Z. Ern~.hrungswiss. 16, 92-97 (1977) 9 1977 Dr. Dietrich Steinkopff Verlag, Darmstadt ISSN 0044-264 X

Institut 1i~r Lebensmittelchemie der Bundeslorschungsanstalt 1fir Ern~ihrung, Karlsruhe

Thermische Inaktivierung und Lagerungsverhalten teclmologisch Mchdger Enzyme II. Lipase aus Geotrichum eandidum und Lipoxigenase aus Sojabohnen K. H. P a r k

und A. F r i c k e r

Mit 5 Abbildungen und 1 Tabelle (Eingegangen am 4. Februar 1977}

1.0. Einleitung Im Gegensatz zu Peroxidase, deren Inaktivierung sehr h~ufig zur Kontrolle des Blanchierprozesses benutzt wird, w u r d e die Hitzeinaktivierung yon Lipasen und Lipoxigenasen bisher relativ wenig untersucht, obwohl diese fiir die Lagerungsstabilit~t yon Lebensmitteln eine wichtige, manchmal sogar dominierende Rolle spielen kSnnen. 1.1. Lipasen Hottenroth (1) untersuchte das Problem der Hitzeinaktivierung yon Pankreaslipase im Hinblick auf die Schutzwirkung des Fettes. Driessen und Stadhouders (2) iiberprfiften die Thermoresistenz bakterieller Lipase

und stellten lest, dab extrazellulare Lipase aus gramnegativen Bakterien relativ hitzeresistent ist. Loncin (3) land in auf fiber 100 ~ erhitzten verschimmelten P a l m k e r n e n eine Lipaserestaktivit~t, die yon Geotrichum candidum herrfihrte. Die Lipase aus diesem Schimmelpilz scheint eine sehr hohe Hitzebest~ndigkeit zu besitzen, weshalb dieses E n z y m isoliert und in die vorliegende Untersuchung einbezogen wurde. 1.2. Lipoxigenasen

Bei zahlreichen Gemfisearten v e r ~ n d e r n sich w~hrend der L a g e r u n g infolge einer Lipoxigenasewirkung F a r b e und Aroma in unerwfinschter Weise. Auch bei der Lagerung vollfetter Sojamehle verursacht die Lipoxigenase einen ,,off-flavor". ?3ber die Kinetik der thermischen Inaktivier u n g yon Lipoxigenase aus Sojabohnen wurde mehrfach berichtet (z. B. 4, 5). Svensson und Eriksson (6, 7) untersuchten die Hitzeinaktivierung yon Erbsen-Lipoxigenase hinsichtlich pH-Abh~ngigkeit und Einflu~ yon Begleitstoffen.

2.0. Experimenteller Teil 2.1. Versuchsmateria~ 2.I.I. Lipase aus Geotrichum candidum

Der v e r w e n d e t e S t a m m En 0203 w u r d e vom Institut ffir G~rungsgewerbe und Biotechnologie der TU Berlin zur Verffigung gestellt. Die Kul486

Park und Fr/cker, Thermische Inaktivierung, II

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turlSsung [nach Alford (8)] wurde durch Filterpapier filtriert und das Filtrat mit Ammoniumsulfat (30-60 % S~ttigung) versetzt. Der in Phosphat-Puffer pH 7,0 gelSste Niederschlag wurde durch F~llung mit Aceton (-50 ~ Endgehalt der LSsung 75 ~ gereinigt, das ausfallende Enzym im N~-Strom getrocknet und bei -25 ~ gelagert. Der Anreicherungsfaktor betrug etwa 10 bezogen auf den Proteingehalt. 2.I.2. Lipoxigenase aus Sojabohnen (50 000 U/lng) wurde yon Fa. Roth (Karlsruhe) bezogen. 2.2. B e s t i m m u n g der Lipaseaktivitgt

Die Bestimmung erfolgte nach der Hydroxams~uremethode (9). 2.3. B e s t i m m u n g der Lipoxigenaseaktivit~it

Die Herstellung der SubstratlSsung erfolgte nach Ben Aziz (10). Zu 2,4 ml SubstratlSsung pH 9,0 (2,5-10-4M Linols~ure, 0,025 % Tween 20) wurden 0,1 ml EnzymlSsung gegeben. Die Enzymaktivit~t wurde durch kontinuierliche Messung der Extinktions~inderung bei Zimmertemperatur ermittelt (Zeiss-Spektralphotometer, 234 nm). Die Hitzebehandlung geschah nach der bereits in der I. Mitteilung (13, siehe auch 11) beschriebenen ,,Kolbenmethode". Die Inaktivierung der Enzyme wurde in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0, zwischen 50 o und 80 ~ Lipase bzw. zwischen 60 o und 75 ~ Lipoxigenase durchgeffihrt.

