DEUTSCHE
MEDIZINISCHE
WOCHENSCHRIFT
schriftlicher Zustimmung des Verlages gestattet. - Für den persönlichen Gebrauch dürfen von Beiträgen oder Teilen von diesen einzelne Kopien hergestellt werden. - Jede im Bereich eines gewerblichen Unternehmens hergestellte Kopie dient im Sinne von 5 54, Abs. 2 UrhRG gewerblichen Zwecken und ist gebührenpflichtig. Die Gebühr beträgt DM ,40 je vervielfältigte Seite. Sie wird entrichtet entweder durch Anbringen einer entsprechenden Wertmarke oder durch Bezahlung an die VG Wissenschaft GmbH., Großer Hirschgraben 17/21, 6000 Frankfurt a. M., von der weitere Einzelheiten zu erfragen sind. - Die Aufnahme der Zeitschrift in Lesezirkel ist nicht gestattet. © Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1977 Printed in Germany
Nr. 12 . Jahrgang 102
Stuttgart, 25. März 1977
Dtsch. med. Wschr. 102 (1977), 415-418 © Georg Thitme Verlag, Stuttgart
Der Effekt der Therapie auf Immunkomplexe bei der chronischen Polyarthritis M. Rosenthal, U. Graf und W. Müller Rheumatologische Universitätsklinik Basel (Leiter Prof. Dr. W. Möller)
Bei 37 von 55 Patienten mit chronischer Polyarthritis ließen sich mittels
eines Phagozytosetests Immunkomplexe im Serum feststellen. Eine Basistherapie mit Goidsaizen, Penicil lamm, c-MercaptopropionyIglycin, Immunsuppressiva oder Levamisol führte zur Reduktion bzw. Elimination der nachweisbaren Immunkomplexe im Serum. Dieses Phänomen kann durch eine verminderte Neubildung von Immunkomplexen, eine Sprengung dieser Komplexe oder auch durch eine Hemmung der Komplexphagozytose verursacht werden. Nach In-vitro-Versuchen scheinen Goidsaize eine Phigozytosehemmung herbeizuführen, während andere Basistherapeutika, darunter auch das immunstimulierend wirkende Levamisol, diese Wirkung vermissen lassen. Möglicherweise kommt dieser Rückgang der zirkulierenden Immunkomplexe durch eine Beeinflussung des Grundprozesses zustande, denn bei der Behandlung mit Antiphlogistika wird er nicht beobachtet. Bei Patienten mit chronischer Polyarthritis wurden vor allem in der Synovialflüssigkeit und deren Zellen, aber
auch in den zirkulierenden Leukozyten und im Serum Immunkomplexe festgestellt (1, 6, 14, 16). Die Erwartung, durch ihren Nachweis die diagnostischen Möglichkeiten bei der chronischèn Polyarthritis entscheidend zu verbessern, hat sich nicht erfüllt, da ähnliche Komplexe bei einer ganzen Reihe anderer entzündlich-rheumatischer Erkrankungen vorkommen. Auch ihre pathogenetische Bedeutung ist noch unklar. Gewisse Beziehungen zwischen dem Auftreten der Komplexe und dem Verlauf der Erkrankung können angenommen werden, da nach unseren früheren Beobachtungen (16) Korrelationen der Immunkomplexe zu bestimmten Entzündungsparametern wie der Blutsenkung, nicht aber zum Gelenk-Index nach Lansbury, also der aktuellen klinischen Aktivität, bestehen. Da die sogenannte Basistherapie in die pathogenetischen Mechanismen eingreifen soll, sind wir der Frage nachgegangen, ob diese Therapie zu einer Beeinflussung
The effect of treatment on circulating immune complexes in rheumatoid arthritis Immune complexes were demonstrated by leucocyte phagocytosis assay in 37 of SS patients with rheumatoid arthritis. After treatment with gold salts, penhcillamine, a-mercaptopropionylglycine, immunosuppressive agents or levaniisole a substantial fall or elimination of demonstrable circulating immune complexes occurred. In-vitro studies revealed that gold salts in therapeutic concentrations inhibited the phagocytosis of immune complexes, while other drugs - penicillamine, levamisole and all antiinflammatory agents including corticosteroids - lack this effect. The reduction in circulating immune complexes under basic therapy may be due to a beneficial effect of these agents on the disease process itself. This test may, therefore, be of value in assessing the efficacy of drug treatment.
der Immunkomplexe im Serum von Patienten mit chronischer Polyarthritis führt und ob durch solche Untersuchungen Aussagen über die Wirksamkeit der Therapie gemacht werden können. Bei einer Verminderung der Komplexe bliebe festzustellen, inwieweit diese ausschließlich auf einer Besserung der Erkrankung oder auf einer Hemmung der Phagozytose von zirkulierenden Immunkomplexen beruht. Zur Beantwortung dieser Frage wurden eine Reihe von In-vitro-Untersuchungen durchgeführt, wobei die Wirkung der Basistherapeutika (Goldsalze, Thiole, Levamisol) wie auch von Salicylaten, Phenylbutazon und Corticosteroiden auf die Phagozytosefähigkeit der Leukozyten studiert wurde.
