Planta (Berl.) 126, 165--171 (1975) 9 by Springer-Verlag 1975
Der Einflug yon Actinomycin D, Puromycin, Cycloheximid, Chloramphenicol und Rifampicin auf die Gametenbildung yon Acetabularia mediterranea H.-U. Koop Institut fiir Pflanzenphysiotogie und Zellbiologie, Freie Universitiit, K6nigin Luise Str. 12--16a, D-1000 Berlin 33 Eingegangen am 16. Mai; angenommen am 9. Juli 1975 The Influence of Actinomyein D, Puromyein, Cycloheximide, Chloramphenicol, and gifampiein on Gamete Formation in A cetabularia mediterranea Summary. Cysts of Acetabularia mediterranea were induced to germinate in the presence of various inhibitors of protein synthesis. Aetinomyein D (50 ~g/ml), puromyein (10 ~g/ml) and eyeloheximide (0.1 ,ag/ml) were found to be strong inhibitors of gamete formation, while chloramphenieol (up to 100 ~g/ml) and rifampiein (10 y.g/ml) did not show any effect. Malformations were found after treatment with puromyein and very high (200 ~g/ml) concentrations of chloramphenieol.
Einleitung Nachdem es gelungen war, die Gametenbildung bei Acetabularia mediterranea durch Exposition an die Atmosph/ire in nahezu allen Cysten einer Population zu induzieren (Koop, 1975a), ist der Prozess der Cystenkeimung einer physiologischen Analyse zug/~nglich geworden. Ziel der vorliegenden Untersuchungen war es, Informationen dar~iber zu erhalten, inwieweit die Synthese spezifischer Proteine in den verschiedenen Zellkomponenten Vorraussetzung f/Jr die w/~hrend der Cystenkeimung unter der Kontrolle yon haploiden Kernen (Koop, 1975b) ablaufenden cytologischen Ver/~nderungen (Koop, 1975c, weitere Literatur siehe dort) ist. Durch Einsatz yon Actinomycin D, einem Hemmstoff der DNA-abh/~ngigen Synthese yon RNA (Kirk, 1960), sollte gekl/~rt werden, ob es zur Gametenbildung der Transscription neuer genetischer Information bedarf. Durch Applikation yon Rifampicin, welches zwar die DNA-abh/~ngige RNA-Polymerase der Chloroplasten nicht aber die der Kerne h e m m t (Surzycki, 1969) sollte Aufschlug dariiber erhalten werden, ob die Prozesse der Cystenkeimung ein funktionsf/~higes Proteinsynthesesystem in den Chloroplasten bzw. Mitochondrien vorraussetzen. Dem gleichen Ziel diente die Inkubation mit Chloramphenicol, das die Proteinsynthese an 70 S - - nicht aber an 80 S-Ribosomen h e m m t (Ellis, 1969). Der Einsatz yon Cycloheximid, welches den transfer yon Aminoacyl-t-t~NA an cytoplasmatische Ribosomen h e m m t (Ennis und Lubin, 1964; Siegel und Sisler, 1964) sollte die Notwendigkeit yon Proteinsynthese speziell an cytoplasmatischen Ribosomen erhellen. Dutch Applikation von Puromycin, welches durch Einbau in neue
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Abb. 1. Hemmung der Cystenkeimung yon Acetabularia mediterranea durch Actinomyein D. Die Ordinate gibt die Keimungsraten (in %) an, die Abszisse die Versuehsdauer (in h)
P o l y p e p t i d k e t t e n (z.B. N a t h a n s , 1964) dazu ffihrt, dab diese vorzeitig v o m Ribosom abgel6st werden, sollte gekl~rt werden, welchen EinfluB die StSrung geordneter T r a n s l a t i o n auf die B i l d u n g der G a m e t e n y o n Acetabularia mediterranea hat. Material u n d Methoden Die Anzuchtbedingungen ffir die Zellen von Acetabularia mediterranea sowie einheitlich reagierende Cystenpopulationen und die Bedingungen zur Induktion der Gametenbildung wurden bereits ausffihrlich beschrieben (Koop, 1975a). Alle hier aufgeffihrten Versuche wurden im Dunkeln bei 21-}-0,2~ durchgefrihrt. In einigen Versuchen (Puromycin, Rifampicin) wurde der Agar durch Glasfritten (Schott u. Gen., Mainz, G. 0, ~ 2,5 cm) ersetzt. In diesem Falle betrug das Volumen der N~hrl6sung 2 ml pro Sch~lchen. Actinomycin D, l~ifampicin und Cycloheximid wurden yon Serva, Heidelberg, bezogen, Chloramphenicol und Puromycin stammten yon Boehringer, Mannheim. Die Hemmstoffe wurden direkt in Erd-SchreiberMedium gel5st und jeweils fiber die gesamte Versuchsdauer appliziert. Alle Versuche wurden mindestens zweimal mit verschiedenen Cystenpopulationen wiederholt. Die Keimungsraten wurden aus jeweils 5 Z~hlungen s 100 Cysten bestimmt, die angegebenen oberen und unteren Abweichungen yon den Mittelwerten geben den Bereich wieder, in dem die Wahrscheinlichkeit, dab der Mittelwert eingeschlossen ist, grSBer gleich 99 % ist (t-Test nach Student). Die Instabilit~t yon Rifampicin ~uch ira Dunkeln (erkennbar an der auftretenden Farbver~nderung), maehte es erforderlieh, Rifampiein-haltige LSsungen ti~glich zweimal zu erneuern, ttierzu kamen dieCysten auf Filtrierpapierscheibehen ( ~ 2 era), die sich auf dem Boden yon UmsetzkSrbchen befanden. Die KSrbchen bestanden aus 1,5 cm langen Stricken yon Plexiglasrohren (~uBerer ~ 3 cm), deren untere Offnung durch angeleimte feine Nylongaze ~r war. Diese KSrbchen mit den enthaltenen Filtrierpapierscheibchen und den darauf sieh befindenden Cysten wurden im Dunkeln mit einer Pinzette zweimal t~glich in ein neues KulturschS~lehen (2 ml LSsung plus Glasfritte) ribertragen. Bei den zugehSrigen Kontrollen wurde entsprechend verfahren.
