Planta (Berl.) 93, 214--226 (1970) 9 by Springer-Verlag 1970

Der EinfluB von Natrium- und Kaliumionen auf die Phosphataufnahme bei Ankistrodesmus braunii C. I. ULLRICH-EBERIUS u n d W . Sn~oNis Botanisches Institut I der Universit~t Wiirzburg Eingegangen am 19. Mai 1970 T h e I n f l u e n c e of S o d i u m a n d P o t a s s i u m I o n s on t h e U p t a k e of P h o s p h a t e b y Ankistrodesmus braunii

Summary. The uptake of phosphate as influenced by sodium and potassium ions was investigated in the light and in the dark. I t was found to be a function of the external phosphate concentration. At a low concentration (up to l0 -5 mol/1) in the presence of Na + phosphate is quickly absorbed and hence phosphate is the limiting factor for further labelling. In the presence of K + phosphate uptake is constant over a long period. The enhancement of phosphate uptake by Na + is also found when the external concentration of P is raised up to 10-4 mol/L Then the gross uptake proceeds over six hours, with the greatest Na+-dependent increase occurring in the label of the TCA-insoluble phosphate fraction (Pu). The phosphate uptake is strongly dependent on the pH of the reaction mixture. In the presence of Iqa+ it is highest between pH 5.6 and 7. As the uptake in the presence of K + parallels the dissociation curve of the dihydrogen form H~PO~-, the Na+-enhancement is optimal in the alkaline pH range (pH 8). On the basis of a comparison between the pH-dependence of phosphate uptake and the dependence of the uptake on the external phosphate concentration analysed by a method of enzyme kinetics, it is suggested that Ankistrodesm~ts metabolically transports H2PO ~- but not HPO~ ~. Moreover, it is concluded from the absence of light stimulation and the weak inhibition of the uptake by DCMU or CCCP in the presence of K+ that at low P-concentrations the diffusion is limiting the uptake. Only at higher concentrations is an active phosphate uptake measured. Furthermore it is concluded that the observed Na+-stimulation of the 3~p. labelling of the TCA-soluble and insoluble compounds inside the cell is indirect and depends only on the action of Na + and K+ ions at the first transport site in the plasmalemma.

Einleitung Na+- u n d K + - I o n e n fSrdern den S t o f f t r a n s p o r t n i c h t n u r d u r c h tierische M e m b r a n e n , s o n d e r n es w e r d e n auch T r a n s p o r t s y s t e m e pflanzlicher Zellen spezlfisch d u r c h diese K a t i o n e n beeinflul~t, wie die U n t e r s u c h u n gen y o n M a c R o b b i e (1962), B a u m e i s t e r u n d C o n r a d (1966), Siegenthaler, B e l s k y u n d Goldstein (1967) u n d Meszes u n d E r d e i (1969) zeigen. DaB die y o n Simonis u n d U r b a c h (1963) b e i d e r Griinalge Ankistrodesmu8 braunii b e o b a c h t e t e kurzfristige I~la+-FSrderung des P h o s p h a t e i n b a u s in organische V e r b i n d u n g e n n i c h t anf ehler d i r e k t e n F S r d e r u n g der energieliefernden S y s t e m e , A t m u n g u n d P h o t o s y n t h e s e , b e r u h t , w u r d e

Einflul~ yon Na+ und K + auf die Phosphataufnahme

215

in der vorangegangenen Arbeit (Ullrieh-Eberius und Simonis, 1970) dargestellt. Da Na+- und K+-Ionen aueh die intracellul/~re Verteilung des Phosphates nieht unterschiedlich beeinflussen, entfallen die intraeellularen Membran- mud Enzymsysteme als Angriffspunkte der Kationenwirkung. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit der Einflu$ yon Na+ und K + unmittelbar auf die Phosphataufnahme untersucht. Da die H6he der Aufnahmerate sowohl yon extraeellul/~ren :Faktoren wie vom energetisehen Zustand der Zelle abh/~ngt, wurden gleiehzeitig die Grobfraktionen des Orthophosphates, der TCE-15sliehen organisehen und TCE-unl5sliehen Phosphatverbindungen berficksiehtigt. Diese Fraktionen zeigen aueh, in welchem Ausma$ die a~P-Markierung 15slicher organischer Verbindungen innerhalb kurzer Zeiten (2 rain) direkt yon der Aufnahmereaktion abh/~ngig sein kann und dal3 sie unter ffir die Aufnahme mlgfinstigen Bedingungen nieht die wahren Stoffweehselabl/iufe innerhalb der Zelle widerspiegelt.

