijndreehter Frfihe Verbesserte) wurde in Sand vorgezogen und 1 Tag vor Versuchsbeginn auf beliiftete N~hrlSsung (Esc~laIc~, 1966) umgepflanzt. Die Pfianzen wuchsen im 14 Std-Tag. Honigtau. Zur Gewinnung des Itonigtaus benutzten wir die Blattlausart Acyrthosiphon pisum HARem; fiir Di~tversuche wurde hauptsi~chlich Neomyzus circum/lexus BUCKT. verwendet. Die Methode zur kfinstlichen Ern~hrung wurde yon ESC~RIC~ (1968) beschrieben; die Zusammensetzung der Di~itlSsung wurde yon En~aHAR])T (1968) mitgeteilt. Chromatographie. Chromatographiert wurde an Kieselgel-H (Merck 7736) mit den FlieBmitteln D 1 = Essigsdure~thylester/i-Propanol/NHa (45/35/20) und D2 n-Butanol/Eisessig/Wasser (5/1/4). Zum Aminosiiurenaehweiswurde mit Ninhydrin, zum Nacbweis organischer Siiuren mit Bromkresolgriin (40 mg Bromkresolgrfin in 90 ml Aceton -~ 10 ml Formuldehyd) bespriiht. Extralction. Blattextrakte wurden durch Zerreiben yon gefriergetrocknetem Material mit Sand in 80 %igem heiBem Athanol hergestellt. Die Filtrate wurden fiber hintereinandergeschaltete S~ulen (20 cm, 2 cm ;~) mit Amberlite IR 120 und Amberlite II~4B gegeben und mit ca. 400 ml C02-freiem Aqua dest. nachgewaschen. ])er Ourchlauf (FraktionI) enthielt alle nichtionischen Stoffe. Die Amberlite IR 120-S~ule wurde zur Elution der Aminos~iuren mit ca. 40Oral 2N l~tt 3 ausgewaschen (Fraktion II). In der gleichen Weise wurde die Amberlite II~ 4B-S~iule zur Elution der organischen S~uren behandelt (Fraktion III). Die Elute wurden am l%otavapor bei ~ 40~ C konzentriert und dann gefriergetrocknet. Tracer. D,L-Phenylalanin-l-l~C (spez. Aktivit~t 50 me/mlVi) und L-Phenylalanin-1-14C (spez. Aktivit~t 12mc/mM) wurden yon Radiochemical Center, Amersham, England bezogen. D-Phenylalanin-l-laC wurde nach der unten beschriebenen Methode aus dem D,L-l~acem~t hergestellt. Applikation und autoradiographischer Naehweis der Tracer wurden nach den bereits frfiher besehriebenen Verfahren durchgeffihrt (Escm~ic]~, 1966).

2. Methode zur enzymatischen Bestimmung der optischen Antipoden yon D,L-Phenylalanin-l-14C und zur Isolierung yon D-Phenylalanin au8 dem Racemat Zum Nachweis und zur Bestimmung yon D-Aminos~uren in biologischem Material existieren bereits einige enzymatische 1V[ethoden. Am gebr~uchlichsten ist

