Planta (Berl.)129,155-159 (1976)
PI~H~J 9 by Springer-Verlag 1976
Einflufl von Phospholipiden auf den St~irkemetabolismus Georg H. Vieweg und Maria A.R. de Fekete Fachbereich Biologieder TechnischenHochschule,Schnittspahnstrage3, D-6100 Darmstadt, Federal Republikof Germany
The Effect of Phospholipids on Starch Metabolism Summary. The presence of phospholipids reduces the breakdown of amylose catalyzed by/~-amylase, phosphorylase and a-amylase. The activities of the/%amylases of sweet potato (Ipomoea batatas) and barley (Hordeum vulgare L.) disminish to less than 10% of the activity in the control without the phospholipids. When the amylose was comple• with phospholipids the activity of the c~-amylase of Bacillus subtilis was reduced to about 25% of the control value. A similar effect was observed for the amylases of Zea mays leaves. The phosphorylase effected almost no phosphorolysis of the complexed amylose, but starch synthesis from glucose-l-phosphate proceeded at a rate that was about 60% of that with pure amylose. The activity of the synthetase from bundle sheath cells of maize leaves was not influenced much by the presence of phospholipids, whereas the ,,branching enzyme" of maize endosperm did not produce any amylopectin from the complexed amylose. These facts could explain the simultaneous deposition of amylose and amylopectin in the starch granules. Some of the newly formed glucan chains may be protected by formation of a complex with the phospholipids. This protected amylose can not undergo branching or breakdown, but it can be elongated owing to the activity of synthetase or phosphorylase. Amylopectin is formed from the chains that are not complexed.
tung der stfirkespeichernden Gewebe gestattet die Synthese von Amylose und die anschliel3ende Verzweigung dieser zu Amylopektin. In Versuchen in vitro k6nnen aber mit Enzymgemischen, die in der Zusammensetzung der im Gewebe entsprechen, nur verzweigte Polysaccharide gebildet werden, wogegen in vivo sowohl Amylose als auch Amylopektin abgelagert werden. In der Bildung von Komplexen der Amylose mit Lipiden (Schoch und Williams, 1944) haben wir eine noch nicht beschriebene M6glichkeit gesehen, die neu aufgebauten Amyloseketten vor gewissen weiteren Umsfitzen zu schfitzen. In St/irkek6rnern wurden verschiedene Lipide festgestellt. Getreidestfirken enthalten viel Lysolecithin (Acker und Schmitz, 1967), Kartoffelst/irke hauptsfichlich Lecithin (Bolling und E1 Baya, 1975). Der Anteil an Phospholipiden kann 1% des Trockengewichtes betragen. Diese Befunde wiesen uns darauf hin, dal3 Phospholipide eine Rolle bei der gleichzeitigen Bildung von Amylose und Amylopektin spielen k6nnen. Wir haben deswegen den Einflul3 yon Phospholipiden auf die Aktivitfit der stfirkeumsetzenden Enzyme untersucht. Hierftir haben wir zunfichst kfiufliches Lecithin aus Eiern benutzt, das neben 50% Lecithin etwa je 15% Lysolecithin, Kephalin und Lysokephalin enthielt. Ober einige dieser Ergebnisse haben wir beim XII. Internationalen Botanischen Kongrel3 1975 in Leningrad vorgetragen.
Material und Methoden Einleitung
St/irkekSrner wachsen sehr langsam durch Apposition (Ubersicht bei Badenhuizen, 1971). Mit fortschreitender Reifung nimmt der relative Amylosegehalt zu (Banks und Greenwood, 1973), doch sind Amylose und Amylopektin nebeneinander durch das ganze St/irkekorn hindurch verbreitet. Die Enzymausstat-
Phosphorylaseaus Kartoffeln: Die KartoffelwurdeaufeinerPlastikreibe, angefeuchtet mit 1 M Mercapto/ithanol, zerkleinert, der Brei durch Perlongaze gepreBt und durch Zentrifugation bei 1000 x g w/ihrend 5 min yon der St/irke befreit. Dieser Extrakt wurdedanneingefroren,nach dem Auftauenwiederabzentrifugiert und die iiberstehendeFliissigkeitffirdie Versucheeingesetzt. Amylasen: Die kS,uflichen Amylasen wurden kurz vor dem Test in 0,5 M (NHg)2SOg-L6sungaufgenommenbzw. verdfinnt und zwar: fl-Amylaseaus Sfil3kartoffeln,kristallineSuspensionin
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G.H. Vieweg und M.A.R. de Fekete: Einflug von Phospholipiden auf den Stfirkemetabolismus
Ammoniumsulfat 20 mg ml- 1 von Sigma Chemical Co./~-Amylase aus Gerste, lyophilisiert, (45 U/rag) yon Merck und c~-Amylase aus Bacillus subtilis, lyophilisiert, (170 U/rag) yon Merck. Enzyme aus Biindelscheidenzellen tier Maisbldtter: Zea-maysPflanzen wurden im Gew~ichshaus, wie bereits beschrieben (Vieweg und Fekete, 1972), kultiviert. Sie wurden vor der Aufarbeimng 40 h verdunkelt. Die Herstellung der Bfindelscheiden, das nachfolgende Homogenisieren und die Prfiparation der Enzyme folgte der bei Fekete und Vieweg (1974b) angegebenen Methodik. Es wurde abet nicht ein Gesamtenzym, sondern fraktioniert mit Ammoniumsulfat gef~illt. Der Niederschlag der F~illung zwischen 20 und 35% der S/ittigung mit Ammoniumsnlfat enthielt den Hauptanteil der 16slichen