Acta neuropath. (Berl.) 32, 199--207 (1975) 9 by Springer-Verlag 1975

La rdaction de Marchi: Aspects uhrastructuraux Claude F u e n t e s et R o b e r t MarLy Laboratoire de Neurophysiologie, Universit6 des Sciences et Techniques du Languedoc Montpellicr, France l~e~u le 3 mars, 1975; accept6 le 20 mars, 1975 The Marchi R e a c t i o n : U l t r a s t r u c t u r a l Aspects

Summary. A secondary demyelination process was brought about in the optic tract by unilateral enucleation of 10 adult rats which were sacrificed at 8, 15, 20, 30 and 45 days respectively, after the intervention. The Marchi reaction, which is identifiable by the presence of granular bodies, is positive at all stages, but tends to lessen towards the 45th day. The granular bodies are inside the disintegrating myelin sheath, and gradually fill the space made available by the degenerate axoplasm. The granular bodies are at first bulky and compact before breaking up and disappearing. The remains of the myelin sheath are then resorbed. Satellite cells occur from the 15th day onwards. The interest of the Marchi reaction for the tracing of nervous pathways is confirmed by these findings. Key words: Marchi Reaction -- Secondary Demyelin~tion -- Electron Microscopy.

Introduction La m6thode de Marchi et ses variantes contemporaines, d6riv6es pour la plupart du procdd6 de Swank et D a v e n p o r t (1934, 1935) sent actuellement en ddfaveur auprbs des neuropathologistes et des neuro-anatomistes. Deux raisons principales justifient a p p a r e m m e n t cette ddsaffection & l'6gard d ' u n des rares procdd6s hodographiques disponibles au sens strict du terme: d ' u n e part, les corps granuleux -- 616ments d'identification de base -- soul6vent la suspicion sur plusieurs points (unit6 ou diversit6, nature exelusivement lipidique ou non, fid61it6 discutable du trajet qu'ils dessinent); d ' a u t r e part, l'impossibilit6 de mettre en 6vidence les fibres amy61iniques. Cette deuxi6me critique t r o u v a n t en elle-mgme ses limites, l'objectif de notre analyse concernera seulement la premi@re sdrie d'argumerits, en utilisant comme matdriel d'dtude un segment des voles visuelles primaires ne c o m p o r t a n t que des axones et des cellules ndvrogliques, en l'occurrence le traetus optique du Rat, apr6s 6nucldation unilatdrale. E n ce qui eoncerne la n a t u r e des matdriaux mobilisds par la mdthode de Marchi et en se limitant s ceux 6 m a n a n t des gaines de mydline, l'accord semble actuellement fair entre neurochimistes et histochimistes. La mdthode est une r~action qui t r a d u i t la libdration prdcoce d'esters du cholestdrol p e n d a n t une pdriode limitde, laquelle succ~de la lente dissociation des autres constituants lipidiques de la mydline, cdrdbrosides et sphingomydlines en particulier (Adams, 1958, 1965; W o l f g r a m et Rose, 1958; Wolman, cf. 1970). Sur ces bases, il devient possible de soumettre les corps granuleux s une analyse ultrastructurale & divers intervalles c o u v r a n t les principales drapes de la d@gdndrescence walldrienne eonsdeutive & l'dnucldation.

