41
Zeitaufgelöste Laserfluoreszenzmikroskopie von Hämatoporphyrin-Derivat in vivo J. Feyh', A. Goetz ,
1-I.
Schnec/zenhurger , W. Muller', E. Kastenbauer'
Klintk und Pohkiinik fur Hats Nasen Ohrenkranke, K1,nikurn GroIhadern, UniversitltMunchen
Jnsntut fur Chirurgische Forsehung, Klinikuni Grof0iadern, Univcrsitar Mflnchen Fachhochschule Aalen, Beethovenstraile 1, 70S0 Aalen
Die zeitaufgeloste Laserfluoreszenzmikroskopie steilt em exaktes Verfahren zur quantirativen Be-
stimmung der HpD-Fluoreszenz in vivo dar. Das Ziel dieser Arbeit war die Messung der Verteilung von Hamatoporphyrin-Derivat im Tumor gegenuber dern urnciliegenden Normalgewebe bei l0Versuchstieren nen Zeitraum von 8Tagen. Darüber hinaus wurde die unterschiedliche Aufnahrne von HpD in verschiedenen Tumorsubkompartimenten gemessen. Die HpD-Fluoreszenz im Tumor zeigte Maximaiwerte 5 bis 9 Stunden nach intravenöser Applikation. Das Verhàltnis Tumor/ nimorumliegendes Normalgewebe zu diesem Zeitpunkt war 3 bis 8. Drei Tage nach i.v.-Gabe von HpD waren die Fluoreszenzwerte in beiden Geweben annãhernd gleich. Zwischen TagS und Tag8 wurde eine Zunahme der HpD-Konzentration zugunsten des Tumorgcwebes bei 50 % der Versuchstiere gernessen. Vergleichende Fluoreszenzmessungen im Tumorzentrum und Tumorrandbereich zeigten eine deutlich bevorzugte Aufnahme von HpD im Tumorrandbereich. Vermutlich ist diese bevorzugte Aufnahme von HpD im Tumorrandbereich dem tumorumliegen den Odem zuzuordnen und Ausdruck einer Extravasation von Hamatoporphyrin-Deri-
Time-Resolved Laser Fluorescence Microscopy of Hematoporphyrin Derivative in Vivo
Laser-assisted fluorescence microscopy proved a powerful method for quantitative in vivo mea-
surement of HpD fluorescence. Therefore the aim of the present work was to study the distribution of HpD in tumor vs. adjacent tumor-free tissue of 10 animals over a period of 8 days. We measured additionally the differences in HpD uptake in different tumor subcompartments. In tumor tissue HpD fluorescence showed maximum values 5—9 hours after i.v. application of the drug. The relation tumor/tumor-free tissue at that time was about 3—8. The third day of examination showed nearly identical values for both tissues. Between dayS and day8 we found an increase of HpD contents in tumor vs. normal tissue in 50 % of the examined animals. Comparative measurements in the tumor centre and the tumor edge showed a preferential uptake of HpD in the tumor edge area. Probably the higher retention of HpD in this area is due to the oederna zone surrounding the tumor and to extravasation of HpD.
vat.
Einleitung
Trotz des verbreiteten, klinisch experimentellen Einsatzes von Hãmatoporphyrin-Derivat (HpD) als tumorselektiven Photosensibilisator bleiben die Mechanismen, die zu einer bevorzugten Aufnahme des Fluochroms in malignem Gewebe führen, weitgehend unbekannt. Berichte verschiedener Autoren (Chang, Dougherty, 1978; Henderson und Mitarb., 1983; Berns und Mitarb., 1983) weisen darauf hin, daI Hamatoporphyrin-Derivat bevorzugt von neoplastischen Zellen gegenuber Normaizellen aufgenommen wird. Darauf aufbauend ist es von Bedeutung, für die photodynamische Therapie die Aufnahme, Retention und Freisetzung von Hämatoporphyrin-Derivat im Laryngo-Rhino-Otol. 70 (1991) 41—44 Georg Thieme Verlag Sturtgart New York
Tumor gegenuber dem turnorumliegenden Normalgewcbe zu messen sowie Unterschiede der HpD-Verteilung in den Subkompartimenten des Tumors zu untersuchen. In den vergangenen Jahren wurde eine beachtliche Anzahl von Arbeiten vorgelegt (David Kessel, yearly review, 1984), die sich indirekter Methoden zur Bestimmung der HpD-Konzentration in Tumor- und anderen Geweben bedienten. Bislang war es jedoch nicht moglich, HpD in vivo anhand seincr Fluoreszenz an identischen Tumor- und Normalgeweeinen Zeitraum von rnehreren Tagen kontinuierben lich zu messen. Dies beruht vornehmlich darauf, dal HpD einerseits eine sehr schwache Fluoreszenz mit Maxima bei 630 und 690 nm zeigt sowie bei Anregungslichtleistung grö1er als 50mW/cm2 em rasches Ausbleichen der Fluoreszenz zeigt (Schneckenburger und Mitarb., 1987). Weiterhin mu zur quantitativen Messung von der Hamatoporphyrin-Derivat-Fluoreszenz eine spektrale Trennung der vom Gewebe herrflhrenden Autofluoreszenz erfolgen.