Ergebnisse
Actinomycin D A e t i n o m y c i n D h e m m t die G a m e t e n b i l d u n g in Cysten y o n Acetabularia mediterranea (Abb. 1). Bei einer K o n z e n t r a t i o n y o n 5 ~g/ml gelangen ca. 45%
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Abb. 2. Hemmung der Cystenkeimung yon Acetabularia mediterranea durch Puromycin. Die Ordinate gibt die Keimungsraten (in %) an, die Abszisse die Versuchsdauer (in h) der Cysten (Kontrolle 85%) zur Ausbildung yon Gameten, bei l0 Fg/ml 20%, bei 20 Fg/ml noch 9% und bei 50 ~g/ml ist die Hemmung nahezu vollst~ndig. Actinomyein D hat keinen EirffluB auI die Charakteristik der Keimungskinetik. Beginn der Keimung und ihr Endpunkt sind bei allen untersuchten Konzentrationen gleich. Die liehtmikroskopisehe Analyse yon Cysten, die unter dem EinfluB yon Actinomycin D zur Gametenbildung gelangten, eIgaben keine Hinweise auf eytologische Ver~nderungen im Vergleieh zu den Kontrollans&tzen. Puromycin
Ebenso wie Actinomycin D hemmt Puromycin die Bildung der Gameten in zur Keimung induzierten Cysten von Acetabularia mediterranea (Abb. 2). Eine signifikante Keimungshemmung ist bereits bei einer Konzentration yon 1 ~g/ml zu beobachten. 50% Itemmung treten bei ca. 2 Fg/ml auf, bei 10 ~g/ml ist die Hemmung fast total. Mit steigender Konzentration an Puromycin treten bei den gebildeten Gameten vermehrt MiBbildungen auf. Im Gegensatz zu Gameten aus Kontrollans/ttzen, die sich dutch groge Einheitliehkeit in Form und Gr66e auszeichnen (Abb. 3a), entstehen in Puromycin-behandelten Cysten Gebilde unterschiedlieher Form und GrSge (Abb. 3b). Im Extremfall werden Monstren gebildet, die die Gr6Be der Gameten um ein vielfaches iibersteigen (Abb. 3c). Die Monstren tragen eine groBe Anzahl yon Augenflecken und aktiv sich bewegenden Geigelpaaren. Sie diirften wohl aueh mehrkernig sein, da sieh Puromyein-behandelte Cysten im mikroskopisehen Bild (vgl. Koop, 1975e, Fig. 4d) bis ca. 24 Std naeh Versuchsbeginn nicht yon den Kontrollen unterseheiden. Cycloheximid Cycloheximid erweist sich ebenso wie Actinomycin D und Puromycin ~ls Hemmstoff der Gametenbildung yon Acetabularia mediterranea (Abb. 4). Schon 0,001 Fg/m] zeigen einen deutiichen tIemmeffekt, 50% Hemmung werden bei etwa 0,005 Fg/ml erzielt, bei 0,05 Fg/ml ist die Hemmung vollst~ndig. Im Ge-
Abb. 3 A - D
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Abb. 4. Hemmung der Cystenkeimung yon Acetabularia mediterranea durch Cycloheximid. Die Ordinate gibt die Keimungsraten (in %) an, die Abszisse die Versuchsdauer (in h)
gensatz zu Actinomyein D und Puromycin zeigt Cyeloheximid einen Einflug nieht nur auf die Anzahl der keimenden Cysten sondern aueh auf die Keimungskinetik. I m dargestellten Versuch waren entlassene Gameten und entleerte Cysten bei der Kontrolle und 0,001 Fg/ml sehon bei 43 h zu beobaehten, bei 0,005 Fg/ml jedoch erst naeh 47 h und bei 0,01 Fg/ml sogar erst naeh 64 h. Cytologisehe Vergnderungen unter dem Einflug von Cyeloheximid wurden nieht beobaehtet. Chloramphenicol
Chloramphenieol hat his zu einer Konzentration yon 100 ~g/ml keinerlei Einflu6 auf die Cystenkeimung yon Acetabularia mediterranea. Bei noch h6heren Konzentrationen (200 Fg/ml) treten MiBbildungen auf (Abb. 3d), die wohl auf toxischen Nebeneffekten beruhen. Wie beim Puromyein kommt es bei extremen Chloramphenieol-Konzentrationen zur Bildung yon Monstren mit vielen Augenfleeken und aktiv sieh bewegenden Geigelpaaren. h n Gegensatz zum Puromyein wurde jedoeh beobachtet, da6 die dureh Chloramphenieo! hervorgerufenen Gebride sich nicht yon der bei der Gametenbildung entstehenden zentralen Blase (vgl. Koop, 1975c) zu trennen verm6gen. I m Extremfa]l bleibt fast der gesamte Cysteninhalt mit der zentralen Blase verbunden. Der Cystendeekel springt dann zwar zur gegebenen Zeit auf, der Inhalt kann aber die geSffnete Cyste nicht verlassen.