Translokation und Verhalten yon D-Phenylalanin

215

die Bestimmung mit D-Aminos~ure-Oxidase (BOULANGER und OsT~ux, 1962). SC~IMITT und ZE~K (1966, 1968) geben neuerdings ein Veffahren an, bei dem D-Aminosguren dutch eine aus I-Iefe gewonnene Aeetyl-CoA:D-Aminosgure~-N-Acetyltransferase N-aeetyliert werden. Bei unseren Untersuehungen fiber Translokation und Stoffweehsel yon D,L-Phenylalanin-l-14C (D,L-Phe-l-14C) bewf~hrte sich ein anderes Verfahren. Das Prinzip der Methode ist folgendes: Durch Behandlung der Analysenproben mit einer L-Aminos~ure-Decarboxylase wird die L-Form der Aminos~ure quantitativ deearboxyliert und das freiwerdende 14C02 in K 0 H fixiert. Dutch 3/Iessung der gadioaktivitgt des COs und des nieht mngesetzten D-Phe l~13t sich das Mengenverhgltnis der beiden optisehen Antipoden in der Analysenl6sung bestimmen. In der gleichen Weise lggt sich mit dem Enzym D-Phe-IJ4C aus kommerziellem D,L-Phe-l-14C isolieren. Als Deearboxylase stand uns die in marinen Rotalgen verbreitet vorkommende, partikelgebundene L-Leuein-Carboxylyase zur Verffigung. Dieses Enzym deearboxyliert neben seinem Hauptsubstrat L-Leucin mit hoher Aktivitgt eine Reihe weiterer aliphatischer Aminosguren sowie Phenylalanin. ~ber diese Decarboxylase wurde bereits in einer ersten Mitteilung kurz berichtet (HART~AN~, 1967). Vorteilhaft fiir analytisehe Zweeke ist, dab sich die Enzymprf~parate sehr leieht gewinnen lassen und dab sic praktiseh unbegrenzt haltbar sin& Wir verwendeten ])eearboxylaseprgparate aus Cystoclonium purpureum (Hubs.) BAT~., da das Enzym dieser Alge Phenylalanin mit besonders hoher Aktivitg,t dec~rboxyliert. Herstellung des Enzympriiparates. Frische oder tiefgefrorene Thalli yon C. purpureum werden im ,,Waring Blendor" mit kaltem Aceton (--18 ~ C) mehrfaeh extrahiert und dann geffiergetrocknet. Das staubfeine Aeetontrockenpulver wird solange mit verdfinntem Puffer (pH 5--7) oder H20 gewasehen, his die Zentrifugationsfiberst~nde fast farblos erscheinen. Nach erneuter Acetonbehandlung und Gefriertrocknung erhglt man ein homogenes Troekenpulver, das yon wasserlfslichen Begleitstoffen praktisch vollst~ndig befreit ist. Troeken und kiihl gelagert ist das Pr~parat unbegrenzt haltbar. Isolierung yon D-Phe-I-I~C aus dem Racemat. Die enzymatische Deearboxylierung wird manometrisch in der Warburgapparatur unter N2-Atmosphf~re bei 37~ durehgefiihrt. Unter diesen Bedingungen setzt 1 mg unseres Enzyml0r~iparates pro Stunde 1,2 ~mol L-Phe urn. Bestimmungsansatz: Ein Warburggefgg (Vol. ca. 15 ml) mit 2 Seiten~Lrmchen wird wie folgt beschiekt: Reaktionsraum: 20 mg Aeetontrockenpu]ver; 1,4 ml 0,2 M Phosphatpuffer pH 6,0; 2 tzmol Pyridoxal-5-phosphat/0,2 ml Puffer Zentralgef~B : 0,2 ml 10 %ige KOH Seitenarm I: 0,1 me D,L-Phe-IJ4C/0,4 ml Puffer Seitenarm II: 0,25 ml 2N HC1 Die Reaktion wird dutch Zukippen der L6sung von Seitenarm I gestartet. Nach 3stfindiger Inkubation wird die Enzymkatalyse dureh Zugabe der S~ure aus Seitenarm II gestoppt und zur quantitativen Absorption des 14CO~an KOH weitere 30 min gesehfittelt. Die geaktionsl6sung wird sodann mit I-I20 quantitativ in ein Zentrifugenglas iibergewasehen, sehaff abzentrifugiert und der I~fiekstand mehrmals mit H~O ausgewaschen. Die ~berst~nde werden vereinigt, und fiber eine Amberlite II~120-S~iule gegeben. Die Aminos~ureffaktion wird mit 2N NH 3 eluiert, am Rotavapor konzentriert und gefriergetroeknet. Das so gewonnene Prgloarat ist ehromatographisch rein und enthf~lt als einzige markierte Substanz radioaktives Phe, das sieh nach erneuter enzymatiseher Analyse (s. u.) als mindestens 96%ig reines I)-Phe-l-laC erweist (Tabelle 1). 15"

216

W. ESCIIRICH und T. HARTMANN:

Tabelle 1. Bestimmung der optischen Antipoden in lcommerziellem D,L-Phe-1-14C und

im enzymatisch ans dem Racemat isolierten D-Phe-l-laC mit Hil/e der unspezi/ischen L-Leucin-Decarboxylase aus Rotalgen Expt. Nr.

Substrat

1 2 3 4 5

]),L-Phe-l-14C

1 2 3 4

D-Phe-l-14C

Ipm im Phe

% im CO 2

D-Phe

L-Phe

4740 6369 5650 5552 5556

4944 5747 5181 5885 6061

51 53 52 49 48

49 47 48 51 52

9259 3079 10526 11765

224 127 214 337

98 96 98 97

2 4 2 3

Quantitative Bestimmung der optischen Ant@oden. Proben yon chromatographisch reinem ]),L-Phe-I-14C mit Aktivitiiten yon ca. 20000 Ipm werden in der eben beschriebenen Weise enzymatisch umgesetzt. Nach Versuchsabbruch werden ReaktionslSsung und die KOH, die das aus dem L-Phe abgespaltene laC02 enth~lt, quantitativ in Mel~kolben fibertragen und mit H20 ad 5 ml aufgefiillt. Je 2real 2 ml werden in Edelstahlsch~lchen pipettiert. Die Proben mit 14C02 werden mit einigen Tropfen BaOH versetzt. Nach dem Abdampfen der Flfissigkeit wird die Radioaktivit~t in iiblicher Weise mit einem MethandurchfluBz~hler im Probenwechsler (LB2700) bestimmt. ])as Ergebnis yon 5 Einzelbestimmungen ist in Tabelle 1 zusammengefaBt. Unter der Annahme, dal? die beiden optischen Antipoden im Ausgangspr~parat im Verh~ltnis 50:50 vorliegen, ergibt sich ein Bestimmungsfehler yon etwa 3 %. Entsprechende AnMysen des enzymatisch isolierten D-Phe-l-14C ergeben aufgrund der l~adioaktivitiit im CO 2 einen l~estgehalt an L-Phe yon hSchstens 4% (Tabelle 1). ])ieser l~estgehalt l~13t sich nicht wesentlich verringern, wenn das D-Phe-Pr~parat einer zweiten enzymatischen l~einigung unterworfen wird. ])a zudem in Kontrollans~tzen ohne Enzympriiparat stets eine geringe Markierung in der CO~-Fraktion nachzuweisen ist, inuB bei der Enzyminkubation mit einer geringfiigigen, mSglicherweise durch das PyridoxMlohosphat begiinstigten, nichtenzymatischen und damit auch nicht stereospezifischen ])ecarboxylierung gerechnet werden. Wenn die beschriebene Nethode, wie in der vorliegenden Arbeit, zur Bestimmung der optischen Antipoden yon Phe-l-14C aus biologischem Material, z. B. der Aminos~uregesamtfraktion yon Itonigtau, verwendet wurde, so wurden den Bestimmungsans~tzen 4 lzmol inaktives L-Phe zugesetzt. I)amit war es einmal mSglich, manometrisch zu kontrollieren, ob die ])ecarboxylierungsreaktion tats~chlich quantitativ zu Ende gefiihrt wurde, zum anderen lieg sich eine mSgliche kompetitive Hemmung der Phe-])ecarboxylierung durch gleichzeitig in den Proben vorhandene andere Aminosi~uren ausschliel3en.