3.0. Ergebnisse 3.1. Thermische Inaktivierung yon Lipase aus Geotrichum candidum

In Abbildung 1 sind die Inaktivierungskurven dargestellt. Bei 50 ~ tritt wie bei anderen Enzymen (vergl. 13) ein Knickpunkt auf. Bei hSheren Temperaturen verl~uft die Hitzeinaktivierung der IApase nach einer

2,0

~

1,5

01

-1.0 t~c

0,5

\

It 0

0,5

1 1,5 s 2.10~ Erhitzungszeit

Abb. I. Hitzeinaktivierung von IMpase aus Geotrichum candidum bei verschiedenen Temperaturen in Abhfingigkeit yon der Erhitzungszeit bei p H 7,0. Mo: Anfangsenzymaktivitat, M: Restenzymaktivit~t

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Zettschrift 1fir Ern~hrungswtssenscha]t, Band 16, Heft 2 (1977)

,~,0

o

3,0

"~

\ 2,0

%

\ 1,0

50

60

70 "C 80 Temperatur Abb. 2. D-Werte von IApase aus Geotrichum candidum in Abh~ingigkeit yon der Temperatur bei pH 7,0 Reaktion 1. Ordnung. Die D-Werte sind fiir verschiedene Temperaturen in Abbildung 2 dargestellt Aus der Neigung der Geraden ergibt sich ein z-Wert yon 19. 3.2. I n a k t i v i e r u n g s v e r l a u f y o n Sojalipoxigenase

Die in Abbildung 3 dargestellten Inaktivierungskurven weisen bei Temperaturen yon 60 bis 64 ~ ~hnliche Knickpunkte auf wie die Lipase. Zwischen 66 und 75 ~ ist ein solcher Knickpunkt nicht mehr sichtbar. Abbildung 4 zeigt die Abh~ngigkeit yon log D yon der ErhRzungstemperatur. Der daraus ermittelte z-Wert betr~gt 9,8. Da die bei der Hitzebehandlung verwendete Enzymkonzentration ein wichtiges Kriterium zur Standardisierung yon Erhitzungsversuchen im

~

:•:1,5 0

0,5

~2~c

1 1,5 s 2.10~ Erhitzungszeit

Abb. 3. Hitzeinaktivierung yon Lipoxigenase aus Sojabohnen bei versehiedenen Temperaturen in Abh~ingigkeit yon der Erhitzungszeit bei p H 7,0.

Park und FHcker, Thermische Inakttvterung, II

9,5

4,0 %

3,0

o --....

o J

2,0

1,0 60

64

68 72 ~ 76 Temperotur

Abb. 4. D-Werte yon Lipoxigenase aus Sojabohnen in Abh~ingigkeit yon der Temperatur bei pH 7,0. Modellsystem sein k6nnte, w u r d e auch die Abhhngigkeit der thermischen I n a k t i v i e r u n g des Enzyms yon der Konzentration ermittelt. Abbildung 5 zeigt jedoch, dab k a u m Unterschiede im Bereich y o n E n z y m k o n z e n t r a t i o hen zwischen 10 und 80/~g/ml auftreten. Die nach der ,,Transition-stateTheorie" ermittelten t h e r m o d y n a m i s c h e n K o n s t a n t e n sind in Tabelle 1 zusammengestellt. 4.0. Diskussion Der ffir Lipase aus Geotrichum candidum gefundene z-Wert y o n 19 ~ w a r grSl3er als die in der L i t e r a t u r angegebenen Werte yon ca. 3,5 ~ ffir Pankreaslipase und 5,5 ~ fiir Milchlipase (1). Driessen u n d Mitarbeiter (2) berichteten fiber eine sehr hohe Hitzebest~ndigkeit (D = 16 min bei 130 ~ der Lipase aus Pseudomonas fluorescens. Da dieser hohe D - W e f t aus dem

2,0 o o ~

n

1,0

0

0,5

1 1,5 s 2i03 Erhitzungszeit

Abb. 5. I-Iitzeinaktivierung von SojaIipoxigenase in Abhfingigkeit von der Enzymkonzentration bei 60 ~ und pit 7,0. 9 10 #g/ml, [] 20/~g/ml, • 40/~g/ml,

O 80/zg/n'Lt.

Zeitschrilt ]fir Erntfhrungswissenscha:ft, Band I6, Heft 2 (1977)

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Tab. 1. Thermodynamisehe Konsgan~en f'dr die Inaktivierung der Lipase aus Geotriehum eandidum und der Lipoxigenase aus Sojabohnen. Enzym Lipase (Geotriehum eandidum) Lipoxigenase (Sojabohnen)

Temp. (~

pH

AH* (kJ/mol)

AG* (kJ/mol)

AS* (J/tool 9K)