Abb. 3A--D. MiBbildungen bei der Gametenbildung von Acetabularia mediterranea. (A) Gameten aus Kontrollans~tzen. (B) Mfl]bildungen yon Gameten im Inneren einer mit 10 Fg/ml Puromycin behandelten Cyste unmittelbar vor deren Entleerung. (C) Monstren mit vielen Geil~elpaaren und Augenflecken, die unter der Einwirkung yon 10 ~g/ml Puromycin w~hrend der Cystenkeimung gebildet wurden. (D) Vielgei{~elige RestkSrper an der zentralen Blase in einer Cyste, die unter dem EiafluB yon 200 Fg/ml Chloramphenicol zur Keimung induziert wurde. Die ~{ikrophotographien wurden unter Verwendung eines B]aufilters (BG 12) yon lebendem Material hergestellt. Der eingezeichnete MaBstab entspricht 10 y.m
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H.-U. Koop
Ri/ampicin Rifampicin zeigt selbst in der hohen Konzentration yon 10 ~tg/ml keinen EinfluB auf die Bildung der Gameten yon Acetabularia mediterranea. Cytologische Ver&nderungen wnrden nicht beobachtet.
Diskussion
Der Einsatz yon Aetinomyein hat in der Disknssion fiber die Natur der "morphogenetischen Substanzen" yon Acstabularia mediterranea eine grol]e Rolle gespielt (Schweiger und Schweiger, 1963; ]3rachet et al., 1964; Zetsche, 1964). Die bier vorgelegten Ergebnisse (Abb. 1) zeigen, dal] bei der Gametenbildung yon Acetabularia mediterranea kurzfristig neue genetische Information transscribiert werden mull. Diese Information liegt nicht, wie etwa im Falle der Hutbildung, schon lange Zeit in transscribierter Form im Cytoplasma vor. Puromycin hemmt in der Acetabularia-Zelle Wachstum und Morphogenese (Brachet, 1963; Zetsche, 1966) durch Hemmung der Synthese yon Proteinen sowohl im Cytoplasma (Zetsche, 1969) als auch in den Chloroplasten (Apel nnd Schweiger, 1973; Bonotto et al., 1969). Zu den bisher bekannten Wirkungen yon Puromycin auf Acetabularia mediterranea kommt nun die ttemmung der Gametenbildnng hinzu (Abb. 2). Eine geordnete Gametenbildung kann offenbar nur bei ungestSrter Translation ablaufen, Die durch Puromycin hervorgerufenen MiBbildungen lassen sich analog denen bei der Acetabularia-Zelle beobachteten (Brachet, 1963) erkl/~ren: die vorzeitige Abl6sung der sich bildenden Polypeptidketten f/ihrt zu unvollstiindigen und damit funktionsgestSrten Proteinen. Diese wiederum ffihren zu StSrungen in der zeitlichen und r/~umlichen Koordination der morphogenetischen Prozesse, so dab Mil~bildungen resultieren. Der Einsatz yon Cycloheximid, Chloramphenicol und Rifampicin sollte kl/~ren, welche Ribosomen an der zur Gametenbildung erforder]ichen Proteinsynthese beteiligt sind. Cycloheximid (Bonotto st al., 1969 ; Zetsche, 1969 ; Apel und Schweiger, 1973; Kloppstech und Schweiger, 1974) hemmt die Gametenbildung, wi~hrend Chloramphenicol und Rifampicin ohne Wirkung sind. Chloramphenicol (Brachet, 1958) und Rifampiein wurden in Konzentrationen eingesetzt, die sich in den bei Acetabularia-Zellen untersuchten F/~llen als hemmend ffir die Proteinsynthese erwiesen hatten (Zetsche, 1969; Br/indle und Zetsche, 1971; Apel und Schweiger, 1973; Kloppstech und Schweiger, 1974). Es kann daher davon ausgegangen werden, dab der Proteinsynthese an 70 S-Ribosomen bei der Keimung der Cysten yon Aeetabularia mediterranea keine entscheidende Bedeutung zukommt, eine ungestSrte Proteinsynthese an cytoplasmatischen lgibosomen jedoch Vorraussetzung ffir die Gametenbfldung ist. Das Auftreten yon MiBbildungen bei sehr hohen Chloramphenicol-Konzentrationen kann als 1Yachweis daffir gelten, dab die ~Tirkungslosigkeit nieh/G einfach darin begriindet ist, dab Chloramphenicol nicht in die Cysten anfgenommen wird. Auff~llig bei diesen wie bei den dutch Puromycin hervorgerufenen MiBbildungen ist die Tatsache, dab offensichtlich die Ausbildung der Augenfleeke und Gei6elpaare weniger leicht gest5rt wird als die Aufgliederung des Cytoplasmas in Bezirke, die den sp~teren einzelnen Gameten entsprechen.