Patienten und Methodik Patienten. Bei SS Patienten mit einer entsprechend den ARA*Krite rien (15) definitiven oder klassischen chronischen Polyarthritis wurden vor und (oder) während der Behandlung mit Basistherapeutika, *
ARA
= American Rheumatism Association
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¡D)
Alle Manuskripte sind direkt an die Schriftleitung zu richten. Grundsätzlich werden nur solche Arbeiten angenommen, die vorher weder im Inland noch im Ausland veröffentlicht worden sind. Die Manuskripte dürfen auch nicht gleichzeitig anderen Blättern zum Abdruck angeboten werden. - Mit der Annahme des Manuskriptes erwirbt der Verlag für die Dauer der gesetzlichen Schutzfrist (S 64 UrhRG) die ausschließliche Befugnis zur Wahrnehmung der Verwertungsrechte im Sinne der SS 15ff. des Urheberrechtsgesetzes. Übersetzung, Nachdruckauch von Abbildungen - Vervielfiiltigung auf fotomechanischem oder ähnlichem Wege oder im Magnetton-Verfahren, Vortrag, Funk- und Fernsehsendung sowie Speicherung in Datenverarbeitungsanlagen - auch auszugsweise - sind nur mit
Rosenthal u. a.: Therapiewirkung auf lmmunkomplexe bei chronischer Polyarthritis
wie Aurothiomalat-Natrium (Tauredon®), Penicillamin (Mercaptyl®) und u-Mercaptopropionylglycin (Thiola®), sowie mit Immunsuppressiva oder mit nicht-steroidalen Antiphiogistika Immunkomplexe im Serum qualitativ und semiquantitativ mit Hilfe eines Phagozytosetests nachgewiesen. Nachweis von Immunkomplexen. Immunkomplexe wurden mit der von Hurd und Mitarbeitern (6) entwickelten indirekten Methode als Inklusion innerhalb menschlicher peripherer Blutleukozyten mit Hilfe von Fluoresceinisothiocyanat-(FITC-)markierten Antiseren nachgewiesen (Abbildung 1*). Für den Test wurden Leukozyten aus heparinisiertem, venösem Blut (Liquemin® 10 E/ml Blut, Roche, Basel) von normalen Spendern mit Hilfe eines Methocel® (Dow Chemicals, Zürich)-Ronpacon® (Cilag-Chemie, Schaffhausen)-Gradienten gewonnen (S). Nach dreimaligem Waschen mît phosphatgepufferter Kochsalziösung (PBS 0,15 mol/I) wurden diese Zellen in einer Konzentration von 10 X 106/ml in der 0,15 mol PBS suspendiert. 0,2 ml der Leukozytensuspension wurden mit 0,2 ml Patientenserum oder normalem Kontroilserum während 90 min bei 37 °C inkubiert. Von den so vorbehandelten Leukozytensuspensionen wurden nach erneutem dreimaligem Waschen mit 0,15 mol PBS Ausstriche angefertigt und mit absolutem Methanol bei + 4 °C fixiert. Anschließend wurden die Ausstriche während 30 min bei 37 °C mit einem polyvalenten Anti-Human-Immunglobulin-Serum oder einem monospezifischen Anti-Human-C3-Serum inkubiert, wobei Antiseren der Ziege (Meloy Laboratorien, Springfield, Virginia) in einer Verdünnung von 1 : 10 verwendet wurden. Am Ende der Inkubationsperiode wurden die Zellausstriche erneut dreimal während 10 min in 0,15 mol PBS gewaschen und anschließend im ZeissFluoreszenzmikroskop im UV-Auflicht beurteilt. In einer Reihe von Experimenten wurden den Leukozytensuspensionen jeweils nach Zugabe der Patientenseren folgende Medikamente zugesetzt: Aurothiomalat-Natrium (Tauredon®), ferner Levamisol (Janssen Pharmaceutica, Beerse, Belgien), Penicillamin (Mercaptyl®), a-Mercaptopropionylglycin (Thiola®), Prednisolon (Ultracorten®-H), Acetylsalicyl-lysin (Aspégic®) und Phenylbutazon (Butazolidin®). Die den Suspensionen zugesetzten Dosen der Medikamente sind aus Tabelle 3 ersichtlich. Beurteilung der Immuninklusionen. a) Stufenmethode: Die im Fluoreszenzmikroskop beobachteten Immuninklusionen in den Leukozyten wurden semiquantitativ in vier Stufen eingeteilt. Stufe O = keine Fluoreszenz (fragliche Fluoreszenz wurde als negativ betrachtet), Stufe 1 = wenige Leukozyten mit kleinen und mittleren fluoreszierenden Inklusionen, Stufe 2 = mehrere Leukozyten mit kleinen und mittleren fluoreszierenden Inklusionen, Stufe 3 = viele Leukozyten mit kleinen bis großen fluoreszierenden Inklusionen. b) Prozentuale Methode: Die im Fluoreszenzmikroskop beobachteten Leukozyten wurden gezählt (200 Zellen, und der prozentuale Anteil derjenigen Zellen wurde bestimmt, die Immuninklusionen enthielten. Der hierdurch ermittelte Prozentsatz ergibt wohl eine Information über den Anteil der immuninklusionshaltigen Leukozyten an der Gesamtpopulation der Leukozyten, doch erlaubt die Methode keine Beurteilung der Größe und Anzahl dieser Inklusionen. Deshalb wurden beide hier beschriebenen Methoden bei den verschiedenen Experimenten benutzt.
Ergebnisse Einfluß der Basisthera pie. Im Serum der 55 Patienten mit chronischer Polyarthritis, von denen 30 symptomatisch mit nicht-steroidalen Antiphiogistika und Analgetika behandelt wurden und 25 eine Basistherapie mit Gold, Penicillamin oder Thiola erhielten, wurden die Immunkomplexe in der angeführten Methode im Serum bestimmt. Bei 26 der 30 Patienten, die seit längerer Zeit, mindestens 4 Wochen, ausschließlich nicht-steroidale 1.