Ergebnisse 1. Transport in der P/lanze A p p l i z i e r t m a n 2,5 ~c D , L - P h e - I - l a C au~ die O b e r s e i t e des 1. Prim/~rb l a t t e s e i n e r j u n g e n Vicia ]aba-Pflanze, so z e i g t die A u t o r a d i o g r a p h i e

Translokation und Verhalten von D-Phenylalanin

217

der nach 24stiindiger Inkubationszeit gefriergetroekneten Pflanze ein Verteilungsmuster des Tracers, das ffir viele proteinogene Aminos/~uren typisch ist (Abb. 2). Schwgrzungen finden sich vor allem fiber den Hauptzentren der Proteinsynthese, SproBspitze, jungen B1/tttern und Seitenwurzeln. Der Stengel ist als zuftihrendes Organ und infolge seiner relariven Leitelementdichte ebenfalls geschwgrzt. Xltere BlOtter (Blatt 2) seheinen kein radioaktives Material importiert zu haben; jtingere, aber bereits ausgewachsene Blgtter (Blatt 3), zeigen meist nur eine schwache Markierung der Blattnerven. Eine mehr diffuse Verteilung der radioaktiven Markierung in den oberirdischen Pflanzenteilen erhglt man bei Applikation yon H14C0~ unter Photosynthesebedingungen (Abb. 1). Die dabei synthetisierten Assimilate werden z. B. auch in gltere B1/~tter geleitet, offenbar deswegen, weft sie fiir den Betriebsstoffwechsel benStigt werden. Betrachtet man das Verteilungsmuster des D-Phe-l-14C, einer Substanz, die weder ffir die Atmung, noch ffir die Proteinsynthese benutzt zu werden seheint (Abb. 3), so fgllt der geringe Export an radioaktivem Material aus dem behandelten Blatt anti Wurzeln, SproBspitze und Stengel lassen nur eine schwache Einlagerung von markiertem Material erkennen, und die ausgewachsenen Blgtter 2 und 3 scheinen vSllig frei yon Radioaktivit/tt zu sein. So weir entsprechen die autoradiographischen Verteilungsmuster dem Konzept von ,,source" und ,,sink", wonach der Bedarf den Stofftransport regelt. Es ist jedoch schon mehrfach darauf hingewiesen worden, dag eine fehlende Schwgrzung in der Autoradiographie nicht unbedingt bedeutet, dag das betreffende Organ v611ig frei von Radioaktivit/~t ist (Esctn~ICH, 1966 ; ESCHRIC~ und STEI~ER, 1967 ; C~AFTS, 1967 ; CA~NY und AsKItA~, 1967). I n der Autoradiographie erscheinen ausgewachsene Blgtter oft weig, obwohl Blattl/~use, die an ihnen saugten, radioaktiven Honigtau ausgeschieden batten. Aus der Autoradiographie ist also nicht zu ersehen, ob die Siebr6hren eines weig erscheinenden Organs markiert sind oder nicht. Die ffir die Abb. 1--3 verwendeten Pflanzen waren am 3. Primgrblatt mat je ca. 20 Blattl/~usen (BL) besetzt, deren Honigtau w/~hrend der Inkubationszeit aufgefangen wurde. I n allen 3 F/tllen war der Honigtau radioaktiv. Dies bedeutet, dab nicht nur Photosyntheseprodukte und L-Phe, sondern auch D-Phe in den SiebrShren zu wandern vermSgen. Abb. 4 zeigt die Autoradiographie des Chromatogramms der 3 Honigtauproben. Der radioaktive Fleck der Proben B und C stimmt positionsm/~6ig mit Phe fiberein. Probe A enthielt ein Gemiseh radioaktiver Stoffe (Zueker und Aminos~uren), die im einzelnen nieht analysiert wurden.

("~

"

\ {

I !

. "

~ L - Phe4

"

}

2/ . . . . .

9

/

X

~,~' !

, k,

~ ',

'

~

:t

:: " t;

/1]

'~'

.;'

..