Einfliisse auf die Gametenbildung yon Acetabularia
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Die aufgef/ihrten Versuche geben keinerlei A u s k u r g t fiber den I n d u k t i o n s m e e h a n i s m u s der Cystenkeimung. Auffgllig ist jedoeh, dab n u r dureh Cycloh e x i m i d eine Verz6gerung in der K e i m u n g hervorgerufen wird. Zuktinftige gersuche, die insbesondere die g o r i n k u b a t i o n der Cysten m i t t I e m m s t o f f e n vor der K e i m u n g einsehliel3en, sollen klgren, ob die I n d u k t i o n ebenso wie die ReMisation der G a m e t e n b i l d u n g einer funktionsfghigen K e r n - c o d i e r t e n P r o t e i n b i o s y n t h e s e bedarf. Der Autor dankt Frau S. Artelt fiir ihre excellente technische Hilfe bei der Durchffihrung der Versuche. Literatur Apel, K., Schweiger, I-I.G.: Sites of synthesis of chloroplast-membrane proteins; evidence for three types of ribosomes engaged in chloroplast-protein synthesis. Europ. J. Biochem. {18, 373--382 (1973) Bonotto, S., Goffeau, A., Janowski, M., Van den Driessche, T., Brachet, J. : Effects of various inhibitors of protein synthesis on Acetabularia mediterranea. Biochim. biophys. Acta (Amst.) 174, 704--712 (1969) Brachet, J. : ~lew observations on biochemical interactions between nucleus and cytoplasm in Amoeba and Acetabularia. Exp. Cell P~es., Suppl. 6, 78--96 (1958) Brachet, J. : Effects of puromycin on morphogenesis in amphibian eggs and Acetabularia mediterranea. Nature (Loud.) 199, 714~-715 (1963) Brachet, J., Denis, I-I., de Vitry, F.: The effects of actinomycin D and puromycin on morphogenesis in amphibian eggs and Acetabularia mediterranea. Develop. Biol. 9, 398--434 (1964) ]grgndle, E., Zetsche, K. : Die Wirkung yon Rifampicin auf die RNA- und Proteinsynthese sowie die Morphogenese und den ChlorophyllgehM~ kernhaltiger und kernloser Acetabularia-Zellen. Planta (Berl.) 99, 46--55 (1971) Ellis, 1%.J. : Chloroplast ribosomes : Stereospecificity of inhibition by chlorampheicol. Science 163, 477--478 (1969) Ennis, H.L., Lubin, M.: Cycloheximide: Aspects of inhibition of protein synthesis in mammalian cells. Science 146, 1474--1476 (1964) Kirk, J.M. : The mode of action of actinomycin D. Biochim. biophys. Acta (Amst.) 42, 167-169 (1960) Kloppstech, K., Schweiger, H.G.: The site of synthesis of chloroplast ribosomal proteins. Plant Sci. Letters 2, 101--105 (1974) Koop, H.U. : Germination of cysts in Acetabularia mediterranea. Protoplasma (Wien) 84,137-146 (1975) Koop, 1-I.U.: {fiber den Oft der Meiose bei Acetabularia mediterranea. Protoplasma (Wien) (1975b), (in press) Koop, H.U. : Multinuclear stages of the life cycle of Acetabularia mediterranea. Pro~oplasma (Wien) (1975c) (in press) Nathans, D. : Puromycin inhibition of protein synthesis: incorporation of puromycin into peptide chains. Proc. nat. Acad. Sci. (Wash.) 51, 585--592 (1964) Schweiger, H.G., Schweiger, E. : Zur Wirkung yon Actinomycin C auf Acetabularia. Naturwissensehaften 50, 620 (1963) Siegel, 3/[.1%., Sisler, 1LI.D.: Site of action of cycloheximide in cells of SacJ~aromyces pastorianus. II. The nature of inhibition of protein synthesis in a cell.free system. Biochim. biophys. Acta (Amst.) 87, 83--89 (1964) Surzycki, S. J. : Genetic functions of the chloroplast of Chlamydomona8 reinhardi: effect of rifampin on chloroplast DNA-dependent P~NA polymerase. Proc. nat. Acad. Sci. (Wash.) 63, 1327--1334 (1969) Zetsche, K. : Hemmung der Synthese morphogenetischer Substanzen im Zellkern yon Aeetabularia mediterranea durch Actinomycin D. Z. Naturforsch. 19b, 751--759 (1964) Zetsche, K. : Anreicherung yon ~Proteinsynthese induzierenden Substanzen in Acetabularia mediterranea unter dem Einflul3 yon Puromycin. Z. iNaturforsch. 21b, 88--90 (1966) Zetsche, K. : Die Wirkung yon P~NA- und Proteinsyntheseinhibitoren aui den Chlorophyllgehalt kernhMtiger und kernloser Acetabularien. Planta (Berl.) 89, 284--298 (1969)
Der Einflug yon Actinomycin D, Puromycin, Cycloheximid, Chloramphenicol und Rifampicin auf die Gametenbildung yon Acetabularia mediterranea H.-U. Koop Institut fiir Pflanzenphysiotogie und Zellbiologie, Freie Universitiit, K6nigin Luise Str. 12--16a, D-1000 Berlin 33 Eingegangen am 16. Mai; angenommen am 9. Juli 1975 The Influence of Actinomyein D, Puromyein, Cycloheximide, Chloramphenicol, and gifampiein on Gamete Formation in A cetabularia mediterranea Summary. Cysts of Acetabularia mediterranea were induced to germinate in the presence of various inhibitors of protein synthesis. Aetinomyein D (50 ~g/ml), puromyein (10 ~g/ml) and eyeloheximide (0.1 ,ag/ml) were found to be strong inhibitors of gamete formation, while chloramphenieol (up to 100 ~g/ml) and rifampiein (10 y.g/ml) did not show any effect. Malformations were found after treatment with puromyein and very high (200 ~g/ml) concentrations of chloramphenieol.