200

C. Fuentes et R. Marry

M~thodes Le rat a 4t~ choisi parce que le tractus optique, dans cette esp@ce, comprend une forte majorit4 de fibres crois~es (90 ~ 95~ selon Polyak, 1957). Dix rats de souche Wistar, m~les et adultes, d'un poids moyen de 300 g, ont ~t6 utilis6s. L%nucldation unil~t@rale a ~t~ pratiqu~e sous anesth6sie au pentobarbital sodique, en m6nageant au maximum les v~isseaux. Les animaux, soumis ~ un traitement postop6ratoire appropri@, ont @t4 sacrifi~s par paire & des intervalles de 8, 15, 20, 30 et 45 jours. La mdthode histologique a~loptde est bas~e sur la variante de la technique dire de Swank et Davenport (1935) proposde par Foltz et Matzke (1960); elle en diff@re au moment de l'imprdgnation osmique. Le proc6d~ est au total le suiv~nt. Apr~s perfusion de 500 ml d'un m@lange compos6 & parties ~gales de chlorate de potassium (solution aqueuse ~ 2,5~ et de bichromate de potassium (solution aqueuse s 6~ le eerveau est imm@diatement lor@lev4 et immerg@ pendant 12 h dans de la formaline & 10~ salve et neutralisde. Le cerveau est alors fractionn4 en blocs de 3 s 4 mm d'@paisseur et plac~ pendant 5 ]ours dans le liquide de perfusion puis, sans lavage, pendant 4 jours ~ 10~ dans le m61ange suivant: liquide de Mfiller, 2 volumes; solution aqueuse de t~troxyde d'osmium s 10/0, i volume. L'immersion est poursuivie pendant 3 jours suppldmentaires ~ la temp@rature de la pi@ee dans le m~me m@lange renouvel~. Les blocs sont alors inclus dans la celloi'dine, puis coup~s s 100 tzm. Deux coupes sur trois sont destindes ~ la microscopie optique; ]a troisi~me est trait@e pour la microscopie ~lectronique. A cette fin, le tractus optique est pr61ev~ dans la masse sous loupe binoculaire, d@barrass~ ensuite de la cello~dine par l'alcool-6ther, inclus dans l'araldite enfin. Le bloc est alors ddbit@ en coupes de 600 ~ environ. Apr~s contre-eoloration par l'ac@tate d'uranyle-citrate de plornb, les coupes sont mont~es sur grilles au collodion et observ@es sur microscope J E M 100 ]3.

R@sultats

Microscopie optique a) 8~, 15~ et 20~ jour postopdratoire Au 8~ jour, le trac~us optique situ~ du cbt@ oppos~ & l'dnucldation pr6sente dans son ensemble une r6action positive. A 15 et 20 jours, la r~aetion paralt plus intense (Fig. i a e t b) ; elle pr6domine darts la portion du tractus qui longe successivement le pied du p~doncule et la face latdrale du thalamus. A grossissement ad6quat, l'on observe en abondance des corps granulenx disposds longitudinalement selon le grand axe du tractus (Fig. 1 c et d), ainsi que des granules plus petits en nombre moindre et des fragments particulaires en quantit@ minime. Les corps granuleux proprement dits sont de formes et de dimensions varides, et d'opacit6 globalement homog~ne (Fig. 1 d). Dans le tractus homolat~ral par rapport & l'6nucl6ation, la r~action de Marchi n'est positive que sur son bord latdral. Ainsi se trouve confirm~e la localisation en cet endroit des fibres directes en provenance de la r@tine.

b) 30~ et 45~ ]our postopdratoire Bien qu'eneore positive, la r~action de Marchi semble s'att@nuer sur l'ensemble du tractus. Ce ph6nom~ne, qui exprime tr~s probablement l'~limination d'un hombre important de fbres ddg~n~r6es, n'a pas ~td analys@ dans ce travail.

Microscopie ~lectronique L e s a s p e c t s u l t r a s t r u c t u r a u x successifs des c o r p s g r a n u l c u x s u g g ~ r e n t u n e s ~ q u e n c e 6 v o l u t i v e q u i p e u t p a r a l t r e de p r i m e a b o r d t r o p s c h ~ m a t i q u e . E n effet, le p r o c c s s u s d e ddg@n~reseence w a l l 6 r i e n n e n ' a f f e c t e pas s i m u l t a n ~ m e n t t o u s l e s a x o n e s d u t r a e t u s , de s o r t e q u e , & c h a q u e i n t e r v a l l e choisi, c o e x i s t e n t des s t a d e s diffdrents de d 6 m y ~ l i n i s a t i o n s e c o n d a i r e . Or, l ' ~ t a p e (( M a r e h i - p o s i t i v e ~) d e celle-ci p r 6 s e n t c a p p a r e m m e n t s o n m a x i m u m e n t r e le 8 ~ e t le 45 ~ j o u r p o u r l ' e n s e m b l e d u