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Zusammenfassung
J. Feyh und Mitarb.
42 Lai-yngo-Rhino-Otol. 70 (1991) Abb1
Schematischer Aufbau zur zeitaufgelosten Laserfluoreszenzmikroskopie. [in Argonlaser erzeugt in einem Farbstofflaser einen Laserstrahl der Wellenlange 420nm, dessen Pulsrate 80kHz betragt. Uber einen haibdurchiassigen Spiegel wird der Laserstrahl geteilt. [in Teil des Strahies tritt in das Fluoreszenzmikroskop em, trifft auf die Probe auf und lost Fluoreszenzphotonen aus, die von einem Photomultiplier detektiert werden und einem Zeit-Spannungs-Konverter zugeleitet werden. Der andere Teil des Strahles wird direkt dem Zeit-Spannungs-Konverter zugeleitet. Die Laserlichtleistung wird Uber eine Photodiode permanent gemessen.
AAA 82 MHz
Fluoreszenz—
Modengekoppeiter
mikroskop
Argoc—Laner ( 364 rim
Abb.2 Messung der HpD-Fluoreszenz m
lI 0
TUMORGEWEBE S
a 0.
NORMALGEWEBE A
DETEKTIONSBEREIGH 610-690 rim
LSJ 0
Tumor- und Normalgewebe eines Versuchstieres uber den Versuchszeitraum von 8Tagen im Detektionsbereich 650nm±4Onm. Die Rotfluoreszenz von HpD war 5—9 Stunden sowie 80—l4OStunden nach i.v-Gabe von HpD erhbht.
0
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12
0 10 0. a,
C,
C a,
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U-
2
Material und Methode In Pentobarbitalnarkose (50 mg/kg KG) wurden rransparen te reflonbeschichtete Aluminiumkammern in die dorsale Rückenhautfalte Syrischer Goldhamster implantiert. Weiterhin wurden zwei Polyethylendauerverweilkatheter in die rechte Arteria caroOs communis sowie die Vena jugularis interna mikrochirurgisch cmgebracht. 48 Stunden nach dem Eingriff wurden, soweit die Kaminerpräparation die Kriterien für eine intakte Mikrozirkuiation tra-
fen, 4—8 x 10 Zellen des amelanotischen Harnstermelanornes (A-niel-3) in das Zentrum der Präparation inokuliert. Für die darauf folgenden Tage wurden die Tiere bei 38°C in einem Inkubator gehalten. 4—STage nach Tumorzellinokulation zeigten die Turnoren
cinen durchschnittlichen Durchmesscr von 3—4mm. Zu diescm Lcirpunkt war das für diesen Tumor typische chaotische GefäLnetzwerk vollstãndig etabiiert. Hãmatoporphyrin-Derivat (Photofrin II, Photomedica Inc., New York) wurde intravenbs in einer Dosierung von 5mg/kg KG verabreicht. Der Aufbau der zeitaufgelOsten Laserfluoreszenzrnikroskopie ist in Abb. 1 wiedergegeben und basiert auf einern synchron gepumpten Farbstofflasersystem bei 420 nm mit einer Puls-
dauer von lOps und einer Wiederhoiungsfrequenz von 80k1-Iz
(Schneckenburger, 1985). Die Kammerprãparation wurde im Fluoreszenzauflichtmikroskop durch den Farbstofflaserstrahl orthograd beleuchtet und die Fluoreszenz mit Hilfe eines Einzclphotonenzahlers detektiert. Die durchschnittliche Lcistungsdichte konnte mit diescm System bei 1 mW/cm2 limitiert werden. Damit wurde em Ausbleichen der Fluoreszenz ausgeschlossen. Die Fluoreszenz wurde in Feldern der GrOfe 400 x 400 jim im Tumor, Turn orrandbereich und tumorumliegenden Normalgewebe gemessen. Der Detektionsbereich für die einzelnen Fluoreszenzrnessungen war 610—690nrn und 660—740nrn bei Erfassung der beiden Fluoreszenzmaxima von Hamatoporphyrin-Derivat sowie 510—S7Onm zur Messung der Gewebsautofluoreszenz. Messungen wurden jeweils vor Gabe von HpD (Kontrolle) und anschlic1end alie 60Minuten am ersten Tag sowie jeweils eine Mcssung an den folgenden 7Tagen durchgeführt.