Einleitung Nachdem es gelungen war, die Gametenbildung bei Acetabularia mediterranea durch Exposition an die Atmosph/ire in nahezu allen Cysten einer Population zu induzieren (Koop, 1975a), ist der Prozess der Cystenkeimung einer physiologischen Analyse zug/~nglich geworden. Ziel der vorliegenden Untersuchungen war es, Informationen dar~iber zu erhalten, inwieweit die Synthese spezifischer Proteine in den verschiedenen Zellkomponenten Vorraussetzung f/Jr die w/~hrend der Cystenkeimung unter der Kontrolle yon haploiden Kernen (Koop, 1975b) ablaufenden cytologischen Ver/~nderungen (Koop, 1975c, weitere Literatur siehe dort) ist. Durch Einsatz yon Actinomycin D, einem Hemmstoff der DNA-abh/~ngigen Synthese yon RNA (Kirk, 1960), sollte gekl/~rt werden, ob es zur Gametenbildung der Transscription neuer genetischer Information bedarf. Durch Applikation yon Rifampicin, welches zwar die DNA-abh/~ngige RNA-Polymerase der Chloroplasten nicht aber die der Kerne h e m m t (Surzycki, 1969) sollte Aufschlug dariiber erhalten werden, ob die Prozesse der Cystenkeimung ein funktionsf/~higes Proteinsynthesesystem in den Chloroplasten bzw. Mitochondrien vorraussetzen. Dem gleichen Ziel diente die Inkubation mit Chloramphenicol, das die Proteinsynthese an 70 S - - nicht aber an 80 S-Ribosomen h e m m t (Ellis, 1969). Der Einsatz yon Cycloheximid, welches den transfer yon Aminoacyl-t-t~NA an cytoplasmatische Ribosomen h e m m t (Ennis und Lubin, 1964; Siegel und Sisler, 1964) sollte die Notwendigkeit yon Proteinsynthese speziell an cytoplasmatischen Ribosomen erhellen. Dutch Applikation von Puromycin, welches durch Einbau in neue
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Abb. 1. Hemmung der Cystenkeimung yon Acetabularia mediterranea durch Actinomyein D. Die Ordinate gibt die Keimungsraten (in %) an, die Abszisse die Versuehsdauer (in h)
P o l y p e p t i d k e t t e n (z.B. N a t h a n s , 1964) dazu ffihrt, dab diese vorzeitig v o m Ribosom abgel6st werden, sollte gekl~rt werden, welchen EinfluB die StSrung geordneter T r a n s l a t i o n auf die B i l d u n g der G a m e t e n y o n Acetabularia mediterranea hat. Material u n d Methoden Die Anzuchtbedingungen ffir die Zellen von Acetabularia mediterranea sowie einheitlich reagierende Cystenpopulationen und die Bedingungen zur Induktion der Gametenbildung wurden bereits ausffihrlich beschrieben (Koop, 1975a). Alle hier aufgeffihrten Versuche wurden im Dunkeln bei 21-}-0,2~ durchgefrihrt. In einigen Versuchen (Puromycin, Rifampicin) wurde der Agar durch Glasfritten (Schott u. Gen., Mainz, G. 0, ~ 2,5 cm) ersetzt. In diesem Falle betrug das Volumen der N~hrl6sung 2 ml pro Sch~lchen. Actinomycin D, l~ifampicin und Cycloheximid wurden yon Serva, Heidelberg, bezogen, Chloramphenicol und Puromycin stammten yon Boehringer, Mannheim. Die Hemmstoffe wurden direkt in Erd-SchreiberMedium gel5st und jeweils fiber die gesamte Versuchsdauer appliziert. Alle Versuche wurden mindestens zweimal mit verschiedenen Cystenpopulationen wiederholt. Die Keimungsraten wurden aus jeweils 5 Z~hlungen s 100 Cysten bestimmt, die angegebenen oberen und unteren Abweichungen yon den Mittelwerten geben den Bereich wieder, in dem die Wahrscheinlichkeit, dab der Mittelwert eingeschlossen ist, grSBer gleich 99 % ist (t-Test nach Student). Die Instabilit~t yon Rifampicin ~uch ira Dunkeln (erkennbar an der auftretenden Farbver~nderung), maehte es erforderlieh, Rifampiein-haltige LSsungen ti~glich zweimal zu erneuern, ttierzu kamen dieCysten auf Filtrierpapierscheibehen ( ~ 2 era), die sich auf dem Boden yon UmsetzkSrbchen befanden. Die KSrbchen bestanden aus 1,5 cm langen Stricken yon Plexiglasrohren (~uBerer ~ 3 cm), deren untere Offnung durch angeleimte feine Nylongaze ~r war. Diese KSrbchen mit den enthaltenen Filtrierpapierscheibchen und den darauf sieh befindenden Cysten wurden im Dunkeln mit einer Pinzette zweimal t~glich in ein neues KulturschS~lehen (2 ml LSsung plus Glasfritte) ribertragen. Bei den zugehSrigen Kontrollen wurde entsprechend verfahren.