*
Abbildung
1
siehe Tafel Seite 423
Deutsche Medizinische Wochenschrift
Antiphiogistika, insbesondere Acetylsalicylsäure, Phenylbutazon und Indometacin, erhalten hatten, konnten Immunkomplexe im Serum nachgewiesen werden. Ini Gegensatz dazu waren solche Komplexe nur bei elf der 25 Patienten vorhanden, die unter einer länger dauernden Basistherapie standen (Tabelle 1). Tab. 1. Nachweis von Immunkomplexen in Seren von Patienten mit chronischer Polyarthritis bei Behandlung mit nicht-steroidalen Antiphlogistika und Basistherapeutika Behandlung
Patientenzahl
Immuninklusionen
30
26
25
11
symptomatische Therapie (ausgenommen Corticosteroide) Basistherapie (Gold, Penicillamin, Thiola®)
Bei 16 Patienten, die zunächst ausschließlich symptomatisch behandelt wurden und Immunkomplexe im Serum aufwiesen, wurde eine Basistherapie eingeleitet (Tabelle 2). Drei bis fünf Monate nach Einleitung dieser Therapie wurden die Immuninklusionen im Serum erneut bestimmt. Bei acht dieser 16 Patienten konnten im Laufe der Basistherapie keine Immunkomplexe mehr im Serum nachgewiesen werden. Die übrigen acht wiesen noch solche Komplexe auf, doch waren sie deutlich zurückgegangen. Tab. 2. Semiquantitative Bestimmung von Immunkomplexen im Serum von Patienten mit chronischer Polyarthritis während Basistherapie Patient
Immunglobuline C3-Komplement vor während vor während Basistherapie Basistherapie
B. M.
+ + +
1
+1 +2 +2
G.A.
+1
+1
+2
+1
H. R.
+
+
1
+
+
M.M.
+3
0
+3
0
Sch. E.
-F-
2
0
0
St. A.
+ +
1
0
B. A.
2
0
+1 +1 +2
G.M. G.A. M.A. G.K.
+2 +2 +2 +3
+1 +1 +1
+1
0
+3 +2 +2 +3
V. F.
+1 +3 +I
+ +
1
+
1
1
+
3
+ +
O
+
2
A. H.
R. E.
L. A.
H. M.
0
3
0
1
2
3
+
3
0 0
+
1
1
0
0
0
+1 0 1
2 0
Medikament Thiola® Penicillamin
Gold Gold Penicillamin Gold Gold Levamisol Levamisol Gold Gold Gold Gold Gold Azathioprin Penicillamin, Chiorambucil
Bei einzelnen Patienten wurden die zirkulierenden Immunkomplexe im indirekten Phagozytosetest in monatlichen Abständen bestimmt. Die Befunde bei einem dieser Patienten mit klassischer seropositiver chronischer Polyarthritis sind in Abbildung 2 dargestellt. Wie hieraus ersichtlich, kam es bereits nach zweimonatiger Goldbehandlung zu einer Reduktion der nachweisbaren Im-
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416
Rosenthal u. a.: Therapiewirkung auf Immunkomplexe bei chronischer Polyarthritis
munkomplexe, nach S Monaten waren sie noch wesentlich stärker abgesunken. Parallel mit diesen Befunden war eine Besserung des klinischen Krankheitsbildes zu verzeichnen.
-
Immuninklusionen
% 50
Ig-Inklusionen C3lnklusionen
40
30
20
10
2
1
3
4
5
Monate Abb. 2. Nachweis von zirkulierenden Immunkomplexen mit dem indirekten Phagozytosetest während einer Goldtherapie bei chronischer Polyarthritis.
Wie schon früher anhand von Reihenuntersuchungen festgestellt, korrelierte der Nachweis der Immunkomplexe im allgemeinen mit der Aktivität der Erkrankung, gemessen an der Blutsenkungsgeschwindigkeit. Ein starker Abfall der zirkulierenden Immunkomplexe wurde, wie bei dem in Abbildung 3 dargestellten Fall, unter dem Einfluß der Therapie besonders dann beobachtet, wenn auch die Aktivität der Erkrankung durch die Behandlung günstig beeinflußt wurde. Statistische Signifikanzen lassen sich allerdings aus unseren bisherigen Resultaten noch nicht errechnen, da die Zahlen der untersuchten Patienten noch zu gering sind. Der Effekt von Basistherapeutika,Prednisolon und verschiedenen nicht-steroidalen Antiphiogistika. Um festzustellen, inwieweit der Rückgang der Immunkomplexe auf
eine Besserung der Erkrankung oder gegebenenfalls auf eine direkte Wirkung der Basistherapeutika auf die Phagozytosefähigkeit der zirkulierenden Blutleukozyten zurückzuführen ist, wurde in vitro der Indirekttest durchgeführt (Abbildung 3). Bei dieser Untersuchung wurde zu den Seren von zwölf Patienten mit chronischer Polyarthritis, die nicht unter einer Basistherapie standen und im Indirekttest Immunkomplexe im Serum aufwiesen, Aurothiomalat-Natrium in verschiedenen Konzentrationen (entsprechend 1, 3, 10 und 20 mg/l metallischem Gold) beigefügt. Die Testleukozyten stammten von zwölf normalen Spendern, und die Auszählung der Immuninklusionen erfolgte nach der prozentualen Technik. Unter zunehmender Goldsalzkonzentration kommt es zu einer deutlichen Reduktion der inklusionshaltigen Zellzahl. Diese Reduktion konnte bei der Bestimmung sowohl von immunglobulinhaltigen als auch von komplementkomponenthaltigen Inklusionen festgestellt werden. Gleichartige Untersuchungen wie mit Gold wurden auch mit einer Reihe weiterer Medikamente durchgeführt, die teils zur Basistherapie, teils zur symptomatischen Behandlung der chronischen Polyarthritis verwendet werden. Wie aus Tabelle 3 ersichtlich, war bei Zusatz keines dieser Medikamente in den verschiedenen Konzentrationen, die zum Teil im therapeutischen Bereich, zum Teil aber auch weit darüber hinaus liegen, mit der hier verwendeten Methode eine Verminderung oder Vermehrung der Immunkomplexe im Serum zu beobachten, gleichgültig ob die Untersuchung mit AntiImmunglobulinserum oder Anti-C3-Serum durchgeführt
wurde. Tab. 3. Effekt verschiedener Antirheumatika auf den Nachweis von Immunkomplexen in vitro (indirektes Verfahren)
(mg/l)"
Penicillamin Thiola® Levamisol Prednisolon Acetylsalicylat Phenylbutazon
15
*
*°
5
Diskussion
lont
3 I
-
10
2)
20
1
3
C3 KornpIonent
10
20
n = 12)
Abb. 3. Einfluß steigender Goldkonzentrationen auf die Zahl immuninklusionshaltiger Leukozyten bei der indirekten Methode zum Nachweis von Immunkomplexen.