Ergebnisse
Der zeitliche Verlauf der Fluoreszenzintensitäten (610—690nm) im Tumor gegenüber dem tumorumliegenden Gewebe ist für em einzelnes Versuchstier in Abb. 2 wiedergegeben. Die Fluoreszenzwerte wurden durch Subtraktion der in dem Bereich vor Gabe von HpD gemes-
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Gewebe
Zeitaufgeloste Laserfluoreszenzrnikrosko pie
Laryngo-Riiino-OtoI. 70 (1991) 43 Abb.3 HpD-Fluoreszenzintensif9t in Tumor-
F 89
20 000
•—•
Tumorgewebe
•
Tumorrand
zentrum und Turnorrandbereich eines Vet suchstieres Uber den Versuchszeitraum von 192 Stunden im Detektionsbereich von 650 nm 40 nrn. HpD reichert sich zwischen dot 4. und 9. Stunde rn Tumorrandbereich urn einen Faktor 1 0—i ,5 stbrker als im Turnorzentrum an.
0
24
10
48
72
96
120 144 168 190
[h
Abb.4 Verhaltnis der HpD-Fluoreszeriz rn
[Ratio]
Tumor gegenOber dern umriegenden Normalgewebe für n = 1 OTiere Ober einen MeBzeitraurn von 192 Stunden. Eine signifikant erhöhte Tumorselektivitbt von HpD wird zwischen dot fOnften und neunten Stunde nach iv. Applikation gemessen (Friedman Test).
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120 144 166 192 Zeit [h]
senen Autofluoreszenz korrigiert. Die Autofluoreszenz den Gesamtzeitraum der Messungen von selbst lag 510—S7Onm konstant und diente als Kontrolic. 6Stunden nach intravenöser Gabe von HpD zeigt das Tumorgewebe eine maximal selektive Aufnahmc des Photosensibilisators gegenüber dem umliegenden normalen Gewebe. Das Verhältnis Tumor/Normalgewebe zu diesem Zeitpunkt betrug 3—8. Eine zweite tumorselektive Akkumulation von HpD wurde 5—8lagc nach i.v. Gabe gemessen, konnte jedoch nur bci 50 % der Versuchstiere rcproduziert werden. In Ahb. 3 sind die Gesamtfluorcszenzintensitiiten im Verhãltnis ihrer Fluoreszenzintensitäten von Tumor zum umliegenden Normalgewebe für lOVersuchstiere wiedergegeben. Alle Tumoren zeigten eine maximal selektive Anreicherung von HpD 5—9Stunden nach i.v. Applikation. Das Verhältnis Tunior/umliegendes Normalgewebe war 3—8 zu diescm Zeitpunkt. Das Maximalverhältni s Turn or/umliegendes Normalgewebe fand sich bci allen 10 Versuchstiercn 6Stunden nach i.v. Gabe von HpD.
In Abb. 4 ist der zeitliche Verlauf der HpDFluoresLenLlntensität für das Tumorzentrurn gegenüber dem Tumorrandbereich dargesteilt. Die heiden Tumorsubkompartirnente retinieren Hamatoporphyrin-Derivat mit der gleichen zeitabhangigen Dynamik, jedoch mit einem
quantitativen Unterschied vom Faktor 2.
