Fd Cosmrr.

To.xicol. Vol. 13. pp. 427431.

Pergamon

Prrss

1975. Printed

in Great Britain

ZUR FRAGE EINER KOMBINIERTEN WIRKUNG EINES CHEMISCHEN MUTAGENS UND STRAHLENSTERILISIERTER NAHRUNG IM MUTAGENIT;iTSUND REPRODUKTIONSTEST BE1 DER MAUS H. W. Burldes/brschurlgsarlsta/t

/iir Erniihrung. Engesserstrasse (Eingegangerl

RENNER

Institut .Jir Strahl~rltech,lo/ogi~. 20. Bundmqwhlik Deutschland am 28 Januar

D-75

Kurlsrrrhe,

1975)

Zusammenfassung-Unter Verwendung von 2000 Mausen (NMRI/Han) wurde gepriift, ob die mutagene Wirkung von Cyclophosphamid (Endoxan) durch Verabreichung strahlensterilisierten Futters (Dosis, 4,5 Mrad) verstarkt wird. In einem Dominant-Letal-Test waren die mannlichen Tiere zu Versuchsbeginn mit 100 mg Endoxan/kg vorbehandelt. Die splten Spermatiden reagierten am empfindlichsten auf die Wirkung des Endoxans. Signitikante Unterschiede zwischen der Kontrollgruppe (Endoxan und unbestrahltes Futter) und der Versuchsgruppe (Endoxan und strahlensterilisiertes Futter) waren nicht zu ermitteln. Im Dominant-Letal-Test hat somit strahlensterilisierte Nahrung keine co-mutagene Wirkung zu Endoxan. In einem ‘I-monatigen Reproduktionstesf als Dauerpaarungsversuch ohne Laktationsphasen durchgefuhrt. wurden die weiblichen Tiere periodisch alle 2 Wochen mit 20 mg Endoxan/kg behandelt. Die Verringerung dcr Wurfgrosscn mit zunehmendem Alter und W.tnfzahl der Muttertiere war unter der Wirkung des Chemomutagens deutlich starker als ohne dieses. Die Wirkung des Endoxans kam such in einer erhijhten Zahl von Aborten und frtihzeitiger Sterilitlt zum Ausdruck. Der Einfluss des Verzehrs von strahlensterilisierter Nahrung war dagegen in den untersuchten Parametern zu keinem Zeitpunkt des Versuches erkennbar. Abstract-The possible intensification of the mutagenic effect of cyclophosphamide (Endoxan) by the feeding of a radiation-sterilized diet (dose, 4.5 Mrad) was studied in 2000 NMRI/Han mice. In a dominant lethal test, males were pretreated with IO0 mg Endoxan/kg body weight. The greatest sensitivity towards Endoxan was observed during the late-spermatid stage. No significant differences were detected between the control group (Endoxan plus non-irradiated diet) and the experimental group (Endoxan plus radiation-sterilized diet). In this test. radiation-sterilized feed showed no co-mutagenic effect when combined with Endoxan treatment. In a reproduction study of 7 months duration (continuous mating without lactation periods), the females were treated every 2 wk with 20 mg Endoxan/kg body weight. The decline in litter size with increasing number of litters (i.e. with advancing age of the females) was more pronounced after treatment with the chemical mutagen than in the untreated group. Increases in the frequency of abortions and in premature sterility resulted from Endoxan treatment. During the entire observation period, no effects from the intake of radiation-sterilized food were detected.

ElNFijHRUNG

In einer friiheren Untersuchung (Renner, Griinewald u. Ehrenberg-Kieckebusch, 1973) konnte’ keine

mutageneWirkung einesstrahlensterilisierten Futters auf MIuse und Ratten beobachtet werden. Seither sind uns iihnliche Untersuchungenvon Bronnikova u. Okuneva (1972 u. 1973)bekannt geworden, die ebenfallszu negativen Ergebnissenfuhrten. Die im folgenden beschriebeneArbeit galt der Frage, ob durch den Verzehr strahlensterilisiertenFutters die Wirkung einesChemomutagens verstlrkt wird. Als Chemomutagenwurde ein bekannter Mitosehemmer,dasCyclophosphamid(Endoxan@),gewlhlt, dessen mutagene Eigenschaften von mehreren Autoren beschriebenwurden (Angel, 1964; Arrighi, Hsu u. Bergsagel,1962;Brittinger, 1966; Rohrborn,