Material und Methodik Ankistrodesmus braunli wurde wie kfirzlich besehrieben (Ullrich-Eberius und Simonis, 1970) in Synchronkultur angezogen. Ffir Versuchszwecke wurden die Algen nach 5stiindiger Verarmung an PO~-, Na+ mad K + entweder in Glaskfivetten (Lollipop) oder in 25 ml-Erlenmeyer-Gef~13enbei 30~ C in einem Warburg-Apparat inkubiert. Die s2P-markierte Phospha~lSsung wurde nach 2 rain Adaptationszeit im Dmakeln und 8 rain Vorbelichtmagszeit zu den in PO~--, Na +- und K+-freier NithrlSsung suspendierten Algen gegeben. Die Lichtintensitiit w/~hrend der Einlagermag betrug 20000 lx Weil31icht oder 10000 erg/cm2.sec Rotlicht yon 683 nm. Die Endkonzentrationen in der ReaktionslSsung waren ffir NaC1 bzw. KC1 2.10 -2 mol/1 und ~fir den Tris-H2SOa-Puffer bei pH 8 5.10-" tool/1. Fiir die anderen ptt-Werte wurde ein Puffergemiseh aus Tris (2,5.10 -2 tool/l) mad Phthalat (10-4 his 10-2 tool/l) verwendet. Der in den Abbildungen aufgetragene pH-Wert wurde unmittelbar im Filtrat tier Proben gemessen. Die Phosphataufnahme (GP) wurde durch rasches Abfiltrieren und Waschen der Algen beendet. Nach AbtSten mit 10%iger Trichloressigs~ure (TCE) wurden die TCE-15slichen Phosphatverbindmagen wiihrend 30 mia Ex~raktionszeit yon den ualSslichen Phosphatverbindungen (Pu) abgetrennt. Dieser Extrakt wurde nach Methoden yon Avron (1960) oder Yanagita (1964) ffaktioniert in Orthophosphat (Pa), TCE-15sliches organisches Phosphat (Po), dieses durch Schwefels~urehydrolyse in stabile (Po-stabil) und s~urelabile Phosphatverbhldungen (Po-labil). Der Orthophospha~gehalt (alp) wurde nach Gerlach und Deuticke (1963) bestimmt. Als Phosphataufnahme wird die auf Grtmd der spezifisehen Aktivit~t der Einlagerungs16s~lg in ~Mole umgerechnete gesamte a2P-Markierung in den Algen bezeiohnet.

Ergebnisse 1. ZeitabMingigkeit der Phosphatau[nahme Die in Kurzzeitversuchen markierten s~urel6slichen organisehen phosphorylierten Verbindungen erreichen im Lieht und im Dunkein innerhalb der ersten 10 rain der Einlagerung die maximale Na+-bedingte FSrderung der a~P-Markierung (Ullrieh-Eberius und Simonis, 1970). Dal~ dies auf dem seheinbaren S/~ttigungsverlauf der Phosphataufnahme in

216

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Abb. 1. Phosphataufnahme in Na+- trod in K+-Gegenwart im Lieht und Dunkeln. 1,88.10-e tool/1 P, 25 Kg Chl/5 ml, Luft-t- 3% COS

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Abb. 2. Phosphatattfnahme und ~P-Markierung des Po im Lich~. Die Algen der 1P-K~vettenserie erhielten nur bei Einlagerungsbeginn 5-10-6 tool/1 P. Die Algen der 2P-Kiivettenserie erhielten nach 15 rain (Pfeil) nochmals 5.10-6 mol/1 P, 55 Kg Ohl/5 ml, Luft

Na+-Gegenwar% beruht, zeigt Abb. 1. Der Gesamtaufnahme folgt die zeitabhs 3~'P-M~rkierung des Po im Licht und auch im Dunkeln fast proportional (Abb. 2). I n K+-Gegenwart ist der Verlauf der M~rkierung des Po ebenfalls proportional der sehr geringen Gesamtaufnahme und wie diese bis zu 60 min ann/~hernd linear. Auff&llig ist der geringe Licht-Dunkel-Unterschied (Abb. 1 und 2).