Diskussion Die Kombination der zeitaufgelosten Laserfluoreszenzrntkroskopie mit dem amelanotischen Melanom
der Ruckenhautkammerprãparation des syrischen Goldhamsters (Endrich und Mitarb., 1980) erlaubt zum ersten Mal eine kontinuierliche quantitative Fluoreszenzdetektion der HpD-Fluoreszenz in vivo an identischen Tumor- und einen Zeitraum von 8Tagen. Normalgewebsarealen Die maximale tumorsclektive Retention von Hamatoporphyrin-Derivat in Tumorgewebe gegenuber dem umliegenden Normalgewebe 6Stunden nach intravenöser Applikation von Hämatoporphyrin-Derivat steht in teilweiser Uber-
einstimmung mit anderen Arbeiten, bei dcnen Hãmato-
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5
J. Feyh
und Mitarb.: Zeitau/gelosteLaser/luoreszenzrnikroskopie
Literatur
porphyrin-Derivat indirekt in verschiedenen Geweben nachgewiesen wurde (Anghileri und Mitarb., 1976; Bugelshi und Mitarb., 1981). Eine zweite tumorselektive Anreicherung von Hlsmatoporphyrin-Derivat 5—8 Tagc nach Applikation des Photosensibilisators konnte für 500/s der Versuchstiere nachgewiesen werden. obwoh! alle Tumoren kei-
nen Unterschied in der Aufnahme, Retention und Clearence von HpD wdhrend der ersten S Tage des Mefzeitraumes zcigten. Diese zweite tumorselektive Anreicherung zu einem späten Zeitpunkt wurde erstmals im Rahmen dieser
Arbeit erhoben und bedarf weiterer Untersuchungen, da hieraus moglicherweisc Konsequenzcn im Hinblick auf zeitlich verzdgerte therapeutische Laserlichtapplikationen ergeben könnten. sich
Hinsichtlich der Verteilung von Hämatoporphyrin-Dcrivat in den cinzclnen Turnorsubkompartimenten Leigt sich tine hcvorzugte Aufnahme des Phorosensibilisators im Tumorrandbereich, der morphologisch dem physiologischerweise vorkommcnden Peritumorödem zuzuordnen ist. Möglicherweisc kommt die höhere Anreichc-
rung von Hdmatoporphyrin-Derivat in diesem Bereich durch eine Extravasation des Porphyrins durch die endothelialen Fenster der Tumorgefafe (Hammersen und Mitarb., 1983) zustande. Dieser bevorzugte Anreicherungsort dürftc jedoch in diesem den Tumor ernlshrenden Bereich em potcntie]les Ziei für die photodynamische Therapie im l-Iinblick auf cine vollstdndigc Tumorzerstorung scm.
Anghileri, L.J., M. Heidhreder, R Mathes. CO-Hcmatoporphyrin accumulation by experimental tumors. NucI. Mcd. 15 (4) (1976) 183—183
Berns, N. W., M. Hammer-Wilson, R.J. Walter, W. Wright, M.-H. Chow, M. Nahabedian, A. Wile.- Uptake and localization of HpD and active fractions in tissuc culture and in serially-biopsied human tumors. In: Porphyrin Localization and treatment of Tumors (Ed.: D. R. Doiron, C.J. Gomer). Alan R. Liss, New York 1984 Bugeiski, P.J., C. W. Porter, T.J. Dougherty: Auroradiographic distribution of hematoporphyrin derivative in normal and tumor tissue of the mouse. Cancer Res. 41(1) (1981) 4606—4610 Chang, C., T.J. Dougherty: Photoradiation therapy: kinetics and thcrmodynamics of porphyrin uptake and loss in normal and malignant cells in culture. Rad. Res. 74 (1978) 498—506 Endrich, B., K. Asaishi, A. Goetz, K. Messmer.- Technical report. A new chamber technique for microvascular studies in unancsthetizcd hamstcrs. Res. Exp. Mcd. 177(1980) 125—134 Goetz, A., B. Endrich, C. Laprell, K. Messmer: An experimental model
for prolonged studies of thc microcirculation. Bibi. Anat. 20 (1978)65 Hen derson, B. W., D. A. Belinie,; B. Zirling, T.J. Dougherty: Aspects of the cellular uptakc and retention of hcmatoporphyrin-derivative and their correlations with the biologic response to PDT in