Synthetase. In den nachfolgenden Fraktionen befanden sich die Amylasen neben anderen st/irkeumsetzenden Enzymen. ,,Branching enzyme" aus Maisendosperm (in Anlehnung an Manners et al., 1968). Aus einem Maiskolben wurde Endosperm im milchigen Zustand ausoperiert. Davon wurden 14 g mit 14 ml 0,2 M Na-Citrat bei pH 7,0 und 0,28 ml Dithioerythrit (10 mg/ml) homogenisiert. Grobe Zellreste wurden mit einer Perlongaze entfernt, die partikui/iren Bestandteile 20 min bei 30 000 x g abzentrifugiert. Das Enzym konnte zwischen 20 und 35% Sfittigung mit Ammoniumsulfat geffillt werden. Hierf/ir wurden entsprechende Volumina gesgtttigter Ammoniumsulfat-L6sung, eingestellt auf pH 6,9 zugegeben. Der Niederschlag wurde in 0,2 M Na-Citrat bei pH 7,0 aufgenommen und als Enzym eingesetzt. Die Amylose und das Amylopektin (erworben bei Serva) wurden nach Angaben yon Griffi n und Wu (1968)jeweils frisch gel6st. Das PhospholiPidgemisch wurde mit Lecithin aus Eiern von Merck in warmen absoluten Athanol angesetzt (80 mg ml 1). F/ir die St/irke-Phospholipidkomplexe wurden auf 5 gl des Gemisches 75 gl der Amylose- bzw. Amylopektinl6sung pipettiert, gut geschtittelt, und dann wurden die weiteren Zutaten zugegeben. Die Reaktion wurde mit Enzym gestartet. Die Bestimmung der Synthetaseaktivitfit haben wir, wie bei Fekete und Vieweg (1974b) beschrieben, durchgeftihrt, aber statt St/irke 32 gg Amylose nnd 0,4 mg Phospholipidgemisch eingesetzt. In denjenigen Versuchen, bei welchen die Ver/inderung der Amylose- oder Amylopektinkonzentration verfolgt wurde, mugten vor der St/irkebestimmung die Lipide entfernt werden. Hierftir wurde der doppelte Enzymansatz (0,2 ml) mit 0,6 ml ges~ittigter CaCl2-L6sung 5 rain gekocht. Nach dem Abkfihlen wurde 0,5 ml Chloroform zugegeben, gut durchgemischt, 1 ml Petroleumbenzin (Siedebereich 6 0 - 80~ C) zugeffigt und wieder durchgemischt. Die Trennung der Phasen wurde durch 5 minfitiges Zentrifngieren bei 1 500 x g beschleunigt, und dann wnrde die obere Schicht sorgf/iltig abgesaugt. Die w~issrige Phase wurde noch zweimal mit 1,5 ml einer Mischung yon Chloroform und Petroleumbenzin (Siedebereich 4 0 - 60 ~ C) 1:2 (v/v) gewaschen, dann wieder 10 m i n i m Wasserbad gekocht und abzentrifugiert. Die Polysaccharide wurden in 0,4 ml der iiberstehenden Fliissigkeit nach Krisman (1962) bestimmt. Amylose wurde bei 635 nm und Amylopektin bei 550 nm gemessen. Ffir die Auswertung der reduzierenden Zucker wurden die Proben nach Somogyi photometrisch nach Nelson, wie beschrieben bei Najdar (1955), behandelt.
Ergebnisse EinfluJ3 der Phospholipide auf die Phosphorylase aus Kartoffel Kartoffelknollen enthalten eine sehr aktive Phosphorylase (1,4-e-D-Glucan:orthophosphat c~-glucosyltransferase, EC 2.4.1.1.), deren Aktivit~it auch in ver-
Tabelle 1. EinfluB der Phospholipide beim Auf- und Abbau der Amylose durch Stiirkephosphorylase. Der Ansatz enthielt 6 gmol Morpholinofithansulfons/iure pH 6,0, 3,3 gl Enzym und, wo angegeben, 5 gl Athanol bzw. 0,4 mg Phospholipidgemisch in 5 pl Athanol im Endvolumen von 0,l ml. Der Ansatz im Versuch a enthielt noch 63 gg Amylose und 1 gmol Glucose-l-phosphat, im Versuch b 126 gg Amylose und 4 gmol Phosphat bei pH 6,0 Versuch a) Zutaten
Zunahme der Amylose (gg) nach 20 rain
40 min
80 min
keine )~thanol Athanol+ Phospholipidgemisch
27,5 22,0 12,5
56,7 52,7 33,2
110,8 109,4 68,4
Versuch b)
Abnahme der Amylose (gg)
keine Athanol Athanol+ Phospholipidgemisch
9,0 7,7 5,7
25,3 27,5 6,6
50,6 45,7 6,0
diinnten Extrakten ohne Anreicherung- oder Reinigungsschritte nachgewiesen werden kann. Die Amylaseaktivitfit solcher Prfiparate ist sehr gering. Nach Inkubation mit Glucose-l-phosphat kann die Zunahme der Amylosekonzentration beobachtet werden. Die Zugabe von Phospholipiden zum Ansatz verringert die Bildung von Glycosylbindungen um etwa 40% (Tabelle la). Untersucht man die Reaktion in der phosphorolytischen Richmng, so ist der EinfluB wesentlich ausgepr~igter: Der anffingliche Abbau ist auf die H/ilfte reduziert. Ein weiterer Umsatz der Amylose in Anwesenheit des Gemisches findet nicht statt (Tabelle lb).
Einflufl der Phospholipide auf die Amylasen Wir haben kfiufliche gereinigte Enzyme und ein von uns angereichertes Prfiparat aus Bfindelscheiden yon Maisblfittern getestet. Der Abbau der Amylose und des Amylopektins wurde durch die Abnahme der Jodffirbung verfolgt. Gleichzeitig wurden die gebildeten reduzierenden Zucker bestimmt. Die Tabelle 2a zeigt, dab Phospholipide den Abbau der Amylose durch die /~-Amylase (1,4-~-D-Glucan maltohydrolase, EC 3.2.1.2.) aus Ipomoea batatas beinahe g/inzlich unterdrficken. Die Abnahme der Amylosekonzentration ~ihnelt der beim Phosphorolyseversuch gefundenen. Auch die Hydrolyse des Amylopektins wurde unter gleichen Bedingungen verfolgt. Die Versuche zeigen, dab der Abbau um etwa ein Viertel gehelnmt wird.
