Planta (Berl.) 92, 57--63 (1970)
Der Chlorophyllgehah yon Tumoren an bleichem und griinem Blattgewebe von Kalanchoefedtschenkoi ROLF BEIDERBECK u n d I-IELFRIED NITSCHE Botanisches Institut der Universitgt Heidelberg
Eingegangen am 22. Januar 1970 The Chlorophyll C o n t e n t of T u m o r s from P a l e a n d Green Leaf Tissues of Kalanchoe [edtschenkoi
Summary. Pale and green leaves of Kalanchoe /edtschenkoi var. variegata were inoculated with Agrobacterium tume]aciens. Six weeks later the chlorophyll contents of the leaves and their tumors were investigated. The tumor tissues possess very similar concentrations of chlorophylls and a low number of chloroplasts per cell. Thereby they differ from each of the initial tissues. The qualitative composition of pigments (chlorophylls and carotenoids) of the 4 tissues is the same. Einleitung Bei der T r a n s f o r m a t i o n v o m N o r m a l z n s t a n d z u m C r o w n g a l l - Z u s t a n d wird der Differenzierungsgrad der Zellen erheblieh ver~ndert. A u f g r u n d der A k t i v i e r u n g zahlreieher b i o s y n t h e t i s c h e r Systeme, u . a . des Aminos/iure- u n d des W u c h s s t o f f h a u s h a l t e s , k o m m t es zur A u s b i l d u n g eines Z u s t a n d e s eigener A r t , d e r sich sowohl v o m m e r i s t e m a t i s e h e n Charakter als aueh v o m C h a r a k t e r ausdifferenzierter Zellen u n t e r s e h e i d e t (Braun, 1962; Lioret, 1966; L e j e u n e u. J u b i e r , 1968). D a b e i ist auch der ChlorophyllgehalC d e r Zellen betroffen. Meist sind die T u m o r zellen ehlorophyll/irmer als die e n t s p r e e h e n d e n griinen N o r m a l z e l l e n (Hoffmann u. K a r s t e n , 1966). Uns interessierte die F r a g e , ob d e r Crowngal]-Zustand der Zellen, gekennzeiehnet dureh einen niederen Chlorophyllgehalt, y o n verschieden differenzierten N o r m a l g e w e b e n aus erreieht werden kann. Zur e x p e r i m e n t e l l e n Priifung dieses P r o b l e m s eignet sich Kalanchoe [edtschenkoi vat. variegata. Diese Crassulacee ist p a n a s e h i e r t u n d besitzt neben n o r m a l grfinen Teilen auch Seitensprosse u n d B1/itter, die v o l l k o m m e n bleich sind. Eine einzige Pflanze k a n n so hinsichtlieh der F/~rbung zwei g u t u n t e r s e h e i d b a r e B l a t t g e w e b e zur T r a n s f o r m a t i o n zur Verftigung stellen.
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R. Beiderbeck und H. Nitsche:
Material und Methoden Anzucht der Bakterien. Agrobacterium tume/aciens, StammB6, wurde auf einern vollsynthetischenMedium kultiviert u n d die Zellzahl durch Trtihungsrnessung bestimrnt (Beiderbeck, 1970). Testpflanzen. 