vitro. In: Porphyrin Photoscnsitization (Ed.: D. Kesscl, T.J. Dougherty). Plenum Press, New York (1983) 279—292 Kessel, D.: Hcmatoporphyrin and HpD: Photopysics, Photochcmistry and Photorherapy, Yearly review. Photochcm. Photobiol. 39 (6) (1984) 85 1—859. Pergamon Press Ltd.. Schneckenburger, H.: Time-resolved microfluorescence in biomcdical diagnosis. Optical Engineering 24 (1985) 1024—1044 Schneckenburger, H., J. Eeyh, A. Goetz, M. Frenz, W. Brendel: Quantirative in vivo measurement of the fluorescent components of Pho tofrinll. Photochem. Photobiol. 46 (1987) 765—768
Dr.med. J. Feyh K.linik und Poliklinik fOr Hals , Nascn, Ohrenkrankc
Klinikum Grohadcrn
Marchioninistrajle 15 D—8000 München 70
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44 Laryngo-Rhino-Otol. 70 (1991)
Zeitaufgelöste Laserfluoreszenzmikroskopie von Hämatoporphyrin-Derivat in vivo J. Feyh', A. Goetz ,
1-I.
Schnec/zenhurger , W. Muller', E. Kastenbauer'
Klintk und Pohkiinik fur Hats Nasen Ohrenkranke, K1,nikurn GroIhadern, UniversitltMunchen
Jnsntut fur Chirurgische Forsehung, Klinikuni Grof0iadern, Univcrsitar Mflnchen Fachhochschule Aalen, Beethovenstraile 1, 70S0 Aalen
Die zeitaufgeloste Laserfluoreszenzmikroskopie steilt em exaktes Verfahren zur quantirativen Be-
stimmung der HpD-Fluoreszenz in vivo dar. Das Ziel dieser Arbeit war die Messung der Verteilung von Hamatoporphyrin-Derivat im Tumor gegenuber dern urnciliegenden Normalgewebe bei l0Versuchstieren nen Zeitraum von 8Tagen. Darüber hinaus wurde die unterschiedliche Aufnahrne von HpD in verschiedenen Tumorsubkompartimenten gemessen. Die HpD-Fluoreszenz im Tumor zeigte Maximaiwerte 5 bis 9 Stunden nach intravenöser Applikation. Das Verhàltnis Tumor/ nimorumliegendes Normalgewebe zu diesem Zeitpunkt war 3 bis 8. Drei Tage nach i.v.-Gabe von HpD waren die Fluoreszenzwerte in beiden Geweben annãhernd gleich. Zwischen TagS und Tag8 wurde eine Zunahme der HpD-Konzentration zugunsten des Tumorgcwebes bei 50 % der Versuchstiere gernessen. Vergleichende Fluoreszenzmessungen im Tumorzentrum und Tumorrandbereich zeigten eine deutlich bevorzugte Aufnahme von HpD im Tumorrandbereich. Vermutlich ist diese bevorzugte Aufnahme von HpD im Tumorrandbereich dem tumorumliegen den Odem zuzuordnen und Ausdruck einer Extravasation von Hamatoporphyrin-Deri-
Time-Resolved Laser Fluorescence Microscopy of Hematoporphyrin Derivative in Vivo
Laser-assisted fluorescence microscopy proved a powerful method for quantitative in vivo mea-
surement of HpD fluorescence. Therefore the aim of the present work was to study the distribution of HpD in tumor vs. adjacent tumor-free tissue of 10 animals over a period of 8 days. We measured additionally the differences in HpD uptake in different tumor subcompartments. In tumor tissue HpD fluorescence showed maximum values 5—9 hours after i.v. application of the drug. The relation tumor/tumor-free tissue at that time was about 3—8. The third day of examination showed nearly identical values for both tissues. Between dayS and day8 we found an increase of HpD contents in tumor vs. normal tissue in 50 % of the examined animals. Comparative measurements in the tumor centre and the tumor edge showed a preferential uptake of HpD in the tumor edge area. Probably the higher retention of HpD in this area is due to the oederna zone surrounding the tumor and to extravasation of HpD.
vat.