G.H. Vieweg und M.A.R. de Fekete: Einflul3 von Phospholipiden auf den Stgrkemetabolismus Tabelle 2. Einflug der Phospholipide auf die/?-Amylase aus lpomea batatas und die e-Amylase aus Bacillus subtilis. Die Proben enthielten in 0,1 ml 2 gg/?-Amylase (Versuch a) bzw. 7 lag e-Amylase (Versuch b), 108 gg AmyIose bzw. 142 gg Amylopektin, 4 gmol Acetatpuffer bei pH 5,0 und, wo angegeben, 0,4 mg Phospholipidgemisch in 5 pl Athanol oder 5 pi ,~.thanol. Der Ansatz wurde 30 rnin bei 30~ inkubiert Versuch a) Zutaten
Z~nahme der reduzierenden Zucker
% Abnahme der JzFS.rbung bei 2m,x
nmol
% Aktivitilt
Amylose Amylose +Athanoi Amylose + Phospholipidgemisch + Nthanol
76,5 73,8 6,1
100 96,5 8,0
88,6 89,2 7,6
Amylopektin Amylopektin + )~thanol Amylopektin + Phospholipidgemisch + Athanol
81,6 82,1 59,8
100 100,6 73,3
64,8 63,3 51,5
Amylose Amylose + Athanol Amylose + Phospholipidgemisch + Athanol
67,8 61,3 27,0
100 90,4 39,8
99,2 99,0 41,5
Amylopektin Amylopektin + Athanol Amylopektin + Phospholipidgemisch + AthanoI
80,7 77,1 61,5
I00 95,5 76,2
97,4 97,2 79,9
Versuch b)
Auch die e-Amylase (1,4-e-D-Glucan glucanohydrolase, EC 3.2.1.1.) aus Bacillus subtilis wird durch Phospholipide gehemmt. Wie die Tabelle 2b zeigt, betr~gt die Aktivitfit des Enzyms mit Amylose als Substrat noch etwa 40% des Wertes ohne die Zugabe der Phospholipide. Die Hemmung der Spaltung des Amylopektins ist vergleichbar mit der fttr die/~-Amylase gefundenen. In einem /ihnlichen Experiment haben wir die Beeinflussung der Amylaseaktivitfit eines Pr/iparates aus Biindelscheidenzellen vom Maisblatt untersucht. Das Enzym enthielt mehrere elektrophoretisch nachweisbare Amylasebanden und andere st/irkeumsetzende Enzyme. In diesem Versuch haben wir die Abnahme der Jodffirbung bei 560 nm gemessen, weil bei dieser Wellenlfinge ffir Amylose und Amylopektin der gleiche Umrechnungsfaktor gilt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 wiedergegeben. Auch mit diesem Enzymgemisch kann die sch/itzende Wirkung der Phospholipide auf den Abbau der Amylose beobachtet werden. In einigen Experimenten haben wir den AmylosePhospholipid-Komplex vonder fiberschtissigen Lipidsuspension durch Zentrifugation getrennt, mit Wasser mehrfach gewaschen und in wS.13riger Suspension als Substrat ffir die Amylasen des Maisblattes geboten. Der Abbau des gewaschenen Komplexes war/ihnlich dem der Amylose mit Phospholipidtiberschul3.
Einflufl der Phospholipide auf die Stiirkesynthetase
Tabelle 3. Einflul3 der Phospholipide auf die Amylasen aus Maisblfittern. Der Ansatz enthielt 280 pg Amylose bzw. Amylopektin, 8 gmol Morpholinofithansulfonsfiure pH 6,5, Enzym aus Biindelscheiden von Maisbl/ittern, geffillt zwischen 35 und 60 % Ammoniumsulfat-Sfittigung (520 gg Protein) und, wo angegeben, 0,8 mg Phospholipidgemisch in 10 pl Athanol bzw. 10 pl Athanol in einem Endvolumen von 0,2 ml. Der Ansatz wurde 60 min bei 30~ inkubiert Zutaten
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Zunahme der reduzierenden Zucker nmol
% Aktivitfit
% Abnahme der J2F~irbung bei 560nm
Amylose Amylose + Athanol Amylose + Phospholipidgemisch + A.thanol
273 196,7 64,1
100 72,1 23,5
50,8 34,2 8,7
Amylopektin Amylopektin + Athanol Amylopektin + Phospholipidgemisch + Athanol
353,6 262,6 270,9
I00 74,3 76,6
63,1 57,6 54,6
Die Btindelscheidenzellen des Maisblattes enthalten eine Stfirkesynthetase (ADPGlucose: 1,4-c~-D-glucan 4-e-glucosyltransferase, EC 2.4.1. ?), deren Aktivit/it von der Vorbehandlung der Pflanzen abh/ingig ist (Fekete und Vieweg, 1974b). Das zwischen 20 und 35% Sfittigung mit Ammoniumsulfat geffillte Enzymprfiparat enthielt sehr wenig Amylaseaktivit/it und wurde in der Glucosyltibertragung aus ADP-Glucose auf Amylose durch Zugabe vom Phospholipidgemisch kaum beeinflul3t.
EinjTufi der Phospholipide auf das ,,branching enzyme"
Auf die Aktivitfit des ,,branching enzyme" (1,4-e-DGlucan: 1,4-~-D-glucan 6-glucosyltransferase, EC 2.4.1.18) wird aus der Verfinderung des Jod-Spektrums nach Inkubation mit Amylose und der Bestimmung der /%Amylolyse geschlossen (Lavintman und Krisman, 1964). Wit haben in unseren Versuchen ein Enzym aus unreifen Maisendosperm benutzt. Nach 120 rain Inkubation konnten wit aus der Verschiebung des Maximums des Jod-Spektrums von 635 auf
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G.H, Vieweg und M.A.R. de Fekete: Einflug von Phospholipiden auf den St/irkemetabolismus
0,80 / 0,70
/
0,60
/
to
---
/
to
t120
1
n
0,50 co m
,,
< 0,40
-Phospholipide
"
§ oh p s holipide i
500
600
500
600
nm
Abb. 1. EinfluB der Phospholipide auf die Aktivit~it des ,,branching
enzyme" aus Maisendosperm. Der Ansatz enthielt: 4 pl Citrat pH 7,0, Enzym (etwa 60 pg Protein), 220 gg Amylose, 10 gl Athanol und, wo angegeben, 0,8 mg Phospholipide in einem Endvolumen yon 0,2 ml. Nach 120 min Inkubation wurden die Proben ffir die J2-Reaktion, wie in Methoden beschrieben, vorbereitet. Ftir die Nullprobe wurde der Ansatz mit abgekochtem Enzym verarbeitet. Die Absorption wurde in einem Spektralphotometer (Beckman Instrument, Modell 24) Extinktionsbereich 0 - 1 gemessen und bei einem Vorschub von 100 nm rnin- 1 aufgezeichnet
570 nm die Bildung von Verzweigungen feststellen (Abb. 1), die durch die /%Amylolyse des Produktes bestfitigt wurden. Die verzweigende Wirkung wurde in Anwesenheit von Phospholipiden ganz unterdrtickt.