'he

Abb. 1 3. Autoradiographien -con gefriergetroekneten Vieia/aba-Pflanzen. 24stiindige Inkubation mit ~r Verbindungen. Applik~tion am aufgerauhten 1. Primgrblatt (l). Abb. 1.20 ~.e I-D~CO~in 20 ~xl Phosphatpuffer pI-I 7,8. Abb. 2. 2,5 ~xe D,L-Phe-IJ~C in 5 F1 Aqu~ dest. Abb. 3. 2,5 ~xe D-Phe-I-~C in 10 ~xl Aque dest. Die Unt~erseiten der 3. PrimS~rbl~tter waren w~hrend der Versuehszeit mit jeweils ca. 20 Blat~l~usen (BL; Acyrthosiphon pisum) besetzt, deren Honigtau aufgefangen wurde. Exposition: 35 Std bei 20 ~ C. Ma6sti~be: 5 cm

/

: ......... L.);

'

'~

"',

i{

:

]

,

..

! 9

"J}

2/

x

; /

.-3

,..I

=

:3

=

~0

_'-,9

219

Translokation und Verhalten yon D-Phenylalanin

Die 3 chromatographischen Analysen sind quantitativ nicht miteinander vergleiehbar. 2. Quantitative Zusammensetzung von marlciertem Phe i m Honigtau

Auf das 1. Prims yon jewei]s 4 Vicia /aba-Pflanzen wurden a) 2,5 ~c D,L-Phe-l-14C, b) 2,5 ~c D-Phe-l-laC aufgetragen. Wi~hrend der 24stfindigen Versuchszeit war die Unterseite des 3. Blattes jeder Pflanze mit Blattl/~usen besetzt. Der yon den Li~usen ausgeschiedene Honigtau wurde gesammelt, mit Wasser aufgenommen und fiber Amber]ire I R 120-Si~ulen gegeben. Die wi~l~rigen Elute enthielten kein radioaktives Material. Die absorbierten Aminoss wurden e]uiert, die Elute getrocknet und chromatographisch fiberprfift. Als einzige radioaktiv markierte Aminos~ure lie[~ sich Phe nachweisen. Die Isomerenzusammensetzung des aus den Honigtauproben isolierten markierten Phe wurde enzymatisch bestimmt. Das Ergebnis ist zusammen mit dem einer sp~ter durchgeffihrten Versuchswiederholung aus Tabelle 2 zu entnehmen. Die Genauigkeit dieser Bestimmungen wurde leider durch die geringen RadioTabelle 2. Das Verhgltnis der optischen Antipoden von mar]~iertem Phe im Honigtau nach Fi~tterung von D,L-Phe-1-14C und D-Phe-l-14C D,L-PheHT = Phe aus dem Honigtau der Pflanzen, die mit D,L-Phe gefiittert wurden. D-PheHT = Phe aus dem Honigtau der Pflanzen, die mit D-Phe geffittert wurden. Expt. Nr.

Eingesetztes Pr~parat

1 2

Ipm

% D-Phe

L-Phe

185 54

66 86

34 14

566 473

349 49

62 91

38 9

2472 2750

2231 105

53 96

47 4

im Phe

im C02

D,L-Phe~T D-PheHT

358 299

D,L-Phe~T D-PheHT

Authent. D,L-Phe Authent. D-Phe

aktivit~ten der Honigtauproben beeintr~chtigt. Immerhin zeigen die Daten eindeutig, dab D-Phe in den Siebr6hren transportiert wird. I m Honigtau der mit D,L-Phe versorgten Pflanzen l~tl~t sich deutlich mehr D- als L-Phe nachweisen. Ob dieser Befund allerdings das tats~ehliehe D,L-Verhi~ltnis in der SiebrShre wiedergibt, ist fraglich. Denn es mug damit gerechnet werden, da6 die Blattl~nse einen Teil des L-Phe selbst verwerten. Versuche, die L~use mit einer Di/itlSsung unter Zusatz yon D,L-Phe-I-~4C kfinstlieh zu ern/s sehlugen fehl. Die yon uns verwendete L/~useart lieferte unter diesen Bedingungen keinen ttonigtau.

220 EscgRictt und HAlCTMAI~N: Translokation und Verhalten yon D-Phenylalanin Eine andere Blattlausart, Neomyzus circum/lexus, die sich leicht kfinstlieh erni~hren lgBt, produziert bei Fiitterung yon D,L-Phe-I-~aC ttonigtau, in dem das Verh~ltnis der optischen Antipoden des markierten Phe merklich zugunsten der D-Form verschoben ist.

