Histochemistry 55, 325-339 (1978)
Histochemistry 9 by Springer-Verlag 1978
Le noyau du gam/~te de l'Equisetum arvense L. I. Etudes cytochimiques uitrastructurales des composants nucl6aires du gambte mfir. H. Hadj M a b r o u k Laboratoire de Botanique, Universit6 Paris VI, 12, rue cuvier, F-75-Paris 5~me, France
The Sperm of Equisetmn arvense L. I, Ultrastructural and Cytochemical Studies of Nuclear Constituents of the Ripe Sperm Summary. Several ultrastructural cytochemical methods are used to determine the constituents of the ripe nucleus of Equisetum arvense L. They show that: D N A , associated with an arginine-rich histone, is localized in central region of the nucleus; nucleoplasm is reduced to a thin peripheral coat and contains a probably lysine rich histone; R N A is not detectable; non histone proteins form lenticular amounts disposed against the nuclear membrane. R6sum6. Les m&hodes utilisbes pour localiser, en microscopie 61ectronique, les constituants du noyau du gam6te mfir de l'Equisetum arvense L. montrent q u e : l ' A D N , associ6 fi une histone riche en arginine, se situe darts la zone centrale de l'organite ; le nucl6oplasme, renfermant une histone probablement riche en lysine, est r6duit/t une fine couche p6riph6rique; I ' A R N n'est plus identifiable;les prot6ines non-histone forment des massifs lenticulaires, acco16s/t la membrane nucl6aire.
Introduction L'organisation des spermatozoides libres des v6g6taux est maintenant bien connue. L'6volution du cytoplasme, n o t a m m e n t la diff6renciation de l'appareil cin~tique, a fair l'objet de nombreux travaux; par contre le noyau a 6t6 peu 6tudi& I1 est probable que l'extr~me opacit6 de cet organite dans le gam6te mfir et la difficult6 qu'il y a ~ caract6riser les composants nucl6aires en sont les raisons principales. Cependant des techniques cytochimiques, raises au point r6cemment, permettent maintenant d'aborder dans de meilleures conditions l'6tude de cet organite en microscopie 61ectronique.
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Des recherches mettant en oeuvre ces techniques, consacr6es aussi bien aux acides nucl6iques qu'aux prot6ines, entreprises chez les gam6tes animaux, ont montr6 qu'il existait, au cours de la diff6renciation de la cellule, un changement dans la localisation et dans la nature des histones li6es g I'ADN. I1 nous a paru int6ressant de v6rifier si un ph6nomSne comparab!e existait chez certains gam6tes v6g~taux. Le pr+sent travail est consacr6 au spermatozoide de l'Equisetum arvense L. Dans ce premier article nous envisagerons uniquement l'~tude du gamete mfir.
Mat6riel et techniques Les prothalles mfiles utilis6s pour cette 6tude sont ceux d'une Equisetac~e, L'Equisetum arvense L., cultivbs au laboratoire selon la m6thode pr6conis~e par Laroche (1967). Pour les dtudes rnorphologiques, les fragments de prothalles raffles, portant des anth+ridies, sont fixSs, immddiatement apr+s leur pr618vement, par le glutarald6hyde en solution 5- 6,25% dans le tampon cacodylate. Quelques minutes apr6s, ils sont d6coup6s en fragments plus petits (1 52 ram), puis immerg6s ~. nouveau durant 3 h 5- 4 ~ dans une solution fra~che de fixateur. Le materiel est ensuite postfix6 par le t6troxyde d'osmium ~. 2% dans le mSme tampon, d6shydrat6 par l'alcool et inclus dans un m~lange Epon-Araldite; les coupes ultrafines sont contrast~es par l'acatate d'uranyle et le citrate de Plomb. Pour les dtudes cytochimiques, trois types de m+thodes sont employ6s: les digestions enzymatiques, les colorations r6gressives et les rSactions cytochimiques. a. Digestions enzymatiques. L'extraction enzymatique est pratiqu6e sur des fragments de prothalles, donc sur ~bloc~), aprSs fixation par le glutaraldbhyde et un lavage darts le tampon. Les enzymes utilis6es sont: -la pronase 5. 1% darts le tampon phosphate ~ pH 7.3; -la trypsine fi 1% dans le tampon phosphate 5- pH 7.3; -la pepsine 5- 1% dans HC1 0,1 N. -la d6soxyribonucl6ase en suivant la m6thode pr+conis6e par Stevens et Swift (1966). Quelle que soit l'enzyme employbe, les traitements sont effectuSs ~ 37 ~ C pendant 12 ~, 24 h et suivis d'une postfixation par le tbtroxyde d'osmium. b. Colorations. Les ribonucl6oprotSines et les d6soxyribonucl+oprot6ines ont 6t6 diff6renci6es sur coupes ultrafines en mettant en oeuvre la technique r6gressive de Bernhard (I968-69) 5- I'EDTA (pour notre mat+riel les dur6es optimales de traitement out 6t6:2 mn sur la solution g 5% d'acbtate d'uranyle; 35 mn d ' E D T A ; iron 30 sur le citrate de Plomb; les t6moins sont obtenus en supprimant le passage sur I'EDTA.). Pour localiser les histones, nous avons utilis& la m6thode de Bloch et Hew (1960) au fast green-6osine en microscopie photonique et celle de Sheridan et Barnett (1969) a l'acide phosphotungstique (APT) en microscopie 61ectronique. c. Rkactions cytochimiques. Diverses m6thodes nous out permis de caract~riser I'ADN: Celle de Moyne (1972) qui consiste dans un premier temps, apres avoir pratiqu6 une hydrolyse sur du mat6riel fix6 par le glutarald6hyde, h bloquer les groupements hydroxyles 5- l'aide d'une ac6tylation; puis dans un second temps, les coupes ultrafines ayant flott6 sur le r~actif de Schiff, fi mettre en ~vidence, les groupements hydroxyles du complexe A D N hydrolys~-r~actif de Schiff par l'Sthylate de thallium selon Mentr6 (1972). Celle de, Gautier (1970), dans laquelle les 6chantillons, fix6s par le glutarald6hyde, hydrolys+s par l'acide chlorhydrique N 5- 60 ~ C pendant 15 ran, sont color6s par une solution d'amine d'osmium 5- 0,05% dans l'eau distill~e trait6e par le SO2 (nons avons apport6 toutefois une 16g+re modification dans la pr6paration de Famine en diminuant de moiti6, la quantit6 d'osmium r6agissant). Celle de Thiery (1972) (R~action Hatag) off les coupes ultrafines, provenant d'un matSriel fix8 par le glutarald~hyde, sont mises 5- flotter pendant 15 mn sur l'acide chlorhydrique, traitSes ensuite par la thiocarbohydrazide en milieu ac~tique puis par le prot6inate d'argent.
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Celle de Roels et Goldfischer (1971), modifi+e par Anteunis et al. (1973) applicable fi des +chantillons de volume r6duit (2 ou 3 anth~ridies seulement), ceux-ci fixes par le formol, sont mis fi incuber dans une solution de 3-3'Diaminobenzidine oxydae pendent 3 h /t 37~ C, postfix~s par le tetroxyde d'osmium fi 1% dens l'eau distill6e pendant 90 mn et inclus dans le m~lange Epon-Araldite. Dans tousles cas l'observation de coupes temoins est n~cessaire celles-ci sont obtenues en supprimant l'hydrolyse dens les m~thodes de Moyne, Gautier et Thiery et en remplac.ant la DAB par de l'eau distillOe dans la re+rhode d'Anteunis et coll. Pour caract~riser certaines prot6ines de type histone, nous avons employ~ la technique de MacRae et Meetz (1970): fixation au formoI /L 10% neutralis6 par l'ac+tate de sodium, immersion dans une solution d'argent ammoniaca] puis dans une solution de formol fi 3%. Apres lavage soigneux ~t l'eau, l'inclusion est effectu~e, selon les m6thodes habituelles. Les coupes ultrafines ont 6t6 examinees au microscope 61ectronique Siemens Elmiskop I.