Aspects ultrastrueturaux de la r6action de Marchi

201

Fig. 1 a--d. La r~action de Marchi dans le tractus optique, 15 jours apr~s ~nuclgation s droite. Bilan en microscopic optique. (a) Le tractus optique gauche (T.O.) est impr~gn6 sur route sa longueur Gx 8. (b) Les corps granuleux sont visibles; l'imprggnation pr6domine k la pattie m6diane du T.O. Gx 50. (c) D&ail de la partie mgdiane du T.O.. corps gr~nuleux abondants, massifs et compacts, aeeompagn~s de partieules plus petites. Gx 400. (d) D&ail de 1~ fig. e. Corps gram~leux typiques, de dimensions et de formes vari~es. Aux alentours, fragments partieulaires et eellules satellites (4). Immersion Gx 1600. a--d, Coupes/~ la celloidine (100 ~m)

202

C. Fuentes et R. Marry

tractus. Dans ees conditions, l'6volution propos6e ci-dessous exprime probablement la s6quenee r6elle des fairs.

a) Ddlai postopgratoire : 8 ]ours (Fig. 2a et b) Les corps granuleux typiques se pr6sentent sons la forme de masses arrondies, plus rarement multilob6es, trgs denses aux 6lectrons sans ~tre cependant totalement homog~nes. Tels les fragments de m6tal inclus dans les grelots, ils song situ6s dans la lumi~re de la fibre dont l'axoplasme est en 6tat de r6sorption plus ou moins avane6e. La gaine de my61ine poss~de encore grossi~rement sa silhouette primitive, mais se trouve d6js profond6ment remani6e. Ses feuillets dissoci6s tendent s se regrouper (Fig. 2 a) ou ~ s'effilocher, dormant 5, son pourtour un aspect 6chevel6 plus ou moins l~chc (Fig.2b). Par endroits, la structure lamellaire s'estompe pour former des plages pales, contrastant avec l'aspect relativcmcnt lone6 de la gaine. Ce fair permet de supposer que des mat6riaux identiques s ceux qui constituent les corps granuleux se tronvent encore dans les divers feuillets.

b) Ddlai postopdratoire: 15 ]ours (Fig. 2c et d) L'axoplasme, selon route apparence, a complbtement disparu. Les corps granuleux occupent la quasi-totalit6 de la fibre. Suivant le plan de coupe, ils se pr6sentent comme des blocs hdtdrog~nes (Fig. 2 c) on des masses compactes (Fig. 2d) La gaine de my61ine est encore nettement identifiable, mais plus profonddment altdrde que prdcddemment. Des segments denses s'y voient encore, mais ne constituent plus: qu'une minorit6 sur un fond gris~tre off subsiste la ((lamination )) (Fig. 2 d). Un certain nombre d'axones se trouvent ineorpords dans du cytoplasme glial, probablement astroeytaire. Les uns se pr6sentent eomme les pr6c6dents, y eompris leurs corps granuleux; mais d'autres song visiblement dans un 6tat de d6g6n6rescence plus avanc6e, s'exprimant soit par la d~sagr6gation des corps granuleux, soit par leur absence. Dans ce dernier eas, la gaine est r6duite k quelques feuillets effilochds, dispersgs dans sa lumi6re.

c) Dalai postop~ratoire: 20 ]ours (Fig3a) La plupart des corps granuleux song en cours de fragmentation et de d6sagr~gation. La gaine de my61ine, tr~s pale et amenuis6e, est pliss6e sur tout son pourtour. A c e stade, l'on ne pent plus parler syst6matiquement de formations plus ou moins massives enferm6es dans une tubulure, mais plut6t de fragments granuleux encore contenus par des vestiges concentriques de gaine. Dans certaines cellules satellites des axones phagocytds pr6sentent des corps granuleux dissoci6s des degr6s divers ou bien seulement des feuillets de my61ine tr~s laches, 6tal6s sur route Ieur lumi~re.

d) D~lai postop~ratoire : 30 ]ours L'aspect des axoncs est tr~s comparable 5~celui de l'6tape pr6c6dentc, ainsi que celui des cellules satellites avec peut-~tre, dans celles-ci, un degr6 plus avanc6 de phagocygose.