1,
5,
10,
20
1,
5,
10,
20
0,5, 2,
4,
8
0,05, 0,1, 0,2, 0,3
50, 100, 200, 300 10, 50, 100, 200
Beeinflussing der nachweisbaren Immunkomplexe Immunglobulin- C3-Komkomplexe plexe keine keine keine keine keine keine
keine keine keine keine keine keine
Penicillamin (Mercaptyl), Prednisolon (Ultracorten® H), Acetylsalicylat (Aspegic®), Phenylbutazon (Butazolidin®) Jede Konzentration wurde in fünf verschiedenen Experimenten getestet
10
1
getestete Konzentrationen
Medikament*
Rdok
poly
417
In den letzten Jahren konnten Immunkomplexe bei einer Reihe rheumatischer Erkrankungen einschließlich der chronischen Polyarthritis mit verschiedenen Verfahren nachgewiesen werden (1, 3, 6, 10, 11, 13, 14, 16, 18, 20). Entgegen den Erwartungen erwies sich die diagnostische Bedeutung dieses Nachweises bisher als re-
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Nr. 12, 25. März 1977, 102. Jg.
Rosenthal u, a.: Therapiewirkung auf Immunkomplexe bei chronischer Polyarthritis
lativ gering. Auch erlaubt das Auftreten der Immunkomplexe bei den meisten rheumatischen Erkrankungen keine sicheren prognostischen Aussagen. Umstritten ist dagegen bisher die Frage, welche Wirkung die verschiedenen Formen der Pharmakotherapie auf die zirkulierenden Immunkomplexe bei der chronischen Polyarthritis haben und inwieweit eine Beeinflussung dieser Komplexe den therapeutischen Wert des verwendeten Medikamentes widerspiegelt. Aufgrund unserer Untersuchungen kann angenommen werden, daß symptomatisch wirkende Pharmaka wie die nicht-steroidalen Antiphlogistika keinen wesentlichen Effekt auf die zirkulierenden Immunkomplexe haben, wohl aber die verschiedenen sogenannten Basistherapeutika wie Goldpräparate, Thiole, Immunsuppressiva und Immunstimulantien. Während der Therapie mit diesen »Basistherapeutika« beobachtet man in einem deutlich niedrigeren Prozentsatz zirkulierende Immunkomplexe als bei der Behandlung mit nicht-steroidalen Antiphlogistika. Zudem stellten wir bei Verlaufsbeobachtungen einen substantiellen Abfall der nachweisbaren Immunkomplexe im Serum von Patienten mit chronischer Polyarthritis fest, die mit den Basistherapeutika behandelt wurden. Ähnliche Beobachtungen wurden von anderen Autoren bisher vor allem bei der schweren Verlaufsform der chronischen Polyarthritis, dem sogenannten FeltySyndrom, gemacht (7, 8). Nach unseren bisherigen Resultaten scheinen gewisse Korrelationen zwischen dem therapeutischen Effekt der Basistherapie und der Beeinflussung der zirkulierenden Immunkomplexe zu bestehen, doch reichen die Befunde noch nicht aus, um statistisch signifikante Aussagen zu machen. Bereits früher konnten wir feststellen (16), daß eine Beziehung zwischen dem Vorhandensein der Immunkomplexe im Serum und der Aktivität der Erkrankung besteht, eine Beobachtung, die sich mit den vorgenannten Befunden deckt. Bei In-vitro-Studien über den Einfluß der Basistherapeutika auf den Nachweis von Immunkomplexen im Phagozytosetest führte die Inkubation von immunkomplexhaltigen Seren mit Goldsalzen zu einer von der Konzentration des Goldgehaltes abhängigen Reduktion der nachweisbaren Komplexe. Dieser Effekt wurde bei Thiolen (Penicillamin und Thiola), Levamisol, Prednisolon, Acetylsalicylsäure und Phenylbutazon vermißt. Ob der Goldeffekt auf einer Sprengung der Immunkomplexe oder ihrer verminderten Phagozytose durch die Leukozyten beruht, läßt sich mit unserem Testsystem nicht eindeutig klären. Unter Berücksichtigung der Beobachtung anderer Autoren (9, 12) möchten wir am ehesten eine Hemmung der Komplexphagozytose durch den Goldzusatz annehmen. Möglicherweise ist diese Hemmung einer der Wirkmechanismen des Goldes. Bei den anderen Basistherapeutika ist dagegen die Wirkung auf die Immunkomplexe wahrscheinlich durch einen Effekt auf den Krankheitsprozeß selbst zu erklären. Mit den symptomatischen Antirheumatika konnten wir, wie auch andere Untersucher (4, 17), keine Phagozytosehemmung beobachten. Einige Autoren dagegen (2, 9) berichteten über eine solche Hemmung. Diese Diskrepanz könnte sowohl durch die verschiedenartigen Testsysteme als
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auch, wie Sneiderman und Wilson (17) zeigten, durch die Verwendung extrem hoher Corticosteroiddosen zu-
stande kommen. Insgesamt kann die Bestimmung von zirkulierenden Immunkomplexen im Serum von Patienten mit chronischer Polyarthritis nach unseren bisherigen Beobachtungen gewisse Hinweise auf eine Wirksamkeit der Basistherapie geben, allerdings müssen die Befunde durch weitere Untersuchungen noch erhärtet werden. Insbesondere ist noch die Frage zu prüfen, ob man aufgrund des Verhaltens der Immunkomplexe während der Therapie nicht schon früher als durch die Änderung des klinischen Bildes Aussagen über die Wirksamkeit der Behandlung auf den Grundprozeß machen kann. Diese Arbeit wurde unterstützt vom Schweizerischen Nationalfonds zur Förderung dcr wissenschaftlichen Forschung (Nr. 3.0830.73).