R~sultats Le gamete mille de l ' E q u i s e t u m a r v e n s e presente une organisation bien particuliere (Duckett, 1973; H. M a b r o u k , 1976) caracterisee par une localisation peripherique, au contact du plasmalemme, des principaux organites et par leur disposition selon une spirale lfiche. L ' e t u d e de cette cellule est facilitee par l'examen de sections de materiel colore par l'acide p h o s p h o t u n g s t i q u e (APT), coloration qui interesse, outre le noyau, l'appareil cinetique. Une coupe longitudinale axiale de la cellule (Fig. 1), c'est ~ dire incluant l'axe de la spirale suivant ]aquelle se disposent les organites, permet de definir un pele anteriem (A) et un pele posterieur (P). A u pele antarieur (A), l'appareil cinetique est identifiable en trois endroits (Fig. 1-3), ce qui correspond /t la section d'une structure spiralee plane d ' u n tour et demi; une mitochondrie(m) de grande taille (que la technique ne permet pas de mettre en evidence) est toujours associ6e fi cet appareil cinetique. Ce dernier est constitue par un ensemble de microtubules, de fibrilles, de cinetosorues et de flagelles organises en un appareil complexe, fort c o m p a r a b l e fi ceux etudies chez d'autres gametes vegetaux (Carothers et Kreitner, 1967; Paolillo et al., 1968; D u c k e t t et Bell, 1969; Duckett, 1973). Le noyau, nettement sbpare de l'appareil cinetique, lui fait suite; tr~s effile fi son extremit6 anterieure (N1 et N2), il affecte une forme en massue au p61e posterieur (N3). Trois sections, decalees l'ane par r a p p o r t fi l'autre, sont identifiables sur ce cliche, ce qui c o r r e s p o n d / t la coupe d ' u n organite pregentant un enroulement spirale helicoidal. Les deux ensembles, n o y a u d'une part, mitochondrie-appareil cinetique d'autre part, sont relies et maintenus l'un 5. l'autre (grosse fl6che) par les microtubules de la bande fibreuse ($1). A u centre de la spirale decrite par l'appareil cinetique se localisent les restes du cytoplasme et les autres organites. Sur ce cliche, les flagelles(f) sont enroules a u t o u r du gamete dans deux d~pressions du pele anterieur. Pour ce qui concerne le n o y a u du gam6te mfir, dont l'6tude constitue le sujet de cet article, on constate, sur les coupes ultrafines observees en microscopie +lectronique (Fig. 4), qn'il est tres o p a q u e aux electrons et relativement h o m o g~ne. On peat y distinguer, apr~s mise en oeuvre des methodes usuelles de
Fig. 1. Caract6risation des prot6ines par I'APT; /t l'int6rieur du noyau seule une fine couche p~riph~rique est color,e; elle pr6sente des invaginations vers l'int&ieur de l'organite (fl6ches). Cette technique, qui met 6galement en 6vidence l'appareil cin6tique, permet de comprendre l'organisation du gain+re. CH, chromatine; J; flagelle; N, noyau; m, mitochondrie, x 23000 Fig. 2. Lorsqu'une digestion par la pronase pr~chde le traitement par t'APT, la coloration disparait (fI6che double); toutefois des structures non colorhes subsistent dans le nucl6oplasme. N., noyau. • 28000
Fig. 3. N o y a u du gam6te mfir trait6 par la pronase. La zone p6riph6rique est sensiblement 6claircie, bien que diverses structures fibreuses subsistent (fl6che) fi cet endroit; la masse centrale (CH) demeure tr6s homog6ne; les lentilles (/) ne sont pas dig+r6es, a, amidon; CH, chromatine; p, plaste. • 27000 Fig. 4. N o y a u apr6s mise en oeuvre des m6thodes usuelles. La chromatine (C/t) est tr6s dense; l, Ientille pbriph~rique; ran, m e m b r a n e nucl6aire; rip, nucl6oplasme, x 20000 Fig. 5. Apr6s traitement par la pepsine, on note un 6claircissement sensible du nucl6oplasme p+riphbrique (np) et de la masse centrale (CH) off les fibrilles (fl+che double) sont aisement perceptibles; les lentilles (/) conservent un contraste c o m p a r a b l e / t celui qu'elles ont apr6s emploi des m6thodes usuelles, m n enveloppe nucl6aire, x 70000
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fixation et coloration: une masse centrale tr6s condens6e (CH), form6e par la juxtaposition de nombreuses fibrilles; une tr6s fine touche de nucl6oplasme (np), de 0,2 ~t d'~paisseur, comprise entre l'enveloppe nucle~iire (nan) et la masse centrale (CH); quelques lentilles (1) p6riph6riques, form6es d'un mat6riel diff6rent de celui de la chromatine et de celui du nucl60plasme. a. Digestions enzymatiques Apr6s traitement par la pepsine (Fig. 5), la densit6 du noyau diminue; le nucl6oplasme est dig6r6 et une zone claire (fl6che), s6pare l'enveloppe nucl6aire (ran) de la pattie centrale (CH). L'enzyme agit 6galement sur cette derni6re et l'on distingue plus ais6ment les structures fibrillaires (flbche double), sur un fond sensiblement 6clairci. La pepsine, qui attaque aussi bien les prot6ines du nucl6oplasme que celles de la chromatine, n'agit pas sur celles des lentilles accol6es /t la membrane nucl6aire, lentilles qui conservent un contraste 61ev6. Cette enzyme, bien que n'ayant pas une sp6cificit6 absolue, coupe de pr6f6rence des liaisons peptidiques off figurent les acides amin6s aromatiques ou acides (Monneron, 1966); ces acides amin6s existeraient dans toutes les prot6ines du noyau fi l'exception de celles constituant les lentilles. Les r6sultats obtenus apr6s traitement du mat6riel par la pronase (Fig. 3) sont comparables aux pr6c6dents; toutefois la digestion nous semble moins importante bien que cette enzyme agisse (Monneron, 1966). La trypsine (Fig. 6 et 8) ne modifie pas sensiblement l'aspect de la masse centrale (CH); par contre elle produit un 6claircissement substantiel du nucl6oplasme (fl6che) et surtout la digestion des lentilles p6riph6riques (1),/t l'exception des trav6es opaques incluses dans ces derni6res (double fl6che), trav6es qui ne peuvent 6tre observ6es que difficilement apr6s emploi des m6thodes usuelles (Fig, 9, fl~che). Cette enzyme rompt des liaisons peptidiques du type Lys-X ou Arg-X; ces amino-acides devraient doric 6tre abondants dans les lentilles p6riph6riques. La ddsoxyribonuclkase (Fig. 7) 6claircit consid6rablement, la masse centrale (CH), si dense apr6s emploi des colrations usuelles (Fig. 9); seules des structures fibrillaires l~ches sont encore discernables. Par contre, le nucl6oplasme (fl6che, Fig. 7) et les lentilles (1) conservent un contraste relativement 61ev& Cette diminution du contraste permet de localiser I'ADN uniquement dans la zone centrale du noyau; les fibrilles persistantes correspondent probablement aux structures prot~iques li6es ~t l'acide nucl6ique. b. Mkthodes de colorations Coloration par I'APT: Dans les cellules que nous avons 6tudi6es, cette technique colore pr6f6rentiellement les microtubules de l'appareil cin~tique et certains territoires nucl6aires.
