日 内 分 泌 会 誌,(Folia

endocrinol.)66.747∼759.1990

747

ラ ッ ト 卵 巣 に お け るVasoactive Peptideの

Intestinal

作 用 に つ い て

帝京 大学 医学部 産 婦人科 (指導:荒 井 清 教授) 大

The

Effect

of

川

Vasoactive

亮

Intestinal

Ryoichi

of Obstetrics

Teikyo

University

(Director:

recent

peptide in

years,

(VIP)

the

in

ovary

made

in

treatment

in

rats

gonadotropin or

produced

These

presence in

were

of

the

of

by

investigated.

VIP

dependently

in

an

monophosphate

(c-AMP)

dehydrogenase

(3ƒÀ-HSD)

stimulated

but

the

the

granulosa

stimulating

induce

cells.

The by

Another

less

than

cells

at

that

of

suggesting

In

125I-VIP

with

of the

of

these

cells

dose

and

cyclic

adenosine

for

was time

24

VIP

was

blocked, in

the

its

stimulate

hours. (FSH)

FSH,

although not

the

granulosa

hormone

cells

did

steroids

3ƒÀ-hydroxysteroid

VIP-receptor cells

secretin

in

of the

cells

Unlike

granulosa

48hr

pregnenolone.

stimulating FSH.

granulosa and

in

of

granulosa

follicle

presence

the CCK

for

in

enhanced

the

that

the

gastrin,

to

than

stimulated

contrast,

with

similar

less

VIP, PHM-27,

VIP.

a way

slightly

binding

unlabelled peptide,

of

in

VIP

incubated

collected chorionic

amount

labelled

amount

after

were

production The

We

human

VIP-receptor

3•~10-8M.

increased.

when

collected

VIP

did

dose

granulosa

potency the

, not

was

granulosa

all. According

progesterone

was

of

were

3ƒÀ-HSD

from

and

of

unknown.

medium

of

progesterone

value

similarly

cells

effect

LH-receptor.

dependently,

was

VIP

significance

cells

the

formed by

and

ED.

activity

Activities

free

intestinal

still

and

determined

progesterone

estrogen

approximate

RIA.

cells

Luteal (PMS)

serum

We

specific of

a

VIP.

is cells

rats. serum

vasoactive

the

action

granulosa

in

of

granulosa

of of

Ovarian

cultured

amount

stimulated

with

VIP

were

the

.

of

Investigations

mare

amounts

the

LH-receptor

Arai)

mechanism

ovaries

by

Ovary

Gynecology

hypophysectomized

medium

Rat

significance

studied.

pregnant

cells

various

culture

determined

Induction

rat

with

the

of Medicine

Kiyosyi

detailed

immature

treated

(hCG).

absence

the

using

on

physiological

been

but

VIP

estrogen

immature

cells

of

and

have

done,

and School

Prof.

localization organs

been

studies

with

from

various

have

vitro

the

Peptide

OHKAWA

Department

In

一

to production

the

present in

vitro

study, was

VIP not

did

stimulated

第66巻

not

exert by

第8号

this

any peptide.

effect

on

the

luteal

cells,

and

748

ラ ッ ト卵 巣 に お け るVasoactive

The through

VIP

effects seem

the VIP-receptor The

regulate

observed

to be at least partly

in the granulosa

direct

the ovarian

Intestinal

c-AMP

suggest

dependent

that

and

川)

may

be mediated

it may

act as a local hormone

to

function.

言

多 くの 脳 消 化 管 活 性 ペ プ チ ドが 発 見 さ れ,種

き た 。 又,そ

作 用 に つ い て(大

cells.

effects of VIP

緒 近 年,数

Peptideの

々 の 臓 器 に存 在 す る こ と が 明 らか と な っ て

の 臓 器 に 存 在 す る 活 性 ペ プ チ ドの 作 用 に つ い て も解 明 され て きて い る。 現 在 ま で に

20種 類 の 活 性 ペ プ チ ドが 発 見 さ れ て お り,こ れ ら はgastrointestinal gut hormoneな

ど と総 称 され て い る。 こ の 中 のVIP(Vasoactive

hormoneあ Intestinal

る い は,brain Peptide)は,28の

ア ミ ノ酸 か ら な る グル カ ゴ ン フ ァ ミ リー の 一 つ で あ る。VIPは,1970年,Muttら21)に ブ タ腸 管 よ り分 離 さ れ,腸