3. Nachweis von IY-Malonyl-D-Phe Wie bereits in der Einleitung mitgeteflt wurde, kSnnen D-Aminos~uren in der hSheren Pflanze mit Malonsaure N-acyliert werden. Besehrieben wurde diese Reaktion fiir D-Tryptophan (ZE~K und SCH~F, 1963, 1964) und D-Methionin (K]sGL~vIc et al., 1968). Nach AbschinB unserer Experimente berichteten Rosa und N~ISH (1968), dab eine Reihe weiterer D-Aminos~uren (Valin, Leucin, Isoleuein, Tyrosin, Alanin, Glutamins~ure und auch Phenyla]anin) mit Malonss N-aeyliert werden kSnnen. Die Malonylierung yon D-Aminos~uren scheint demnach bei hSheren Pflanzen in einer ~hnlich unspezifischen Reaktion katalysiert zu werden, wie dies bei niederen Pflanzen ffir die N-Aeetylierung yon D-Aminoss bekannt ist (u. a. SCH•ITT und ZS,NK, 1968). Aueh bei unseren Versuehen land sich in w~Brigen alkoholisehen Extrakten yon Blattern, auf die D,L- oder D-Phe-I-14C aufgetragen worden waren, neben freiem Phe eine radioaktive Substanz, deren Identiti~t mit Malonyl-D-Phe-l-14C in folgender Weise gesiehert wurde. Die Blattextrakte wurden fiber Amberlite-Si~ulen fraktioniert. Die neutrale Fraktion I enthielt keine Radioaktiviti~t, die basisehe Fraktion I I nur markiertes Phe und die S~urefraktion I I I die oben erwi~hnte Substanz, bei der es sieh demnaeh um eine organisehe S~ure handeln muBte. l~-Malonyl-Aminosauren werden bei Temperaturen fiber 100~ leieht thermiseh decarboxyliert, hierbei wird die freie Carboxylgruppe der Malonss abgespalten, so dab die entspreehende N-Acetyl-Aminosiiure entsteht (Good und ASD~EA]~, 1957). In einem entsprechenden Versuch wurde ein aliquoter Tell der Fraktion I I I auf die Startlinie einer Dfinnschichtplatte aufgetragen und die Platte 40 min auf 150~ erhitzt. Naeh dem Abkfihlen wurde auf den erhitzten Startfleck zusgtzlich inaktives authentisches N-Aeetyl-D-Phe aufgetragen, sowie als Vergleiehsflecken daneben ein weiteres Aliquot der Fraktion III, D,L-Phe-I-~4C und authentisehes N-Aeetyl-D-Phe. Abb. 5 zeigt die Autoradiographie des entwiekelten Chromatogramms. Dutch Sprfihen mit Bromkresolgrfin wurde das inaktive Acetyl-Phe siehtbar. Es zeigt den gleiehen Rf-Wert wie die beim Erhitzen aus dem vermutliehen Malonyl-Phe entstandene radioaktive Substanz. Die gleiehe Ubereinstimmung ergab sieh, wenn das Chromatogramm in einem anderen FlieBmittelsystem entwiekelt wurde (Abb. 6). Weiterhin wurde ein Tell der Fraktion I I I sauer hydrolysiert (16 Std mit 6N HC1). Das ttydrolysat wurde fiber Amberlite gereinigt. Itierbei

Abb. 4--8. Autoradiographien yon Diinnschichtchromatogrammen. Abb. 4. Honigt~u yon Blattl~usen, die an den Pflanzen der Abb. 1--3 gesaugt hatten. A 2q~ch Applikation yon 1-I14C0~ (ZA markierte Photosyntheseprodukte; Zucker llnd Aminos~Luren); B nach Applikation yon D,L-Phe-l-14C; U nach Applikation yon D,Phe-l-14C. FlieBmitteh D 1; Exposition: 7 Tage bei 20~ Abb. 5 u. 6. Auftrenhung der S~urefraktion yon B l a t t e x t r a k t e n nach 24stiindiger I n k u b a t i o n mit D,L-Phe-I-I*C. A Analyse; vor dem Entwiekeln 40 rain auf 150 ~ C erhitzt; mit zus~tzlich aufgetragenem inaktivem Ac-Phe. B Analyse; nieht erhitzt. C. Authentisches D,L-Phe-I-I*C. D Authentisches inaktives Ac-Phe. Abb. 5. Fliel]mittel D2. Abb. 6. FlieBmittel D 1. Exposition: 7 Tage bei 20 ~ C. dc-19he N-Acetyl-Phenylalanin; Mal-Phe ~-Malonyl-D-Phe-l-14C. Abb. 7 u. 8. Auftrennung der E x t r a k t e junger, m i t L- u n d D-Phe-IA4C behandelter BlOtter. Abb. 7. Analyse der Aminos~urefraktion. Abb. 8. Analyse der Sgurefraktion. A Authentisches D,L-Phe-I-~4C; B Analyse ,,D-Phe-l-14C"; C Analyse ,,L-Phe-IA~C". Fliel~mittel D 1. Exposition: 7 Tage bei 20 ~ C

222

W. Eseg~eg und T. ~r~ART~C~ANN:

t r a t praktisch die gesamte Radioaktivits in der Aminos~urefraktion auf. Bei der ehromatographischen Analyse lieB sich nur ein radioaktiver Fleck nachweisen, dessen Identit~t mit Phe durch Vergleichschromatographie in mehreren Flie{~mitteln gesichert wurde. Die enzymatische Analyse des durch Hydrolyse erhaltenen Phe ergab mindestens 95 % reines D-Phe. Damit darf als sieher gelten, da[t es sich bei der in Fraktion I I I auftretenden radioaktiven Substanz um N-Malonyl-D-Phe-l-~C handelt.