6 Monate a]te Pflanzen yon Katanchoe/edtschenkoi var. variegata Harnet et Peru'. (20--30 crn hoch), die unter natfirlichem Licht-Dunkel-Wechsel (Langtag) angezogen wurden. In/e~tion. An den panaschierten Pflanzen wurden junge weil~e und grfine Bl~itter (an den obersten drei Knoten) durch rnehrere Einstiehe rnit der Injektionsnadel verwundet und infiziert rnit Suspensionen yon 2 • 109 Bakterien/rnl. Nach der Infektion wurden die Pflanzen irn ersten Experiment weiter irn natfirlichen Licht-Dunkel-Wechsel (Langtag) irn Gew~chshaus gehalten, im zweiten Experirnent wurde zum natiirlichen Kurztag Zus~tzlicht gegeben (2 Leuchtstoffr6hren Osrarn-L-Fluora 65 W, 77 I~ uTx) fiir 13 h je Tag. Extrak,tion der Pigmente. /)as Frischgewicht 6--7 Wochen alter Turnoren (oberhalb der Blattoberfl~che abgeschnitten) und norrnalen Blattgewebes wurde bestimmt. Nach Zusatz yon 1 g MgC0 a (zur Neutralisation der hei ZerstSrung der Gewebe freigesetzten S~uren) und 7 rnl Aceton wurde Gewebe von 1 g Frischgewicht rnit 8 g Seesand griindlich zerm6rsert und dm Pigmente des Hornogenats mit insgesarnt 30 rnl Aceton durch eine G2-Fritte in die Vorlage gewaschen. Der wEssrige Acetonextrakt wurde mit 20 rnl Petrolather (40--60 ~ C) versetzt, die Pigmente durch zehnmaliges Waschen mit Wasser in die Petroli~therphase iibergetrieben und diese 20 rain bei -18~ aufbewahrt, wobei sich unl6sliche Bestandteile absetzten. Eine Phaeophytinbildung konnte nicht beobachtet werden (vg]. Abb. 1). Messung des Pigmentgehaltes. 5 Teile des verd/innten oder eingeengten klaren Petrol~therauszugs wurden rnit 1 Teil ~ther gernischt, die Extinktion irn Spektralphotometer RPQ 20 (Zeiss) verrnessen bei den Wellenli~ngen 662 und 644 nm. Aus den Extinktionswerten wurden die Chlorophyllkonzentrationen errechnet (Ziegler u. Egle, 1965). Ca [mg/1] ~ 10,05- EG62--0,89- E6~~ Cb [rag/l] = 16,37 9E6a~---2,69 9 E~6~.. Di~nnschichtchromatographie. Petroli~therextrakte w u r d e n auf m i t Triglyceriden i m p r ~ g n i e r t e n Cellulose-Platten (Egger, 1962) chromatographiert.
Chloroplastenziihlung erfolgte a n l e b e n d e n S c h n i t t e n der Gewebe i m Fluoreszenszusatz des P h o t o m i k r o s k o p s I I (Zeiss). Ergebnisse Morphologische Beobachtung. Die aus weil~em oder gr/inem Blattgewebe h e r v o r g e g a n g e n e n T u m o r e n u m g e b e n die Einstichstelle als ein Ringwulst. Sie n e h m e n trotz un~erschiedlicher H e r k u n f t den gleichen gelbgrfinen F a r b t o n a n u n d sind z u m Z e i t p u n k t der E x p e r i m e n t e etwa gleich gTO~.
ChloroplastenzShlungen. A u s z ~ h l u n g e n der Chloroplasten in d e a Muttergeweben u n d den T u m o r g e w e b e n zeigten deutliche Un~erschiede
Chlorophyllgehalt yon Tumoren
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Tabelle 1. Anzahl der Chloroplasten in Tumor- und Normalgeweben, gemessen als Zahl rot/luoreszierender Plastiden. Angegeben Mittelwerte aus 20 Messungen. In Klammern Standardabweichungeu Zellen
Blattgewebe
SchlieBzellen Mesophyll Tumorzellen
Tumorgewebe aus
griines
bleiches
grSnem
bleichem Blatt
6,8 (1,0) 50 (7,5) --
6,5 (1,0) 0 --
--7,5 (4,1)
--12 (2,6)
Tabelle 2. Der Farbsto//gehalt je Gramm Frischgewicht in den 4 Gewebetypen. Angegeben sind Mittdwerte aus 2 3 Bestimmu~jen, in Klammern Standardabweichungeu Expt.