管 ぜ ん 動 運 動 や,腸

液 分 泌 を 司 る25)こと が解 明 され た 。 そ の 後VIPは

脳 内 に も局 在 す る こ と が 示 さ れ5)19),視 床 下 部 ・下 垂 体 系 で,ホ 用 を 発 揮 して,プ ま た,VIPは

よ り初 め て

ル モ ン あ るいは神 経伝 達 物 質 の作

ロ ラ ク チ ン分 泌 を調 節 す る事 や7)9)16)26),LH分 泌 を 抑 制 す る2)可能 性 が 報 告 され た 。

消 化 管 ・中 枢 神 経 の み な らず,ネ

お り3)4),VIP投

コや,ヒ

与 後 家 兎 の 血 中progesterone(P)濃

ト性 腺 に お い て も そ の 局 在 が 認 め ら れ て 度 が 上 昇 す る 事10)など か ら,こ

お い て 作 用 して い る可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 そ の 後 幾 つ か の 報 告 が あ る が,卵 用 に つ い て は,未

れ が末梢 に

巣 に お け るVIPの

作

だ不 明の点 が多 い。

本 研 究 は,VIPの

卵 巣 に お け る 作 用 を追 求 す る た め,in

vitroで

体 細 胞 に対 す る ス テ ロ イ ド分 泌 作 用 を 調 べ た 。 さ ら に,卵

ラ ッ ト卵 巣 顆 粒 膜 細 胞 及 び 黄

巣 顆 粒 膜 細 胞 に お け るVIP

receptor

の 同定 な ど も試 み た 。 実 験 材 料 お よび 方 法 1)実

験材 料

卵 巣 顆 粒 膜 細 胞:生

後22∼23日

令 のSprague-Dawley系

りdiethylstibestrol

0.1mg/0.1mlラ

摘 出 卵 巣 をHank's

calcium

magnesium

中 で25ゲ ー ジ 針 で 穿 刺 して,顆 卵 巣 黄 体 細 胞:24日 (PMS)(帝

nuclease min,37℃ 5分)洗

free medium(HCMF溶

崎 市)50IU/0.5ml生

生 否 はtrypan

blue

dyeで

New

York)

serum

間 後 にhuman

hormone chorionic

与 後6日 目 に卵 巣 を摘 出,周

細 切 後collagenase(SIGMA,St.Louis)20mgとdeoxyribo-

空 気 中 でincubationし 養 溶 液)を3回

mare's

食 を 皮 下 投 与,64時

食 を 皮 下 投 与 した 。hCG投

I (DNase:SIGMA)50μgをBSA0.1%を

浄(培

日よ

巣 を摘 出 した 。

液,GIBCO,

幼 若 メ ス ラ ッ トにpregnant

gonadotropin(hCG)25IU/0.25ml生 囲 組 織 を 除 去,約1mm3に

間 皮 下 投 与 後,卵

粒 膜 細 胞 を 採 取 した 。

令Sprague-Dawley系

国 臓 器 製 薬,川

幼 若 メ ス ラ ッ トの 下 垂 体 を摘 出,翌

ッカ セ イ 油/dayを3日

溶 解 したHCMF溶

液5ml中

て 細 胞 を 採 取 した 。 そ れ ぞ れ 採 取 した 細 胞 は,遠

行 な い,BURKER-TURK型

に 入 れ,90 心(800rpm,

血 球 計 算 盤 で 細 胞 数 を数 え た 。 細 胞 の

染 色 して 確 認 した 。

試薬 Vasoactive

intestinal

peptide

(VIP),

gastrin 第66巻

(big

第8号

gastrin),

cholecystokinin

(CCK-

日 octapeptide),

PHM-27

stimulating

(human

本

内

PHI),

分

泌

会

に よ り125Iを

749

誌 Institute

Louis

ク ロ ラ ミ ンT法

雑

secretinは,Peptide

hormone(FSH)は,SIGMA(ST.

し た 。hCG,VIPは

学

Inc(大

USA),hCGは,帝

標 識,そ

阪 府),

follicle

国 臓 器 製 薬 よ り購 入

れ ぞれ の標識 ホル モ ンをゲ ル濾過 で 精

製 した 。 2)方

法

培養 方法 培 養 液 は,2mM-l

glutamin,

Δ4-androstenedioneの

penicillin

い た 。 採 取 し た 顆 粒 膜 細 胞,黄 (CORNING,

100IU/ml,

入 っ たDulbecco's

New

York)を

体 細 胞 は,そ

Eagle

粒 膜 細 胞 の 入 っ たweｌlに

に 保 存,後

(c-AMP)の

WELL

イ ン キ ュ ベ ー タで

は,FSH,VIP,CCK,Gastrin

はhCGあ

る い はVIPを

添 加 し,無

間 で の 培 養 液 は,サ

添加 群 を

ンプル チ ュー ブ に

日 ス テ ロ イ ド ホ ル モ ン,Adenosine3',5'-cyclicmono-phosphate

測 定

培 養 液 中 のE2とPは,特 Adenocine

異 性 の 高 い 抗 血 清 を 使 用 し て,培

3,5-cyclic

Honmaら13)の

monophosphosphate

方 法 に 従 い,サ

のc-AMPを

(c-AMP)の

養 液 中 濃 度 をRIAに

よ り測 定 し た 。

測定

イ ク リ ッ クAMPキ

ッ ト(ヤ

マ サ,東

京 都)を

用 い て培養 液 中

測 定 した 。

3β-Hydroxysteroid

Dehydrogenase

△4,5

isomerase

佐 野 ら24)の 方 法 に 従 い 測 定 を 行 な っ た 。 す な わ ち,14 さ れ た14C-Progesteroneと 添 加 群 と,無 10μ1(14