Diskussion
Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dab die Amylose dutch Bildung eines Komplexes mit Phospholipiden vor dem enzymatischen Abbau geschfitzt wird. Dies gilt sowohl ftir die Phosphorolyse als auch ftir die Hydrolyse, wobei die c~-Amylase weniger beeinflul3t wird als die /3-Amylase. Der Effekt auf den Abbau des Amylopektins ist gering. Die Umwandlung von Amylose zu Amylopektin wird ebenfalls durch die Komplexbildung unterdrfickt. Dagegen kann die komplexierte Amylose durch die Synthetase unbehindeft weiter verlfingert werden, und auch die dutch Phosphorylase katalysierte Synthese verlfiuft mit einer Geschwindigkeit, die etwa nur um ein Drittel verkleinert ist. In unseren Versuchen haben wir eine sehr groBe Menge verschiedener Phospholipide eingesetzt, um nachzuprfifen, ob der von uns vorgeschlagene Regulationsmechanismus funktioniert. Da die Lipidzusammensetzung der Stfirkek6rnchen verschiedener Herkunft nicht einheitlich ist, mug angenommen werden, dab in den einzelnen Geweben die Regulation ziem-
lich spezifisch ist. Nur so ist eine Beeinflussung des Stfirkestoffwechsels durch die geringen Lipidmengen der St/irkek6rner m6glich. Aus den Werten von Bekker und Acker (1972) ffir Gerstenstfirke haben wir errechnet, dab 1 Phospholipidmolekfil auf 123 Glucosereste entf~illt. In vivo k6nnen deshatb nicht alle Amyloseketten maximal mit Phospholipid besetzt sein. Hamori und Senior (1973) haben gezeigt, dab die Konformation der Amylosekette an den Endstfikken ffir die Bildung des Jod-Komplexes nicht geeignet ist. Vielleicht sind auch f~r die Phospholipide Stellen am nicht reduzierenden Ende der Amylosekette ,,verboten". Nur die aus dem Komplex herausragenden Teile werden dutch /?-Amylase oder Phosphorylase abgebaut oder als Primer ftir die Synthese verwendet. Die dutch das Lipid belegte Kette kann weder gespalten noch verzweigt werden und bleibt als lineares Polysaccharid liegen, das weiter nut noch durch die Synthetase oder durch die Phosphorylase verlfingert wird. Diese Annahme ist in Einklang mit den Befunden yon Banks und Greenwood (1973), die mit der Reifung des Gewebes eine Zunahme nicht nut des Gehaltes, sondern auch des Molekulargewichtes der Amylose fanden. Auch bei der Keimung k6nnen die durch der Phospholipid geschiitzten Amyloseketten vorerst nicht abgebaut werden. Der Umsatz des Amylopektins verlfiuft abet ungehindert. Die Spaltung der Amylose k6nnte nur nach Entfernung des eingeschlossenen Phospholipides fortgesetzt werden. Fukui und Nikuni (1956) zeigten, dab die Mobilisierung der Stfirke w/ihrend der Keimung von einer Zunahme des AmyloseAmylopektin-Verhfiltnisses begleitet wird. Bei diesem Abbau vermindert sich das Molekulargewicht der Amylose nur wenig (Greenwood und Thomson, 1959). Diese Resultate best/itigen den besonderen Zustand der Amylose im St/irkekorn. Aufdie mit Phospholipid wenig besetzten Amyloseketten k6nnen einige Enzyme, wie die c~-Amylase oder das ,,branching enzyme" noch einwirken. Dadurch k6nnen neue Primer fiir die weitere Synthese bereitgestellt werden (Fekete und Vieweg, 1974a), oder es werden Polysaccharide mit nur wenigen Verzweigungen produziert. Produkte, die des Verzweigungsgrades wegen zwischen der Amylose und dem A.mylopektin eingeordnet werden, sind bekannt (Ubersicht bei Ulmann, 1971). Alle Enzyme, die an dem Stoffwechsel der Stfirke beteiligt sind, setzen die nicht komplexierten Ketten urn. Nut aus diesen kann Amylopektin entstehen. Es hat uns nicht fiberrascht, dab die Phospholipide die Amylopektinbildung verhindern. Griffin und Wu (1971) trennten das ,,branching enzyme" in eine Hydrolase und ein verkniipfendes Enzym. Wenn diese Hydrolase sich wie die von uns untersuchten Amyla-
G.H. Vieweg und M.A.R. de Fekete: EinfluB von Phospholipiden auf den St/irkemetabolismus
sen verhfilt, kann sie geschfitzte Amylose nicht angreifen. Durch die Hemmung der Spaltung der linearen Ketten wird kein Substrat ftir die folgende Reaktion bereitgestellt. Die Befunde, fiber die wir in dieser Arbeit berichten, erweitern den Bereich, den man f~r die Regulation des Stfirkehaushaltes in Betracht ziehen mul3. Neben dem Verhalten und den Eigenschaften der Enzyme, die direkt die Bildung oder den Abbau der Polyglucane katalysieren, muB noch die Beeinflussung durch Lipide beachtet werden. Es ist bekannt, dab die Aktivitgt einiger Enzyme durch Phospholipide reguliert wird (Rothfield and Romeo, 1971). Auch ffir die Stfirkesynthetase wurde eine Wechselwirkung mit Lipiden vorgeschlagen (Downton and Hawker, 1975). Der Lipidstoffwechsel ist nicht nur an der Bildung der Plastidenmembran oder an der um die jungen St/irkek6rnchen gefundenen Hfille (Ohad et al., 1971) beteiligt, sondern greift direkt in die Zusammensetzung der Stfirke ein. Durch die Phospholipide wird das Substrat in einen Zustand versetzt, der die simultane Bildung der Amylose und des Amylopektins im St/irkekorn gestattet. Wir danken Frau Ingrid Walter ftir sorgf~iltige Mitarbeit. Die Arbeit wurde durch Untersttitzung der Deutschen Forschungsgemeinschaft gef6rdert.