’

1970a).Folgendezwei voneinanderunabhlngigeVersuchewurden durchgefuhrt: In Versuch 1 wurde mittels des Dominant-LetalTestesgepriift, ob in den verschiedenenStadien des Spermiogenesezyklus die durch Endoxanbehandlung der mannlichen Tiere induzierten dominantenLetalmutationendurch Filtterung mit strahlensterilisierter Nahrung erhijht werden (Endoxanbehandlungder mannlichenTiere). In Versuch2 wurde in einem Dauerpaarungsversuch geprtift, ob die Reproduktionskapazitatder weiblichen Versuchstieresich verringert, wenn diese unter period&her Endoxanbehandlung zus;itzlich mit strahlensterilisiertem Futter ernahrt werden(Endoxanbehandlung der weibhchenTiere). EXPERIMENTELLER

TEIL

Tiermaterial und Haltung. In beiden Versuchen wurde der M&use-Auszuchtstamm NMRI/Han, SPF

@Oder Cytoxan; Warenzeichen der Asta Werke, Brackwede. 427

428

H. W.

RENNER

StandardgruppeB: physiologischeNaCl-Liisung (Zentralinstitutfur Versuchstierzucht,Hannover) verund strahlensterilisierte Nahrung. wendet.BeideVersuchewurdenmit 10Wochenalten Kontrollgruppe C: periodische EndoxanbehandMPusengestartet.Alle Tiere wurden einzeln in MakrolonkafigenTyp 2 gehalten.Die Versuchstierraume lung und unbestrahlteNahrung. VersuchsgruppeD: periodischeEndoxanbehandwaren vollklimatisiert: Lufttemperatur 21 f 1°C lung und strahlensterilisierte Nahrung. relative Luftfeuchte 60”/, + 5, Luftwechsel/h 15-fach mit Luftfilterung und 1Zstiindigen Hell-Dunkel; Durch die bei diesem Versuch mitgefuhrten Rhythmus. Gruppen A und B solltegeprtift werden,ob sicheine Diiit. Den Tieren wurde Altromin H in pelletierter Auswirkung der strahlensterilisiertenDiat (ohne Form ad lib. gefiittert. Fur die Tiergruppen,die strah- Endoxan) auf die permanenteReproduktionsbelalensterilisierteNahrung erhielten,wurde Altromin in stungfeststellenIHsst. jeweilswochentlichenAbst;indenmittelsdesinstitutsParallel zu den Endoxanbehandlungen der C- und eigenen Elektronen-Linearbeschleunigers mit 10 D-Weibchenwurde den A- und B-WeibchenphysioMeV Elektronenund einerDosisvon 45 + 08 Mrad in offenen Paletten bestrahlt. Allen Tiergruppen logischeKochsalzliisunginjiziert. Bei Versuchsbeginn wurde wijchentlich eine Vitaminsupplementierung wurde die Zahl der Paareje Gruppe auf 55 erhoht, iiber das Trinkwasser verabreicht (Multibionta, E. urn nach Erscheinender ersten beiden Wtirfe bis dahin nicht trlchtig gewordene Weibchen-gegeMerck AG, Darmstadt). benenfallswahllos andereWeibcheezu eliminieren Versuch 1