Einleitung
Trotz des verbreiteten, klinisch experimentellen Einsatzes von Hãmatoporphyrin-Derivat (HpD) als tumorselektiven Photosensibilisator bleiben die Mechanismen, die zu einer bevorzugten Aufnahme des Fluochroms in malignem Gewebe führen, weitgehend unbekannt. Berichte verschiedener Autoren (Chang, Dougherty, 1978; Henderson und Mitarb., 1983; Berns und Mitarb., 1983) weisen darauf hin, daI Hamatoporphyrin-Derivat bevorzugt von neoplastischen Zellen gegenuber Normaizellen aufgenommen wird. Darauf aufbauend ist es von Bedeutung, für die photodynamische Therapie die Aufnahme, Retention und Freisetzung von Hämatoporphyrin-Derivat im Laryngo-Rhino-Otol. 70 (1991) 41—44 Georg Thieme Verlag Sturtgart New York
Tumor gegenuber dem turnorumliegenden Normalgewcbe zu messen sowie Unterschiede der HpD-Verteilung in den Subkompartimenten des Tumors zu untersuchen. In den vergangenen Jahren wurde eine beachtliche Anzahl von Arbeiten vorgelegt (David Kessel, yearly review, 1984), die sich indirekter Methoden zur Bestimmung der HpD-Konzentration in Tumor- und anderen Geweben bedienten. Bislang war es jedoch nicht moglich, HpD in vivo anhand seincr Fluoreszenz an identischen Tumor- und Normalgeweeinen Zeitraum von rnehreren Tagen kontinuierben lich zu messen. Dies beruht vornehmlich darauf, dal HpD einerseits eine sehr schwache Fluoreszenz mit Maxima bei 630 und 690 nm zeigt sowie bei Anregungslichtleistung grö1er als 50mW/cm2 em rasches Ausbleichen der Fluoreszenz zeigt (Schneckenburger und Mitarb., 1987). Weiterhin mu zur quantitativen Messung von der Hamatoporphyrin-Derivat-Fluoreszenz eine spektrale Trennung der vom Gewebe herrflhrenden Autofluoreszenz erfolgen.
Heruntergeladen von: NYU. Urheberrechtlich geschützt.
Zusammenfassung
J. Feyh und Mitarb.
42 Lai-yngo-Rhino-Otol. 70 (1991) Abb1
Schematischer Aufbau zur zeitaufgelosten Laserfluoreszenzmikroskopie. [in Argonlaser erzeugt in einem Farbstofflaser einen Laserstrahl der Wellenlange 420nm, dessen Pulsrate 80kHz betragt. Uber einen haibdurchiassigen Spiegel wird der Laserstrahl geteilt. [in Teil des Strahies tritt in das Fluoreszenzmikroskop em, trifft auf die Probe auf und lost Fluoreszenzphotonen aus, die von einem Photomultiplier detektiert werden und einem Zeit-Spannungs-Konverter zugeleitet werden. Der andere Teil des Strahles wird direkt dem Zeit-Spannungs-Konverter zugeleitet. Die Laserlichtleistung wird Uber eine Photodiode permanent gemessen.
AAA 82 MHz
Fluoreszenz—
Modengekoppeiter
mikroskop
Argoc—Laner ( 364 rim
Abb.2 Messung der HpD-Fluoreszenz m
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TUMORGEWEBE S
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NORMALGEWEBE A
DETEKTIONSBEREIGH 610-690 rim
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Tumor- und Normalgewebe eines Versuchstieres uber den Versuchszeitraum von 8Tagen im Detektionsbereich 650nm±4Onm. Die Rotfluoreszenz von HpD war 5—9 Stunden sowie 80—l4OStunden nach i.v-Gabe von HpD erhbht.
