Klinische

Klin. Wschr. 56, 445-448 (1978)

Wochesnhdlt © Springer-Verlag 1978

Die intraindividuelle Streuung der fibrinolytischen Aktivit~it bei Probanden* J. Harenberg, E. Walter und E. Weber Abteilung Klinische Pharmakologie der Medizinischen Universitfits-KlinikHeidelberg

The Intraindividual Variation of Fibrinolytic Activity in Volunteers Summary. In five volunteers fibrinolytic activity has been measured five times over a period of six weeks during increasing values of circadian rhythm. Euglobulinlysis-time, paper fibrinolysis, fibrinogen, plasminogen, ~-antitrypsin, ~2-makroglobulin, thrombinocoagulase-time and fibrin-split-products were used in one study. An increase of fibrinolytic activity in the mooning was observed in all volunteers. Intraindividual variation of values is considerable but less than variation of values compared interindividually. Moreover variation was smaller at noon than in the time before noon. In clinical trial of the short-time effect of drugs the period of the plateau of the fibrinotytic activity should be used because of its smaller variation of values. Furthermore, in this period the intraindividual variation of the fibrinolytic activity is smaller than during increasing slope of the circadian rhythm of fibrinolysis. Intraindividual control should be granted. Key words: Fibrinolysis - Circadian rhythms - Clinical trial - Euglobulinlysis-time. Zusammenfassung. Bei 5 Probanden wurde fiber einen Zeitraum von 6 Wochen ffinfmal die Anstiegsphase im Tagesrhythmus der fibrinolytischen Aktivitfit untersucht. Als Parameter wurden die EuglobulinlyseZeit und die Papierfibrinolyse, die Plasmaproteine, Fibrinogen, Plasminogen, cq-Antitrypsin und ~2-Makroglobulin sowie die Thrombinocoagulase-Zeit und die Fibrinspaltprodukte erfagt. Es zeigte sich bei allen * Gef6rdert dutch das Schwerpunktsprogramm,,Klinische Pharmakologie" der Deutschen Forschungsgemeinschaft Sonderdruckanfragen an: Dr. med. J. Harenberg (Adresse s. nach Literatur)

Probanden der Anstieg der Fibrinolyse am Vormittag. Die Schwankungsbreite der fibrinolytischen Aktivitfit ist intraindividuell kleiner als bei einem interindividuellen Vergleich. Weiterhin zeigt sie mittags eine geringere Streuung als vormittags. Bei Untersuchungen zur klinischen Prfifung eines Soforteffektes von Arzneimitteln auf die Fibrinolyse sollte der Zeitraum der Plateauphase der fibrinolytischen Aktivitfit gew/ihlt werden, um die Streuung der Ausgangswerte m6glichst gering zu halten. Weiterhin ist die intraindividuelle Streuung der fibrinolytischen Aktivit/it in diesem Zeitraum geringer als wfihrend der Anstiegsphase im Rahmen des circadianen Rhythm u s d e r Fibrinolyse. Eine intraindividuelle Kontrolle mu[3 gew/ihrleistet werden.

Sehliisselwiirter: Fibrinolyse - circadiane Rhythmik - klinische Prfifung - Euglobulinlyse-Zeit.

Die fibrinolytische Aktivitfit des gesunden Menschen weist einen Tagesrhythmus auf. Sie liegt zwischen 4 und 8 Uhr morgens am niedrigsten und in der Zeit von 1 4 - 2 2 Uhr in Form eines Plateaus am h6chsten (Fearnley, 1957; Rosing, I970; Walter et al., t977). Bisher wurde eine Aktivierung oder Hemmung der Fibrinolyse bei Erkrankungen (Chakrabsrti, 1968; Jipp, 1972), nach Einwirkung einiger Medikamente (Isacson, 1970; Banerjee, t975; Bruhn, 1975) sowie nach k6rperlicher Belastung (Rosing, 1970) und anderen Stref3situationen festgestellt. Eine Steigerung der fibrinolytischen Aktivit/it durch oral zu verabreichende Medikamente wfire bei verschiedenen klinischen Indikationen von Interesse. Es sind aber bisher entsprechende Substanzen ffir eine langfristige Anwendung am Menschen nicht bekannt geworden (yon Kaulla, 1968; Bruhn, 1975). Ffir klinische Untersuchungen mug darauf hingewiesen werden, dab die