Fig. 6. Apr6s traitement par la trypsine, on note un +claircissement de la zone pbriph6rique (fl6che); Ies Ientftles (/) qui s'y trouvent sont ~galement dig6r6es. La masse centrale (CH) ne subit pas d'importantes modifications. • 20000 Fig. 7. Apr6s traitement par la d6soxyribonucl~?ase; la masse centrale (CH) s'6claircit consid&ablement; seules des structures fibrillaires lfiches sont encore pr6sentes. A la p~riph6rie du noyau une fine pellicule opaque aux 61ectrons (fI+che), correspondant au nucl6oplasme demeure contrast+e; les lentilles (/) accol~es fi l'enveloppe nucl6aire ne sont pas dig6r6es, x 23000 Fig. 8. Apr6s traitement par la trypsine, ies lentilles (/) sont digbrbes, fi l'exception des trav~es opaques aux ~lectrons (fl6che double), x 54000 Fig. 9. Sur cette preparation t~moin ou le mat6riel n ' a pas 6t6 trait6 par une solution enzymatique~ le noyau est tr6s opaque aux 61ectrons; les travees se distinguent ~t peine au sein des lentilles p6riph6riques (fl6che). CH, chromatine; l, lentille. • 54000
Fig. 10. Caract6risation de I ' A D N par la r6action de M O Y N E . Toute la partie centrale (CH) du noyau du spermatozoide est contrast6e; la couche p6riph~rique et les lentilles (/) demeurant transparentes aux 61ectrons. x 23000 Fig. 11. Coloration des prot6ines basiques par l'acide phosphotungstique (APT). U n e fine couche, opaque aux 6lectrons, est raise en 6vidence ~t la p6riph6rie du noyau; elle est r6gulibre vers l'ext+rieur, car limit6e par l'enveloppe nucl6aire, mais pr~sente des invaginations vers l'int6rieur (fl6che); la zone centrale (CH) n'est pas color+e, x 28500 Fig. 12. Coloration r6gressive fi I'EDTA. La masse centrale du noyau est enti6rement blanchie. La zone p~riph6rique est form6e par une couche finement granulaire (fl+che double), x 28500 Fig. 13. Caract~risation de I ' A D N par la m+thode de T H I E R Y . Seule la partie centrale est contrast6e (CH); la couche p6riph6rique (fl6che) et les lentilles ([) ne r6agissent pas. x 20000
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Sur la Figure 1, qui correspond/t une section suivant l'axe ant@o-postbrieur du gamete, la coloration employee, met on bvidence au niveau des trois sections du noyau, une fine couche p6riph6rique, /t contour r6gulier vers l'ext6rieur (car limit~ par l'enveloppe nucl~aire) mais pr6sentant des invaginations vers l'int6rieur (fl6che), comme si elle se moulait sur une zone centrale (CH)/t contour irrbgulier. Ces invaginations sont plus importantes aux extr6mitSs ~ffil6es du noyau (N2). Lorsque la technique est mise en oeuvre sur du mat6riel pr6alablement trait~ par la pronase (Fig. 2), la coloration disparait (fl6che double); les structures plus ou moins fibrillaires persistant fi l'int6rieur de la masse digbr~e, ne sont pas colorables par I'APT. Cette couche, opaque aux blectrons aprSs emploi de cette technique, correspond, par sa localisation et sa nature prot~ique, au nucl6oplasme p@iph6rique. Coloration r~gressive il E D T A . Apr6s raise en oeuvre de cette m6thode (Fig. 12), la masse centrale (CH), qui parait dense apr6s coloration par l'ac6tate d'uranyle et le citrate de plomb seuls, est enti6rement blanchie. Cette zone d6color6e (CH) est entour6e par une couche granulaire (fl6che double) qui correspond au nuclboplasme p6riph@ique. Nous n'avons jamais obtenu dans ce noyau, une 616vation du contraste de certaines structures comparable ~ celles qui, habituellement apr6s raise en oeuvre de cette technique, marque la pr6sence des ribonuclboprot6ines. I1 est fort probable que ces derni6res ont disparu ~ maturit6.
c. Rbactions cytochimiques Caractbrisation de I'ADN. Apras raise en oeuvre de la technique de Moyne
(Fig. 10), la partie centrale (CH) du noyau du spermatozoide mfir est seule fortement contrastbe; elle est tr6s homog6ne et tras dense ce qui rend dalicate l'observation des structures la constituant. La fine couche nucl~oplasmique p@ipharique (flache) n'est pas contrast~e, pas plus que les lentilles occupant les indentations de la masse centrale, et il est int&essant de constater que les clichas obtenus sont superposables, bien que les contrastes soient invers6s, avec ceux rbalis6s apras coloration du mat@iel par I'APT (Fig. 11). Apr6s la m6thode de Gautier (Fig. 17) ou celte de Thiery au TCH-prot6inate d'argent (Fig. 13), l'aspect du noyau est le mSme que celui obtenu apr~s raise en oeuvre de la raaction de Moyne (Fig: 10); on distingue toujours une masse centrale (CH) opaque aux 61ectrons, bien que le contraste obtenu varie tr6s sensiblement selon la technique employae; Le nucl6oplasme (fl6che) et les lentilles (1) ne sont, 1~ encore, jamais contrast6s. Le traitement par Ia 3-3'DAB oxyd6e (Fig. 18) qui permet de distinguer les acides nucleiques des proteines qui leur sont liaes met 6galement en 6vidence la masse centrale (CH), qui, fi fort grossissement (Fig. 16, flache double), parait formae d'61aments fibrillaires 6troitement juxtapos6s. Le contraste de la fine couche (Fig. 18, fleche) entourant la masse centrale et des lentilles (1) accol6es l'enveloppe nuclaaire n'est pas renforc6.
Fig. 14 et 15. Mise en 6vidence des histones riches en arginine par l'argent ammoniacal ; les particules opaques aux 61ectrons sont strictement localis6es dans la zone centrale. Fig. 14, • 15000; Fig. 15, x 21000 Fig. 16. Apr6s traitement par 3-3'diaminobenzidine oxyd6e; les 6lements fibrillaires constituant la masse centrale (CH) sont ais6ment discernables. Les ribosomes cytoplasmique sont 6galement tr+s contrast6s x 60000 Fig. 17. Caract6risation de I ' A D N par la technique de Gautier et Cogliati. La masse centrale (CH) est l~g6rement opaque aux 6te~trons; la touche p~riph6rique (fl~che) et les lentilles (/) Me sont pas r~actives, x 45000 Fig. 18. Caract6risation des acides nucl6iques par la 3-3'diaminobenzidine oxyd6e. La masse centrale (CH) du noyau apparait dense, et fort opaque aux 61ectrons. U n e couche p6riph~rique (fl6che) moins contrast6e entoure la zone centrale; elle correspond au nucl+oplasme. I ' A R N ribosomial est 6galement bien distinct, x 20000
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CaractOrisation de certaines protOines de type histone. Apras traitement par l'argent ammoniacal (Fig. 14 et 15), des particules opaques aux electrons (de 120/L 200 A~ de diamatre) apparaissent dans la partie centrale (CH) du noyau; elles sont strictement localisbes dens ce territoire et, aucune n'apparait dans le nucleoplasme paripherique (fleche) ou les lentilles (1).
Discussion
Le noyau de spermatozoide de l'Equisetum arvense parait fort comparable, apras emploi des methodes usuelles, /t celui des gametes libres d'autres vagataux, notamment en ce qui concerne l'extrame condensation de la chromatine. I1 en est ainsi chez le PtOridium aquilinum (Manton, 1959), l'Ascophyllum (Cheignon, 1964), le Nitella. (Turner, 1968), le Sphaerocarpus (Diers, 1967) ou le Polytrichum (Genevas, 1970), entre autres. Chez de nombreux spermatozoides libres, egalement, au cours de la gamatogenase, le nucleole se resorbe progressivement et disparait. Ce phenomene a eta suivi chez Polytrichum juniperinum par Allen (1912) et Crepin (1968). Bien qu'aucune technique ne permette de caracteriser I'ARN, en microscopie electronique certaines, telle la coloration regressive ~ I'EDTA ou calla /~ la 3-3'DAB oxydee, donnent le plus souvent des indications quant /t la presence de ce constituant nucleaire. Chez l'Equisetum les rasultats fournis par ces m6thodes, qu'elles aient ate raises en oeuvre avec ou sans digestion pr6alable par la ribonuclease, suggarent que le noyau du gamete mfir est dapourvu d'ARN. I1 convient toutefois de hater que chez les Bryophytes et la Selaginelle (Robert, 1974), off ce phanomane peut atre observ6, le cytoplasme disparait presque totalement, disparition qui s'accompagne ganeralement d'une resorption des ribosomes cytoplasmiques comme l'a mantra Genevas (1967), en microscopie alectronique, chez le Polytrichum formosum. I1 n'en est pas de marne chez l'Equisetum off le cytoplasme constitue, fi maturit6, une part importante du volume cellulaire, les ribosomes demeurant toujours presents. La membrane nucleaire dans le gamete de cette espece, comma dens celui de la Selaginelle, est toujours identifiable. I1 n'en est pas de marne chez PoIytrichum off son existence a pu m6me atre raise en doute. Toutefois, comma le suggare Ganevas (1970), il est probable qu'elle est, dens ce dernier cas, atroitement accolae aux masses osmiophiles adjacentes, et difficile fi discerner. Les methodes qui en microscopie alectronique nous ant permis de caractariser I'ADN, sont de plusieurs types; toutefois la plupart d'entre elles suivent le schema general de la reaction de Feulgen. La plus proche de cette derniare est celle de Moyne qui met en evidence /t l'aide de l'ethylate de thallium, les groupements hydroxyles resultants de la combinaison du raactif de Schiff et des groupements pseudo-aldehydiques liberbs par hydrolyse de I'ADN. Dans celle de Gogliati et Gautier (1973), l'amine d'osmium, dont la constitution chimique n'est pas encore exactement precisae, utilisee apr6s hydrolyse chorhydrique comme reactif du type Schiff, met en evidence specifiquement I'ADN.