217

Einflul~ von Na + und K + auf die Phosphataufnahme

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Abb. 3. Phosphatsbnahme (~P mad ~=P) im Einlagerungsmedium im Licht. 5.10-~ reel/1 P, 80 Fg Chl/5 ml, Luft Nach beendeter Bruttophosphataufnahme in Na+-Gegenwart 16st eine erneute/~quimolare Phosphatgabe yon 5- l0 -6 reel/1 die gleiehe Aufnahmekinetik wie zu Beginn der Reaktion aus (Abb. 2). Einem gleiehen Anstiegswinkel folgt wieder naeh 10 mhl Sgttigung. Die der Phosphataufnahme proportiona.le Marlderung des Po steigt naeh weiterer s~+szpGabe ebenfalls wieder steil an. Die Phosphataufnahme in K +- Gegenwart reagiert auf die erneute Phosphatzugabe nur langsam. Die Markierung des Po folgt der Kinetik der Aufnahmereaktion. Eine ann~hernd genaue Berechnung der spezifisch dm-eh Na + bedingten Phosphataufnahmerate gegenfiber der in K+. Gegenwart setzt voraus, dab st6rende Adsorptionserseheixmngen ausgeschlossen werden k6nnen. Das in Abb. 2 dargestellte System ist naeh der zweiten Phosphatgabe bereits mit s2p ges/s w/~hrend innerhalb der n~chsten 5 rain die Phosphataufnahme weiterhh~ linear ansteigt. Die Berechnung ergibt eine Aufnahmerate yon 2,2 (Na +) bzw. 0,25 (K+) ~Mol P/rag Chl/h, d.h. etwa eine 9fache F6rderung durch Na+ bei einer extraeellul/~ren Konzentration yon 5.10 -6 reel/1 P. Dag der Sgttigungsverlauf der Phosphataufnahme in Na +- Gegenwart weder dureh Substrats/ittigung des Transportproteins verursacht wird, noeh dureh einen starken Efflux nieht markierten Phosphates aus der

C. I. Ullrich-Eberius und W. Simonis:

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Abb.4. Oben: Phosphataufnahme, ~=P-Gehalt der N~hrlSsung u~d 32P-Markierung des Pu" Unten: Prozentualer A~teil der 32P-N[arkierungder Phosphatfraktionen an der Gesamteinlagerung; erhShte extracellul~re Phosphatkonzentration (10-4tool/I), Licht, bei Versuchsbegilm 40 ~g Chl/3 ml, Luft -F 1,5% CO2 Zelle, sondern da6 in Na+-Gegenwar~ Substratmangel die Ursaehe ist, zeigt die gleiehzeitige Messung des restliehen rap. und a~P-Gehaltes in der Einlagerungsl6sung (Abb. 3). Die Na+-bedingte FSrderung der Phosphataufnahme ist aueh bei hSheren Phosphatkonzentrationen und langfristig und damit allgemein vorhanden und stellt keinen Spezialfall yon Kurzzeitmarkierungen dar, wie die Jn Abb. 4 dargestellten Versuehe zeigen, die fiber einen Entwicklungseyclus der Algen durehgeffihrt wnrden.

EinfluI3 von Na + und K + auf die Phosphataufnahme

219

Tabelle. Na+-FSrderung der a2P-Marklerung in Abhdngigkelt yon der Zeit, gemessen iiber 22 Std, 10-4 mol/l P, maxlmale F6rderung kursiv. Bedingungerb s. Abb. 4 Zei~ (S~d)

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126 129 112 101 92 91 88 83 69