und damit alle vier Gruppen auf 50 fertile Paare zu DieserVersuchwurde aus personellenund rlum- bringen. lichen Griinden in zwei hintereinanderablaufenden Unmittelbar nach einer erfolgten Geburt wurden Serien(a und b) durchgefbhrt.Nur sokonnte der Ver- die Jungenentfernt, noch bevor bei den Muttertieren suchmit der notwendigerweise hohen Zahl von 400 eine Laktation in Gang gekommenwar. Dadurch mannlichen und 1200 weiblichen Mausen durch- konnte noch am gleichenoder folgendenTag eine geftihrt werden. Bei Versuchsbeginnwurden allen erneuteKonzeption eintreten.Registriertwurden bei mannlichenTieren 100mg Endoxan/kg Kiirperge- jedemWeibchendie Geburtstermineund die Zahl der wicht subkutaninjiziert. Einen Tag danachwurde die Jungen.Der Versuch lief tiber 212 Tage. Nach 191 erste Gruppe gepaart und in wochentlichen Tagenwurden alle Mlnnchen entfernt. Abstinden jeweils eine weitere Gruppe (Paarungsverhliltnis 1:3). Da die Endoxanwirkung in der Woche7 weitgehendabgeklungenwar, wurdeauf eine ERGEBNISSE UND DISKUSSION zunachstmitgefuhrte Gruppe fur die Woche 8 verzichtet, was such beim Vergleichmit einer unbehan- &much I delten ‘Standardgruppe’(n = 118)aus vorangegang- In Tabelle 1 sind die Ergebnissevon Versuch 1 Die enenUntersuchungen(Renneret al. 1973)gerechtfer- getrennt fur Seriea und Serieb wiedergegeben. tigt schien.Die mannlichenund weiblichenMIusen Endoxanwirkung ist in den ersten beiden Wochen erhielten entwederunbestrahlteNahrung (Kontroll- nach der Behandlungder Mannchen deuthch an der gruppe, K) oder strahlensterilisierteNahrung (Ver- HShe der toten Implantate bzw. der lebendenFeten erkennbar(Tabelle1).Die Zahl der praimplantativen suchsgruppe, V). Die Mannchen wurden jeweils bis zu 7 Tage in Eiverluste reflektiert die Wirkung des Chemomuden Paarungsk&igen belassen. Weibchen mit tagensnicht eindeutig.Bei dem Vergleich der Daten Vaginalpfropf wurden von den MPnnchen getrennt. fii die Kontrollgruppemit der obenerwiihnten‘StanIn den Fallen, in denenin einemKafig nach Ablauf dardgruppe’ ergibt sich fur die Variable ‘lebende desTages3 noch kein Weibchenmit Pfropf festge- Feten’ ein statistischhochsignifikanterUnterschied, stellt werdenkonnte, wurdedasMannchen gegenein d.h. dasEndoxanhat die erwarteteund beabsichtigte anderesausgetauscht,dessenBefruchtungsfahigkeit Wirkung ausgetibt.In Ubereinstimmungmit den Unsichbereitserwiesenhatte. Dadurch war es miiglich, tersuchungenvon Rohrborn (1970a)und Brittinger rnannlicheSterilit;it aus dem Versuchauszuschalten. (1966) wurde die st;irkste induzierte Wirkung Die trachtigenWeibchenwurdenzwischendem 15. gefunden,wenn die mannlichenKeimzellen im Staund 17. Tage der Gravidit;it laparatomiert, wobei dium der spaten Spermatidenvon der Endoxanbenach Herauspraparieren von Uteri und Ovarien die handlunggetroffenwaren. In Seriea wurde zunfichst Daten fur den Dominant-Letal-Test gewonnen nocheineKontrollgruppe fur die Woche8 mitgefuhrt, wurden.Zur vollstandigenErfassungder frtihen Post- die aber keine erkennbaren Nachwirkungen der implantationsverluste (Deciduomata) wurden die Endoxanbehandlungmehr zeigt. Es ist auffallend, Uteri nach einer auf Wislocki u. Dempsey (1945) dassdie Mittelwerte/WeibchendieserGruppe ausser zurtickgehendenMethode angefarbt. bei Pr%rnplantationsverlustenin allen Parametem besser liegen als die der ‘Standardgruppe1973’aus Versuch 2 dem friiheren Versuch. Im Versuch2 wurdenden weiblichenTieren perioKernfragediesesVersuchesist, ob signifikanteUndisch in 14t;igigen Abst;inden 20 mg Endoxan/kg terschiedezwischendenVersuchs-und den KontrollKorpergewicht (in 0,2”/,iger Losung) subkutan inji- gruppen auftreten. Ein Verdacht ergibt sich aus der ziert. Ab demTage nach der erstenInjektion wurden Feststellung,dassdie Zahl der toten Implantate bei die Weibchenmit unbehandeltenMannchen in per- Serie a in der Woche 2 und bei Serie b in der manent monogamer Paarung gehalten. Folgende Woche 3-6 in der Versuchsgruppehoher liegt als in Gruppen (cede50 Paare)wurdengebildet: der Kontrollgruppe. StandardgruppeA: physiologischeNaCl-LSsung Bei der VerwendungeinfacherFormeln, die hiiufig (Weibchen)und unbestrahlteNahrung (alle Tiere). bei der Interpretation von Resultatenausdominanten