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Dans celle de Thiery, les groupes ald6hydiques, r6v61~s par l'hydrolyse chlorhydrique, sont mis en 6vidence par la thiocarbohydrazide, elle mame r6v616e par le prot6inate d'argent. La mbthode propos6e par Roels et Goldfischer, fort diff6rente, n'est plus une application de la r6action de Feulgen; elle met en 6vidence les groupements phosphates des acides nucl6iques par la DAB oxyd6e. Ainsi, comme l'ont fait remarquer Anteunis et coll., de m6me que Roels et Goldfischer, l'intensite de la coloration 6tant proportionnelle aux nombres de groupements phosphates libres, I'ADN en raison de sa structure bicat6naire parait, sur les coupes ultrafines, plus contrastb que I'ARN. Toutes ces r6actions donnent au niveau du noyau du gam6te 6tudi6 des r6sultats comparables quant/t la localisation de I'ADN, r6sultats qui, en outre, sont en parfait accord avec ceux obtenus par d'autres m6thodes (coloration fi I'EDTA, digestion par la DNase): I ' A D N est toujours strictement localisO dans la zone centrale de l'organite. Les m6canismes chimiques mis en jeu sont diff6rents, ce qui permet de consid6rer ces techniques comme toutes parfaitement satisfaisantes. Toutefois la raise en oeuvre de ces r6actions, comme l'intensit6 de la coloration obtenue, sont sensiblement diff6rentes de l'une/~ l'autre. Ainsi la reaction de Moyne donne le contraste le plus 61ev6 mais sa r6alisation n6cessite de nombreuses manipulations; la 3-3'DAB permet d'obtenir un bon contraste, mais n'est pas sp6cifique puisqu'elle ne permet pas de distinguer avec certitude I'ADN des A R N ; Famine d'osmium est celle dont la raise en oeuvre est la plus simple, par contre les pr6parations sont tr6s peu contrast6es; le TCHprot6inate d'argent colore moins intensement mais la m6thode est facilement r6alisable. Pour ce qui concerne notre matdriel ce sont les rOactions de Moyne et celle au TCH-protdinate d'argent qui ont donnk les r~sultats les plus satisfaisants. Les m6thodes de caract6risation des prot6ines donnent des r~sultats plus d~licats ~ interpr6ter, en raison m~me de la vari6t~ des protbines pr6sentes l'int6rieur du noyau. La m6thode de Sheridan et Barnett (1969) consiste /t traiter le mat6riel par l'acide phosphotungstique en solution alcoolique au cours de la d6shydratation; les auteurs constatent alors une coloration 61ective du complexe synaptin6mique. Les contr61es qu'ils ont effectu~, in vitro, permettent d'attribuer la coloration/t une histone. Le m6canisme de la r6action et, par la suite le type d'histone color6, n'est cependant pas connu. Les colorations par I'APT sont nombreuses et diverses. Utilis6 ~ bas pH il met en 6vidence la fraction polysaccharidique des complexes glycoprot6iques (Pease, 1966; 1970; Marinozzi, 1966; Rambourg, 1967). En solution alcoolique, Gillies (1973) a montr~ qu'il contraste selon le temps de Coloration, soit les 616ments lat6raux du complexe synaptin6mique (apr6s 15 h de traitement), soit tout le complexe ainsi que la chromatine (apr6s 19 h). Dans le cas des gam6tes d'Equisetum arvense, la coloration par I'APT est obtenue apr6s un temps d'action court (12 h): elle met donc en 6vidence uniquement les prot~ines nucl6oplasmiques et celles de l'appareil cin6tique. Le traitement par les enzymes prot6olytiques (pronase) pr6c6dant celui par I'APT supprime le contraste ce qui doit 6tre rapproch6 des observations d'Emmelot et al. (1964) ;
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ces auteurs ont en effet montr6 que la coloration de la surface des cellules h6patiques par I'APT disparait lorsqu'elle est suivie d'une digestion par la trypsine, ou par simple flottage des coupes sur le s6rum physiologique. Les territoires contrast+s par I'APT en solution alcoolique sont les mSmes que ceux color6s, en microscopie photonique, par l'6osine dans la mbthode de Bloch (1960), au fast green-bosine, coloration attribube, dans ce cas, 5- la pr6sence de lysine; la prot6ine raise en 6vidence par I'APT peut donc 8tre riche en lysine, mais il est difficile de l'affirmer, la coloration par I'APT pouvant avoir une toute autre signification. La technique 5- l'argent ammoniacal colore spbcifiquement d'aprSs MacRae et Meetz (1970) les protbines riches en arginine. Les particules opaques aux 61ectrons, qui apparaissent dans la partie centrale du noyau, ont un diam6tre de 200 A. D'aprbs les auteurs elles correspondent 5- la coloration brune obtenue, en microscopie photonique, par Black et Ansley (1965). Dans notre matbriel, la mise en oeuvre, en microscopie photonique, de certaines techniques de coloration (fast green-6osine) permet d'attribuer une localisation comparable pour l'arginine, ce qui tend fi confirmer la valeur de la m6thode 5- l'argent ammoniacal. Les r6sultats obtenus, en mettant en oeuvre les techniques dont nous venons de discuter la valeur, montrent que, si l'on s'int6resse 5- l'organite dans son ensemble, il y a, dans le noyau du gamSte mfir, sbgr6gation des protbines du type histone: Celles riches en arginine 6tant toujours associ6es 5- I'ADN dans la partie centrale, celles vraisemblablement riches en lysine se situant dans le nucl6oplasme. Quant aux lentilles pbriph6riques, elles sont vraisemblablement constitubes de prot6ines non histone. Cette disposition est fort diffbrente de celle rencontrbe dans les cellules spermatogbnes off les diff6rents types de protbines coexistent au niveau du r6seau chromatique (article en prbparation). En conclusion, le noyau de spermatozoide de l'Equisetum arvense parait fort comparable, apr6s emploi des m&hodes usuelles, /t celui des gamStes d'autres v6gStaux, notamment en ce qui concerne la condensation tr6s importante de la chromatine et la r6sorption nucl6olaire. Toutefois les recherches cytochimiques, r6alis6es ~i l'aide de techniques sp6cifiques, montrent que I'ADN et les histones riches en arginine coexistent en btroite association dans la zone centrale du noyau. On retrouve 15. une forme d'organisation comparable/t celle rencontr6e chez les spermatozoides de diverses esp6ces animales (Chevallier et Gusse, 1975). Chez ces derni6res cependant la gam6tog6nSse s'accompagne d'une 61imination progressive des histones de type somatique riches en lysine. Chez l'Equisetum il n'y a pas 61imination fi propremerit parler mais plut6t une s~gr6gation de ce dernier type d'histone ~ la pbriph6rie de l'organite dans le nucl6oplasme. En outre chez les gam6tes animaux, il y a disparition compl6te des prot6ines non histones; dans le spermatozoide que nous avons 6tudib, ces derniSres persistent et se localisent dans les lentilles accol6es /t la membrane nucl6aire. La persistance de ces prot6ines constitue une particularitb qui semble exister 6galement dans les gam6tes de certaines S61aginelles (Robert, 1977).