4. Syntheseorte von N-Malonyl-D- Phe Extrahiert man das 3. Prim~rblatt der mit D,L-Phe~ 1-14C behandc]ten Pflanzen (vgl. Abb. 2), so finder sich neben sehr wenig ~reiem Phe eine relativ grol~e Menge N-Malonyl-D-Phe. Desgleichen enthalten Stenge] und Seitenwurzeln die Malonylverbindung. Die Synthese dieser Subst~nz ist also nicht auf den Applikationsort beschr~tnkt, sondern sic finder offensichtlich in alien Teilen der Pf]anze start. Ein Transport des Malons~turekonjugats in den SiebrShren kann ausgesehlossen werden, da im Honigtau stets nur freies Phe zu linden war. Theoretisch bestand allerdings die M5glichkeit, d~l~ N-Malonyl-D-Phe im Darmtr~kt der Blattl~use gespa]ten wurde. Zur Prfifung dieser Frage versuchten wir chromatographisch gereinigtes N-Malonyl-D-Phe-lM14C mit einer Di~tlSsung an Blatt]~use (Neomyzus circum]lexus) zu verffittern. Die Tiere verweigerten jedoch die Nahrungsaufnahme und starben. Aul~erdem wurden einige Pflanzen fiber das aufgerauhte 1. oder 3. Prim~rblatt mit N-Malonyl~D-Phe-l-14C versorgt. Der Stoff wurde weder im Blattgewebe verteilt noch in die SiebrShren aufgenommen, denn Blattls die an der Unterseite des Auftrageblattes saugten, lieferten nur inuktiven Honigtau. Diese Befunde zeigen eindeutig, dal~ N-Malonyl-D-Phe ausschliel~lieh im Parenchym gebildet wird; tritt es in grSBerer Entfernung yon der Applikationsstelle des Phe auf, so kann es erst nach Austritt des transportierten D-Phe aus der SiebrShre im benaehbarten Parenchym synthetisiert worden sein. 5. Biochemisches Verhalten yon D- und L-Phe Junge Vicia ]aba-Pflanzen, deren 1. Prim~rblatt gerade roll entf~ltet war, wurden iiber ein Bl~ttchen des 1. Prim~rblattes entweder mat 2,5 ~c D- oder mit 2~ ~c L-Phe-l-~4C versorgt. Die absoluten Mengen an Phe, die auf das jeweilige Bl~ttcben gebracht wurden, waren beim D-Phe 8,3 ~g0 beim L-Phe 28 ~g. Nach 24 Std wurden die Auftragebl~tter abgeschnitten und extrahiert; dann liel~en wir die Pflanzen 2 Tage weiterwachsen. Die B1/~ttchenextrakte wurden fiber Amberlites~ulen fraktioniert. Die Fraktionen I waren inaktiv. Autoradiographien yon Chromatogrammen

Translokation und Verhalten yon D-Phenylalanin

223

der Fraktionen I I und I I I zeigten folgendes (Abb. 7 und 8); die mit D-Phe behandelten B1/~ttehen enthielten sowohl freies Phe als aueh N-Malonyl-D-Phe mit radioaktiver Markierung. I m E x t r a k t betrug das Verhgltnis Phe:N-Malonyl-Phe = 1:2. Dagegen war das L-Phe im /ithanohsehen B1/~ttehenextrakt nieht wiederzufinden, u n d e s t r a t a u e h nieht als Malonylverbindung auf. Die gesamte L-Phe-Radioaktivit/it der B1/~ttehen befand sieh im unlSslichen Riiekstand. Von den Autoradiographien der Pflanzen, die 2 Tage naeh Entfernen der Auftragebl/~ttchen eingefroren worden waren, blieben die der L-Phe-Pflanzen weig, die der D-Phe-Pflanzen zeigten geringe Sehw~rzungen fiber dem Stengel unterhalb der Insertionsstelle des 1. Prim/trblattes. Dieser Versueh zeigt, dab L-Phe in relativ jungen Blgttern vollst/~ndig eingebaut wird, offenbar in Protein. Ferner best/ttigt der Versueh noehmals, da$ nur D-Phe mit Malons/~ure zn N-Malonyl-D-Phe aeyliert wird. Werden mit D-Phe behandelte Blgtter mit heil~em Wasser und Athanol extrahiert, so enth~lt der Rtiekstand praktiseh keine Radioaktivit/it. Damit konnten wit, wie erwartet, feststellen, dab D-Phe nieht in Protein oder andere unl6sliehe Stoffe eingebaut wird. Bei einem weiteren Versueh benutzten wit /iltere Pflanzen, deren 3. Primgrbl~tter noeh nieht ausgewaehsen waren. Wieder wurde ein B1/ittehen des 1. Prim/~rbla%es mit D- bzw. L-Phe-l-~aC behandelt. Die Pflanzen blieben 2r Std im Lieht stehen. Dann entfernten wit die Auftrageblgttehen und froren zum gleiehen Zeitpunkt je eine Kontrollpflanze (K in Abb. 9 und 10) ein. Die fibrigen Pflanzen ohne Auftragebl/ittehen enthielten also nur diejenige Menge an radioaktivem Material, die w~hrend der 24stiindigen Pulsmarkierung aus den Auftragebl/~ttehen exportiert worden war. 2 Tage sp/iter wurden aueh diese Pflanzen eingefroren. Ihre Autoradiographien (Abb. 9 und 10) zeigen, dag das Blgttehen der L-Phe-Pflanze in 24 Std mehr radioaktives Material exportiert hatte als das der D-Phe-Pflanze. Dieser Befund entsprieht also ungef/~hr dem in Abb. 2 und 3 dargestellten Ergebnis. Die naeh dem Entfernen der Phe-Quelle neu hinzugewaehsenen Teile sind bei den L-Phe-Pflanzen deutlieh gesehw/irzt (Abb. 9, L), bei den D-Phe-Pflanzen blieben sie weig (Abb. 10, D). Blattl~use, die bei einem Parallelversueh an die neu hinzugewaehsenen Pflanzenteile (4. Blatt) angesetzt wurden, lieferten nur bei den L-Phe-Pflanzen sehwaeh markierten I-Ionigtau; die Siebr6hren der D-Phe-Pflanzen waren frei yon RadioaktivitKt. Diskussion