Gewebetyp
Gewicht (g)
Chlorophylle (~g/g Fg.) a b
Chl. ~/Chl. b
griin Tumor griin bleich Tumor bleich
1 1 1 1
234 29,6 3,3 19,9
(41) (2,8) (0,2) (3,1)
113 13,4 1,53 9,8
(12) (1,9) (0,06) (2,8)
2,05 2,22 2,19 2,06
(0,13) (0.12) (0,22} (0,27)
gr(in Tumor griin bleich Tumor bleich
1 1 5 1
163 19,7 1,0 10,0
(6,0) (3,0) (0,01) (2,3)
77 9,7 0,49 4,6
(5,2) (2,9) (0,01) (0,9)
2,12 2,09 2,13 2,18
(0,07) (0,3) (0,04) (0,06)
(Tabelle 1). Das griine Blattgewebe enthi~lt im Mesophyll u n d in den Sehlie~zellen Chloroplasten in ahnlicher Anzahl wie Kalanchoe daigremontiana (Butter~ass, 1959). I n den Sehlie~zellen des bleichen Gewebes sind genausoviel Chloroplasten wie in denen des grtinen Gewebes, woraus m a n auf einen gleichen Ploidiegrad in beiden Geweben sehliel~en k a n n (Butterfass, 1963). Das Mesophyl] enth~lt dagegen keine entwiekelten Chloroplasten. I m untersuehten T u m o r p a r e n c h y m fanden sieh stets Chloroplasten; wie bei T u m o r e n yon Kalanchoe diagreraontiana sind sie kleiner als die SchlieBzellehloroplasten des ~ormalgewebes (Hoffmann u. Karsten, 1966). Tnmoren, die aus bleiehem oder aus grfinem Blattgewebe hervorgegangen sind, enthalten sehr i~hnliehe Anzahlen yon Chloroplasten pro Zelle, und zwar mehr als das bleiche u n d weniger als das griine Ausgangsgewebe. Itinsiehtlich der Chloroplastenzahl nehmen die Tumorgewebe somit unabhangig y o n ihrer H e r k u n f t eine intermedi~re Stellung ein. Pigmentgehalt der Gewebe. Wie aus Tabelle 2 hervorgeht, ver~tndert sieh der Pigmentgehalt aller Gewebetypen yon Experiment zu
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R. Beiderbeck und H. Nitsche:
Experiment. Diese Sehwankung der absoluten Menge an Pigment pro G r a m m Frisehgewicht wird erkl/trt aus den untersehiedliehen Anzuehtbedingungen bei beiden Experimenten. Bekanntlieh fiihrt untersehiedlieher Liehtgenul~ bei h6heren Pflanzen zu untersehiedlieher Pigmentausriistung (Clauss, 1954). Bei allen untersuehten Geweben ist das Verhgltnis yon Chlorophyll a:Chlorophyll b fast konstant; es nimmt den Wert 2 an (Tabelle 2). Wie zu erwarten, zeigt das griine Gewebe den h6ehsten Gehalt an Chlorophyllen, das bleiehe Gewebe den geringsten. Das Tumorgewebe, das veto griinen Btatt a b s t a m m t , besitzt nur noeh etwa 1/s des Chlorophylls im griinen Muttergewebe. Dagegen enthalten Tumoren der bleiehen B1/~tter eine 6--10mal h6here Menge an Chlorophyllen als das bleiehe Muttergewebe. Transformation zum Tumorgewebe senkt also in griinen B1/~ttern den Chlorophyllgehalt, in bleiehen Bl~ttern derselben Pflanze erh6ht sie ihn auf einen ann/~hernd gleiehen Wert. Bei versehiedenen AuBenbedingungen ist trotz unterschieclliehem absoluten Pigmentgehalt iiberall ein gleieher relativer Gehalt an Chlorophyllen bei den versehiedenen Gewebetypen zu linden (Tabelle 3). Naeh der Tabelle 3 ist ein Tumorgewebe hinsiehtlieh seines Pigmentgehaltes sehr viel ~hnlieher dem anderen Tumorgewebe als dem Normalgewebe, yon dem es abstammt. Tabelle 3. Farbsto]/gehalt der verschiedenen Gewebetypen (ttg/g Frischgewicht) in Prozent des Farbsto/fgehaltes der grignen Blgtter Exp,.