Wirkung eines Mutagens und bestrahlten Futters Tabelle

I. Dominant-Letal-Test

iiber

die

Dauer

der

Spermiogenese (Versuch

nach

429

Vorbehandlung

miinrtlicher

M&e

rnit

Endoman

I)

Zahl/befruchtete Weibchen n

Gelbkorper

Woche*

K

V

K

V

K

I 2 3 4 5 6 7

94

93 28 25 28 23 27 29

15.1 15.4 17.0 l7,9 16.2 15.8 16.8

l5,l 14.7 16.1 l6,3 Il.6 l6,5 15.5

Il.6

I I.3 1 I.0 13.0 12.6 II,8 I I.4 12.9 13.0

(16.1)

(122)

28 28 25 27 28 28 I8

;W I 2 3 4 5 6 7.

93 32 34 32 30 29 30

93 33 31 33 30 30 32

15,2 15.2 15.4 I5,4 15.7 15.7 16.2

Prlimplantationsverluste

Implantate V

V

K

V

K

V

3.8

4.0 5,l 3.9 4-2

3.2 2.9 2.7

2.8 3,3 2.7 I.8 1.7

831 871

8.3 6.3

15.3

I I.2

14.7 14.6 15.9 l5,5 15.8 I54

II,2

I I,6 I2,4 I I,9 l2,O I2,3

4,4 4.0 5,3 4.4 4.4 3,9

12.2 l2,l II.6 I49 l2,O

6.0

5.6 3.5

II.0

4,u

9.5

4.0

I I,6

3.8

12.3 II.8 II.9 I I,4

3,0 3,8 3.7 3.9

2.4 2,l 1.5 1.9

136 I.3

/ipSj

$9,

Serie b

Lebende Feten

K

Serie a

II.1 9.6

‘Tote Implantate

4.3 5.2 3,o 3.6 3.7 3.9 4.0

3.1 3.3 I,7 I,8 1.5 1.7

9.5 IO,3 9.9 9.3 IO.7

II,0 II,6

(10.7) 2.8 3.0

2.1 22 1.8

2.1 1.5

I.8

.lO.3 10.2 9.7 9.9

831

8.2 6.5

7.8 9.9 IO,6 10.4 IO.3 10.5

9.5

IO.1 IO.0

9.8 9.8

n = Zahl der befruchteten Weibchen K = Kontrolle (100 mg Endoxan/kg + unbestrahlte Nahrung) V = Versuch (100 mg Endoxan/kg + strahlensterilisierte Nahrung) SC = ‘Standardgruppe 1973 *Verpaarungszeit nach der Behandlung: Die entsprechenden behandelten Stadien waren: Woche I. reife Spermien; 2, spate Spermatiden; 3, mittlere und frtihe Spermatiden; 4 und 5, Spermatozyten; 6-8. Spermatogonien.

Letalstudien angewandtwerden (Rohrborn, 1970b), miissen statist&he Priifverfahren herangezogen gelangtman im Bereichdes suspektenSpermiogene- werden.Hierfiur kommenTestsfur zwei unabhlngige seabschnittes zu demin Tabelle2 gezeigtenBild. For- Stichprobenin Frage, insbesondere der ,$-Test und meln, die mit der Zahl der corpora lutea arbeiten. der U-Test (Rangzahlentestnach Wilcoxon, Mann wurden als ungeeigneterachtet, weil sie einen wei- und Whitney). Bei den statistischenTestswurde nicht teren Unsicherheitsfaktorbeinhalten.Bei den prozen- mit den Mittelwerten der Tabelle I, sondernmit den tualen Postimplantationsverlusten liegen die Werte absolutenZahlen gerechnet. der Versuchsgruppe teilweiseiiber, teilweiseunter den Der X2-Test bei Implantaten (tote lmplantate + Werten der Kontrollgruppe. Der deutliche Unter- lebendeFeten) deckt einen deutlichen Unterschied schiedin der Woche 2, Seriea, tritt in der Wiederho- nur in der Woche 2, Serie a, auf. Die im Xl-Test lungsserie (2b)nicht auf. Ein ahnlichesBild zeigt such Woche 2a auftretendeSignihkanz(P < 0,05)hat sich die Berechnungder ‘induziertenLen&at’: Der in der in der Wiederholungsserie (2b) nicht bestiitigt. WichWoche 2aerhiiht erscheinende Wert fur dieseBerech- tig isf dassder wesentlichschlrfer priifende U-Test nung tritt bei der Wiederholung(2b) nicht auf. bei ‘toten Implantaten’ und bei ‘lebenden Feten’ Urn zu klaren. ob signifikante Unterschiede weder in der fraglichen Woche 2 noch in einem zwischenVersuchs-und Kontrollgruppen bestehen, anderenAbschnitt der Spermiogenese einen Unterschiedaufdeckt.Insgesamtbetrachtetlassensich folglich eindeutigeUnterschiedezwischenKontroll- und Tabelle 2. Rechnerische Priijimg (Versuch 1) Versuchsgruppenicht finden. Daher wird das Versuchsergebnis dahingehendinterpretiert, dasseinecoPostimplantationsmutageneWirkung von strahlensterilisierter Nahrung verluste (%)* zu Endoxan im Dominant-Letal-Test unter den Induzierte Letalitat Woche Kontrolle Versuch beschriebenen Versuchsbedingungen nicht nachweisnachImplantationt bar ist. la 28.0 25,0 -4,1 lb 2a