446

J. Harenberg et al. : Fibrinolytische Aktivit/it bei Probanden

methodischen Probleme bei der Erfassung der Fibrinolyse unter Gabe von Arzneimitteln bislang nicht vollsffmdig gel6st worden sind (Walter et al., 1977). Die grol3e Schwankungsbreite der fibrinolytischen Aktivitfit bei Gesunden, auf die Cash (1966) hingewiesen hat, stellt eine wesentliche Erschwerung der Erfassung der fibrinolytischen Aktivit~it dar. Die folgenden Untersuchungen sollen einen Beitrag zu dieser Problematik liefern.

Tabelle 1. Die intraindividuetle Schwankung der fibrinolytischen Aktivit~it 5 gesunder Probanden gemessen an 5 Tagen mit der Euglobulinlyse-Zeit (Median mit Konfidenzintervall c~=0,05) Proband

Euglobulin-Lysezeit (h) 8,00 h

A B C D E

7,33 23,66 24,33 25,15 29,16

12,00 h (5,00-15,50) (11,10-28,00) (19,66-26,66) (I6,50-29,33) (7,58-39,00)

2,83 (2,006,25 (4,176,42 (3,403,50 (2,1611,00 (2,20-

3,50) 8,08) 14,30) 4,66) 13,30)

Methoden An der Untersuchung nahmen 5 gesunde m~innliche Probanden im Alter von 2 0 - 2 5 Jahren und mit einem K6rpergewicht zwischen 62 und 84 kg je ftinfmal teil. Die Untersuchungstage wurden auf einen Zeitraum yon 6 Wochen verteilt und den Probanden randomisiert zugeordnet. Die Versuchsbedingungen wurden wie folgt standardisiert: An den Voruntersuchungstagen war es den Probanden untersagt, Sport zu treiben, ab 20 Uhr zu rauchen sowie Alkohol, Kaffe, Tee oder koffeinhaltige Getr~inke zu sich zu nehmen. Am Untersuchungstag erhielten die Probanden ein leichtes Standardfrfihstiick. Die Btutabnahmen fanden um 8 und 12 Uhr statt. In der Zwischenzeit waren leichte k6rperliche Bet~tigung erlaubt, rauchen0 sowie GenuB yon Kaffee und koffeinhaltigen GetrS.nken jedoch weiterhin verboten. Die Blutabnahme erfolgte mit einer Straug-Kan/ile (1,2 ram, Fa. Braun Melsungen AG) aus einer ungestauten Kubitalvene (Fedderson, 1972). Die globale fibrinolytische Aktivit/it des Plasmas wurde mit der Papierfibrinolyse (Goossens, 1970) bestimmt. Die um 8 Uhr gemessenen Werte wurden gleich 0% gesetzt und die 12 Uhr-Werte in ihrer Ver~inderung gegentiber den Ausgangswerten in % nach der Formel: Lyseprozent 12 U h r = 100 x

Lysewert 12 Uhr Leerwert Lysewert 8 Uhr--Leerwert

berechnet. Die Standardabweichung 2 ± s der Methode lag bei 5,47%. Die EuglobulJnlyse-Zeit wurde nach der Mehtode yon Kaulla und Schultz (1959) im Thrombelastographen (Hartert, 1952) registriert. Mit ihr wurden unter Ausschaltnng der Inhibitoren die Aktivatoren der Fibrinolyse bestimmt. Die Standardabweichung 2 + s der Methode lag bei 3,5%. Die Thrombinkoagulase-Zeit (Soullier, 1970) und die Reptilase-Zeit (Wenzel, 1974) wurden mit Reagenzien der Firma Boehringer bestimmt (Thrombinkoagulase- und Reptilase-Reagens, Boehringer Mannheim). Die Plasmakonzentrationen an Fibrinogen und Plasminogen sowie den wichtigsten Inhibitoren der Fibrinolyse: alpha-2-Makroglobulin und alpha-l-Antitrypsin (Gallimore, 1975), wurden mit Immundiffusionsplatten der Firma Behring ermittelt (M-PartigenPlatten, Behring-Werke, Marburg/Lahn). Die Fibrin-Spaltprodukte wurden mit einer Modifikation des ,,tanned red cell haemagglutination inhibition immunoassay" (Merskey, I969), dem H~imagglutinations-Hemmtest (Wellcome FDP-Kit HA 14, Deutsche Wellcome OmbH Abt. Labordiagnostika, 3006 Burgwedel/Han.), semiquantitativ auf Mikrotiterplatten bestimmt (Flow Laboratories Ltd., Schottland).