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Histochemistry 9 by Springer-Verlag 1978
Le noyau du gam/~te de l'Equisetum arvense L. I. Etudes cytochimiques uitrastructurales des composants nucl6aires du gambte mfir. H. Hadj M a b r o u k Laboratoire de Botanique, Universit6 Paris VI, 12, rue cuvier, F-75-Paris 5~me, France
The Sperm of Equisetmn arvense L. I, Ultrastructural and Cytochemical Studies of Nuclear Constituents of the Ripe Sperm Summary. Several ultrastructural cytochemical methods are used to determine the constituents of the ripe nucleus of Equisetum arvense L. They show that: D N A , associated with an arginine-rich histone, is localized in central region of the nucleus; nucleoplasm is reduced to a thin peripheral coat and contains a probably lysine rich histone; R N A is not detectable; non histone proteins form lenticular amounts disposed against the nuclear membrane. R6sum6. Les m&hodes utilisbes pour localiser, en microscopie 61ectronique, les constituants du noyau du gam6te mfir de l'Equisetum arvense L. montrent q u e : l ' A D N , associ6 fi une histone riche en arginine, se situe darts la zone centrale de l'organite ; le nucl6oplasme, renfermant une histone probablement riche en lysine, est r6duit/t une fine couche p6riph6rique; I ' A R N n'est plus identifiable;les prot6ines non-histone forment des massifs lenticulaires, acco16s/t la membrane nucl6aire.
Introduction L'organisation des spermatozoides libres des v6g6taux est maintenant bien connue. L'6volution du cytoplasme, n o t a m m e n t la diff6renciation de l'appareil cin~tique, a fair l'objet de nombreux travaux; par contre le noyau a 6t6 peu 6tudi& I1 est probable que l'extr~me opacit6 de cet organite dans le gam6te mfir et la difficult6 qu'il y a ~ caract6riser les composants nucl6aires en sont les raisons principales. Cependant des techniques cytochimiques, raises au point r6cemment, permettent maintenant d'aborder dans de meilleures conditions l'6tude de cet organite en microscopie 61ectronique.
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Des recherches mettant en oeuvre ces techniques, consacr6es aussi bien aux acides nucl6iques qu'aux prot6ines, entreprises chez les gam6tes animaux, ont montr6 qu'il existait, au cours de la diff6renciation de la cellule, un changement dans la localisation et dans la nature des histones li6es g I'ADN. I1 nous a paru int6ressant de v6rifier si un ph6nomSne comparab!e existait chez certains gam6tes v6g~taux. Le pr+sent travail est consacr6 au spermatozoide de l'Equisetum arvense L. Dans ce premier article nous envisagerons uniquement l'~tude du gamete mfir.
Mat6riel et techniques Les prothalles mfiles utilis6s pour cette 6tude sont ceux d'une Equisetac~e, L'Equisetum arvense L., cultivbs au laboratoire selon la m6thode pr6conis~e par Laroche (1967). Pour les dtudes rnorphologiques, les fragments de prothalles raffles, portant des anth+ridies, sont fixSs, immddiatement apr+s leur pr618vement, par le glutarald6hyde en solution 5- 6,25% dans le tampon cacodylate. Quelques minutes apr6s, ils sont d6coup6s en fragments plus petits (1 52 ram), puis immerg6s ~. nouveau durant 3 h 5- 4 ~ dans une solution fra~che de fixateur. Le materiel est ensuite postfix6 par le t6troxyde d'osmium ~. 2% dans le mSme tampon, d6shydrat6 par l'alcool et inclus dans un m~lange Epon-Araldite; les coupes ultrafines sont contrast~es par l'acatate d'uranyle et le citrate de Plomb. Pour les dtudes cytochimiques, trois types de m+thodes sont employ6s: les digestions enzymatiques, les colorations r6gressives et les rSactions cytochimiques. a. Digestions enzymatiques. L'extraction enzymatique est pratiqu6e sur des fragments de prothalles, donc sur ~bloc~), aprSs fixation par le glutaraldbhyde et un lavage darts le tampon. Les enzymes utilis6es sont: -la pronase 5. 1% darts le tampon phosphate ~ pH 7.3; -la trypsine fi 1% dans le tampon phosphate 5- pH 7.3; -la pepsine 5- 1% dans HC1 0,1 N. -la d6soxyribonucl6ase en suivant la m6thode pr+conis6e par Stevens et Swift (1966). Quelle que soit l'enzyme employbe, les traitements sont effectuSs ~ 37 ~ C pendant 12 ~, 24 h et suivis d'une postfixation par le tbtroxyde d'osmium. b. Colorations. Les ribonucl6oprotSines et les d6soxyribonucl+oprot6ines ont 6t6 diff6renci6es sur coupes ultrafines en mettant en oeuvre la technique r6gressive de Bernhard (I968-69) 5- I'EDTA (pour notre mat+riel les dur6es optimales de traitement out 6t6:2 mn sur la solution g 5% d'acbtate d'uranyle; 35 mn d ' E D T A ; iron 30 sur le citrate de Plomb; les t6moins sont obtenus en supprimant le passage sur I'EDTA.). Pour localiser les histones, nous avons utilis& la m6thode de Bloch et Hew (1960) au fast green-6osine en microscopie photonique et celle de Sheridan et Barnett (1969) a l'acide phosphotungstique (APT) en microscopie 61ectronique. c. Rkactions cytochimiques. Diverses m6thodes nous out permis de caract~riser I'ADN: Celle de Moyne (1972) qui consiste dans un premier temps, apres avoir pratiqu6 une hydrolyse sur du mat6riel fix6 par le glutarald6hyde, h bloquer les groupements hydroxyles 5- l'aide d'une ac6tylation; puis dans un second temps, les coupes ultrafines ayant flott6 sur le r~actif de Schiff, fi mettre en ~vidence, les groupements hydroxyles du complexe A D N hydrolys~-r~actif de Schiff par l'Sthylate de thallium selon Mentr6 (1972). Celle de, Gautier (1970), dans laquelle les 6chantillons, fix6s par le glutarald6hyde, hydrolys+s par l'acide chlorhydrique N 5- 60 ~ C pendant 15 ran, sont color6s par une solution d'amine d'osmium 5- 0,05% dans l'eau distill~e trait6e par le SO2 (nons avons apport6 toutefois une 16g+re modification dans la pr6paration de Famine en diminuant de moiti6, la quantit6 d'osmium r6agissant). Celle de Thiery (1972) (R~action Hatag) off les coupes ultrafines, provenant d'un matSriel fix8 par le glutarald~hyde, sont mises 5- flotter pendant 15 mn sur l'acide chlorhydrique, traitSes ensuite par la thiocarbohydrazide en milieu ac~tique puis par le prot6inate d'argent.
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Celle de Roels et Goldfischer (1971), modifi+e par Anteunis et al. (1973) applicable fi des +chantillons de volume r6duit (2 ou 3 anth~ridies seulement), ceux-ci fixes par le formol, sont mis fi incuber dans une solution de 3-3'Diaminobenzidine oxydae pendent 3 h /t 37~ C, postfix~s par le tetroxyde d'osmium fi 1% dens l'eau distill6e pendant 90 mn et inclus dans le m~lange Epon-Araldite. Dans tousles cas l'observation de coupes temoins est n~cessaire celles-ci sont obtenues en supprimant l'hydrolyse dens les m~thodes de Moyne, Gautier et Thiery et en remplac.ant la DAB par de l'eau distillOe dans la re+rhode d'Anteunis et coll. Pour caract~riser certaines prot6ines de type histone, nous avons employ~ la technique de MacRae et Meetz (1970): fixation au formoI /L 10% neutralis6 par l'ac+tate de sodium, immersion dans une solution d'argent ammoniaca] puis dans une solution de formol fi 3%. Apres lavage soigneux ~t l'eau, l'inclusion est effectu~e, selon les m6thodes habituelles. Les coupes ultrafines ont 6t6 examinees au microscope 61ectronique Siemens Elmiskop I.