60

7,0

120,4

96,97

73

60

7,0

196,5

102,5

288,7

AH* ---- Aktivierungsenthalpie AG* ---- freie Ak~ivierungsenthalpie AS* ~- Ak~ivlerungsentropie zweiten flachen Teil der I n a k t i v i e r u n g s k u r v e ermittelt wurde, ]assen sich diese Daten nicht mit denen der vorliegenden Mitteilung vergleichen, denn diese w u r d e n aus dem ersten steilen Tell der I n a k t i v i e r u n g s k u r v e n gewormen. Der z-Weft yon 9,8 ~ ftir die Lipoxigenaseinaktivierung w a r in guter ?3bereinstimmung mit den yon anderen A u t o r e n angegebenen Daten z = 8,73 ~ (4)9 u n d z = 8,13 ~ (5) ffir Sojalipoxigenase. Der z-Wert ffir Lipoxigenase aus Erbsen von 3,7 ~ (nach 7) wich dagegen davon stark ab. Bei ~ b e r l e g u n g e n zur technologischen B e d e u t u n g der I n a k t i v i e r u n g y o n Lipasen u n d Lipoxidasen in Lebensmitteln ist auch d a r a n zu denken, daI3 Triglyceride in Anwesenheit y o n Lipase sozusagen ,,indirekte" Substrate ffir Lipoxigenase im Hinblick auf die unges~ttigten Fetts~iuren, die d u r c h Lipasewirkung abgespalten werden, darstellen kSnnten. Zwar sind Lipoxigenasen bekannt, die Fetts~uren im Triglyceridverband direkt angreifen kSnnen; die Reaktionsgeschwindigkeit ist aber mit freien u n g e s~ttigten Fetts~uren wesentlich gr56er. U n t e r s u c h u n g e n fiber den Hitzeinaktivierungsverlauf der beiden E n z y m e im Hinblick auf etwaige gekoppelte Reaktionen kSnnten d e m n a c h y o n lebensmitteltechnologischem Interesse sein.

Zusammenfassung Die thermische Inaktivierung yon Lipase aus Geotrichum candidum und yon Lipoxigenase aus Sojabohnen wurde in Phospbatpufferl6sung untersucht. Ahnlich wie bei Peroxidase wurde ein Knickpunkt bei den Inaktivierungskurven beider Enzyme beobachtet. Dabei ergab Lipase aus Geotrichum candidum einen z-Wert yon 19 ~ der griii3er war als die in der Literatur angegebenen Werte fiir Pankreaslipase und Milchlipase. Ffir die Sojalipoxigenase wurde ein z-Wert yon 9,8 ~ ermittelt.

Summary The thermal inactivation of lipase out of Geotrichum candidum and of lipoxigenase out of soybeans was investigated in phosphate buffer solution. Comparable to peroxidase, a sharp bend was observed in the inactivation curves Dieser z-Wert wurde aus tier angegebenen Aktivierungsenergie Ea nach 2,3 R T M ' der Gleichung z -Ea (vgl. II) errechnet~ *)

Park und Fricker, Thermische Inaktivierung, II

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of b o t h e n z y m e s . T h e z - v a l u e of I9 ~ f o r l i p a s e o u t of G e o t r i c h u m c a n d i d u m was higher than the values indicated in the pertinent literature for pancreas l i p a s e a n d m i l k lipase. T h e z - v a l u e f o r soy l i p o x i g e n a s e w a s f o u n d to b e 9.8 ~

Ltteratur 1. Hottenroth, B., D i e F l e i s c h w i r t s c h a f t 54, 1071 (1974). - 2. D r i e s s e n , F. M., J. Stadhouders, J. officiel O r g a a n , K o n i n k l i j k e N e d e r l a n d s e Z u i v e l b o n d 65, 949 ( 1 9 7 3 ) . - 3. Lonc~n, M., P e r s 6 n l i c h e M i t t e i l u n g . - 4. Farkas, D. F., S. A. GoZdblith, J. F o o d Sci. 27, 262 (1962). - 5. Shibasaki, K., S. Hukano, K. O k u b o , J. F o o d Sei. T e c h n o l . ( J a p a n ) 20, 415 (1973). - 6. Svensson, S. G., C. E. Eriksson, L e b e n s m . Wiss. u. T e c h n o l . 5, 124 (1972). - 7. Svensson, S. G., C. E. Erikssen, L e b e n s m . - W i s s . u. T e c h n o l . 5, 118 (1972). - 8. AlSord, J. A., J. L. Smith, J . A m . Oil C h e m i s t s ' Soc. 42, 1038 (1965). - 9. Park, K. H., R. Duden, A. FTicker, Z. L e b e n s m . U n t e r s . Forschg., 157, 327 (1975). - 10. Ben-Aziz, A., g. Grossman, I. Ascarelli, P. Dudowski, A n a l . B i o c h e m . 34, 88 (1970). - 11. Park, K. H., Diss. Uni. K a r l s r u h e (1976). Anschrift der Verfasser:

K. H. Park u n d A. F r i c k e r , I n s t i t u t fiir L e b e n s m i t t e l c h e m i e d e r B u n d e s f o r s e h u n g s a n s t a l t ffir E r n ~ h r u n g , 7500 K a r l s r u h e