Ergebnisse

Die intraindividuelle Schwankungsbreite der fibrinolytischen Aktivitfit bei den Probanden, gemessen mit

Tabelle 2. Die intraindividuelle Schwankung der fibrinolytischen AktivitS.t 5 gesunder Probanden gemessen an 5 Tagen mit der Papierfibrinolyse (Prozent der Ver~inderung 12,00h gegentiber 8,00 h = A % ) (Median mit Konfidenzintervall e=0,05) Proband

Papierfibrinolyse 12,00 h (A%)

A B C D E

4- 6,5 ( - 2 , 4 - + 7,5) + 8,0 ( - 9 , 5 - + 9,3) +16,7 ( 4 , 4 - 21,7) +15,3 (12,4- 19,0) +22,3 ( 3 , 8 - 26,2)

30, ~td]

3° [Std]

39

20,

20.

10,

10.

//

;

~'2 [staf

---7'/

;

1'~ [sta] Tageszeit

Tageszeit

Abb. 1. Darstellung der einzelnen Euglobulinlyse-Zeiten in Stunden bei zwei Probanden

Tabelle 3. Die Fibrin-Spaltprodukte (FSP) im Serum (gg/ml) bei 5 Probanden an 5 Tagen (Median mit Konfidenzintervall e=0,05) Proband

A B C D E

Fibrin(ogen)-Spaltprodukte (gg/ml) 8,00 h

12,00 b

3,75 1,87 1,87 3,75 3,75

3,75 1,87 1,87 3,75 3,75

(3,75) (1,25-3,75) (t,25-1,87) (2,50-5,00) (3,75--5,00)

(3,75-5,00) (1,25-3,75) (1,25-2,50) (2,50-5,00) (3,75--5,00)

J. Harenberg et al. : Fibrinolytische Aktivit~itbe± Probanden

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Tabelle 4. Plasmakonzentration (mg/100 ml) yon Fibrinogen, Plasminogen, den Antiplasminen ~1 Ant±trypsin und % Makrogtublin der 5 Probanden (Median mit Konfidenzintervall ~=0,05) Plasmaeiweil3e

Fibrinogen

Plasminogen

cq Antitrypsin

mg/100 ml

8,00 h

I2,00 h

8,00 h

12,00 h

8,00 h

12,00 h

8,00 h

12,00 h

Proband A

361,0 (347,0-384,0)

368,0 363,0-375,0)

18,0 (15,0-18,5)

16,0 (14,5-18,5)

254,0 (240,0-267,0)

257,0 (235,0-279,0)

182,0 (162,0-204,0)

182,0 (160,0-209,0)

Proband B

456,0 (423,0-487,0)

456,0 (414,0 482,0)

19,0 (18,0-21,0)

19,0 (17,0-21,0)

309,0 (300,0-316,0)

309,0 (306,0-339,0)

163,0 (158,0-198,0)

162,0 (149,0-192,0)

Proband C

380,5 (366,1-411,4)

381,6 (352,2-411,4)

i9,1 (19,1-19,9)

19,1 (18,I-19,1)

295,4 (290,8-329,5)

295,4 (277,0-.328,4)

194,7 (189,9-199,8)

I95,7 (182,4-199,8)

Proband D

389,7 (333,0-395,4)

375,3 (333,0-400,7)

19,0 17,8 (14,5- 19,8) (14,5- 19,6)