Fig.2a--d. Aspects ultrastructuraux de la r6action de 3/[archi a e t b. D~lai postopgratoire: 8 jours. (a) Corps granuleux disposgs dans la lumigre axonique et rgMisang une image en grelot. La gaine de my61ine, impr4gn~e en partie, pr~sente des feuillets regroup6s et effiloch~s. Gx 35100. (b) Un des deux corps granuleux (r a une structure hdt~rog~ne. Une gaine de mygline pr6sente un aspect gchevel~ (~r Gx28800. (c et d) d61ai postopgratoire: 15 jours. (c) La lumi~re axonique est eombl~e par un volumineux corps dense h6t4roggne. La gaine est grisg~tre, surtout 5~ sa p4riph4rie Gx 28 800. (d) Corps granuleux (e. g.) au contact de la gaine de my61ine. Quelques feuillets de eelle-ei son~ encore impr4gngs Gx 63000. Inclusion dans la celloidine puis l~araldite. Ac6tate d'uranyle-eitrate de plomb

204

C. Fuentes et R. Marty

Fig. 3 a et b. Aspects ultrastructuraux de la r~action de Marchi (suite). (a) D61ai postop4ratoire 20 jours. Corps granuleux en pleine fragmentation. Gaine de my~line gris~tre, amineie et ondul6e sur ~out son pourtour. Gx 36 000. (b) D~lai postop~ratoire: 45 iours. Stade terminal de la d~g6n~rescence de la gaine de my41ine, r~duite s quelques feuillets. Ce vestige axonique d4pourvu de route trace de corps granuleux se trouve s l'int6rieur du cytoplasme d'une cellule satellite, probablement un astrocyte. Gx 28000. Inclusion dans l~ celloidine puis l'araldite. Acetate d'uranyle-citrate de plomb

e) D~lai postop~ratoire : 45 ]ours -

-

A cette date, les corps g r ~ n u l e u x caractdristiques des dtapes prdcddentes homog~nes, puis f r a g m e n t , s - - ne s o n t plus gu~re identifiables, qu'il s'agisse de

Aspects ultrsstructuraux de la r~'action de M~rchi

205

vestiges axoniques encore en place dans les faisceaux ou bien inclus dans une cellule satellite. La gaine de my61ine est maintenant r6duite g une bande compacte formde de plusieurs feuillets accol6s. Dans l'espace ainsi eirconscrit, ces feuillets internes et leurs d6bris forment des r6seaux ou des filets d'6tendue variable. L'amenuisement de la gaine atteint probablement son m a x i m u m lorsqu'un ou deux feuillets p e r m e t t e n t encore de fixer ses limites p6riph6riqucs (Fig. 3b). Telle est la s6quence 6volutive des corps granuleux pour les fibres qui, r6p6tons-le, subissent leur 6tape ((Marchi-positive ~) de d6my61inisation seeondaire entre le 86 et le 456 jour de d61ai postop6ratoire.

Discussion Le proc6d6 de Marchi utilis6 pour cette 6rude est celui qui nous a donn6 les meilleurs r6sultats en microscopie optique, par eompsraison avee diverses variantes propos6es ces derni6res ann6es (Glees, 1943 ; Poirier et al., 1954; Wolman, 1957 ; Anderson, 1959; Harman, 1961; Fraser 1972). La technique publi6e par Busch (1898) et recommand6e par Andrews et Kruger (1969) n'a pas 6t6 test6e. Les raisons principales pour lesquelles la m6thode de Marchi reste pen employ6e peuvent se r6sumer g deux : ]a d61imitation du mat6riel ((Marchi-positif )) et sa nature. En ce qui conccrne la morphologie du mat6riel si l'on met g p a r t les corps granuleux, l'homologation en microscopie optique des aspects moins typiques -- particules, rosettes, ((poussi6re ~)m6tallique -- fair toujours l'objet de discussions (Smith, 1956 a et b; Strich, 1968; Andrews et Kruger, 1969, entre 8utres). Des doutes d'un autre ordre s'adressent g la nature des mat6riaux impliqu6s. Exelusivement lipidiques pour les classiques, ils comprendraient une quantit6 importante d'autres substances, telles que les mueopolysaechsrides. C'est le point de r u e d'Andrews et Kruger (1969), qui rejoignent par ls les conclusions neurochimiques de Wolman (1957, 1970). En fair, le mat6riel ((Marehi-positif )) est repr6sent6 principalement, sinon exclusivement, par des lipides hydrophobes, lib6r6s pr6cocemcnt (Wolfgram et ]~ose, 1958; Giolli et Scully, 1968) et, plus pr6cis6ment, par des esters du cholest6rol (Adams, 1958, 1965). Cette sp6eifieit6 s'applique tout autant au proc6d6 que nous avons utilis6 qu'g une m6thode strictement histochimique comme I'OTAN (ef. Adams, 1965). Dans ees conditions, le r61e jou6 darts la r6action par les substances non lipidiques, y compris les mat6rianx osmiophiles d6erits par Mihglik (1966, 1967) dans des boutons terminaux ne saurait ~tre que minime ou nul.