Die vorgelegten Ergebnisse zeigen, dab D-Phe vom Blattgewebe der Vicia [aba-Pflanzen genauso aufgenommen wird wie L-Phe, und dab beide optischen Antipoden in den SiebrShren tranportiert und auf diesem

224:

W. ESCHR~eH und T. HARTNANN:

s

\

i

h~

o .

,~x~-

i

N 4~

~o

~~d.~=

L

i

7:

~, ~,t o ~

y

~t

,j/,

6D

"

Translokation und Verhalten von D-Phenylalanin

225

Wege in der Pflanze verteilt werden k6nnen. I m Parenchym werden L- und D-Phe - - wie zu erwarten - - in unterschiedlicher Weise metabo]isiert. D-Phe wird a]s N-Malonat festgelegt, wghrend L-Phe in den Eiweigstoffweehsel einflieBt. Ob und in welehem Umfang gleichzeitig ein Abbau der beiden Isomeren stattfindet, lgBt sich mit den in unseren Versuehen verwendeten carboxylmarkierten Tracern nicht entscheiden. Die Bildung yon N-Ma]onyl-D-Phe scheint ein irreversibler ProzeB zu sein. Ein Transport dieser Verbindung im Phloem ist nieht mSglieh. KEGLEVIC et al. (1968) bezeichnen die N-Malonylierung yon D-Aminos&uren als ,,Entgfftungsreaktion". Ob dieser Begriff glfieklieh gew/~hlt ist, mag dahingestellt bleiben; der siehere Naehweis der ,, Giftigkeit" von D-Aminos/~uren ffir die hShere Pflanze steht noeh aus. KIczurI~ und ALDAG (1967) konnten im Gegenteil dureh Dfingung mit versehiedenen D-Aminosguren bei Lolium eine deutliehe Ertragssteigerung erzielen. Der ungehinderte Phloemtransport yon D-Phe und der Befund von SCJ~ErF~a et ah (1967), dab Sterilkulturen yon Helianthus annuus L. D-Aminosauren leicht fiber die Wurzel aus dem N&hrsubstrat aufnehmen kSnnen, erkli~rt vielleieht das natfirliche Vorkommen yon N-MalonylD-tryptophan ( Z ~ K und ScJ~RF, 1963) und den Malonaten anderer D-Aminosguren (I~osA und Nv~ISH, 1968) in versehiedenen Blfitenpflanzen. Die entspreehenden, dutch mikrobiellen Abbau im Boden entstandenen D-Aminos~uren kSnnten yon der Pflanze akkumuliert, verteilt und als Malonat festgelegt worden sein. An junge, noeh nieht ausgewachsene BlOtter yon Vicia ]aba-Pflanzen verfiittertes L-Phe gelangt nieht in das Phloem, sondern wird an Ort und Stelle im B]att eingebaut. Ans <eren Bl&ttern wandert es zu einem Tefl aus und wird in den Siebr6hren zu den Waehstumszentren transportiert. D-Phe wird dagegen auch in jungen Bl&ttern nur z.T. mit Malons&ure acyliert, ein erheblieher Tell wird im Phloem exportiert, wandert in andere Teile der Pflanze und wird dort erst naeh Austritt aus den SiebrShren als Malonat festgelegt. Die in unseren Versuchen mit dem Tracer auf das Blatt gebrachten absoluten Phe-Konzentrationen waren sehr gering (L-Phe 28 ~g; D-Phe 8,3 ~g), so dab bei der Applikation an junge B]/~tter mit sehr aktivem Baustoffweehsel die angebotene Aminosi~ure vollstgndig in den Aminos/~urestoffweehsel einbezogen wird. Wird der Tracer durch ,,Verdfinnen" mit nicht markiertem L-Phe in h6herer Konzentration geboten und damit der Proteinstoffwechsel des Blattes mit Phe ,,fibers~ttigt", l&Bt sich aueh bei jungen Bliittern ein Phe-Export erreichen (HARTMANNund ESCHI~ICI~, unver6ff.). Dieser Befund ist yon Wichtigkeit, wenn bei Translokationsversuchen mit Aminos/~uren die Racemate verwendet werden. Bei der Deutung solcher Ergebnisse so]lte immer das unterschied]iehe bioehemisehe Verhalten der