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105 109 107 104 104

1 2 3 4

Aus dem Vergleieh der Markierungsanteile der einzelnen Grobffaktionen (Abb. 4) wird deutlieh, dal] der grSBte Antefl des Phosphates bei erhShter AuBenkonzentration in kurzen Zeiten und allgemein w/ihrend l~ngerer Aufnahmezei~en ins Pu eingebaut wird. So liegt die gr6Bte Na+-bedingte F6rderung nicht wie bei den bisherigen Kurzzeitversuehen im Po, sondern in l~bereinstimmung mit den Befunden yon Baumeister und Conrad (1965), mi~ 436% im Pu (Tabelle). Nach beendeter Brut~ophosphataufnahme und wei~gehender MarkierungsgMehverteilung sinken in der 10s~findigen Dunkelperiode die Markierungswerte (Abb. 4) der TCE-16slichen Verbindungen zuguns~en der unl6slichen Fraktion ab. Diese steigt w/~hrend der Dunkelperiode yon 75 auf 90%. Die verbMbenden Na+-K+-Unterschiede sind gering und liegen im Bereieh der t~ehlergrenze. 2. Konzentrationsabhiingiglceit der Phosphatau/nahme

Die a2P-markierte Phosphataufnahme wurde inAbhiingigkeit y o n d e r AuBenkonzcntra~ion innerhalb der ersten 2 min der Atffnahmereaktion untersuch$ (Abb. 5), um bei alien Konzentra~ionen einen SubstratfiberschuB zu gewghrleisten und um st6rende Wirkungen des Efflux auszuschlieBen. Andererseits ist hier mit Adsorptionserseheinungen in den ersten Sekunden zu reehnen, die unabh/ingig yon aktiven Aufnahmeprozessen erfolgen.

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Abb. 5. Phosphat~ufnahme (v) und Na+-bedingte FSrderung (rechte Sk~la, K+= 100 %) in Abh~ngigkeit yon der Phosphatkonzentration IS] im Roflicht bei 683 rim, 75 Izg Chl/5 ml, Einlagerungszeit 2 min, Luft J

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Abb. 7. Phosphatsufnahme in Prozent der maximMen Einlagertmg in Na+-Gegenwart (Na+max= 100%) und die Na+-bedingte F6rderung der Gesamteinlagerung (Skala auf 1/1o verldeinert, K+=10% start 100%) im Vergleich mit der extracellulgren prozentualen H2PO~--Konzentration (H2PO~- -~ HPO~ = 100 % ) in Abh~ngigkeit yore extracellul~ren pH-Wert, im Licht. 5.10 -6 tool/1 P, 45 ~g Chl/5 ml, Einlagerungszeit 2 rain, Luft

Ordinate fast im gleiehen Punkt wie die Na+-bedingte Gerade. Es ergibt sieh flit Vm~x (K +) = 4 ~Mol P/mg Chl/h und eine gr6Bere MichaelisKonstante K M (K~) ~ 2,86.10 -5 tool/1 P. Danaeh kann in diesem Bereieh hSherer Phosphatkonzentration die Phosphataufn~hme in K +- wie in Na+-Gegenwart die gleiehe Geschwindigkeit erreiehen. Bei niedriger extracellul~rer Phosphatkonzentration yon 5" 10-~ bis 5" l0 -6 tool/1 ergibt sieh in K+-Gegenwart (Gerade II) eine geringere Maximalgeschw~,digkeit mit Vmax (K+) = 1,05 ~Mol P/mg Chl/h nnd eine gleichzeitig verringerte Michaelis-Konstante K ~ (K+)--2,27.10-smol/1 P. Die Ng+bedingte Aufnahmef6rderung ist im Sehnittpunkt der beiden K +-Geraden am gr61~ten.

3. pH-Abh~ngig/ceit der Phosphataufnahme Die Phosphataufnahme der Na +- und K+-Ans~tze ist in Prozenten der in Na+- Gegenwart erreichten maximalen s~P-Ehfl~gerung [s2P(Na+) = 100% ] dargestellt und naeh Hendrix (1967) mit der Dissoziationskurve des H2PO ~- in Abhgngigkeit yon der H+-Konzentration vergliehen (Abb. 7). Die Phosphataufnahme hut in Na+-Gegenwart ein breites pit-Optimum yon pH 5,6 bis pit 7. In K+-Gegenwart liegt die maximule Phosphataufnahme bei pH 5,8. Mit zunehmender OH--Konzentration im Medium wh~ die Aufnahme in 13bereinstimmung mit der prozentualen Konzentration an H2PO J schnell geringer. Ab pH 8 bleibt sie dsnn unabhi~ngig yon der weiteren prozentuMen Abnahme des H~PO~-auf dem annghernd gleiehen niedrigen Niveau yon 10% der maximalen Einlagerung. M_it entspreehend zunehmender prozentualer IlPO[-Konzentration nimmt die Na+-F5rderung bis zu einem Maximalwert bei pI-I 8,5 zu.