Microscopie optique Sur le plan neuro-anatomique, l'existence chez le rat d'un contingent homolatdral de fibres d'origine r6tinienne, situ6 dans la partie lat6rale du tractus se trouve confirm6e. D ' u n point de r u e neurobiologique, l'int6r6t se porte sur les variations d'intensit6 de la r6action de Marchi observables entre le 86 et le 206 jour. Selon toute w'aisemblance, elles ddpendent de la cindtique walldrienne ellem~me. En effet, si la d6g6n6rescence g u n m o m e n t donn6 affecte les axones sur route leur longueur (Dem~mes et al., 1974), l'entr6e en jeu du processus n'est pas simultande pour routes les fibres.

206

C. Fuentes e r R . Marry

Microscopie ~leetronique Identi/ication et ~volution ultrastrueturales des corps granuleux I1 fair p e u de d o u t e que les masses v o l u m i n e u s e s et denses observdes soient a u t r e chose que l ' e x p r e s s i o n u l t r a s t r u c t u r a l e des corps g r a n u l e u x de la microscopie o p t i q u e ; q u a n t & la t r a n s p o s i t i o n en microscopic @lectronique des a u t r e s 41@ments ((Marchi-positifs )), tels que p a r t i c u l e s et poussiSre mdtallique, elle n ' a pas 6td envisag@e. Les m a t d r i a u x c o n s t i t u t i f s de ces corps g r a n u l e u x p a r a i s s e n t p r o v e n i r e x c l u s i v e m e n t de la gaine de mydline, les cellules satellites ne j o u a n t en la matiSre q u ' u n rSle p h a g o c y t a i r e . E n se r@f6rant a u x conceptions d ' A d a m s (cf. 1965) sur la r d a c t i o n de Marchi, les corps g r a n u l e u x observ6s seraient donc constitu6s d ' e s t e r s de cholest6rol ]ib6rds p a r la d@sagr@gation de la gaine de my41ine et a y a n t r ~ d u i t sdleetivement le t 6 t r o x y d e d ' o s m i u m . Nos o b s e r v a t i o n s o n t 6t6 centr@es sur l'~volution des corps g r a n u l e u x e n t r e le 85 et le 45 6 j our p o s t o p 6 r a t o i r e ; eet i n t e r v a l l e coincide bien avec eelui que les n e u r o c h i m i s t e s fixent s la durde de la r d a c t i o n de Marchi d a n s le systSme n e r v e u x central. Elle commence, selon eux, du 48 a u 75 j o u r aprSs le d 6 b u t de la ddgdndreseenee my@]inique seeondaire e t s ' 6 t e n d sur 2 s 4 semaines (eft W o l m a n , 1970).

Validitg hodographique de la r~aetion de Marehi Le protoeole exp@rimental employd, en l'occurrence une d~mydlinisation secondaire d a n s u n systSme cordonal, s ' e s t r6vdld p a r t i c u l i S r e m e n t d~monstratif, puisque e ' e s t ~ l'int@rieur m6me de la t u b u l u r e m y d l i n i q u e en cours de dissociation que se c o n s t i t u e n t les corps g r a n u l e u x . Ainsi se confirme l'int@rSt de la m d t h o d e de Marchi p o u r le tra~age p r o p r e m e n t d i t des voies nerveuses mydlinis@es, possibilit@ r a r e m e n t offerte avec c e t t e n e t t e t ~ p a r les i m p r e g n a t i o n s a r g e n t i q u e s et m6me p a r 1a r a d i o - a u t o g r a p h i e .

Remerciements. Cc travail a b6n~fici6 de subventions du C.N.R.S. (E.R.A. n ~ 187), de I'I.N.S.E.R.M. (C.L. n ~ 75.1.207.6) et de la F.R.M.F., ainsi que de la collaboration technique de S. Duthil, P. Sibleyras et J. Boyer.