R~sultats Le gamete mille de l ' E q u i s e t u m a r v e n s e presente une organisation bien particuliere (Duckett, 1973; H. M a b r o u k , 1976) caracterisee par une localisation peripherique, au contact du plasmalemme, des principaux organites et par leur disposition selon une spirale lfiche. L ' e t u d e de cette cellule est facilitee par l'examen de sections de materiel colore par l'acide p h o s p h o t u n g s t i q u e (APT), coloration qui interesse, outre le noyau, l'appareil cinetique. Une coupe longitudinale axiale de la cellule (Fig. 1), c'est ~ dire incluant l'axe de la spirale suivant ]aquelle se disposent les organites, permet de definir un pele anteriem (A) et un pele posterieur (P). A u pele antarieur (A), l'appareil cinetique est identifiable en trois endroits (Fig. 1-3), ce qui correspond /t la section d'une structure spiralee plane d ' u n tour et demi; une mitochondrie(m) de grande taille (que la technique ne permet pas de mettre en evidence) est toujours associ6e fi cet appareil cinetique. Ce dernier est constitue par un ensemble de microtubules, de fibrilles, de cinetosorues et de flagelles organises en un appareil complexe, fort c o m p a r a b l e fi ceux etudies chez d'autres gametes vegetaux (Carothers et Kreitner, 1967; Paolillo et al., 1968; D u c k e t t et Bell, 1969; Duckett, 1973). Le noyau, nettement sbpare de l'appareil cinetique, lui fait suite; tr~s effile fi son extremit6 anterieure (N1 et N2), il affecte une forme en massue au p61e posterieur (N3). Trois sections, decalees l'ane par r a p p o r t fi l'autre, sont identifiables sur ce cliche, ce qui c o r r e s p o n d / t la coupe d ' u n organite pregentant un enroulement spirale helicoidal. Les deux ensembles, n o y a u d'une part, mitochondrie-appareil cinetique d'autre part, sont relies et maintenus l'un 5. l'autre (grosse fl6che) par les microtubules de la bande fibreuse ($1). A u centre de la spirale decrite par l'appareil cinetique se localisent les restes du cytoplasme et les autres organites. Sur ce cliche, les flagelles(f) sont enroules a u t o u r du gamete dans deux d~pressions du pele anterieur. Pour ce qui concerne le n o y a u du gam6te mfir, dont l'6tude constitue le sujet de cet article, on constate, sur les coupes ultrafines observees en microscopie +lectronique (Fig. 4), qn'il est tres o p a q u e aux electrons et relativement h o m o g~ne. On peat y distinguer, apr~s mise en oeuvre des methodes usuelles de
Fig. 1. Caract6risation des prot6ines par I'APT; /t l'int6rieur du noyau seule une fine couche p~riph~rique est color,e; elle pr6sente des invaginations vers l'int&ieur de l'organite (fl6ches). Cette technique, qui met 6galement en 6vidence l'appareil cin6tique, permet de comprendre l'organisation du gain+re. CH, chromatine; J; flagelle; N, noyau; m, mitochondrie, x 23000 Fig. 2. Lorsqu'une digestion par la pronase pr~chde le traitement par t'APT, la coloration disparait (fI6che double); toutefois des structures non colorhes subsistent dans le nucl6oplasme. N., noyau. • 28000
Fig. 3. N o y a u du gam6te mfir trait6 par la pronase. La zone p6riph6rique est sensiblement 6claircie, bien que diverses structures fibreuses subsistent (fl6che) fi cet endroit; la masse centrale (CH) demeure tr6s homog6ne; les lentilles (/) ne sont pas dig+r6es, a, amidon; CH, chromatine; p, plaste. • 27000 Fig. 4. N o y a u apr6s mise en oeuvre des m6thodes usuelles. La chromatine (C/t) est tr6s dense; l, Ientille pbriph~rique; ran, m e m b r a n e nucl6aire; rip, nucl6oplasme, x 20000 Fig. 5. Apr6s traitement par la pepsine, on note un 6claircissement sensible du nucl6oplasme p+riphbrique (np) et de la masse centrale (CH) off les fibrilles (fl+che double) sont aisement perceptibles; les lentilles (/) conservent un contraste c o m p a r a b l e / t celui qu'elles ont apr6s emploi des m6thodes usuelles, m n enveloppe nucl6aire, x 70000
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fixation et coloration: une masse centrale tr6s condens6e (CH), form6e par la juxtaposition de nombreuses fibrilles; une tr6s fine touche de nucl6oplasme (np), de 0,2 ~t d'~paisseur, comprise entre l'enveloppe nucle~iire (nan) et la masse centrale (CH); quelques lentilles (1) p6riph6riques, form6es d'un mat6riel diff6rent de celui de la chromatine et de celui du nucl60plasme. a. Digestions enzymatiques Apr6s traitement par la pepsine (Fig. 5), la densit6 du noyau diminue; le nucl6oplasme est dig6r6 et une zone claire (fl6che), s6pare l'enveloppe nucl6aire (ran) de la pattie centrale (CH). L'enzyme agit 6galement sur cette derni6re et l'on distingue plus ais6ment les structures fibrillaires (flbche double), sur un fond sensiblement 6clairci. La pepsine, qui attaque aussi bien les prot6ines du nucl6oplasme que celles de la chromatine, n'agit pas sur celles des lentilles accol6es /t la membrane nucl6aire, lentilles qui conservent un contraste 61ev6. Cette enzyme, bien que n'ayant pas une sp6cificit6 absolue, coupe de pr6f6rence des liaisons peptidiques off figurent les acides amin6s aromatiques ou acides (Monneron, 1966); ces acides amin6s existeraient dans toutes les prot6ines du noyau fi l'exception de celles constituant les lentilles. Les r6sultats obtenus apr6s traitement du mat6riel par la pronase (Fig. 3) sont comparables aux pr6c6dents; toutefois la digestion nous semble moins importante bien que cette enzyme agisse (Monneron, 1966). La trypsine (Fig. 6 et 8) ne modifie pas sensiblement l'aspect de la masse centrale (CH); par contre elle produit un 6claircissement substantiel du nucl6oplasme (fl6che) et surtout la digestion des lentilles p6riph6riques (1),/t l'exception des trav6es opaques incluses dans ces derni6res (double fl6che), trav6es qui ne peuvent 6tre observ6es que difficilement apr6s emploi des m6thodes usuelles (Fig, 9, fl~che). Cette enzyme rompt des liaisons peptidiques du type Lys-X ou Arg-X; ces amino-acides devraient doric 6tre abondants dans les lentilles p6riph6riques. La ddsoxyribonuclkase (Fig. 7) 6claircit consid6rablement, la masse centrale (CH), si dense apr6s emploi des colrations usuelles (Fig. 9); seules des structures fibrillaires l~ches sont encore discernables. Par contre, le nucl6oplasme (fl6che, Fig. 7) et les lentilles (1) conservent un contraste relativement 61ev& Cette diminution du contraste permet de localiser I'ADN uniquement dans la zone centrale du noyau; les fibrilles persistantes correspondent probablement aux structures prot~iques li6es ~t l'acide nucl6ique. b. Mkthodes de colorations Coloration par I'APT: Dans les cellules que nous avons 6tudi6es, cette technique colore pr6f6rentiellement les microtubules de l'appareil cin~tique et certains territoires nucl6aires.