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C,
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Material und Methode In Pentobarbitalnarkose (50 mg/kg KG) wurden rransparen te reflonbeschichtete Aluminiumkammern in die dorsale Rückenhautfalte Syrischer Goldhamster implantiert. Weiterhin wurden zwei Polyethylendauerverweilkatheter in die rechte Arteria caroOs communis sowie die Vena jugularis interna mikrochirurgisch cmgebracht. 48 Stunden nach dem Eingriff wurden, soweit die Kaminerpräparation die Kriterien für eine intakte Mikrozirkuiation tra-
fen, 4—8 x 10 Zellen des amelanotischen Harnstermelanornes (A-niel-3) in das Zentrum der Präparation inokuliert. Für die darauf folgenden Tage wurden die Tiere bei 38°C in einem Inkubator gehalten. 4—STage nach Tumorzellinokulation zeigten die Turnoren
cinen durchschnittlichen Durchmesscr von 3—4mm. Zu diescm Lcirpunkt war das für diesen Tumor typische chaotische GefäLnetzwerk vollstãndig etabiiert. Hãmatoporphyrin-Derivat (Photofrin II, Photomedica Inc., New York) wurde intravenbs in einer Dosierung von 5mg/kg KG verabreicht. Der Aufbau der zeitaufgelOsten Laserfluoreszenzrnikroskopie ist in Abb. 1 wiedergegeben und basiert auf einern synchron gepumpten Farbstofflasersystem bei 420 nm mit einer Puls-
dauer von lOps und einer Wiederhoiungsfrequenz von 80k1-Iz
(Schneckenburger, 1985). Die Kammerprãparation wurde im Fluoreszenzauflichtmikroskop durch den Farbstofflaserstrahl orthograd beleuchtet und die Fluoreszenz mit Hilfe eines Einzclphotonenzahlers detektiert. Die durchschnittliche Lcistungsdichte konnte mit diescm System bei 1 mW/cm2 limitiert werden. Damit wurde em Ausbleichen der Fluoreszenz ausgeschlossen. Die Fluoreszenz wurde in Feldern der GrOfe 400 x 400 jim im Tumor, Turn orrandbereich und tumorumliegenden Normalgewebe gemessen. Der Detektionsbereich für die einzelnen Fluoreszenzrnessungen war 610—690nrn und 660—740nrn bei Erfassung der beiden Fluoreszenzmaxima von Hamatoporphyrin-Derivat sowie 510—S7Onm zur Messung der Gewebsautofluoreszenz. Messungen wurden jeweils vor Gabe von HpD (Kontrolle) und anschlic1end alie 60Minuten am ersten Tag sowie jeweils eine Mcssung an den folgenden 7Tagen durchgeführt.
Ergebnisse
Der zeitliche Verlauf der Fluoreszenzintensitäten (610—690nm) im Tumor gegenüber dem tumorumliegenden Gewebe ist für em einzelnes Versuchstier in Abb. 2 wiedergegeben. Die Fluoreszenzwerte wurden durch Subtraktion der in dem Bereich vor Gabe von HpD gemes-
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Gewebe
Zeitaufgeloste Laserfluoreszenzrnikrosko pie
Laryngo-Riiino-OtoI. 70 (1991) 43 Abb.3 HpD-Fluoreszenzintensif9t in Tumor-
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Tumorrand
zentrum und Turnorrandbereich eines Vet suchstieres Uber den Versuchszeitraum von 192 Stunden im Detektionsbereich von 650 nm 40 nrn. HpD reichert sich zwischen dot 4. und 9. Stunde rn Tumorrandbereich urn einen Faktor 1 0—i ,5 stbrker als im Turnorzentrum an.
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Abb.4 Verhaltnis der HpD-Fluoreszeriz rn
[Ratio]
Tumor gegenOber dern umriegenden Normalgewebe für n = 1 OTiere Ober einen MeBzeitraurn von 192 Stunden. Eine signifikant erhöhte Tumorselektivitbt von HpD wird zwischen dot fOnften und neunten Stunde nach iv. Applikation gemessen (Friedman Test).