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Dr. M. Rosenthal, Dr. U. Graf, Prof. Dr. W. Müller Rheumatologische Universitätsklinik Felix-Planer-Spital CH-4055 Basel, Burgfelderstr. 101
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41 8
4Z3 Zur Arbeit Rosenthal u. a. (Seite 415-41$)
.4
I
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s
I Abb. 1. lrnmunuluoreszenz-1)arsrellung von lmrnunkoniilexen innerhalb von Blurleukozyten gesunder Pcrsonei mit polyvalentern AuuHunian-Inimunglobulin-Anriserum. 550 : 1.
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Bei 37 von 55 Patienten mit chronischer Polyarthritis ließen sich mittels
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auch in den zirkulierenden Leukozyten und im Serum Immunkomplexe festgestellt (1, 6, 14, 16). Die Erwartung, durch ihren Nachweis die diagnostischen Möglichkeiten bei der chronischèn Polyarthritis entscheidend zu verbessern, hat sich nicht erfüllt, da ähnliche Komplexe bei einer ganzen Reihe anderer entzündlich-rheumatischer Erkrankungen vorkommen. Auch ihre pathogenetische Bedeutung ist noch unklar. Gewisse Beziehungen zwischen dem Auftreten der Komplexe und dem Verlauf der Erkrankung können angenommen werden, da nach unseren früheren Beobachtungen (16) Korrelationen der Immunkomplexe zu bestimmten Entzündungsparametern wie der Blutsenkung, nicht aber zum Gelenk-Index nach Lansbury, also der aktuellen klinischen Aktivität, bestehen. Da die sogenannte Basistherapie in die pathogenetischen Mechanismen eingreifen soll, sind wir der Frage nachgegangen, ob diese Therapie zu einer Beeinflussung
The effect of treatment on circulating immune complexes in rheumatoid arthritis Immune complexes were demonstrated by leucocyte phagocytosis assay in 37 of SS patients with rheumatoid arthritis. After treatment with gold salts, penhcillamine, a-mercaptopropionylglycine, immunosuppressive agents or levaniisole a substantial fall or elimination of demonstrable circulating immune complexes occurred. In-vitro studies revealed that gold salts in therapeutic concentrations inhibited the phagocytosis of immune complexes, while other drugs - penicillamine, levamisole and all antiinflammatory agents including corticosteroids - lack this effect. The reduction in circulating immune complexes under basic therapy may be due to a beneficial effect of these agents on the disease process itself. This test may, therefore, be of value in assessing the efficacy of drug treatment.
der Immunkomplexe im Serum von Patienten mit chronischer Polyarthritis führt und ob durch solche Untersuchungen Aussagen über die Wirksamkeit der Therapie gemacht werden können. Bei einer Verminderung der Komplexe bliebe festzustellen, inwieweit diese ausschließlich auf einer Besserung der Erkrankung oder auf einer Hemmung der Phagozytose von zirkulierenden Immunkomplexen beruht. Zur Beantwortung dieser Frage wurden eine Reihe von In-vitro-Untersuchungen durchgeführt, wobei die Wirkung der Basistherapeutika (Goldsalze, Thiole, Levamisol) wie auch von Salicylaten, Phenylbutazon und Corticosteroiden auf die Phagozytosefähigkeit der Leukozyten studiert wurde.