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Ullrich-Eber/us u.Simonis: Eiifflul3von Na+ und K+ auf die Phosphataufnuhme 223 I

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Abb. 9. 32p-Markierung der Phosphatffaktionen in Abh~ngigkeit vom pH-Wert, in Luft q- 3 % CO2. Bedingungen s. Abb. 7 Die einzelnen Fraktionen (Abb. 8) folgen sowohl in Na+- wie in K +Gegenwart in ihrer Markierung der Gesamtphosphataufnahme. Die pH-Optima sind schmaler und liegen im Orthophosphat (pH 6,0) und im unlSslichen Phosphat (pH 5,6) im Bereich hSherer H+-Konzen~ration. Wurden die Algen mit Luft q-3 % CO 2 begast (Abb. 9), so verharrt in Na+-Gegenwart die Markierung aller Fraktionen im alkalischen Bereich nach Durchlaufen eines Minimums bei p H 7,8 au~ hSherem Niveau als bei niedrigem C02-Angebot. In K+-Gegenwart nimmt die Markierung aller Frak~ionen auch bier mit abnehmender tt2PO~--Konzen~ra~ion unbeeinfluBt yon der verbesserten COe-Versorgung ab. Diskussion Nach den Kriterien der Akkumulation und des Energiebedarfs (Sitte, 1969) ist anzunehmen, dab Na+- und K+-Ionen den aktiven Te~l der Phosphataufnahme bei Ankistrodesmus braunii beeinflussen. Bei der verwendeten extracellul/~ren Konzentration yon 5.10 -8 mol/1 P betr/~gt die Innenkonzentration e~wa 5.10 -3 tool/1 0rthophosphat. Bei gleieher Konzentration driicken die Hemms~offe des Energiestoffwechsels DCMU und Antimycin A und auch der Entkoppler CCCP (Carbonylcyanid m-Chlorphenylhydrazon) die Phosphataufnahme in Na+- wie in K+-Gegenwart auf gleiche unhemmbare Restwerte herunter (Ullrich-Eberins und Simohis, 1970). Die Untersuchungen an Ankistrodesmus wurden bei p H 8 durchgef/ihrt, im Bereich der grSBten Na+-K+-Untersehiede in der Phosphataufnahme und der 32p-Markierung der Fraktionen. Obwohl bier nur noch Abb. 8. a2p-Markierung der Phosphatfraktionen in Abh~ngigkei~ vom pH-Wert. Bedingungen s. Abb. 7 16

Planta (Berl.), Bd. 93

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C. I. Ullrich-Eberius und W. Simonis:

13 % des Phosphates als Hg.PO~-vorliegen und 87 % als HPO~ (berechnet aus den Dissoziationskonstanten K 1 --~7.10 -3 reel/1 and K S~--6,5.10 -8 reel/1 bei 30~ nach Farr, 1950), ergibt sieh in Na+-Gegenwart ffir die Phosphataufnahme in Abh/~ngigkeit vonder Aul~enkonzentration (5-10-~ bis 104 reel/l) nur eine Michaelis-Konstante (Abb. 6). Zwei Substrate untersehiedliehen Dissoziationsgrades sollten unterschiedliche Aufnahme. kinetik zeigen. Welehe Dissoziationsstufe des Phosphates wird aber yon Ankistrodesmus aufgenommen ? Es liegen darfiber zahlreiehe, aber keineswegs fibereinstimmende Ergebnisse an versehiedenen Objekten vor. Ffir das einwertige H2PO ~- wird ein Tr/s mit grol~er Affinit/~t angenommen, bei jungen Gerstenwarzeln yon MeGeorge (1932), Van Den Honert (1937), Arnon, Fratzke und Johnson (1942), Hagen und Hopkins (1955), Hendrix (1967) und bei Helen yon Goodman und Rothstein (1957). Hagen und Hopkins nehmen darfiber hinaus einen zweiten, unabh/~ngigen Tr/~ger ftir die Aufnahme des zweiwertigen HPO~ an, der in geringerer Konzentration (Vmax),abet mit grSl3erer Affinit/it (KM) HPO~ transportiert. Die anderen Autoren sehliel~en aus der sehr geringen Phosphataufnahme im alkalisehen pHBereich, dal~ HPO~ von Gerstenwurzeln und Helen nicht aufgenommen wird. Naeh Jacobsen, Hannaple and Moore (1958) dringt HPO~ sehnell in den apparent ]ree space ein, wird aber nicht aktiv aufgenommen, Bei Ankistrodesmus liegt das breite pH-Optimum der Phosphataufnahme im Bereieh hSherer prozentualer H~PO~--Konzentration (Abb. 7). Da bei pH 8 nut eine Miehaelis-Konstante vorliegt, ist wahrseheinlieh, dal~ aueh im alkalischen pH-Bereieh in Na+-Gegenwart nur die Dissoziationsstufe des H~PO~ aktiv aufgenommen wird. I n K +-Gegenwart scheint die Phosphataufnahme fiber zwei verschiedene Meehanismen zu verlaufen (Abb. 6). Im Bereich hSherer Phosphatkonzentration (10-~ bis 10-4 reel/l) ist bei gleicher Maximalgesehwindigkeit wie in Iqa+-Gegenwart die Michaelis-Konstante grSBer, also liegt eine Verdr/~ngungshemmung oder Affinit/~tsverringerung des gleiehen Transportproteins fiir das Substrat vor. Mit wachsender OH--Konzentration im Aul~enmedium nehmen die prozentuale H~PO~--Konzentration and in K +Gegenwart die Phosphatau~nahme gleiehsinnig ab (Abb. 7). Das sprieht ffir die Annahme, dal~ nur H~PO~- und nicht HPO~ aktiv aufgenommen werden kann und dal~ OH--Ionen, durch K+ verst~rkt, die H~PO~-Aufnahme kompetitiv hemmen. Wird die Phosphatkonzentration auf 5" 10-7 bis 5" 10-s mol/1 herabgesetzt, so ist nieht nut die prozentuale H2PO~--Konzentration gering, da im alkalischen pH-Bereich gearbeitet wird, sondern aueh die absolute H~PO~--Konzentration wird sehr niedrig. Die zus/~tzliche kompetitive Hemmung dureh erhShte OH--Konzentration verhindert in K+-Gegenwart wahrscheinlieh die aktive H~PO~--Aufnahme weitgehend und ffihrt

EinfluB yon Na+ und K + auf die Phosphataufnahme

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in der Auftragung nach Lineweaver und Burk (1934) zu einer Geraden (Abb. 6, Gerade II), die weder den gleiehen Ordinatenabsehnitt hat noeh parallel zu den Na +- oder K+-bedingten Geraden verl/~uft. Nach den in K+-Gegenwart geringen Lieht-Dunkel-Untersehieden der Aufnahme (Abb. 1) sowie der/tuBerst sehwachen DCMU- und CCCP-Hemmbarkeit (Ullrieh-Eberius und Simonis, 1970) kann in diesem Bereich das Phosphat nut noch fiber Diffusion in die Zelle gelangen. Der Wirkungsmechanismus der Kationen auf den Phosphattransport am Plasmalemma kann verschiedener Art skin. Einerseits kSnnte ein Transportprotein /~hnlicher Funktion wie bei der Transport-ATPase tierischer Membranen beeinfluBt werden. Allerdings wurde weder in ~qa+noeh in K+-Gegenwart eine Strophantinhemmung der Phosphataufnahme festgestellt. Auch ein Symport (Quastel, 1965) von Na+ und Phosphat ist mSglich, da die Na+-FSrderung bereits bei gleichzeitiger Gabe von Na + und Phosphat aueh ohne Vorinkubation mit Na + auftritt. Aueh der betr/~ehtliche Na+-Efflux spr/iche ffir dieses System. Nach dem EinfluB des H+/OH--Miliens wi~hrend der Aufnahmereaktion kann andererseits aueh eine vorangehende Wechselwirkung an Membranstrukturen der Festladungssehieht mit den Na +- und K+-Ionen die Ursaehe ffir die Beeinflussung des Phosphattransportes sein. Der Deutschen Forschungsgemeinschaft danken wir sehr ffir die Unterstfitzung dieser Arbeiten u_nd Fraulein Maria Griinsfelder ffir ihre freundliche Hilfe bei den Versuchen.

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