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senen Autofluoreszenz korrigiert. Die Autofluoreszenz den Gesamtzeitraum der Messungen von selbst lag 510—S7Onm konstant und diente als Kontrolic. 6Stunden nach intravenöser Gabe von HpD zeigt das Tumorgewebe eine maximal selektive Aufnahmc des Photosensibilisators gegenüber dem umliegenden normalen Gewebe. Das Verhältnis Tumor/Normalgewebe zu diesem Zeitpunkt betrug 3—8. Eine zweite tumorselektive Akkumulation von HpD wurde 5—8lagc nach i.v. Gabe gemessen, konnte jedoch nur bci 50 % der Versuchstiere rcproduziert werden. In Ahb. 3 sind die Gesamtfluorcszenzintensitiiten im Verhãltnis ihrer Fluoreszenzintensitäten von Tumor zum umliegenden Normalgewebe für lOVersuchstiere wiedergegeben. Alle Tumoren zeigten eine maximal selektive Anreicherung von HpD 5—9Stunden nach i.v. Applikation. Das Verhältnis Tunior/umliegendes Normalgewebe war 3—8 zu diescm Zeitpunkt. Das Maximalverhältni s Turn or/umliegendes Normalgewebe fand sich bci allen 10 Versuchstiercn 6Stunden nach i.v. Gabe von HpD.
In Abb. 4 ist der zeitliche Verlauf der HpDFluoresLenLlntensität für das Tumorzentrurn gegenüber dem Tumorrandbereich dargesteilt. Die heiden Tumorsubkompartirnente retinieren Hamatoporphyrin-Derivat mit der gleichen zeitabhangigen Dynamik, jedoch mit einem
quantitativen Unterschied vom Faktor 2.
Diskussion Die Kombination der zeitaufgelosten Laserfluoreszenzrntkroskopie mit dem amelanotischen Melanom
der Ruckenhautkammerprãparation des syrischen Goldhamsters (Endrich und Mitarb., 1980) erlaubt zum ersten Mal eine kontinuierliche quantitative Fluoreszenzdetektion der HpD-Fluoreszenz in vivo an identischen Tumor- und einen Zeitraum von 8Tagen. Normalgewebsarealen Die maximale tumorsclektive Retention von Hamatoporphyrin-Derivat in Tumorgewebe gegenuber dem umliegenden Normalgewebe 6Stunden nach intravenöser Applikation von Hämatoporphyrin-Derivat steht in teilweiser Uber-
einstimmung mit anderen Arbeiten, bei dcnen Hãmato-
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J. Feyh
und Mitarb.: Zeitau/gelosteLaser/luoreszenzrnikroskopie
Literatur
porphyrin-Derivat indirekt in verschiedenen Geweben nachgewiesen wurde (Anghileri und Mitarb., 1976; Bugelshi und Mitarb., 1981). Eine zweite tumorselektive Anreicherung von Hlsmatoporphyrin-Derivat 5—8 Tagc nach Applikation des Photosensibilisators konnte für 500/s der Versuchstiere nachgewiesen werden. obwoh! alle Tumoren kei-
nen Unterschied in der Aufnahme, Retention und Clearence von HpD wdhrend der ersten S Tage des Mefzeitraumes zcigten. Diese zweite tumorselektive Anreicherung zu einem späten Zeitpunkt wurde erstmals im Rahmen dieser
Arbeit erhoben und bedarf weiterer Untersuchungen, da hieraus moglicherweisc Konsequenzcn im Hinblick auf zeitlich verzdgerte therapeutische Laserlichtapplikationen ergeben könnten. sich
Hinsichtlich der Verteilung von Hämatoporphyrin-Dcrivat in den cinzclnen Turnorsubkompartimenten Leigt sich tine hcvorzugte Aufnahme des Phorosensibilisators im Tumorrandbereich, der morphologisch dem physiologischerweise vorkommcnden Peritumorödem zuzuordnen ist. Möglicherweisc kommt die höhere Anreichc-
rung von Hdmatoporphyrin-Derivat in diesem Bereich durch eine Extravasation des Porphyrins durch die endothelialen Fenster der Tumorgefafe (Hammersen und Mitarb., 1983) zustande. Dieser bevorzugte Anreicherungsort dürftc jedoch in diesem den Tumor ernlshrenden Bereich em potcntie]les Ziei für die photodynamische Therapie im l-Iinblick auf cine vollstdndigc Tumorzerstorung scm.
Anghileri, L.J., M. Heidhreder, R Mathes. CO-Hcmatoporphyrin accumulation by experimental tumors. NucI. Mcd. 15 (4) (1976) 183—183
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Dr.med. J. Feyh K.linik und Poliklinik fOr Hals , Nascn, Ohrenkrankc
Klinikum Grohadcrn
Marchioninistrajle 15 D—8000 München 70
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44 Laryngo-Rhino-Otol. 70 (1991)