Gewebetyp
Chlorophyll a
Chlorophyll b
grfin Tumor griin bleich Tumor bleich
100 12,6 1,4 8,5
100 11,8 1,3 8,6
grfin Tumor griin bleich Tumor bleich
100 12,1 0,6 6,2
100 12,6 0,6 5,9
Diinnschichtchromatographie. Eine Auftrennung der Petrol/~therextrakte aus den versehiedenen Geweben an impr~gnierten Celluloseplatten (Egger, 1962) zeigt, dab alle 4 Gewebetypen die gleiehen, ffir griine Organe hSherer Pflanzen typisehen Farbstoffkomponenten enthalten, n~mlieh Chlorophylle a, b, Lutein, (Zeaxanthin), Luteinepoxid
Chlorophyllgehalt yon Tumoren
61 .o
"~ e z ~ N :~,-~
~
-9 2 g~m
.~ ~
FZ e
9~ ~M
Der Chlorophyllgehah yon Tumoren an bleichem und griinem Blattgewebe von Kalanchoefedtschenkoi ROLF BEIDERBECK u n d I-IELFRIED NITSCHE Botanisches Institut der Universitgt Heidelberg
Eingegangen am 22. Januar 1970 The Chlorophyll C o n t e n t of T u m o r s from P a l e a n d Green Leaf Tissues of Kalanchoe [edtschenkoi
Summary. Pale and green leaves of Kalanchoe /edtschenkoi var. variegata were inoculated with Agrobacterium tume]aciens. Six weeks later the chlorophyll contents of the leaves and their tumors were investigated. The tumor tissues possess very similar concentrations of chlorophylls and a low number of chloroplasts per cell. Thereby they differ from each of the initial tissues. The qualitative composition of pigments (chlorophylls and carotenoids) of the 4 tissues is the same. Einleitung Bei der T r a n s f o r m a t i o n v o m N o r m a l z n s t a n d z u m C r o w n g a l l - Z u s t a n d wird der Differenzierungsgrad der Zellen erheblieh ver~ndert. A u f g r u n d der A k t i v i e r u n g zahlreieher b i o s y n t h e t i s c h e r Systeme, u . a . des Aminos/iure- u n d des W u c h s s t o f f h a u s h a l t e s , k o m m t es zur A u s b i l d u n g eines Z u s t a n d e s eigener A r t , d e r sich sowohl v o m m e r i s t e m a t i s e h e n Charakter als aueh v o m C h a r a k t e r ausdifferenzierter Zellen u n t e r s e h e i d e t (Braun, 1962; Lioret, 1966; L e j e u n e u. J u b i e r , 1968). D a b e i ist auch der ChlorophyllgehalC d e r Zellen betroffen. Meist sind die T u m o r zellen ehlorophyll/irmer als die e n t s p r e e h e n d e n griinen N o r m a l z e l l e n (Hoffmann u. K a r s t e n , 1966). Uns interessierte die F r a g e , ob d e r Crowngal]-Zustand der Zellen, gekennzeiehnet dureh einen niederen Chlorophyllgehalt, y o n verschieden differenzierten N o r m a l g e w e b e n aus erreieht werden kann. Zur e x p e r i m e n t e l l e n Priifung dieses P r o b l e m s eignet sich Kalanchoe [edtschenkoi vat. variegata. Diese Crassulacee ist p a n a s e h i e r t u n d besitzt neben n o r m a l grfinen Teilen auch Seitensprosse u n d B1/itter, die v o l l k o m m e n bleich sind. Eine einzige Pflanze k a n n so hinsichtlieh der F/~rbung zwei g u t u n t e r s e h e i d b a r e B l a t t g e w e b e zur T r a n s f o r m a t i o n zur Verftigung stellen.
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R. Beiderbeck und H. Nitsche:
Material und Methoden Anzucht der Bakterien. Agrobacterium tume/aciens, StammB6, wurde auf einern vollsynthetischenMedium kultiviert u n d die Zellzahl durch Trtihungsrnessung bestimrnt (Beiderbeck, 1970). Testpflanzen. 6 Monate a]te Pflanzen yon Katanchoe/edtschenkoi var. variegata Harnet et Peru'. (20--30 crn hoch), die unter natfirlichem Licht-Dunkel-Wechsel (Langtag) angezogen wurden. In/e~tion. An den panaschierten Pflanzen wurden junge weil~e und grfine Bl~itter (an den obersten drei Knoten) durch rnehrere Einstiehe rnit der Injektionsnadel verwundet und infiziert rnit Suspensionen yon 2 • 109 Bakterien/rnl. Nach der Infektion wurden die Pflanzen irn ersten Experiment weiter irn natfirlichen Licht-Dunkel-Wechsel (Langtag) irn Gew~chshaus gehalten, im zweiten Experirnent wurde zum natiirlichen Kurztag Zus~tzlicht gegeben (2 Leuchtstoffr6hren Osrarn-L-Fluora 65 W, 77 I~ uTx) fiir 13 h je Tag. Extrak,tion der Pigmente. /)as Frischgewicht 6--7 Wochen alter Turnoren (oberhalb der Blattoberfl~che abgeschnitten) und norrnalen Blattgewebes wurde bestimmt. Nach Zusatz yon 1 g MgC0 a (zur Neutralisation der hei ZerstSrung der Gewebe freigesetzten S~uren) und 7 rnl Aceton wurde Gewebe von 1 g Frischgewicht rnit 8 g Seesand griindlich zerm6rsert und dm Pigmente des Hornogenats mit insgesarnt 30 rnl Aceton durch eine G2-Fritte in die Vorlage gewaschen. Der wEssrige Acetonextrakt wurde mit 20 rnl Petrolather (40--60 ~ C) versetzt, die Pigmente durch zehnmaliges Waschen mit Wasser in die Petroli~therphase iibergetrieben und diese 20 rain bei -18~ aufbewahrt, wobei sich unl6sliche Bestandteile absetzten. Eine Phaeophytinbildung konnte nicht beobachtet werden (vg]. Abb. 1). Messung des Pigmentgehaltes. 5 Teile des verd/innten oder eingeengten klaren Petrol~therauszugs wurden rnit 1 Teil ~ther gernischt, die Extinktion irn Spektralphotometer RPQ 20 (Zeiss) verrnessen bei den Wellenli~ngen 662 und 644 nm. Aus den Extinktionswerten wurden die Chlorophyllkonzentrationen errechnet (Ziegler u. Egle, 1965). Ca [mg/1] ~ 10,05- EG62--0,89- E6~~ Cb [rag/l] = 16,37 9E6a~---2,69 9 E~6~.. Di~nnschichtchromatographie. Petroli~therextrakte w u r d e n auf m i t Triglyceriden i m p r ~ g n i e r t e n Cellulose-Platten (Egger, 1962) chromatographiert.
Chloroplastenziihlung erfolgte a n l e b e n d e n S c h n i t t e n der Gewebe i m Fluoreszenszusatz des P h o t o m i k r o s k o p s I I (Zeiss). Ergebnisse Morphologische Beobachtung. Die aus weil~em oder gr/inem Blattgewebe h e r v o r g e g a n g e n e n T u m o r e n u m g e b e n die Einstichstelle als ein Ringwulst. Sie n e h m e n trotz un~erschiedlicher H e r k u n f t den gleichen gelbgrfinen F a r b t o n a n u n d sind z u m Z e i t p u n k t der E x p e r i m e n t e etwa gleich gTO~.
ChloroplastenzShlungen. A u s z ~ h l u n g e n der Chloroplasten in d e a Muttergeweben u n d den T u m o r g e w e b e n zeigten deutliche Un~erschiede
Chlorophyllgehalt yon Tumoren
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Tabelle 1. Anzahl der Chloroplasten in Tumor- und Normalgeweben, gemessen als Zahl rot/luoreszierender Plastiden. Angegeben Mittelwerte aus 20 Messungen. In Klammern Standardabweichungeu Zellen
Blattgewebe
SchlieBzellen Mesophyll Tumorzellen
Tumorgewebe aus
griines
bleiches
grSnem
bleichem Blatt
6,8 (1,0) 50 (7,5) --
6,5 (1,0) 0 --
--7,5 (4,1)
--12 (2,6)
Tabelle 2. Der Farbsto//gehalt je Gramm Frischgewicht in den 4 Gewebetypen. Angegeben sind Mittdwerte aus 2 3 Bestimmu~jen, in Klammern Standardabweichungeu Expt.