Fig. 6. Apr6s traitement par la trypsine, on note un +claircissement de la zone pbriph6rique (fl6che); Ies Ientftles (/) qui s'y trouvent sont ~galement dig6r6es. La masse centrale (CH) ne subit pas d'importantes modifications. • 20000 Fig. 7. Apr6s traitement par la d6soxyribonucl~?ase; la masse centrale (CH) s'6claircit consid&ablement; seules des structures fibrillaires lfiches sont encore pr6sentes. A la p~riph6rie du noyau une fine pellicule opaque aux 61ectrons (fI+che), correspondant au nucl6oplasme demeure contrast+e; les lentilles (/) accol~es fi l'enveloppe nucl6aire ne sont pas dig6r6es, x 23000 Fig. 8. Apr6s traitement par la trypsine, ies lentilles (/) sont digbrbes, fi l'exception des trav~es opaques aux ~lectrons (fl6che double), x 54000 Fig. 9. Sur cette preparation t~moin ou le mat6riel n ' a pas 6t6 trait6 par une solution enzymatique~ le noyau est tr6s opaque aux 61ectrons; les travees se distinguent ~t peine au sein des lentilles p6riph6riques (fl6che). CH, chromatine; l, lentille. • 54000
Fig. 10. Caract6risation de I ' A D N par la r6action de M O Y N E . Toute la partie centrale (CH) du noyau du spermatozoide est contrast6e; la couche p6riph~rique et les lentilles (/) demeurant transparentes aux 61ectrons. x 23000 Fig. 11. Coloration des prot6ines basiques par l'acide phosphotungstique (APT). U n e fine couche, opaque aux 6lectrons, est raise en 6vidence ~t la p6riph6rie du noyau; elle est r6gulibre vers l'ext+rieur, car limit6e par l'enveloppe nucl6aire, mais pr~sente des invaginations vers l'int6rieur (fl6che); la zone centrale (CH) n'est pas color+e, x 28500 Fig. 12. Coloration r6gressive fi I'EDTA. La masse centrale du noyau est enti6rement blanchie. La zone p~riph6rique est form6e par une couche finement granulaire (fl+che double), x 28500 Fig. 13. Caract~risation de I ' A D N par la m+thode de T H I E R Y . Seule la partie centrale est contrast6e (CH); la couche p6riph6rique (fl6che) et les lentilles ([) ne r6agissent pas. x 20000
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Sur la Figure 1, qui correspond/t une section suivant l'axe ant@o-postbrieur du gamete, la coloration employee, met on bvidence au niveau des trois sections du noyau, une fine couche p6riph6rique, /t contour r6gulier vers l'ext6rieur (car limit~ par l'enveloppe nucl~aire) mais pr6sentant des invaginations vers l'int6rieur (fl6che), comme si elle se moulait sur une zone centrale (CH)/t contour irrbgulier. Ces invaginations sont plus importantes aux extr6mitSs ~ffil6es du noyau (N2). Lorsque la technique est mise en oeuvre sur du mat6riel pr6alablement trait~ par la pronase (Fig. 2), la coloration disparait (fl6che double); les structures plus ou moins fibrillaires persistant fi l'int6rieur de la masse digbr~e, ne sont pas colorables par I'APT. Cette couche, opaque aux blectrons aprSs emploi de cette technique, correspond, par sa localisation et sa nature prot~ique, au nucl6oplasme p@iph6rique. Coloration r~gressive il E D T A . Apr6s raise en oeuvre de cette m6thode (Fig. 12), la masse centrale (CH), qui parait dense apr6s coloration par l'ac6tate d'uranyle et le citrate de plomb seuls, est enti6rement blanchie. Cette zone d6color6e (CH) est entour6e par une couche granulaire (fl6che double) qui correspond au nuclboplasme p6riph@ique. Nous n'avons jamais obtenu dans ce noyau, une 616vation du contraste de certaines structures comparable ~ celles qui, habituellement apr6s raise en oeuvre de cette technique, marque la pr6sence des ribonuclboprot6ines. I1 est fort probable que ces derni6res ont disparu ~ maturit6.
c. Rbactions cytochimiques Caractbrisation de I'ADN. Apras raise en oeuvre de la technique de Moyne
(Fig. 10), la partie centrale (CH) du noyau du spermatozoide mfir est seule fortement contrastbe; elle est tr6s homog6ne et tras dense ce qui rend dalicate l'observation des structures la constituant. La fine couche nucl~oplasmique p@ipharique (flache) n'est pas contrast~e, pas plus que les lentilles occupant les indentations de la masse centrale, et il est int&essant de constater que les clichas obtenus sont superposables, bien que les contrastes soient invers6s, avec ceux rbalis6s apras coloration du mat@iel par I'APT (Fig. 11). Apr6s la m6thode de Gautier (Fig. 17) ou celte de Thiery au TCH-prot6inate d'argent (Fig. 13), l'aspect du noyau est le mSme que celui obtenu apr~s raise en oeuvre de la raaction de Moyne (Fig: 10); on distingue toujours une masse centrale (CH) opaque aux 61ectrons, bien que le contraste obtenu varie tr6s sensiblement selon la technique employae; Le nucl6oplasme (fl6che) et les lentilles (1) ne sont, 1~ encore, jamais contrast6s. Le traitement par Ia 3-3'DAB oxyd6e (Fig. 18) qui permet de distinguer les acides nucleiques des proteines qui leur sont liaes met 6galement en 6vidence la masse centrale (CH), qui, fi fort grossissement (Fig. 16, flache double), parait formae d'61aments fibrillaires 6troitement juxtapos6s. Le contraste de la fine couche (Fig. 18, fleche) entourant la masse centrale et des lentilles (1) accol6es l'enveloppe nuclaaire n'est pas renforc6.
Fig. 14 et 15. Mise en 6vidence des histones riches en arginine par l'argent ammoniacal ; les particules opaques aux 61ectrons sont strictement localis6es dans la zone centrale. Fig. 14, • 15000; Fig. 15, x 21000 Fig. 16. Apr6s traitement par 3-3'diaminobenzidine oxyd6e; les 6lements fibrillaires constituant la masse centrale (CH) sont ais6ment discernables. Les ribosomes cytoplasmique sont 6galement tr+s contrast6s x 60000 Fig. 17. Caract6risation de I ' A D N par la technique de Gautier et Cogliati. La masse centrale (CH) est l~g6rement opaque aux 6te~trons; la touche p~riph6rique (fl~che) et les lentilles (/) Me sont pas r~actives, x 45000 Fig. 18. Caract6risation des acides nucl6iques par la 3-3'diaminobenzidine oxyd6e. La masse centrale (CH) du noyau apparait dense, et fort opaque aux 61ectrons. U n e couche p6riph~rique (fl6che) moins contrast6e entoure la zone centrale; elle correspond au nucl+oplasme. I ' A R N ribosomial est 6galement bien distinct, x 20000
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CaractOrisation de certaines protOines de type histone. Apras traitement par l'argent ammoniacal (Fig. 14 et 15), des particules opaques aux electrons (de 120/L 200 A~ de diamatre) apparaissent dans la partie centrale (CH) du noyau; elles sont strictement localisbes dens ce territoire et, aucune n'apparait dans le nucleoplasme paripherique (fleche) ou les lentilles (1).
Discussion
Le noyau de spermatozoide de l'Equisetum arvense parait fort comparable, apras emploi des methodes usuelles, /t celui des gametes libres d'autres vagataux, notamment en ce qui concerne l'extrame condensation de la chromatine. I1 en est ainsi chez le PtOridium aquilinum (Manton, 1959), l'Ascophyllum (Cheignon, 1964), le Nitella. (Turner, 1968), le Sphaerocarpus (Diers, 1967) ou le Polytrichum (Genevas, 1970), entre autres. Chez de nombreux spermatozoides libres, egalement, au cours de la gamatogenase, le nucleole se resorbe progressivement et disparait. Ce phenomene a eta suivi chez Polytrichum juniperinum par Allen (1912) et Crepin (1968). Bien qu'aucune technique ne permette de caracteriser I'ARN, en microscopie electronique certaines, telle la coloration regressive ~ I'EDTA ou calla /~ la 3-3'DAB oxydee, donnent le plus souvent des indications quant /t la presence de ce constituant nucleaire. Chez l'Equisetum les rasultats fournis par ces m6thodes, qu'elles aient ate raises en oeuvre avec ou sans digestion pr6alable par la ribonuclease, suggarent que le noyau du gamete mfir est dapourvu d'ARN. I1 convient toutefois de hater que chez les Bryophytes et la Selaginelle (Robert, 1974), off ce phanomane peut atre observ6, le cytoplasme disparait presque totalement, disparition qui s'accompagne ganeralement d'une resorption des ribosomes cytoplasmiques comme l'a mantra Genevas (1967), en microscopie alectronique, chez le Polytrichum formosum. I1 n'en est pas de marne chez l'Equisetum off le cytoplasme constitue, fi maturit6, une part importante du volume cellulaire, les ribosomes demeurant toujours presents. La membrane nucleaire dans le gamete de cette espece, comma dens celui de la Selaginelle, est toujours identifiable. I1 n'en est pas de marne chez PoIytrichum off son existence a pu m6me atre raise en doute. Toutefois, comma le suggare Ganevas (1970), il est probable qu'elle est, dens ce dernier cas, atroitement accolae aux masses osmiophiles adjacentes, et difficile fi discerner. Les methodes qui en microscopie alectronique nous ant permis de caractariser I'ADN, sont de plusieurs types; toutefois la plupart d'entre elles suivent le schema general de la reaction de Feulgen. La plus proche de cette derniare est celle de Moyne qui met en evidence /t l'aide de l'ethylate de thallium, les groupements hydroxyles resultants de la combinaison du raactif de Schiff et des groupements pseudo-aldehydiques liberbs par hydrolyse de I'ADN. Dans celle de Gogliati et Gautier (1973), l'amine d'osmium, dont la constitution chimique n'est pas encore exactement precisae, utilisee apr6s hydrolyse chorhydrique comme reactif du type Schiff, met en evidence specifiquement I'ADN.