27.6 26.2

25.4 34,2

-3,0 I48

Tabelle3. lung

2b 3a

29.9 21,2

14.6

21.7 31.4 18.0

4a

18.8

14.7

4b

l4,4

l7,7

3b

Dauerpaarungsversuch weiblicher Mliuse

mit

unrer periodischer Endosarl (Versuch

Behand2)

i: 319 -5.9 338

Gruppe A B C D

Reproduklionslcislung’ 83.5 823 525 54.9

*(ToteImplantate/Implantate) x 100.Standardgruppe l3,3. lebende Feten/Implantate:Versuchx ,oo, *GeboreneJungefleibchen. lebende Feten/Implantate: Kontrolle> tOhne Aborte.

Wurlzahl*t

Wurrgr6rx*t

8. I 8.2 1.5 7.4

10.3 IO.0 7.0 7.4

430

H. W. RENNER Tabelle

A

1 2 3 4 5 6. 7 8 9 10

Versuch

Wr~qrLjsse

11.6 11,o 12.4 Il.8 1 I.0 9.8 8,7 9,1 7.5 5.1

+ f f + * + f f f f

sind die Zahlen

2.7 4,l 4,O 4,6 4,o 4.4 4.5 3,7 4,4 28

(50) (49) (49) (47) (45) (45) (42) (39) (28) (9)

+ 2.9 (50) k.4.1 (50) f 4.6 (50) f 3.6 (50) f 4,8 (49) f 3,9 (47) 8.7 f 3.8 (44) 6,9 k 4.4 (38) 6.6 f 431 (24) 5.6 + 3.1 (8)

der Weibchen,

5. Dauerpaarungsversuch: Anzahl Gruppe je 20-Tqe-Interval1

die den jeweiligen

der

Jungen/

Gruppe

6;25.3. -14.4. - 5.5. -25.5. -14.6. - 4.7. -24.7. -13.8. - 2.9. -22.9. -12.10. Summe...

A

B

C

D

42 573 526 614 511 438 400 381 300 257 133 4175

61 539 619 536 549 437 409 345 261 244 116 4116

49 210 430 336 322 292 218 239 184 176 171 2627

48 175 413 392 327 373 209 288 154 202 162 2743

40::

1962’ 2044

665

699

davon:

tot geboren. . . 84 lebend geboren. . . 4091

Gtirrf(mit

Aborten)

bei Gruppe C

11.8 11.1 I1,2 12,2 IO,1 9,7

2

W&interval1

I.-IO.