Bibliographic Adams, C. W. M.: Histochemical mechanisms of the Marchi reaction for degenerating myelin. J. Neurochem. 2, 178--186 (1958) Adams, C. W. M., Ibrahim, M. Z. M., Leibowitz, S. : Demyelination. In: ~eurohistochemistry, C. W. M. Adams, ed., pp. 437--487. Amsterdam: Elsevier 1965 Anderson, F. I). : Dichromate-chlorate perfusion prior to staining degeneration in brain and spinal cord. Stain Technol. 84, 65--67 (1959) Andrews, J. M., Kruger, L. : The distribution of Marehi granules in thalamic degeneration. Brain/~es. 15, 537--541 (1969) Busch, C. K. : Ueber eine F~rbungsmethode secund~rer Degenerationen des Nervensystems mit Osmiumsi~ure. ~eurol. Zbl. 17, 476 (1898) Dem~mes, D., Fuentes, C., •arty, R. : Cin6tique des proccssus de d~g4n~rescene~ axonique dans le syst~me uerveux central: @rude exp@rimentale s court terme dans le corps calleux chez le Rat. Acta neuropath. (Berl.) 29, 311--323 (1974) Foltz, F. M., Matzke, H. A. : An experimental study on the origin, course and termination of the cerebellifugal fibers in the Opossum. J. comp. ~Neurol. 114, 107--126 (1960) Fraser, F. J. : Degenerating myelin: comparative histochemical studies using classical myelin stains and an improved Marchi technique minimizing artifacts. Stain Technol. 47,147-- 154 (1972)

Aspects ultrasbructur~ux de la r4~ction de ~[archi

207

Giolli, 1%. A., Scully, J. M. : A note on the mechanism of the Marchi reaction in degenerating myelin. Experientia (Basel) 24, 474--475 (1968) Glees, P. : The Marehi reaction: its use on frozen sections and its time limit. Brain 66, 229--232 (1943) ttarman, P. J. : The Marchi staining method-advantages of dichromate fixation. Stain Technol. 86, 49--52 (1961) Mihs yon P. : Non-lipid osmiophilic granules in the presynaptie neuroplasma of the boutons. Z. Zellforsch. 75, 537--541 (1966) Mihs yon P. : On-the-slide impregnation by albumen-Os04, selective for ciliary basal bodies and osmiophilic granules in synaptic terminals. Stain Technol. 42, 87--91 (1967) Pokier, L. J., Ayotte, 1%. A., Gauthier, C. : Modification of the Marchi technic. Stain Technol. 29, 71--75 (1954) Polyak, S. : The vertebrates visual system, H. Kliiver, ed., p. 1390. Chicago: The University of Chicago Press 1957 Smith, M. C. : Observation on the extended use of the Marchi method. J. Neurol. Neurosurg. Psychiat. 19, 67--73 (1956) Smith, M. C. : The recognition and prevention of artefacts of the 3Iarchi method. J. Neurol. Neurosurg. Psychiat. 19, 74--83 (1956) Strich, S. J. : Notes on the Marchi method for staining degenerating myelin in the peripheral and central nervous system. J. Neurol. Neurosurg. Psychiat. 81, 110--114 (1968) Swank, 1%. L., Davenport, H. A. : Marchi's staining method: studies of some of the underlying mechanisms involved. Stain Technol. 9, 11--19 (1934) Swank, 1%. L., Davenport, H. A. : Chlorate-osmic-formalin method for staining degenerating myelin. Stain Technol. 10, 87--91 (1935) Wolfgram, F., 1%ose, A. S. : Chemical basis of the Marchi method for degenerating myelin. Neurology (Minneap.) 8, 839 -- 841 (1958) Wolman, M. : Histochemical study of changes occurring during the degeneration of myelin. J. Neurochem. 1, 370--376 (1957) Wolman, M.: Histoehemistry of myelination and demyelination. In: Handbook of Clinical Neurology, Vol. 9, P. J. Vinken and G. W. Bruyn, eds., pp. 23--44. Amsterdam: NorthHolland Publ. Comp. 1970 Professeur Robert Marry Laboratoire de Neurophysiologie Universit~ des Sciences et Techniques du Languedoe Place Eug~ne-Bataillon :F-34060 Montpellier C6dex :France

15 Acta neuropath. (Berl.) Bd. 32