Ergebnisse
Actinomycin D A e t i n o m y c i n D h e m m t die G a m e t e n b i l d u n g in Cysten y o n Acetabularia mediterranea (Abb. 1). Bei einer K o n z e n t r a t i o n y o n 5 ~g/ml gelangen ca. 45%
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Abb. 2. Hemmung der Cystenkeimung yon Acetabularia mediterranea durch Puromycin. Die Ordinate gibt die Keimungsraten (in %) an, die Abszisse die Versuchsdauer (in h) der Cysten (Kontrolle 85%) zur Ausbildung yon Gameten, bei l0 Fg/ml 20%, bei 20 Fg/ml noch 9% und bei 50 ~g/ml ist die Hemmung nahezu vollst~ndig. Actinomyein D hat keinen EirffluB auI die Charakteristik der Keimungskinetik. Beginn der Keimung und ihr Endpunkt sind bei allen untersuchten Konzentrationen gleich. Die liehtmikroskopisehe Analyse yon Cysten, die unter dem EinfluB yon Actinomycin D zur Gametenbildung gelangten, eIgaben keine Hinweise auf eytologische Ver~nderungen im Vergleieh zu den Kontrollans&tzen. Puromycin
Ebenso wie Actinomycin D hemmt Puromycin die Bildung der Gameten in zur Keimung induzierten Cysten von Acetabularia mediterranea (Abb. 2). Eine signifikante Keimungshemmung ist bereits bei einer Konzentration yon 1 ~g/ml zu beobachten. 50% Itemmung treten bei ca. 2 Fg/ml auf, bei 10 ~g/ml ist die Hemmung fast total. Mit steigender Konzentration an Puromycin treten bei den gebildeten Gameten vermehrt MiBbildungen auf. Im Gegensatz zu Gameten aus Kontrollans/ttzen, die sich dutch groge Einheitliehkeit in Form und Gr66e auszeichnen (Abb. 3a), entstehen in Puromycin-behandelten Cysten Gebilde unterschiedlieher Form und GrSge (Abb. 3b). Im Extremfall werden Monstren gebildet, die die Gr6Be der Gameten um ein vielfaches iibersteigen (Abb. 3c). Die Monstren tragen eine groBe Anzahl yon Augenflecken und aktiv sich bewegenden Geigelpaaren. Sie diirften wohl aueh mehrkernig sein, da sieh Puromyein-behandelte Cysten im mikroskopisehen Bild (vgl. Koop, 1975e, Fig. 4d) bis ca. 24 Std naeh Versuchsbeginn nicht yon den Kontrollen unterseheiden. Cycloheximid Cycloheximid erweist sich ebenso wie Actinomycin D und Puromycin ~ls Hemmstoff der Gametenbildung yon Acetabularia mediterranea (Abb. 4). Schon 0,001 Fg/m] zeigen einen deutiichen tIemmeffekt, 50% Hemmung werden bei etwa 0,005 Fg/ml erzielt, bei 0,05 Fg/ml ist die Hemmung vollst~ndig. Im Ge-
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Einfliisse auf die Gametenbildung yon Acetabularia I
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Abb. 4. Hemmung der Cystenkeimung yon Acetabularia mediterranea durch Cycloheximid. Die Ordinate gibt die Keimungsraten (in %) an, die Abszisse die Versuchsdauer (in h)
gensatz zu Actinomyein D und Puromycin zeigt Cyeloheximid einen Einflug nieht nur auf die Anzahl der keimenden Cysten sondern aueh auf die Keimungskinetik. I m dargestellten Versuch waren entlassene Gameten und entleerte Cysten bei der Kontrolle und 0,001 Fg/ml sehon bei 43 h zu beobaehten, bei 0,005 Fg/ml jedoch erst naeh 47 h und bei 0,01 Fg/ml sogar erst naeh 64 h. Cytologisehe Vergnderungen unter dem Einflug von Cyeloheximid wurden nieht beobaehtet. Chloramphenicol
Chloramphenieol hat his zu einer Konzentration yon 100 ~g/ml keinerlei Einflu6 auf die Cystenkeimung yon Acetabularia mediterranea. Bei noch h6heren Konzentrationen (200 Fg/ml) treten MiBbildungen auf (Abb. 3d), die wohl auf toxischen Nebeneffekten beruhen. Wie beim Puromyein kommt es bei extremen Chloramphenieol-Konzentrationen zur Bildung yon Monstren mit vielen Augenfleeken und aktiv sieh bewegenden Geigelpaaren. h n Gegensatz zum Puromyein wurde jedoeh beobachtet, da6 die dureh Chloramphenieo! hervorgerufenen Gebride sich nicht yon der bei der Gametenbildung entstehenden zentralen Blase (vgl. Koop, 1975c) zu trennen verm6gen. I m Extremfa]l bleibt fast der gesamte Cysteninhalt mit der zentralen Blase verbunden. Der Cystendeekel springt dann zwar zur gegebenen Zeit auf, der Inhalt kann aber die geSffnete Cyste nicht verlassen.