Patienten und Methodik Patienten. Bei SS Patienten mit einer entsprechend den ARA*Krite rien (15) definitiven oder klassischen chronischen Polyarthritis wurden vor und (oder) während der Behandlung mit Basistherapeutika, *
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Rosenthal u. a.: Therapiewirkung auf lmmunkomplexe bei chronischer Polyarthritis
wie Aurothiomalat-Natrium (Tauredon®), Penicillamin (Mercaptyl®) und u-Mercaptopropionylglycin (Thiola®), sowie mit Immunsuppressiva oder mit nicht-steroidalen Antiphiogistika Immunkomplexe im Serum qualitativ und semiquantitativ mit Hilfe eines Phagozytosetests nachgewiesen. Nachweis von Immunkomplexen. Immunkomplexe wurden mit der von Hurd und Mitarbeitern (6) entwickelten indirekten Methode als Inklusion innerhalb menschlicher peripherer Blutleukozyten mit Hilfe von Fluoresceinisothiocyanat-(FITC-)markierten Antiseren nachgewiesen (Abbildung 1*). Für den Test wurden Leukozyten aus heparinisiertem, venösem Blut (Liquemin® 10 E/ml Blut, Roche, Basel) von normalen Spendern mit Hilfe eines Methocel® (Dow Chemicals, Zürich)-Ronpacon® (Cilag-Chemie, Schaffhausen)-Gradienten gewonnen (S). Nach dreimaligem Waschen mît phosphatgepufferter Kochsalziösung (PBS 0,15 mol/I) wurden diese Zellen in einer Konzentration von 10 X 106/ml in der 0,15 mol PBS suspendiert. 0,2 ml der Leukozytensuspension wurden mit 0,2 ml Patientenserum oder normalem Kontroilserum während 90 min bei 37 °C inkubiert. Von den so vorbehandelten Leukozytensuspensionen wurden nach erneutem dreimaligem Waschen mit 0,15 mol PBS Ausstriche angefertigt und mit absolutem Methanol bei + 4 °C fixiert. Anschließend wurden die Ausstriche während 30 min bei 37 °C mit einem polyvalenten Anti-Human-Immunglobulin-Serum oder einem monospezifischen Anti-Human-C3-Serum inkubiert, wobei Antiseren der Ziege (Meloy Laboratorien, Springfield, Virginia) in einer Verdünnung von 1 : 10 verwendet wurden. Am Ende der Inkubationsperiode wurden die Zellausstriche erneut dreimal während 10 min in 0,15 mol PBS gewaschen und anschließend im ZeissFluoreszenzmikroskop im UV-Auflicht beurteilt. In einer Reihe von Experimenten wurden den Leukozytensuspensionen jeweils nach Zugabe der Patientenseren folgende Medikamente zugesetzt: Aurothiomalat-Natrium (Tauredon®), ferner Levamisol (Janssen Pharmaceutica, Beerse, Belgien), Penicillamin (Mercaptyl®), a-Mercaptopropionylglycin (Thiola®), Prednisolon (Ultracorten®-H), Acetylsalicyl-lysin (Aspégic®) und Phenylbutazon (Butazolidin®). Die den Suspensionen zugesetzten Dosen der Medikamente sind aus Tabelle 3 ersichtlich. Beurteilung der Immuninklusionen. a) Stufenmethode: Die im Fluoreszenzmikroskop beobachteten Immuninklusionen in den Leukozyten wurden semiquantitativ in vier Stufen eingeteilt. Stufe O = keine Fluoreszenz (fragliche Fluoreszenz wurde als negativ betrachtet), Stufe 1 = wenige Leukozyten mit kleinen und mittleren fluoreszierenden Inklusionen, Stufe 2 = mehrere Leukozyten mit kleinen und mittleren fluoreszierenden Inklusionen, Stufe 3 = viele Leukozyten mit kleinen bis großen fluoreszierenden Inklusionen. b) Prozentuale Methode: Die im Fluoreszenzmikroskop beobachteten Leukozyten wurden gezählt (200 Zellen, und der prozentuale Anteil derjenigen Zellen wurde bestimmt, die Immuninklusionen enthielten. Der hierdurch ermittelte Prozentsatz ergibt wohl eine Information über den Anteil der immuninklusionshaltigen Leukozyten an der Gesamtpopulation der Leukozyten, doch erlaubt die Methode keine Beurteilung der Größe und Anzahl dieser Inklusionen. Deshalb wurden beide hier beschriebenen Methoden bei den verschiedenen Experimenten benutzt.
Ergebnisse Einfluß der Basisthera pie. Im Serum der 55 Patienten mit chronischer Polyarthritis, von denen 30 symptomatisch mit nicht-steroidalen Antiphiogistika und Analgetika behandelt wurden und 25 eine Basistherapie mit Gold, Penicillamin oder Thiola erhielten, wurden die Immunkomplexe in der angeführten Methode im Serum bestimmt. Bei 26 der 30 Patienten, die seit längerer Zeit, mindestens 4 Wochen, ausschließlich nicht-steroidale 1.
*
Abbildung
1
siehe Tafel Seite 423
Deutsche Medizinische Wochenschrift
Antiphiogistika, insbesondere Acetylsalicylsäure, Phenylbutazon und Indometacin, erhalten hatten, konnten Immunkomplexe im Serum nachgewiesen werden. Ini Gegensatz dazu waren solche Komplexe nur bei elf der 25 Patienten vorhanden, die unter einer länger dauernden Basistherapie standen (Tabelle 1). Tab. 1. Nachweis von Immunkomplexen in Seren von Patienten mit chronischer Polyarthritis bei Behandlung mit nicht-steroidalen Antiphlogistika und Basistherapeutika Behandlung
Patientenzahl
Immuninklusionen
30
26
25
11
symptomatische Therapie (ausgenommen Corticosteroide) Basistherapie (Gold, Penicillamin, Thiola®)
Bei 16 Patienten, die zunächst ausschließlich symptomatisch behandelt wurden und Immunkomplexe im Serum aufwiesen, wurde eine Basistherapie eingeleitet (Tabelle 2). Drei bis fünf Monate nach Einleitung dieser Therapie wurden die Immuninklusionen im Serum erneut bestimmt. Bei acht dieser 16 Patienten konnten im Laufe der Basistherapie keine Immunkomplexe mehr im Serum nachgewiesen werden. Die übrigen acht wiesen noch solche Komplexe auf, doch waren sie deutlich zurückgegangen. Tab. 2. Semiquantitative Bestimmung von Immunkomplexen im Serum von Patienten mit chronischer Polyarthritis während Basistherapie Patient
Immunglobuline C3-Komplement vor während vor während Basistherapie Basistherapie
B. M.
+ + +
1
+1 +2 +2
G.A.
+1
+1
+2
+1
H. R.
+
+
1
+
+
M.M.
+3
0
+3
0
Sch. E.
-F-
2
0
0
St. A.
+ +
1
0
B. A.
2
0
+1 +1 +2
G.M. G.A. M.A. G.K.