添 加 群 を24時

C-P5;New

ら に60分

(3β-HSD)活 C-Pregnenoloneを60分

Nuclear

50mCi/mmol)お

測 定 cpmを

洗 浄 後,γ

標 識hCGを

胞 を 洗 浄 し,こ

トグ ラ フ ィ ー に 展 開 し,ク

れ に125I-hCGの

ロ

添

み を 加 え た もの と

間 空 気 下 で 再 培 養 し た 。 培 養 し た 細 胞 を さ ら に0.1

カ ウ ン タ ー で 測 定 し た 。 特 異 的 結 合 は,総

過 剰 に 加 え た 時 の 結 合 放 射 能)を

VIP-receptorの

加 え,さ

方 法 に 従 っ て 測 定 し た 。VIP,FSHを

間 培 養 後,細

共 に 加 え た も の を,23℃,12時

%BSA-PBSで

層 ク ロマ

NADを

結 晶 法 で 同定 した 。

用 い て ,G.F.Ericksonら8)の

加 し た も の と 無 添 加 の も の を48時 無 標 識hCGを

生

70000dpm/DMSO

よ び 補 酵 素 の0.1mM

再 培 養 し た 。 こ れ ら を ジ ク ロ ロ メ タ ン で 抽 出 後,薄

125I -hCG105

培 養 し た 際,産

間 培 養 し た 後 培 養 液 を 除 去 し,14 C-Pregnenolone

England

LH-receptorの

性測 定法

そ の 代 謝 産 物 の 単 位 タ ン パ ク あ た り の 量 の 和 で 表 わ し た 。VIP,FSH

マ ト グ ラ フ ィ ー 上 の ス ポ ッ トを メ タ ノ ー ル で 抽 出,再

結 合 か ら 非 特 異 的 結 合(無

差 し引 い て 求 め た 。

測 定

Laburtheら18)の

方 法 に 準 じ て 測 定 を 行 な っ た 。 顆 粒 膜 細 胞106個,125I-VIP

濃 度 のVIP(10-6∼10-10M)と

phosphate

用

測 定 に 供 した 。

E2とPの

HCl緩

京 都)を

調 整,CELL

air下Dubnoff形

対 照 群 と し た 。 培 養 開 始 後30,60分,3,6,12,24,48時 取 り,-20℃

(NISSUI,東

cell/mlに

95%

体 細 胞 の 入 っ たwellに

100μg/ml,100nM

Medium

れ ぞ れ105viable

用 い て,37℃,5%CO2

培 養 を 行 な っ た 。 培 養 開 始 時 に,顆 あ る い はPHM-27を,黄

streptomycin

Modified

衝 液0.25mlに bufferで

を,0.5%BSAと100μg/mlBacitracinの 加 え,30℃

で30分,空

気 下 でincubation後,顆

105cpmと

種 々の

入 っ た25mM

Tris-

粒 膜 細 胞 をKrebs

Ringer

洗 浄 して 測 定 を 行 な っ た 。

タ ン パ ク 定 量 はBradford法

に よ り 求 め た 。 測 定 値 のStatistical

に よ り求 め た 。

第66巻

第8号

analysisは,Student

t test

750

ラ ッ ト卵 巣 に お け るVasoactive

Intestinal

結 1)顆

Peptideの

作 用 に つ い て(大 川)

果

粒 膜細 胞 に対 する作 用

a)Steroid産

生

顆 粒 膜 細 胞105箇 (E2)の

にVIP(10-9-10-6M)を

含 有 量 は,10-9M添

わ ち,VIP添

間 培 養 後 の 培 養 液 中 のestradiol-17β

加 時16±6.3pg/ml,10-8M添

82±16.9pg/ml,10-6M添

加 時39±10.8pg/ml,10-7M添

加 時100.8±17.6pg/mlで,対

加 に よ るE2産

terone(P)産

添 加 し て,24時

生 量 は,量

依 存 的 で あ っ た(Fig1)。

加 時 そ れ ぞ れ0.11±0.07ng/ml,

0.51±0.14ng/ml,1.38±0.28ng/ml,1.70±0.34ng/mlで

あ り,E2と る い はFSH60ngを

こ な っ た と き の,6,12,24,48時

間 に お け るE2産

15,89±28,2450±528,3500±550pg/mlで

間P