248,3 246,7 (238,1 255,5) (238,6-.255,5)

226,2 (212,3-252,1)

229,7 (202,0-239,9)

Proband E

433,0 (375,8-465,2)

410,0 (371,6 465,2)

18,7 (16,8-19,8)

258,3 (232,8-295,5)

233,8 (228,0-267,4)

225,4 (220,8-267,4)

18,7 (17,2-20,1)

Tabelle 5. Die Reptilase-Zeit und Thrombin-Coagutase-Zeit be± 5 Probanden an 5 Tagen (Median mit Konfidenzintervall a=0,05) Proband

A B C D E

Reptilase (s)

Thrombin-Coagulase (s)

8,00 h

12,00 h

8,00 h

12,00 h

18 (17--19) I9 (17--23) 19 (16--23) 18 (17-19) 21 (17--22)

18 (18) 18 (17--t9) 17 (17 21) 17 (17-19) 18 (17-22)

21 (20--22) 23 (22--25) 23 (21-24) 23 (18-21) 22 (21-22)

21 (20--22) 23 (20--24) 22 (21-23) 22 (19-2i) 21 (20-23)

~.2 Makroglublin

254,2 (225,4-281,5)

Die intraindividuellen Schwankungen betrugen im Mittel be± jedem Probanden ffir Fibrinogen ± 29,5 mg-%, fiir Plasminogen +_ 1,6 mg-% ffir alpha-Ant±trypsin ± 18,1 mg-% und f/ir alpha-2-Makroglobulin ± 18,2 mg-% be± Werten, die im Normbereich lagen (Tabelle 4). Es ergaben sich keine Unterschiede zu den gemessenen Uhrzeiten. Die Fibrin-Spaltprodukte im Serum ergaben zu keinem Zeitpunkt einen Anhalt fiir eine steigerung der fibrinolytischen Aktivitfit. Die Mittelwerte zeigten keinen Trend zu einem Tagesrhythmus zu den gemessenen Zeitpunkten. Die intraindividuelle Schwankung lag be± + 0,55 gg/ml Serum (Tabelle 3).

Diskussion

der Euglobulinlyse-Zeit und der Papierfibrinolyse sind in Tabelle 1 und 2 dargestellt. Die fibrinolytische Aktivit/it steigt be± allen Probanden am Vormittag zu den bemessenen Zeitpunkten an. Die Unterschiede zu den MeBzeitpunkten sind mit der EuglobulinlyseZeit be± allen Probanden und mit der Papierfibrinolyse be± 4 der 5 Probanden auf dem Niveau p > 0,05 statistisch signifikant (Wilcoxon Paired ComparisonTest). In Abbildung 1 sind die Verlaufsformen yon 2 Probanden dargestellt. Von ihnen stellt die linke eine kleine, die andere eine groBe intraindividuelte Schwankungsbreite dar. Die Unterschiede in der Aktivit~it k6nnen sowohl morgens als auch mittags bis zu 100% be± der Euglobulinlyse-Zeit ausmachen. Die intraindividuelle Schwankung ±st jedoch mittags be± 2 der 5 Probanden mit dem F-Test statistisch signifikant geringer als vormittags. Die Thrombinkoagulase-Zeit und Reptilase-Zeit lagen be± allen Probanden im Normbereich. Die intraindividuelle Schwankung betrug ± 1,3 s. Es zeigt sich kein Unterschied zu den MeBzeitpunkten um 8 und um 12 Uhr (Tabelle 5).