+2 +2 +2 +3
+1 +1 +1
+1
0
+3 +2 +2 +3
V. F.
+1 +3 +I
+ +
1
+
1
1
+
3
+ +
O
+
2
A. H.
R. E.
L. A.
H. M.
0
3
0
1
2
3
+
3
0 0
+
1
1
0
0
0
+1 0 1
2 0
Medikament Thiola® Penicillamin
Gold Gold Penicillamin Gold Gold Levamisol Levamisol Gold Gold Gold Gold Gold Azathioprin Penicillamin, Chiorambucil
Bei einzelnen Patienten wurden die zirkulierenden Immunkomplexe im indirekten Phagozytosetest in monatlichen Abständen bestimmt. Die Befunde bei einem dieser Patienten mit klassischer seropositiver chronischer Polyarthritis sind in Abbildung 2 dargestellt. Wie hieraus ersichtlich, kam es bereits nach zweimonatiger Goldbehandlung zu einer Reduktion der nachweisbaren Im-
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Rosenthal u. a.: Therapiewirkung auf Immunkomplexe bei chronischer Polyarthritis
munkomplexe, nach S Monaten waren sie noch wesentlich stärker abgesunken. Parallel mit diesen Befunden war eine Besserung des klinischen Krankheitsbildes zu verzeichnen.
-
Immuninklusionen
% 50
Ig-Inklusionen C3lnklusionen
40
30
20
10
2
1
3
4
5
Monate Abb. 2. Nachweis von zirkulierenden Immunkomplexen mit dem indirekten Phagozytosetest während einer Goldtherapie bei chronischer Polyarthritis.
Wie schon früher anhand von Reihenuntersuchungen festgestellt, korrelierte der Nachweis der Immunkomplexe im allgemeinen mit der Aktivität der Erkrankung, gemessen an der Blutsenkungsgeschwindigkeit. Ein starker Abfall der zirkulierenden Immunkomplexe wurde, wie bei dem in Abbildung 3 dargestellten Fall, unter dem Einfluß der Therapie besonders dann beobachtet, wenn auch die Aktivität der Erkrankung durch die Behandlung günstig beeinflußt wurde. Statistische Signifikanzen lassen sich allerdings aus unseren bisherigen Resultaten noch nicht errechnen, da die Zahlen der untersuchten Patienten noch zu gering sind. Der Effekt von Basistherapeutika,Prednisolon und verschiedenen nicht-steroidalen Antiphiogistika. Um festzustellen, inwieweit der Rückgang der Immunkomplexe auf
eine Besserung der Erkrankung oder gegebenenfalls auf eine direkte Wirkung der Basistherapeutika auf die Phagozytosefähigkeit der zirkulierenden Blutleukozyten zurückzuführen ist, wurde in vitro der Indirekttest durchgeführt (Abbildung 3). Bei dieser Untersuchung wurde zu den Seren von zwölf Patienten mit chronischer Polyarthritis, die nicht unter einer Basistherapie standen und im Indirekttest Immunkomplexe im Serum aufwiesen, Aurothiomalat-Natrium in verschiedenen Konzentrationen (entsprechend 1, 3, 10 und 20 mg/l metallischem Gold) beigefügt. Die Testleukozyten stammten von zwölf normalen Spendern, und die Auszählung der Immuninklusionen erfolgte nach der prozentualen Technik. Unter zunehmender Goldsalzkonzentration kommt es zu einer deutlichen Reduktion der inklusionshaltigen Zellzahl. Diese Reduktion konnte bei der Bestimmung sowohl von immunglobulinhaltigen als auch von komplementkomponenthaltigen Inklusionen festgestellt werden. Gleichartige Untersuchungen wie mit Gold wurden auch mit einer Reihe weiterer Medikamente durchgeführt, die teils zur Basistherapie, teils zur symptomatischen Behandlung der chronischen Polyarthritis verwendet werden. Wie aus Tabelle 3 ersichtlich, war bei Zusatz keines dieser Medikamente in den verschiedenen Konzentrationen, die zum Teil im therapeutischen Bereich, zum Teil aber auch weit darüber hinaus liegen, mit der hier verwendeten Methode eine Verminderung oder Vermehrung der Immunkomplexe im Serum zu beobachten, gleichgültig ob die Untersuchung mit AntiImmunglobulinserum oder Anti-C3-Serum durchgeführt
wurde. Tab. 3. Effekt verschiedener Antirheumatika auf den Nachweis von Immunkomplexen in vitro (indirektes Verfahren)
(mg/l)"
Penicillamin Thiola® Levamisol Prednisolon Acetylsalicylat Phenylbutazon
15
*
*°
5
Diskussion
lont
3 I
-
10
2)
20
1
3
C3 KornpIonent
10
20
n = 12)
Abb. 3. Einfluß steigender Goldkonzentrationen auf die Zahl immuninklusionshaltiger Leukozyten bei der indirekten Methode zum Nachweis von Immunkomplexen.
1,
5,
10,
20
1,
5,
10,
20
0,5, 2,
4,
8
0,05, 0,1, 0,2, 0,3
50, 100, 200, 300 10, 50, 100, 200
Beeinflussing der nachweisbaren Immunkomplexe Immunglobulin- C3-Komkomplexe plexe keine keine keine keine keine keine
keine keine keine keine keine keine
Penicillamin (Mercaptyl), Prednisolon (Ultracorten® H), Acetylsalicylat (Aspegic®), Phenylbutazon (Butazolidin®) Jede Konzentration wurde in fünf verschiedenen Experimenten getestet
10
1
getestete Konzentrationen
Medikament*
Rdok
poly
417
In den letzten Jahren konnten Immunkomplexe bei einer Reihe rheumatischer Erkrankungen einschließlich der chronischen Polyarthritis mit verschiedenen Verfahren nachgewiesen werden (1, 3, 6, 10, 11, 13, 14, 16, 18, 20). Entgegen den Erwartungen erwies sich die diagnostische Bedeutung dieses Nachweises bisher als re-
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Nr. 12, 25. März 1977, 102. Jg.