Abb. 3A--D. MiBbildungen bei der Gametenbildung von Acetabularia mediterranea. (A) Gameten aus Kontrollans~tzen. (B) Mfl]bildungen yon Gameten im Inneren einer mit 10 Fg/ml Puromycin behandelten Cyste unmittelbar vor deren Entleerung. (C) Monstren mit vielen Geil~elpaaren und Augenflecken, die unter der Einwirkung yon 10 ~g/ml Puromycin w~hrend der Cystenkeimung gebildet wurden. (D) Vielgei{~elige RestkSrper an der zentralen Blase in einer Cyste, die unter dem EiafluB yon 200 Fg/ml Chloramphenicol zur Keimung induziert wurde. Die ~{ikrophotographien wurden unter Verwendung eines B]aufilters (BG 12) yon lebendem Material hergestellt. Der eingezeichnete MaBstab entspricht 10 y.m
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H.-U. Koop
Ri/ampicin Rifampicin zeigt selbst in der hohen Konzentration yon 10 ~tg/ml keinen EinfluB auf die Bildung der Gameten yon Acetabularia mediterranea. Cytologische Ver&nderungen wnrden nicht beobachtet.
Diskussion
Der Einsatz yon Aetinomyein hat in der Disknssion fiber die Natur der "morphogenetischen Substanzen" yon Acstabularia mediterranea eine grol]e Rolle gespielt (Schweiger und Schweiger, 1963; ]3rachet et al., 1964; Zetsche, 1964). Die bier vorgelegten Ergebnisse (Abb. 1) zeigen, dal] bei der Gametenbildung yon Acetabularia mediterranea kurzfristig neue genetische Information transscribiert werden mull. Diese Information liegt nicht, wie etwa im Falle der Hutbildung, schon lange Zeit in transscribierter Form im Cytoplasma vor. Puromycin hemmt in der Acetabularia-Zelle Wachstum und Morphogenese (Brachet, 1963; Zetsche, 1966) durch Hemmung der Synthese yon Proteinen sowohl im Cytoplasma (Zetsche, 1969) als auch in den Chloroplasten (Apel nnd Schweiger, 1973; Bonotto et al., 1969). Zu den bisher bekannten Wirkungen yon Puromycin auf Acetabularia mediterranea kommt nun die ttemmung der Gametenbildnng hinzu (Abb. 2). Eine geordnete Gametenbildung kann offenbar nur bei ungestSrter Translation ablaufen, Die durch Puromycin hervorgerufenen MiBbildungen lassen sich analog denen bei der Acetabularia-Zelle beobachteten (Brachet, 1963) erkl/~ren: die vorzeitige Abl6sung der sich bildenden Polypeptidketten f/ihrt zu unvollstiindigen und damit funktionsgestSrten Proteinen. Diese wiederum ffihren zu StSrungen in der zeitlichen und r/~umlichen Koordination der morphogenetischen Prozesse, so dab Mil~bildungen resultieren. Der Einsatz yon Cycloheximid, Chloramphenicol und Rifampicin sollte kl/~ren, welche Ribosomen an der zur Gametenbildung erforder]ichen Proteinsynthese beteiligt sind. Cycloheximid (Bonotto st al., 1969 ; Zetsche, 1969 ; Apel und Schweiger, 1973; Kloppstech und Schweiger, 1974) hemmt die Gametenbildung, wi~hrend Chloramphenicol und Rifampicin ohne Wirkung sind. Chloramphenicol (Brachet, 1958) und Rifampiein wurden in Konzentrationen eingesetzt, die sich in den bei Acetabularia-Zellen untersuchten F/~llen als hemmend ffir die Proteinsynthese erwiesen hatten (Zetsche, 1969; Br/indle und Zetsche, 1971; Apel und Schweiger, 1973; Kloppstech und Schweiger, 1974). Es kann daher davon ausgegangen werden, dab der Proteinsynthese an 70 S-Ribosomen bei der Keimung der Cysten yon Aeetabularia mediterranea keine entscheidende Bedeutung zukommt, eine ungestSrte Proteinsynthese an cytoplasmatischen lgibosomen jedoch Vorraussetzung ffir die Gametenbfldung ist. Das Auftreten yon MiBbildungen bei sehr hohen Chloramphenicol-Konzentrationen kann als 1Yachweis daffir gelten, dab die ~Tirkungslosigkeit nieh/G einfach darin begriindet ist, dab Chloramphenicol nicht in die Cysten anfgenommen wird. Auff~llig bei diesen wie bei den dutch Puromycin hervorgerufenen MiBbildungen ist die Tatsache, dab offensichtlich die Ausbildung der Augenfleeke und Gei6elpaare weniger leicht gest5rt wird als die Aufgliederung des Cytoplasmas in Bezirke, die den sp~teren einzelnen Gameten entsprechen.