In Obereinstimmung mit Fearnley (1957), Rosing (1970) und Walter (1977) wurde ein Anstieg der fibrinolytischen Aktivitfit am Vormittag im Sinne einer circadianen Rhythmik be± allen Probanden an allen Untersuchungstagen beobachtet. Be± den gemessenen Parametern lfiBt sich eine Gruppe von Daten herausnehmen, die von Proband zu Proband und be± einem Probanden von Tag zu Tag erhebliche Schwankungen aufweisen. Es handelt sich dabei um die Euglobutinlyse-Zeit und die Papierfibrinolyse. Wir best/itigten die von Cash (1966) gefiugerte Vermutung, die fibrinolytische AktivitS~t des Menschen weise eine groBe intraindividuelle Schwankung auf. Es lieB sich weiterhin zeigen, dab die Schwankungen mittags geringer als am Vormittag sin& Daneben gab es eine Re±he von weiteren Parametern, die weder yon Proband zu Proband noch be± einem Probanden von Tag zu Tag erheblichen Schwankungen unterworfen waren. Es handelte sich dabei um die Reptilase- und Thrombinkoagulase-Zeit

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sowie um die Plasmakonzentrationen yon Fibrinogen, den Fibrin-Spaltprodukten, Plasminogen, alpha-1Antitrypsin und alpha-2-Makroglobulin. Dabei bleibt zu ber/icksichtigen, dal3 es sich in der ersten Gruppe der Megdaten um Aktivit/itsmessungen handelte, wS~hrend in der zweiten Gruppe nur Ptasmakonzentrationen yon Eiweil3en gemessen wurden. Konzentrationsverfinderungen bei Plasmaeiweil3en lassen sich innerhalb eines Tages nur sehr schwierig nachweisen, da diese meistens sehr tange Halbwertszeiten besitzen. Ftir die Untersuchungen zur fibrinolytischen Aktivitfit beim Menschen ergeben sich daher folgende Konsequenzen : Zu vergleichende Mel3punkte mtissen zu exakt identischen Tageszeiten gewfihlt und die Uhrzeiten der Blutabnahmen genau eingehalten und angegeben werden. Bei der Testung von Pharmaka an gesunden Probanden ftihren wir wegen der grol3en interindividuellen Schwankung Kontrollen an denselben Personen durch, um einen intraindividuellen Vergleich zu gewfihrleisten. Um den sofortigen Einflul3 eines Pharmakons auf die Fibrinolyse zu untersuchen, eignet sich das yon Walter et al. (1977) beschriebene Plateau der fibrinolytischen Aktivitfit am Nachmittag, da in diesem Zeitraum die geringeren intraindividuellen Aktivit/itsschwankungen beobachtet worden sind. Aus diesen Grtinden schlagen wir folgendes Versuchsmodell vor: Es wird eine intraindividuelle Kontrolle als Vergleichsgruppe durchgeffihrt. Die Untersuchungen finden zwischen 13 und 18 Uhr statt. Nach der Applikation der Substanz oder w~hrend der Kontrolluntersuchung werden je 3 Messungen vorgenommen. Die Kurve, die sich aus den Me[3daten der Kontrollgruppe ergibt, wird durch die Fehlerbreite der Methode sowie die intraindividuelle Schwankungsbreite der fibrinolytischen AktivitS~t bestimmt. Eine Beeinflussung der Fibrinolyse durch ein Pharmakon ist anzunehmen, wenn nach Applikation einer Substanz Werte gemessen werden, die aul3erhalb dieses Bereiches liegen. Dabei lassen sich folgende Verlaufskurven charakterisieren: eine gerade, eine ansteigende, eine abfallende, eine vorwiegend abfaltende und eine vorwiegend ansteigende Kurve. Die nach der Substanzgabe oder der Kontrolluntersuchung ermittelten Kurven k6nnen einer der ffinf Gruppen zugeordnet und statistisch ausgewertet werden. Walter etal. (1977) stellten in umfangreichen Untersuchungen die Plateau-Phase der fibrinolytischen AktivitM dar. Die jetzt vorgelegten Untersuchungen zeigen, dab die intraindividuetle Schwankungsbreite der fibrinolytischen Aktivit/it mittags geringer als vormittags ist und interindividuell eine grol3e Schwankung aufzeigt. Bei klinischen Prtifungen zum Einflul3 von Pharmaka aufdie Fibrinolyse sollten daher die Untersuchungen zum Zeitpunkt der gering-