Rosenthal u, a.: Therapiewirkung auf Immunkomplexe bei chronischer Polyarthritis
lativ gering. Auch erlaubt das Auftreten der Immunkomplexe bei den meisten rheumatischen Erkrankungen keine sicheren prognostischen Aussagen. Umstritten ist dagegen bisher die Frage, welche Wirkung die verschiedenen Formen der Pharmakotherapie auf die zirkulierenden Immunkomplexe bei der chronischen Polyarthritis haben und inwieweit eine Beeinflussung dieser Komplexe den therapeutischen Wert des verwendeten Medikamentes widerspiegelt. Aufgrund unserer Untersuchungen kann angenommen werden, daß symptomatisch wirkende Pharmaka wie die nicht-steroidalen Antiphlogistika keinen wesentlichen Effekt auf die zirkulierenden Immunkomplexe haben, wohl aber die verschiedenen sogenannten Basistherapeutika wie Goldpräparate, Thiole, Immunsuppressiva und Immunstimulantien. Während der Therapie mit diesen »Basistherapeutika« beobachtet man in einem deutlich niedrigeren Prozentsatz zirkulierende Immunkomplexe als bei der Behandlung mit nicht-steroidalen Antiphlogistika. Zudem stellten wir bei Verlaufsbeobachtungen einen substantiellen Abfall der nachweisbaren Immunkomplexe im Serum von Patienten mit chronischer Polyarthritis fest, die mit den Basistherapeutika behandelt wurden. Ähnliche Beobachtungen wurden von anderen Autoren bisher vor allem bei der schweren Verlaufsform der chronischen Polyarthritis, dem sogenannten FeltySyndrom, gemacht (7, 8). Nach unseren bisherigen Resultaten scheinen gewisse Korrelationen zwischen dem therapeutischen Effekt der Basistherapie und der Beeinflussung der zirkulierenden Immunkomplexe zu bestehen, doch reichen die Befunde noch nicht aus, um statistisch signifikante Aussagen zu machen. Bereits früher konnten wir feststellen (16), daß eine Beziehung zwischen dem Vorhandensein der Immunkomplexe im Serum und der Aktivität der Erkrankung besteht, eine Beobachtung, die sich mit den vorgenannten Befunden deckt. Bei In-vitro-Studien über den Einfluß der Basistherapeutika auf den Nachweis von Immunkomplexen im Phagozytosetest führte die Inkubation von immunkomplexhaltigen Seren mit Goldsalzen zu einer von der Konzentration des Goldgehaltes abhängigen Reduktion der nachweisbaren Komplexe. Dieser Effekt wurde bei Thiolen (Penicillamin und Thiola), Levamisol, Prednisolon, Acetylsalicylsäure und Phenylbutazon vermißt. Ob der Goldeffekt auf einer Sprengung der Immunkomplexe oder ihrer verminderten Phagozytose durch die Leukozyten beruht, läßt sich mit unserem Testsystem nicht eindeutig klären. Unter Berücksichtigung der Beobachtung anderer Autoren (9, 12) möchten wir am ehesten eine Hemmung der Komplexphagozytose durch den Goldzusatz annehmen. Möglicherweise ist diese Hemmung einer der Wirkmechanismen des Goldes. Bei den anderen Basistherapeutika ist dagegen die Wirkung auf die Immunkomplexe wahrscheinlich durch einen Effekt auf den Krankheitsprozeß selbst zu erklären. Mit den symptomatischen Antirheumatika konnten wir, wie auch andere Untersucher (4, 17), keine Phagozytosehemmung beobachten. Einige Autoren dagegen (2, 9) berichteten über eine solche Hemmung. Diese Diskrepanz könnte sowohl durch die verschiedenartigen Testsysteme als
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auch, wie Sneiderman und Wilson (17) zeigten, durch die Verwendung extrem hoher Corticosteroiddosen zu-
stande kommen. Insgesamt kann die Bestimmung von zirkulierenden Immunkomplexen im Serum von Patienten mit chronischer Polyarthritis nach unseren bisherigen Beobachtungen gewisse Hinweise auf eine Wirksamkeit der Basistherapie geben, allerdings müssen die Befunde durch weitere Untersuchungen noch erhärtet werden. Insbesondere ist noch die Frage zu prüfen, ob man aufgrund des Verhaltens der Immunkomplexe während der Therapie nicht schon früher als durch die Änderung des klinischen Bildes Aussagen über die Wirksamkeit der Behandlung auf den Grundprozeß machen kann. Diese Arbeit wurde unterstützt vom Schweizerischen Nationalfonds zur Förderung dcr wissenschaftlichen Forschung (Nr. 3.0830.73).
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Dr. M. Rosenthal, Dr. U. Graf, Prof. Dr. W. Müller Rheumatologische Universitätsklinik Felix-Planer-Spital CH-4055 Basel, Burgfelderstr. 101
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4Z3 Zur Arbeit Rosenthal u. a. (Seite 415-41$)
.4
I
b
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I Abb. 1. lrnmunuluoreszenz-1)arsrellung von lmrnunkoniilexen innerhalb von Blurleukozyten gesunder Pcrsonei mit polyvalentern AuuHunian-Inimunglobulin-Anriserum. 550 : 1.
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Dcr Effekt der Therapie auf Immutikomplexe bei der chronischen Polyarthritis