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Eingegangen am 22. September; angenommen am 30. Oktober 1975
PI~H~J 9 by Springer-Verlag 1976
Einflufl von Phospholipiden auf den St~irkemetabolismus Georg H. Vieweg und Maria A.R. de Fekete Fachbereich Biologieder TechnischenHochschule,Schnittspahnstrage3, D-6100 Darmstadt, Federal Republikof Germany
The Effect of Phospholipids on Starch Metabolism Summary. The presence of phospholipids reduces the breakdown of amylose catalyzed by/~-amylase, phosphorylase and a-amylase. The activities of the/%amylases of sweet potato (Ipomoea batatas) and barley (Hordeum vulgare L.) disminish to less than 10% of the activity in the control without the phospholipids. When the amylose was comple• with phospholipids the activity of the c~-amylase of Bacillus subtilis was reduced to about 25% of the control value. A similar effect was observed for the amylases of Zea mays leaves. The phosphorylase effected almost no phosphorolysis of the complexed amylose, but starch synthesis from glucose-l-phosphate proceeded at a rate that was about 60% of that with pure amylose. The activity of the synthetase from bundle sheath cells of maize leaves was not influenced much by the presence of phospholipids, whereas the ,,branching enzyme" of maize endosperm did not produce any amylopectin from the complexed amylose. These facts could explain the simultaneous deposition of amylose and amylopectin in the starch granules. Some of the newly formed glucan chains may be protected by formation of a complex with the phospholipids. This protected amylose can not undergo branching or breakdown, but it can be elongated owing to the activity of synthetase or phosphorylase. Amylopectin is formed from the chains that are not complexed.
tung der stfirkespeichernden Gewebe gestattet die Synthese von Amylose und die anschliel3ende Verzweigung dieser zu Amylopektin. In Versuchen in vitro k6nnen aber mit Enzymgemischen, die in der Zusammensetzung der im Gewebe entsprechen, nur verzweigte Polysaccharide gebildet werden, wogegen in vivo sowohl Amylose als auch Amylopektin abgelagert werden. In der Bildung von Komplexen der Amylose mit Lipiden (Schoch und Williams, 1944) haben wir eine noch nicht beschriebene M6glichkeit gesehen, die neu aufgebauten Amyloseketten vor gewissen weiteren Umsfitzen zu schfitzen. In St/irkek6rnern wurden verschiedene Lipide festgestellt. Getreidestfirken enthalten viel Lysolecithin (Acker und Schmitz, 1967), Kartoffelst/irke hauptsfichlich Lecithin (Bolling und E1 Baya, 1975). Der Anteil an Phospholipiden kann 1% des Trockengewichtes betragen. Diese Befunde wiesen uns darauf hin, dal3 Phospholipide eine Rolle bei der gleichzeitigen Bildung von Amylose und Amylopektin spielen k6nnen. Wir haben deswegen den Einflul3 yon Phospholipiden auf die Aktivitfit der stfirkeumsetzenden Enzyme untersucht. Hierftir haben wir zunfichst kfiufliches Lecithin aus Eiern benutzt, das neben 50% Lecithin etwa je 15% Lysolecithin, Kephalin und Lysokephalin enthielt. Ober einige dieser Ergebnisse haben wir beim XII. Internationalen Botanischen Kongrel3 1975 in Leningrad vorgetragen.
Material und Methoden Einleitung
St/irkekSrner wachsen sehr langsam durch Apposition (Ubersicht bei Badenhuizen, 1971). Mit fortschreitender Reifung nimmt der relative Amylosegehalt zu (Banks und Greenwood, 1973), doch sind Amylose und Amylopektin nebeneinander durch das ganze St/irkekorn hindurch verbreitet. Die Enzymausstat-
Phosphorylaseaus Kartoffeln: Die KartoffelwurdeaufeinerPlastikreibe, angefeuchtet mit 1 M Mercapto/ithanol, zerkleinert, der Brei durch Perlongaze gepreBt und durch Zentrifugation bei 1000 x g w/ihrend 5 min yon der St/irke befreit. Dieser Extrakt wurdedanneingefroren,nach dem Auftauenwiederabzentrifugiert und die iiberstehendeFliissigkeitffirdie Versucheeingesetzt. Amylasen: Die kS,uflichen Amylasen wurden kurz vor dem Test in 0,5 M (NHg)2SOg-L6sungaufgenommenbzw. verdfinnt und zwar: fl-Amylaseaus Sfil3kartoffeln,kristallineSuspensionin
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G.H. Vieweg und M.A.R. de Fekete: Einflug von Phospholipiden auf den Stfirkemetabolismus