Gewebetyp
Gewicht (g)
Chlorophylle (~g/g Fg.) a b
Chl. ~/Chl. b
griin Tumor griin bleich Tumor bleich
1 1 1 1
234 29,6 3,3 19,9
(41) (2,8) (0,2) (3,1)
113 13,4 1,53 9,8
(12) (1,9) (0,06) (2,8)
2,05 2,22 2,19 2,06
(0,13) (0.12) (0,22} (0,27)
gr(in Tumor griin bleich Tumor bleich
1 1 5 1
163 19,7 1,0 10,0
(6,0) (3,0) (0,01) (2,3)
77 9,7 0,49 4,6
(5,2) (2,9) (0,01) (0,9)
2,12 2,09 2,13 2,18
(0,07) (0,3) (0,04) (0,06)
(Tabelle 1). Das griine Blattgewebe enthi~lt im Mesophyll u n d in den Sehlie~zellen Chloroplasten in ahnlicher Anzahl wie Kalanchoe daigremontiana (Butter~ass, 1959). I n den Sehlie~zellen des bleichen Gewebes sind genausoviel Chloroplasten wie in denen des grtinen Gewebes, woraus m a n auf einen gleichen Ploidiegrad in beiden Geweben sehliel~en k a n n (Butterfass, 1963). Das Mesophyl] enth~lt dagegen keine entwiekelten Chloroplasten. I m untersuehten T u m o r p a r e n c h y m fanden sieh stets Chloroplasten; wie bei T u m o r e n yon Kalanchoe diagreraontiana sind sie kleiner als die SchlieBzellehloroplasten des ~ormalgewebes (Hoffmann u. Karsten, 1966). Tnmoren, die aus bleiehem oder aus grfinem Blattgewebe hervorgegangen sind, enthalten sehr i~hnliehe Anzahlen yon Chloroplasten pro Zelle, und zwar mehr als das bleiche u n d weniger als das griine Ausgangsgewebe. Itinsiehtlich der Chloroplastenzahl nehmen die Tumorgewebe somit unabhangig y o n ihrer H e r k u n f t eine intermedi~re Stellung ein. Pigmentgehalt der Gewebe. Wie aus Tabelle 2 hervorgeht, ver~tndert sieh der Pigmentgehalt aller Gewebetypen yon Experiment zu
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Experiment. Diese Sehwankung der absoluten Menge an Pigment pro G r a m m Frisehgewicht wird erkl/trt aus den untersehiedliehen Anzuehtbedingungen bei beiden Experimenten. Bekanntlieh fiihrt untersehiedlieher Liehtgenul~ bei h6heren Pflanzen zu untersehiedlieher Pigmentausriistung (Clauss, 1954). Bei allen untersuehten Geweben ist das Verhgltnis yon Chlorophyll a:Chlorophyll b fast konstant; es nimmt den Wert 2 an (Tabelle 2). Wie zu erwarten, zeigt das griine Gewebe den h6ehsten Gehalt an Chlorophyllen, das bleiehe Gewebe den geringsten. Das Tumorgewebe, das veto griinen Btatt a b s t a m m t , besitzt nur noeh etwa 1/s des Chlorophylls im griinen Muttergewebe. Dagegen enthalten Tumoren der bleiehen B1/~tter eine 6--10mal h6here Menge an Chlorophyllen als das bleiehe Muttergewebe. Transformation zum Tumorgewebe senkt also in griinen B1/~ttern den Chlorophyllgehalt, in bleiehen Bl~ttern derselben Pflanze erh6ht sie ihn auf einen ann/~hernd gleiehen Wert. Bei versehiedenen AuBenbedingungen ist trotz unterschieclliehem absoluten Pigmentgehalt iiberall ein gleieher relativer Gehalt an Chlorophyllen bei den versehiedenen Gewebetypen zu linden (Tabelle 3). Naeh der Tabelle 3 ist ein Tumorgewebe hinsiehtlieh seines Pigmentgehaltes sehr viel ~hnlieher dem anderen Tumorgewebe als dem Normalgewebe, yon dem es abstammt. Tabelle 3. Farbsto]/gehalt der verschiedenen Gewebetypen (ttg/g Frischgewicht) in Prozent des Farbsto/fgehaltes der grignen Blgtter Exp,.
Gewebetyp
Chlorophyll a
Chlorophyll b
grfin Tumor griin bleich Tumor bleich
100 12,6 1,4 8,5
100 11,8 1,3 8,6
grfin Tumor griin bleich Tumor bleich
100 12,1 0,6 6,2
100 12,6 0,6 5,9
Diinnschichtchromatographie. Eine Auftrennung der Petrol/~therextrakte aus den versehiedenen Geweben an impr~gnierten Celluloseplatten (Egger, 1962) zeigt, dab alle 4 Gewebetypen die gleiehen, ffir griine Organe hSherer Pflanzen typisehen Farbstoffkomponenten enthalten, n~mlieh Chlorophylle a, b, Lutein, (Zeaxanthin), Luteinepoxid
Chlorophyllgehalt yon Tumoren
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-9 2 g~m
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