J. Harenberg et al. : Fibrinolytische Aktivit~it bei Probanden

sten physiologischen Schwankung mit einer intraindividuellen Kontrolle erfolgen. Literatur 1. Banerjee, R.N., Kumar, V., Rao, S.R., Sahni, A.L., Arya, M., Bardhan, J. : Antifibrin action of Phenformin. Diabetologia 11, 105-111 (1975) 2. Cash, J.D.: Effect of moderate exercise on the fibrinolytic system in normal young men and women. Brit. med. J. 2, 5 0 2 - 506 (1966) 3. Chakrabarti, R., Hocking, E.D., Fearnley, G.R., Mann, R.D., Attwell, T.N., Jackson, D~ : Fibrinolytic activity and coronary artery disease. Lancet 1 , 9 8 7 - 9 9 0 (1968) 4. Feddersen, G., Gormsen, J.: Venous stasis and fibrinolytic activity. Scan& J. Haematol. 9, 502-508 (1972) 5. Fearnley, G.R. : Measurement of spontaneous fibrinotytic activity. J. clin. Path. 17, 307-312 (1964) 6. Fearnley, G.R., Dalmforth, G., Fearnley, E.: Evidence of a diurnal fibrinolytic rhythm with a simple method of measuring natural fibrinolysis. Clin. Sci. 16, 645-650 (1957) 7. Gallimore, M.J. : Serum inhibitors of fibrinolysis. Brit. J. Haematol. 31, 217-231 (1975) 8. Goossens, N.: Standardisierte Fibrinolysebestimmung. Med. Welt 21, 1816-1819 (1976) 9. Hartert, H. : Die Thrornbelastographie. Eine Methode zur physikatischen Analyse des Blutgerinnungsvorganges. Ztschr. f. d. ges. exp. Med. 117, 189-203 (1951) 10. Isacson, S., Nilsson, J.M.: Effect of treatment with combined phenformin and ethyloestrenol on the coagulation and fibrinoIytic systems. Scand. J. Haemat. 7, 404-412 (1970) 11. Jipp, P., Bruhn, H.D., Ffirnil3, H. : Blutgerinnung und Fibrinolyse bei arteriosklerotischen Verschliissen der Extremit/iten. Klin. Wschr. 50, 689-695 (1972) 12. Laursen, B., Gormsen, J. : Pharmacological entrancement and s h o r t - t e r m stimulation of blood fibrinolytic activity. Scand. J. Haematol. 6, 402-408 (1969) 13. Merskey, C., Lalezari, P., Johnson, A.J. : A rapid, simple, sensitive method for measuring fibrinolytic split products in human serum. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 131, 871-875 (1969) 14. Rosing, D.R., Brakman, P., Redwood, D.R., Goldstein, R.E., Beiser, G,D., Astrup, T., Epstein, S.E. : Blood fibrinolytic activity in man, diurnal variation and the response to varying intensities of exercise. Circulation Research 27, 171 -- 183 (1970) 15. Soulier, J.P., Prou, D., Ilalle, L.: Further studies on thrombincoagulase. Thromb. Diathes. Haemorrhag. 23, 3 7 - 5 2 (1970) 16. von Kaulla, K.N., Schultz, R.L.: Methods for the evaluation of human fibrinolysis. Amer. J. Clin. Path. 29, 104-112 (1958) 17. Walter, E., Birkholz, L.B, Harenberg, J., Weber, E, : Circadian rhythm of platelet function, fibrinolytic activity of plasma and the influence of reduced food uptake, fat loading and beer drinking on the fibrinolytic activity. First Florence conference on haemostasis and thrombosis 1977 18. Wenzel, E., Holzhiiter, tL, Muschietti, F., Angelkort, B., Ochs, H.-G., Pasztai-Markos, S., Nowak, H., Stfirner, H.: Zuverl~issigkeit des Fibrinogen-(Fibrin-)Spattproduktnachweises im Plasma mit Thrombinkoagulase-, Reptilase- und ThrombinGerinnungszeit. Dtsch. Med. Wschr. 99, 746-756 (1974) Eingegangen am 1. Juni 1977 / Angenommen am 27. August i977 Dr. J. Hareuberg Abt. Klinische Pharmakologie der Universitfit Bergheimer Str. 58 D-6900 Heidelberg 1 Bundesrepublik Deutschland