Ammoniumsulfat 20 mg ml- 1 von Sigma Chemical Co./~-Amylase aus Gerste, lyophilisiert, (45 U/rag) yon Merck und c~-Amylase aus Bacillus subtilis, lyophilisiert, (170 U/rag) yon Merck. Enzyme aus Biindelscheidenzellen tier Maisbldtter: Zea-maysPflanzen wurden im Gew~ichshaus, wie bereits beschrieben (Vieweg und Fekete, 1972), kultiviert. Sie wurden vor der Aufarbeimng 40 h verdunkelt. Die Herstellung der Bfindelscheiden, das nachfolgende Homogenisieren und die Prfiparation der Enzyme folgte der bei Fekete und Vieweg (1974b) angegebenen Methodik. Es wurde abet nicht ein Gesamtenzym, sondern fraktioniert mit Ammoniumsulfat gef~illt. Der Niederschlag der F~illung zwischen 20 und 35% der S/ittigung mit Ammoniumsnlfat enthielt den Hauptanteil der 16slichen Synthetase. In den nachfolgenden Fraktionen befanden sich die Amylasen neben anderen st/irkeumsetzenden Enzymen. ,,Branching enzyme" aus Maisendosperm (in Anlehnung an Manners et al., 1968). Aus einem Maiskolben wurde Endosperm im milchigen Zustand ausoperiert. Davon wurden 14 g mit 14 ml 0,2 M Na-Citrat bei pH 7,0 und 0,28 ml Dithioerythrit (10 mg/ml) homogenisiert. Grobe Zellreste wurden mit einer Perlongaze entfernt, die partikui/iren Bestandteile 20 min bei 30 000 x g abzentrifugiert. Das Enzym konnte zwischen 20 und 35% Sfittigung mit Ammoniumsulfat geffillt werden. Hierf/ir wurden entsprechende Volumina gesgtttigter Ammoniumsulfat-L6sung, eingestellt auf pH 6,9 zugegeben. Der Niederschlag wurde in 0,2 M Na-Citrat bei pH 7,0 aufgenommen und als Enzym eingesetzt. Die Amylose und das Amylopektin (erworben bei Serva) wurden nach Angaben yon Griffi n und Wu (1968)jeweils frisch gel6st. Das PhospholiPidgemisch wurde mit Lecithin aus Eiern von Merck in warmen absoluten Athanol angesetzt (80 mg ml 1). F/ir die St/irke-Phospholipidkomplexe wurden auf 5 gl des Gemisches 75 gl der Amylose- bzw. Amylopektinl6sung pipettiert, gut geschtittelt, und dann wurden die weiteren Zutaten zugegeben. Die Reaktion wurde mit Enzym gestartet. Die Bestimmung der Synthetaseaktivitfit haben wir, wie bei Fekete und Vieweg (1974b) beschrieben, durchgeftihrt, aber statt St/irke 32 gg Amylose nnd 0,4 mg Phospholipidgemisch eingesetzt. In denjenigen Versuchen, bei welchen die Ver/inderung der Amylose- oder Amylopektinkonzentration verfolgt wurde, mugten vor der St/irkebestimmung die Lipide entfernt werden. Hierftir wurde der doppelte Enzymansatz (0,2 ml) mit 0,6 ml ges~ittigter CaCl2-L6sung 5 rain gekocht. Nach dem Abkfihlen wurde 0,5 ml Chloroform zugegeben, gut durchgemischt, 1 ml Petroleumbenzin (Siedebereich 6 0 - 80~ C) zugeffigt und wieder durchgemischt. Die Trennung der Phasen wurde durch 5 minfitiges Zentrifngieren bei 1 500 x g beschleunigt, und dann wnrde die obere Schicht sorgf/iltig abgesaugt. Die w~issrige Phase wurde noch zweimal mit 1,5 ml einer Mischung yon Chloroform und Petroleumbenzin (Siedebereich 4 0 - 60 ~ C) 1:2 (v/v) gewaschen, dann wieder 10 m i n i m Wasserbad gekocht und abzentrifugiert. Die Polysaccharide wurden in 0,4 ml der iiberstehenden Fliissigkeit nach Krisman (1962) bestimmt. Amylose wurde bei 635 nm und Amylopektin bei 550 nm gemessen. Ffir die Auswertung der reduzierenden Zucker wurden die Proben nach Somogyi photometrisch nach Nelson, wie beschrieben bei Najdar (1955), behandelt.
Ergebnisse EinfluJ3 der Phospholipide auf die Phosphorylase aus Kartoffel Kartoffelknollen enthalten eine sehr aktive Phosphorylase (1,4-e-D-Glucan:orthophosphat c~-glucosyltransferase, EC 2.4.1.1.), deren Aktivit~it auch in ver-
Tabelle 1. EinfluB der Phospholipide beim Auf- und Abbau der Amylose durch Stiirkephosphorylase. Der Ansatz enthielt 6 gmol Morpholinofithansulfons/iure pH 6,0, 3,3 gl Enzym und, wo angegeben, 5 gl Athanol bzw. 0,4 mg Phospholipidgemisch in 5 pl Athanol im Endvolumen von 0,l ml. Der Ansatz im Versuch a enthielt noch 63 gg Amylose und 1 gmol Glucose-l-phosphat, im Versuch b 126 gg Amylose und 4 gmol Phosphat bei pH 6,0 Versuch a) Zutaten
Zunahme der Amylose (gg) nach 20 rain
40 min
80 min
keine )~thanol Athanol+ Phospholipidgemisch
27,5 22,0 12,5
56,7 52,7 33,2
110,8 109,4 68,4
Versuch b)
Abnahme der Amylose (gg)
keine Athanol Athanol+ Phospholipidgemisch
9,0 7,7 5,7
25,3 27,5 6,6
50,6 45,7 6,0
diinnten Extrakten ohne Anreicherung- oder Reinigungsschritte nachgewiesen werden kann. Die Amylaseaktivitfit solcher Prfiparate ist sehr gering. Nach Inkubation mit Glucose-l-phosphat kann die Zunahme der Amylosekonzentration beobachtet werden. Die Zugabe von Phospholipiden zum Ansatz verringert die Bildung von Glycosylbindungen um etwa 40% (Tabelle la). Untersucht man die Reaktion in der phosphorolytischen Richmng, so ist der EinfluB wesentlich ausgepr~igter: Der anffingliche Abbau ist auf die H/ilfte reduziert. Ein weiterer Umsatz der Amylose in Anwesenheit des Gemisches findet nicht statt (Tabelle lb).
Einflufl der Phospholipide auf die Amylasen Wir haben kfiufliche gereinigte Enzyme und ein von uns angereichertes Prfiparat aus Bfindelscheiden yon Maisblfittern getestet. Der Abbau der Amylose und des Amylopektins wurde durch die Abnahme der Jodffirbung verfolgt. Gleichzeitig wurden die gebildeten reduzierenden Zucker bestimmt. Die Tabelle 2a zeigt, dab Phospholipide den Abbau der Amylose durch die /~-Amylase (1,4-~-D-Glucan maltohydrolase, EC 3.2.1.2.) aus Ipomoea batatas beinahe g/inzlich unterdrficken. Die Abnahme der Amylosekonzentration ~ihnelt der beim Phosphorolyseversuch gefundenen. Auch die Hydrolyse des Amylopektins wurde unter gleichen Bedingungen verfolgt. Die Versuche zeigen, dab der Abbau um etwa ein Viertel gehelnmt wird.