226

W. Esc/~I~ICI-Iund T. HA~TMANN:

p r o t e i n o g e n e n L - F o r m u n d d e r n i c h t p r o t e i n o g e n e n D - F o r m berficksichtigt werden. Die Deutsche Forschungsgemeinschaft und das Landesamt f/Jr Forschung (NRW) haben unsere Untersuehungen dureh Gewghrung yon Sachmitteln unterstiitzt. Herrn Prof. Dr. M. ZE~;, Mfinehen/Bochum, danken wir fiir wertvolle Ratschl~ge. Herr Dr. P. Em~a~DT, Bonn, war so freundlich, die Versuehe zur Ern~hrung der Blattlguse mit kfinstlicher Digt fiir uns auszufiihren. Fraulein ROSWITgA BIYRCI-IARDT und Frau INaE LACtIMANN hMfen uns in dankenswerter Weise bei der Durchffihrung der Versuehe.

Literatur BOL~I, K. K. : Absorption und Transport markierter Aminos~uren durch Wurzeln yon Zea mays. Ber. schweiz, hot. Ges. 77, 61--102 (1967). BOULANCEn, P. u. •. OSTaEUX: D-Aminos~uren. In: I-I. U. BER~MEY~.R,~ethoden der enzymatischen Analyse. Weinheim/Bergstr. Verlag Chemic 1962. CAN~u M. J., and 1K. J. As~;~AM: Physiological inferences from the evidence of translocated tracer: a caution. Ann. Bot. 31, 403--416 (1967). CRAFTS, A. S. : Bidirectional movement of labeled tracers in soybean seedlings. Hilgardia 37, 625--638 (1967). Em~HA~D% P. : Der Vitaminbedarf einer siebr5hrensaugenden Aphide, Neomyzu8 circumflexus BucI~T. (I-Iomoptera, Inseeta). Z. vergl. Physiol. 60, 416--426 (1968). Escm~rc~, W. : Translokation l~C-markierter Assimilate im Licht und im Dunkeln bei Vicia/aba. Planta (Berl.) 70, 99--124 (1966). - - Translokation aromatischer Verbindungen bei Vicia /aba. 4. Konf. Ges. Biol. Chem.: Biochemie der Phenolk6rper. Feldafing: Farbenfabriken Bayer 1967. - - T r a n s l o k a t i o n radioaktiv markierter Indolyl-3-essigs~ure in SiebrShren yon Vicia/aba. Planta (Berl.) 78, 144--157 (1968). - - u . M. S~EINE~: Autoradiographische 'Untersuchungen zum Stofftransport bei Polytrichum commune. Planta (Berl.) 74, 330 349 (1967). Gooo, N . E . , and W. A. ANI)RI~AE: Malonyltryptophan in higher plants. Plant Physiol. 32, 561--566 (1957). HAI~T~IAN~r, T. : t3ber eine Leueindecarboxylase aus Meeresalgen. Ber. dtsch, bot. Ges. 80, 738--740 (1967). HEYs~R, W. : Das Phloem yon Tradescantia albi/lora. Diss. Bonn, Math.-Nat. Fak. 1968. KEGL~WC, D., B. LAD~SIC, and M. POKOR~u Biochemical studies in tobacco plants. IV. N-Malonylmethionine, metabolite of D-methionine in Nicotiana rustica. Arch. Biochem. 124, 443--449 (1968). KICKUTH, ~. U. ~. ALDAG: Einwirkung yon D-Aminos~uren auf Kulturpflanzen. Angew. Bot. 39, 165--175 (1967). ROSA, N., and A. C. NEIS~: Formation and occurrence of N-malonyl-phenylalanine and related compounds in plants. Canad. J. Biochem. 46, 737--806 (1968). SC~EFFER, F., R. KICKU~ u. R. Au)A~: Die Aufnahme nichtproteinogener Aminos~uren durch h6here Pflanzen. Agrochimica 11, 485--497 (1967).

Translokation und Verhalten yon D-Phenylalanin

227

SCHMITT, J. H. u. M. H. ZENK: Anftrennung m~rkierter DL-Aminos/iuren in ihre optischen Antipoden durch enzymatisehe Acetylierung. Proc. II. Intern. Conf. Methods of preparing and storing labelled compounds, Brussels, p. 305--316 (1966). --Determination of D-amino acids by stereospecific enzymic acetylation. Analyt. Biochem. 23, 4 3 3 ~ 1 (1968). Z ~ K , M. H. u. H. Sc~nRr: D-Tryptophan in hSheren Pflanzen. Bioehim. biophys. Acta (Amst.) 71, 737--738 (1963). - - - - Verbreitung der D-Tryptoph~n-Konjugationsmechanismen im Pflanzenreich. Planta (Berl.) 62, 350--354 (1964). Prof. Dr. W. Esen~ieH, Dr. T. ttAI~T~rA~ Pharmakognostisches Institut der Universit~t 53 Bonn, NuBa]lee 6