Einfliisse auf die Gametenbildung yon Acetabularia
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Die aufgef/ihrten Versuche geben keinerlei A u s k u r g t fiber den I n d u k t i o n s m e e h a n i s m u s der Cystenkeimung. Auffgllig ist jedoeh, dab n u r dureh Cycloh e x i m i d eine Verz6gerung in der K e i m u n g hervorgerufen wird. Zuktinftige gersuche, die insbesondere die g o r i n k u b a t i o n der Cysten m i t t I e m m s t o f f e n vor der K e i m u n g einsehliel3en, sollen klgren, ob die I n d u k t i o n ebenso wie die ReMisation der G a m e t e n b i l d u n g einer funktionsfghigen K e r n - c o d i e r t e n P r o t e i n b i o s y n t h e s e bedarf. Der Autor dankt Frau S. Artelt fiir ihre excellente technische Hilfe bei der Durchffihrung der Versuche. Literatur Apel, K., Schweiger, I-I.G.: Sites of synthesis of chloroplast-membrane proteins; evidence for three types of ribosomes engaged in chloroplast-protein synthesis. Europ. J. Biochem. {18, 373--382 (1973) Bonotto, S., Goffeau, A., Janowski, M., Van den Driessche, T., Brachet, J. : Effects of various inhibitors of protein synthesis on Acetabularia mediterranea. Biochim. biophys. Acta (Amst.) 174, 704--712 (1969) Brachet, J. : ~lew observations on biochemical interactions between nucleus and cytoplasm in Amoeba and Acetabularia. Exp. Cell P~es., Suppl. 6, 78--96 (1958) Brachet, J. : Effects of puromycin on morphogenesis in amphibian eggs and Acetabularia mediterranea. Nature (Loud.) 199, 714~-715 (1963) Brachet, J., Denis, I-I., de Vitry, F.: The effects of actinomycin D and puromycin on morphogenesis in amphibian eggs and Acetabularia mediterranea. Develop. Biol. 9, 398--434 (1964) ]grgndle, E., Zetsche, K. : Die Wirkung yon Rifampicin auf die RNA- und Proteinsynthese sowie die Morphogenese und den ChlorophyllgehM~ kernhaltiger und kernloser Acetabularia-Zellen. Planta (Berl.) 99, 46--55 (1971) Ellis, 1%.J. : Chloroplast ribosomes : Stereospecificity of inhibition by chlorampheicol. Science 163, 477--478 (1969) Ennis, H.L., Lubin, M.: Cycloheximide: Aspects of inhibition of protein synthesis in mammalian cells. Science 146, 1474--1476 (1964) Kirk, J.M. : The mode of action of actinomycin D. Biochim. biophys. Acta (Amst.) 42, 167-169 (1960) Kloppstech, K., Schweiger, H.G.: The site of synthesis of chloroplast ribosomal proteins. Plant Sci. Letters 2, 101--105 (1974) Koop, H.U. : Germination of cysts in Acetabularia mediterranea. Protoplasma (Wien) 84,137-146 (1975) Koop, 1-I.U.: {fiber den Oft der Meiose bei Acetabularia mediterranea. Protoplasma (Wien) (1975b), (in press) Koop, H.U. : Multinuclear stages of the life cycle of Acetabularia mediterranea. Pro~oplasma (Wien) (1975c) (in press) Nathans, D. : Puromycin inhibition of protein synthesis: incorporation of puromycin into peptide chains. Proc. nat. Acad. Sci. (Wash.) 51, 585--592 (1964) Schweiger, H.G., Schweiger, E. : Zur Wirkung yon Actinomycin C auf Acetabularia. Naturwissensehaften 50, 620 (1963) Siegel, 3/[.1%., Sisler, 1LI.D.: Site of action of cycloheximide in cells of SacJ~aromyces pastorianus. II. The nature of inhibition of protein synthesis in a cell.free system. Biochim. biophys. Acta (Amst.) 87, 83--89 (1964) Surzycki, S. J. : Genetic functions of the chloroplast of Chlamydomona8 reinhardi: effect of rifampin on chloroplast DNA-dependent P~NA polymerase. Proc. nat. Acad. Sci. (Wash.) 63, 1327--1334 (1969) Zetsche, K. : Hemmung der Synthese morphogenetischer Substanzen im Zellkern yon Aeetabularia mediterranea durch Actinomycin D. Z. Naturforsch. 19b, 751--759 (1964) Zetsche, K. : Anreicherung yon ~Proteinsynthese induzierenden Substanzen in Acetabularia mediterranea unter dem Einflul3 yon Puromycin. Z. iNaturforsch. 21b, 88--90 (1966) Zetsche, K. : Die Wirkung yon P~NA- und Proteinsyntheseinhibitoren aui den Chlorophyllgehalt kernhMtiger und kernloser Acetabularien. Planta (Berl.) 89, 284--298 (1969)