G.H. Vieweg und M.A.R. de Fekete: Einflul3 von Phospholipiden auf den Stgrkemetabolismus Tabelle 2. Einflug der Phospholipide auf die/?-Amylase aus lpomea batatas und die e-Amylase aus Bacillus subtilis. Die Proben enthielten in 0,1 ml 2 gg/?-Amylase (Versuch a) bzw. 7 lag e-Amylase (Versuch b), 108 gg AmyIose bzw. 142 gg Amylopektin, 4 gmol Acetatpuffer bei pH 5,0 und, wo angegeben, 0,4 mg Phospholipidgemisch in 5 pl Athanol oder 5 pi ,~.thanol. Der Ansatz wurde 30 rnin bei 30~ inkubiert Versuch a) Zutaten
Z~nahme der reduzierenden Zucker
% Abnahme der JzFS.rbung bei 2m,x
nmol
% Aktivitilt
Amylose Amylose +Athanoi Amylose + Phospholipidgemisch + Nthanol
76,5 73,8 6,1
100 96,5 8,0
88,6 89,2 7,6
Amylopektin Amylopektin + )~thanol Amylopektin + Phospholipidgemisch + Athanol
81,6 82,1 59,8
100 100,6 73,3
64,8 63,3 51,5
Amylose Amylose + Athanol Amylose + Phospholipidgemisch + Athanol
67,8 61,3 27,0
100 90,4 39,8
99,2 99,0 41,5
Amylopektin Amylopektin + Athanol Amylopektin + Phospholipidgemisch + AthanoI
80,7 77,1 61,5
I00 95,5 76,2
97,4 97,2 79,9
Versuch b)
Auch die e-Amylase (1,4-e-D-Glucan glucanohydrolase, EC 3.2.1.1.) aus Bacillus subtilis wird durch Phospholipide gehemmt. Wie die Tabelle 2b zeigt, betr~gt die Aktivitfit des Enzyms mit Amylose als Substrat noch etwa 40% des Wertes ohne die Zugabe der Phospholipide. Die Hemmung der Spaltung des Amylopektins ist vergleichbar mit der fttr die/~-Amylase gefundenen. In einem /ihnlichen Experiment haben wir die Beeinflussung der Amylaseaktivitfit eines Pr/iparates aus Biindelscheidenzellen vom Maisblatt untersucht. Das Enzym enthielt mehrere elektrophoretisch nachweisbare Amylasebanden und andere st/irkeumsetzende Enzyme. In diesem Versuch haben wir die Abnahme der Jodffirbung bei 560 nm gemessen, weil bei dieser Wellenlfinge ffir Amylose und Amylopektin der gleiche Umrechnungsfaktor gilt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 wiedergegeben. Auch mit diesem Enzymgemisch kann die sch/itzende Wirkung der Phospholipide auf den Abbau der Amylose beobachtet werden. In einigen Experimenten haben wir den AmylosePhospholipid-Komplex vonder fiberschtissigen Lipidsuspension durch Zentrifugation getrennt, mit Wasser mehrfach gewaschen und in wS.13riger Suspension als Substrat ffir die Amylasen des Maisblattes geboten. Der Abbau des gewaschenen Komplexes war/ihnlich dem der Amylose mit Phospholipidtiberschul3.
Einflufl der Phospholipide auf die Stiirkesynthetase
Tabelle 3. Einflul3 der Phospholipide auf die Amylasen aus Maisblfittern. Der Ansatz enthielt 280 pg Amylose bzw. Amylopektin, 8 gmol Morpholinofithansulfonsfiure pH 6,5, Enzym aus Biindelscheiden von Maisbl/ittern, geffillt zwischen 35 und 60 % Ammoniumsulfat-Sfittigung (520 gg Protein) und, wo angegeben, 0,8 mg Phospholipidgemisch in 10 pl Athanol bzw. 10 pl Athanol in einem Endvolumen von 0,2 ml. Der Ansatz wurde 60 min bei 30~ inkubiert Zutaten
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Zunahme der reduzierenden Zucker nmol
% Aktivitfit
% Abnahme der J2F~irbung bei 560nm
Amylose Amylose + Athanol Amylose + Phospholipidgemisch + A.thanol
273 196,7 64,1
100 72,1 23,5
50,8 34,2 8,7
Amylopektin Amylopektin + Athanol Amylopektin + Phospholipidgemisch + Athanol
353,6 262,6 270,9
I00 74,3 76,6
63,1 57,6 54,6
Die Btindelscheidenzellen des Maisblattes enthalten eine Stfirkesynthetase (ADPGlucose: 1,4-c~-D-glucan 4-e-glucosyltransferase, EC 2.4.1. ?), deren Aktivit/it von der Vorbehandlung der Pflanzen abh/ingig ist (Fekete und Vieweg, 1974b). Das zwischen 20 und 35% Sfittigung mit Ammoniumsulfat geffillte Enzymprfiparat enthielt sehr wenig Amylaseaktivit/it und wurde in der Glucosyltibertragung aus ADP-Glucose auf Amylose durch Zugabe vom Phospholipidgemisch kaum beeinflul3t.
EinjTufi der Phospholipide auf das ,,branching enzyme"
Auf die Aktivitfit des ,,branching enzyme" (1,4-e-DGlucan: 1,4-~-D-glucan 6-glucosyltransferase, EC 2.4.1.18) wird aus der Verfinderung des Jod-Spektrums nach Inkubation mit Amylose und der Bestimmung der /%Amylolyse geschlossen (Lavintman und Krisman, 1964). Wit haben in unseren Versuchen ein Enzym aus unreifen Maisendosperm benutzt. Nach 120 rain Inkubation konnten wit aus der Verschiebung des Maximums des Jod-Spektrums von 635 auf
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G.H, Vieweg und M.A.R. de Fekete: Einflug von Phospholipiden auf den St/irkemetabolismus
0,80 / 0,70
/
0,60
/
to
---
/
to
t120
1
n
0,50 co m
,,
< 0,40
-Phospholipide
"
§ oh p s holipide i
500
600
500
600
nm
Abb. 1. EinfluB der Phospholipide auf die Aktivit~it des ,,branching
enzyme" aus Maisendosperm. Der Ansatz enthielt: 4 pl Citrat pH 7,0, Enzym (etwa 60 pg Protein), 220 gg Amylose, 10 gl Athanol und, wo angegeben, 0,8 mg Phospholipide in einem Endvolumen yon 0,2 ml. Nach 120 min Inkubation wurden die Proben ffir die J2-Reaktion, wie in Methoden beschrieben, vorbereitet. Ftir die Nullprobe wurde der Ansatz mit abgekochtem Enzym verarbeitet. Die Absorption wurde in einem Spektralphotometer (Beckman Instrument, Modell 24) Extinktionsbereich 0 - 1 gemessen und bei einem Vorschub von 100 nm rnin- 1 aufgezeichnet
570 nm die Bildung von Verzweigungen feststellen (Abb. 1), die durch die /%Amylolyse des Produktes bestfitigt wurden. Die verzweigende Wirkung wurde in Anwesenheit von Phospholipiden ganz unterdrtickt.