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Dans celle de Thiery, les groupes ald6hydiques, r6v61~s par l'hydrolyse chlorhydrique, sont mis en 6vidence par la thiocarbohydrazide, elle mame r6v616e par le prot6inate d'argent. La mbthode propos6e par Roels et Goldfischer, fort diff6rente, n'est plus une application de la r6action de Feulgen; elle met en 6vidence les groupements phosphates des acides nucl6iques par la DAB oxyd6e. Ainsi, comme l'ont fait remarquer Anteunis et coll., de m6me que Roels et Goldfischer, l'intensite de la coloration 6tant proportionnelle aux nombres de groupements phosphates libres, I'ADN en raison de sa structure bicat6naire parait, sur les coupes ultrafines, plus contrastb que I'ARN. Toutes ces r6actions donnent au niveau du noyau du gam6te 6tudi6 des r6sultats comparables quant/t la localisation de I'ADN, r6sultats qui, en outre, sont en parfait accord avec ceux obtenus par d'autres m6thodes (coloration fi I'EDTA, digestion par la DNase): I ' A D N est toujours strictement localisO dans la zone centrale de l'organite. Les m6canismes chimiques mis en jeu sont diff6rents, ce qui permet de consid6rer ces techniques comme toutes parfaitement satisfaisantes. Toutefois la raise en oeuvre de ces r6actions, comme l'intensit6 de la coloration obtenue, sont sensiblement diff6rentes de l'une/~ l'autre. Ainsi la reaction de Moyne donne le contraste le plus 61ev6 mais sa r6alisation n6cessite de nombreuses manipulations; la 3-3'DAB permet d'obtenir un bon contraste, mais n'est pas sp6cifique puisqu'elle ne permet pas de distinguer avec certitude I'ADN des A R N ; Famine d'osmium est celle dont la raise en oeuvre est la plus simple, par contre les pr6parations sont tr6s peu contrast6es; le TCHprot6inate d'argent colore moins intensement mais la m6thode est facilement r6alisable. Pour ce qui concerne notre matdriel ce sont les rOactions de Moyne et celle au TCH-protdinate d'argent qui ont donnk les r~sultats les plus satisfaisants. Les m6thodes de caract6risation des prot6ines donnent des r~sultats plus d~licats ~ interpr6ter, en raison m~me de la vari6t~ des protbines pr6sentes l'int6rieur du noyau. La m6thode de Sheridan et Barnett (1969) consiste /t traiter le mat6riel par l'acide phosphotungstique en solution alcoolique au cours de la d6shydratation; les auteurs constatent alors une coloration 61ective du complexe synaptin6mique. Les contr61es qu'ils ont effectu~, in vitro, permettent d'attribuer la coloration/t une histone. Le m6canisme de la r6action et, par la suite le type d'histone color6, n'est cependant pas connu. Les colorations par I'APT sont nombreuses et diverses. Utilis6 ~ bas pH il met en 6vidence la fraction polysaccharidique des complexes glycoprot6iques (Pease, 1966; 1970; Marinozzi, 1966; Rambourg, 1967). En solution alcoolique, Gillies (1973) a montr~ qu'il contraste selon le temps de Coloration, soit les 616ments lat6raux du complexe synaptin6mique (apr6s 15 h de traitement), soit tout le complexe ainsi que la chromatine (apr6s 19 h). Dans le cas des gam6tes d'Equisetum arvense, la coloration par I'APT est obtenue apr6s un temps d'action court (12 h): elle met donc en 6vidence uniquement les prot~ines nucl6oplasmiques et celles de l'appareil cin6tique. Le traitement par les enzymes prot6olytiques (pronase) pr6c6dant celui par I'APT supprime le contraste ce qui doit 6tre rapproch6 des observations d'Emmelot et al. (1964) ;
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ces auteurs ont en effet montr6 que la coloration de la surface des cellules h6patiques par I'APT disparait lorsqu'elle est suivie d'une digestion par la trypsine, ou par simple flottage des coupes sur le s6rum physiologique. Les territoires contrast+s par I'APT en solution alcoolique sont les mSmes que ceux color6s, en microscopie photonique, par l'6osine dans la mbthode de Bloch (1960), au fast green-bosine, coloration attribube, dans ce cas, 5- la pr6sence de lysine; la prot6ine raise en 6vidence par I'APT peut donc 8tre riche en lysine, mais il est difficile de l'affirmer, la coloration par I'APT pouvant avoir une toute autre signification. La technique 5- l'argent ammoniacal colore spbcifiquement d'aprSs MacRae et Meetz (1970) les protbines riches en arginine. Les particules opaques aux 61ectrons, qui apparaissent dans la partie centrale du noyau, ont un diam6tre de 200 A. D'aprbs les auteurs elles correspondent 5- la coloration brune obtenue, en microscopie photonique, par Black et Ansley (1965). Dans notre matbriel, la mise en oeuvre, en microscopie photonique, de certaines techniques de coloration (fast green-6osine) permet d'attribuer une localisation comparable pour l'arginine, ce qui tend fi confirmer la valeur de la m6thode 5- l'argent ammoniacal. Les r6sultats obtenus, en mettant en oeuvre les techniques dont nous venons de discuter la valeur, montrent que, si l'on s'int6resse 5- l'organite dans son ensemble, il y a, dans le noyau du gamSte mfir, sbgr6gation des protbines du type histone: Celles riches en arginine 6tant toujours associ6es 5- I'ADN dans la partie centrale, celles vraisemblablement riches en lysine se situant dans le nucl6oplasme. Quant aux lentilles pbriph6riques, elles sont vraisemblablement constitubes de prot6ines non histone. Cette disposition est fort diffbrente de celle rencontrbe dans les cellules spermatogbnes off les diff6rents types de protbines coexistent au niveau du r6seau chromatique (article en prbparation). En conclusion, le noyau de spermatozoide de l'Equisetum arvense parait fort comparable, apr6s emploi des m&hodes usuelles, /t celui des gamStes d'autres v6gStaux, notamment en ce qui concerne la condensation tr6s importante de la chromatine et la r6sorption nucl6olaire. Toutefois les recherches cytochimiques, r6alis6es ~i l'aide de techniques sp6cifiques, montrent que I'ADN et les histones riches en arginine coexistent en btroite association dans la zone centrale du noyau. On retrouve 15. une forme d'organisation comparable/t celle rencontr6e chez les spermatozoides de diverses esp6ces animales (Chevallier et Gusse, 1975). Chez ces derni6res cependant la gam6tog6nSse s'accompagne d'une 61imination progressive des histones de type somatique riches en lysine. Chez l'Equisetum il n'y a pas 61imination fi propremerit parler mais plut6t une s~gr6gation de ce dernier type d'histone ~ la pbriph6rie de l'organite dans le nucl6oplasme. En outre chez les gam6tes animaux, il y a disparition compl6te des prot6ines non histones; dans le spermatozoide que nous avons 6tudib, ces derniSres persistent et se localisent dans les lentilles accol6es /t la membrane nucl6aire. La persistance de ces prot6ines constitue une particularitb qui semble exister 6galement dans les gam6tes de certaines S61aginelles (Robert, 1977).
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