B

Fiir den Versuch 2 ist das Ergebnis in Tabelle 3 an Hand der drei Parameter, Reproduktionsleistung, Wurfzahl und Wurfgriisse zusammengefasst. Die Wirkung des Endoxans (Vergleich der Gruppen A und B mit den Gruppen C und D) ist deutlich zu erkennen. Dagegen zeigt sich keine offensichtliche Wirkung der Bestrahlung (Vergleich A mit B und C mit D). Wiihrend der 7-monatigen Versuchsdauer sind aus der Gmppe A fiinf, der Gruppe B eine, der Gruppe C eine und der Gruppe D drei weibliche Tiere durch Tod ausgeschieden. Die mit zunehmender Wurfiahl abnehmende Wurfgriisse wird aus Tabelle 4 deutlich. Die Reproduktionskapazitt war mit dem 10. Wurf in den Gruppen C und D praktisch erschijpft, in den Gruppen A und B war sie zu diesem Zeitpunkt noch bei einem kleinen Teil der eingesetzten Weibchen mit stark reduzierten Wurfgri5sse.n erhalten. Die Dauerbelastung der weiblichen Versuchstiere durch Reproduktion und Endoxan kam ausser in den sich verringernden WurfgrGssen noch in hlufigen Aborten oder in friihzeitiger Sterilitit zum Ausdruck (12 und 13 Aborte bei 391 und 397 Wiirfen in den Gruppen A und B, aber 58 und 54 Aborte bei 316 und 315 Wiirfen in den Gruppen C und D). Die Verabreichung der bestrahlten Dlt hatte dagegen keinen Einfluss auf die Hiiufigkeit von Aborten und Tabelle

wm

WurfgrSsse/Weibchen

Nummer des Wurfs

In Parenthesen

4. Dauerpaarungsuersuch:

5.1 8.7 9.4 7.2 6.4 6.2 6.4 6,2 732 5.5 Wurf

+ + * f f f + f f f

gebracht

5,3 4,3 4,3 5,2 4,7 4.2 4,7 4,2 4,7 3,5

D (50) (50) (50) (50) (50) (47) (38) (28) (9) (2)

4.8 8.7 8,7 8,l 8.6 6.2 8,l 5,6 7.2 7,O

+_ 5.3 f 4.0 f 4.9 + 4,4 f 4.8 f 4,7 + 4.0 + 4,4 f 5,2

(50) (50) (50) (50) (47) (46) (36) (26) (13) (1)

haben.

Wiirfen. Die erwartete induktive Wirkung des Endoxans hat zu signifikanten Unterschieden zwischen den Gruppen A und C bzw. B und D geftihrt: P c 0,001 (X*-Test). Ein analoger Vergleich zwischen den Gruppen A und B l&t dagegen keinen Unterschied aufgrund der Strahlensterilisierung des Futters erkennen, ebensowenig unterscheiden sich die Gruppen C und D. Aus dem gleichmiissigen Abfall der Wurfgrijssen in den Endoxan-behandelten Gruppen C und D (Tabelle 4) kann ebenfalls gefolgert werden, dass die zutitzlithe Futterbehandlung (Bestrahlung) bei der Gruppe D zu keinem sichtbaren Unterschied gegeniiber C geftihrt hat. Diese Aussage ist aber zu pauschal, da sie nur auf den Mittelwerten (mit hoher Standardabweichung) beruht. Daher wurde der gesamte Versuchszeitraum in gleiche Tr%chtigkeitsintervalle (Tabelle 5) zu je 20 Tagen eingeteilt und die Zahl der in den einzelnen Zeitrlumen geborenen Jungen registriert. Auch diese Art der Darstellung ergibt nur zuf?illige Unterschiede beim Vergleich A mit B und C mit D. Es kann gefolgert werden, dass die Reproduktionsleistung von unter period&her EndoxanBehandlung stehenden weiblichen MPusen durch Verftitterung von strahlensterilisierter Dilt nicht beeinflusst wird. Anerkennungen-Verfasser dankt Herrn Prof. Dr. N. Brock fir die freundliche Uberlassung des Cyclophosphamids zu unseren Versuchszwecken und Herrn M. Knoll fir gewissenhafte und sorgfSge technische Assistenz bei der Durchftihrung der Versuche.

LITERATUR Angel, H. (1964). ijber die Wirkung des Trilthyleniminobenzochinon-1,4 (Trenimon) und des N,N-Bis-(Bchlor;ithyl)-N,O-propylenphosphorslureesterdiamid (Endoxan) auf den Schwangerschaftsverlauf, die

Embryonalentwicklung, die Fertilitit und die Mutagenitit sertation.

an dem Universitit

Rattenstamm BDI. Inauguraldisdes Saarlandes, Homburg/Saar.

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431

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