Diskussion
Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dab die Amylose dutch Bildung eines Komplexes mit Phospholipiden vor dem enzymatischen Abbau geschfitzt wird. Dies gilt sowohl ftir die Phosphorolyse als auch ftir die Hydrolyse, wobei die c~-Amylase weniger beeinflul3t wird als die /3-Amylase. Der Effekt auf den Abbau des Amylopektins ist gering. Die Umwandlung von Amylose zu Amylopektin wird ebenfalls durch die Komplexbildung unterdrfickt. Dagegen kann die komplexierte Amylose durch die Synthetase unbehindeft weiter verlfingert werden, und auch die dutch Phosphorylase katalysierte Synthese verlfiuft mit einer Geschwindigkeit, die etwa nur um ein Drittel verkleinert ist. In unseren Versuchen haben wir eine sehr groBe Menge verschiedener Phospholipide eingesetzt, um nachzuprfifen, ob der von uns vorgeschlagene Regulationsmechanismus funktioniert. Da die Lipidzusammensetzung der Stfirkek6rnchen verschiedener Herkunft nicht einheitlich ist, mug angenommen werden, dab in den einzelnen Geweben die Regulation ziem-
lich spezifisch ist. Nur so ist eine Beeinflussung des Stfirkestoffwechsels durch die geringen Lipidmengen der St/irkek6rner m6glich. Aus den Werten von Bekker und Acker (1972) ffir Gerstenstfirke haben wir errechnet, dab 1 Phospholipidmolekfil auf 123 Glucosereste entf~illt. In vivo k6nnen deshatb nicht alle Amyloseketten maximal mit Phospholipid besetzt sein. Hamori und Senior (1973) haben gezeigt, dab die Konformation der Amylosekette an den Endstfikken ffir die Bildung des Jod-Komplexes nicht geeignet ist. Vielleicht sind auch f~r die Phospholipide Stellen am nicht reduzierenden Ende der Amylosekette ,,verboten". Nur die aus dem Komplex herausragenden Teile werden dutch /?-Amylase oder Phosphorylase abgebaut oder als Primer ftir die Synthese verwendet. Die dutch das Lipid belegte Kette kann weder gespalten noch verzweigt werden und bleibt als lineares Polysaccharid liegen, das weiter nut noch durch die Synthetase oder durch die Phosphorylase verlfingert wird. Diese Annahme ist in Einklang mit den Befunden yon Banks und Greenwood (1973), die mit der Reifung des Gewebes eine Zunahme nicht nut des Gehaltes, sondern auch des Molekulargewichtes der Amylose fanden. Auch bei der Keimung k6nnen die durch der Phospholipid geschiitzten Amyloseketten vorerst nicht abgebaut werden. Der Umsatz des Amylopektins verlfiuft abet ungehindert. Die Spaltung der Amylose k6nnte nur nach Entfernung des eingeschlossenen Phospholipides fortgesetzt werden. Fukui und Nikuni (1956) zeigten, dab die Mobilisierung der Stfirke w/ihrend der Keimung von einer Zunahme des AmyloseAmylopektin-Verhfiltnisses begleitet wird. Bei diesem Abbau vermindert sich das Molekulargewicht der Amylose nur wenig (Greenwood und Thomson, 1959). Diese Resultate best/itigen den besonderen Zustand der Amylose im St/irkekorn. Aufdie mit Phospholipid wenig besetzten Amyloseketten k6nnen einige Enzyme, wie die c~-Amylase oder das ,,branching enzyme" noch einwirken. Dadurch k6nnen neue Primer fiir die weitere Synthese bereitgestellt werden (Fekete und Vieweg, 1974a), oder es werden Polysaccharide mit nur wenigen Verzweigungen produziert. Produkte, die des Verzweigungsgrades wegen zwischen der Amylose und dem A.mylopektin eingeordnet werden, sind bekannt (Ubersicht bei Ulmann, 1971). Alle Enzyme, die an dem Stoffwechsel der Stfirke beteiligt sind, setzen die nicht komplexierten Ketten urn. Nut aus diesen kann Amylopektin entstehen. Es hat uns nicht fiberrascht, dab die Phospholipide die Amylopektinbildung verhindern. Griffin und Wu (1971) trennten das ,,branching enzyme" in eine Hydrolase und ein verkniipfendes Enzym. Wenn diese Hydrolase sich wie die von uns untersuchten Amyla-
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sen verhfilt, kann sie geschfitzte Amylose nicht angreifen. Durch die Hemmung der Spaltung der linearen Ketten wird kein Substrat ftir die folgende Reaktion bereitgestellt. Die Befunde, fiber die wir in dieser Arbeit berichten, erweitern den Bereich, den man f~r die Regulation des Stfirkehaushaltes in Betracht ziehen mul3. Neben dem Verhalten und den Eigenschaften der Enzyme, die direkt die Bildung oder den Abbau der Polyglucane katalysieren, muB noch die Beeinflussung durch Lipide beachtet werden. Es ist bekannt, dab die Aktivitgt einiger Enzyme durch Phospholipide reguliert wird (Rothfield and Romeo, 1971). Auch ffir die Stfirkesynthetase wurde eine Wechselwirkung mit Lipiden vorgeschlagen (Downton and Hawker, 1975). Der Lipidstoffwechsel ist nicht nur an der Bildung der Plastidenmembran oder an der um die jungen St/irkek6rnchen gefundenen Hfille (Ohad et al., 1971) beteiligt, sondern greift direkt in die Zusammensetzung der Stfirke ein. Durch die Phospholipide wird das Substrat in einen Zustand versetzt, der die simultane Bildung der Amylose und des Amylopektins im St/irkekorn gestattet. Wir danken Frau Ingrid Walter ftir sorgf~iltige Mitarbeit. Die Arbeit wurde durch Untersttitzung der Deutschen Forschungsgemeinschaft gef6rdert.
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