BIOCHIMIE, 1975, 57, 44,5-452,

Problbmes techniques de la rdsonance magndtique nucldaire des acides nucl6iques. A. ])ANCHIN. Instit~t de Biologic Phgsico-Chimique, 13 rue P. et M. Curie - - 75005 Paris.

Summary. - - The application of nuclear magnetic resonance to nucleic acids is discussed here, in terms of the proposed study of their structural, eonformational and dynamic aspects. Relaxation techniques, using for example paramagnetic ions as localised probes, provide information about dynamic behavionr ; high resolution spectroscopy about threedimensional structure, using proton or carbon 13 resonance for the overall study, and phosphorus 31 resonance for the study of phosphate polyribose chain.

P a r m i les mdthodes physiques susceptibles d'etre utilis6es en biologic, c'est c e r t a i n e m e n t la cristallographie aux r a y o n s X qui a d o n n 6 le plus g r a n d h o m b r e de r i s u l t a t s speetaculaires. Cette mdthode, eepend'an,t: a l ' i n c o n v 6 n i e n t de ne consid6rer q u ' u n aspect statique des mol6cules que l'on 6tndie avec, de surcroit, une certaine probabilit6 d ' i n t r o d u i r e des i n t e r a c t i o n s anormales dues ~ la structure du cristal. La r6sonance magn6tique nucl6aire p e r m e t en p r i n c i p e , bien au contraire, d'6tudier les mol6cules en solutio.n et de c o n n a i t r e dans le ddtail les structures et les m o u v e m e n t s locaux. Ce n'est, c e p e n d a n t , q u ' u n p r i n c i p e th6orique car, malheureusement, de n o m b r e u s e s l i m i t a t i o n s interv i e n n e n t essentiellement fi cause de la trbs faible sensibilit~ de cette m6thode (du moths lorsqu'il s'agit d'6tudes structurales). Pour cette raison d'ailleurs ce sont surtout des petites mol6cules (de poids mol6culaire _~ 1000) qui out 6t6 6tudides, et, darts les cas favorables de petites prot6in:es. L'6tude des acides nucl6iques est particul i 6 r e m e n t difilcile, essentiellement ,5 cause de leur trop grande homog6n6it6 structurale (poly phosphates, polyriboses, p o l y a r o m a t i q u e s : p u r i n e s p y r i m i d i n e s ) et elle ne s'est r6v616e fructueuse que tr6s r 6 c e m m e n t apr6s u n certain n o m h r e de tentatives qui u ' o n t p u 6tre c o u r o n n 6 e s de succbs [e. g. 1-5]. Nous sommes donc amen6s h 6tudier dans le d6tail le p h 6 n o m 6 n e de la r 6 s o n a n c e magn6tique afin de d6gager des c o n d i t i o n s th6oriques convenables p o u r p e r m e t t r e une analyse positive de la s t r u c t u r e et de la d y n a m i q u e des acides nucl6iques. Deux grandes lignes seront suivies : d ' u n e part une analyse de la halite rdsolution qui p e r m e t d'6tudier la structure, et d ' a u t r c part, u n e a n a l y s e des p h 6 n o m 4 n e s de relaxation des spins nuel6aires qui p e r m e t d'6tudier la d y n a m i q u e en

pr6sence de sondes locales c o n v e n a b l e s (ions p a r a m a g n 6 t i q u e s p a r exemple). Problbmes de la Haute R~solution : sensibilitY, r61e du c h a n g e m e n t d ' e n v i r o n n e m e n t d'un noyau doud de spin.

L'avantage de la r 6 s o n a n c e magn6tique par r a p p o r t aux autres t e c h n i q u e s physiques est de permettre une e x t r a o r d i n a i r e r,,'soIution : on peut c o n n a i t r e l ' e n v i r o n n e m e n t d ' u n n o y a u dou6 de spin en d i s t i n g u a n t des v a r i a t i o n s de l ' o r d r e de un dix mitli+me de la v a r i a t i o n m a x i m u m possible. Cependant, la sensibilitO de la m6thode est trbs faible, comme nous allons ]e veir. It est possih!e de d o n n e r deux pr6sentations diff6rentes de la r6sonance magn6tique, une prdsentation quantique qui a l'avantage d'etre form e l l e m e n t simple p u i s q u ' i l s'agit s i m p l e m e n t de t r o u v e r les valeurs p r o p r e s d ' o n H a m i l t o n i e n e x p r i m a n t l ' i n t e r a c t i o n d ' u n n o y a u dou6 de spin et d ' u n champ magn6tique, mats qui a l ' i n c o n v b n i e n t de peu p a r l e r ~ r i n t u i t i o n , et une pr,~sentation classique, plus eomplexe du p o i n t de r u e de l'6eriture i n i t i a l e des 6quations mats qui parle l ' i m a g i n a t i o n , p u i s q u e le n o y a u est repr6sent6 comme u n dipole magn6tique m 6 c a n i q u e m e n t coupl6 au c h a m p magn6tique. Presentation rhode.

quantique : sensibilitd

de lu m~-

Lorsque l'on met u n n o y a u dou~ de spin atomique darts u n c h a m p magn6tique, l ' i n t e r a c t i o n est repr6sent6e p a r le H a m i l t o n i e n ,3C= - - ?..H off ~ = gsSnI est le m o m e n t m a g n 6 t i q u e du n o y a u et H le champ magn6tique.

A. Danchin.

446

P o u r u n proton, de spin ~§, cela signifie que la d6g6n6rescence du n i v e a u f o n d a m e n t a l est lev6e p o u r deux 6tats de h o m b r e de spin 4 ~ et 1/~. Darts la d i r e c t i o n d u c h a m p _

_

-

fondamental

~

~

112

~ ÷'~/2

•

o

H

l'dnergie de s~paration est p r o p o r t i o n n e l l e au c h a m p hv = gN~' H. Ce que l'on peut d6tecter, c'est la diff6rence du h o m b r e des spins qui se t r o u v e n t h chaque n i v e a u d'6nergie, cela s'6crit : hv g~H N _ 1~ - - e kT ~ e kT N+1/2 Que vaut cette 6nergie ? P o u r u n c h a m p d6jh assez 61evd de 10 Tcsla on trouve u n e valeur de l ' o r d r e de 10..7 ev, h c o m p a r e r avec l'6nergie therm i q u e qui cst de l ' o r d r e de 0.1 ev h la t e m p 6 r a t u r e ordinaire... Darts ces c o n d i t i o n s (g~H ~ < tions sont pr,esque dgales.

kT) les popula-

N+l/2 = 1 + g~(~H/2kT N_I/2 = 1 - - gi3H/2kT ce qui impliqne que le m o m e n t m a g n 6 t i q u e global v a u d r a Ng-%-°H/4kT (o.u, darts le eas g~n~ral d ' u n spin I, NH g2'8-~I(I .-k 1)). 3 kT Ce m o m e n t est d on.c e x l r ~ m e m e n t petit, ce qui explique la faible sensibilit6 de la m~thode. Pratiquernent il est difficile de faire u n e Oude p o u r des p r o t o n s dont la eo.neentration se.rait inf6rieure 1raM, et encore faut-il utiliser une a c c u m u l a t i o n des donn6es sur u n e ou p l u s i e u r s he~res p o u r avoir suffisamrnent de sign,al. P o u r d'autres n o y a n x , il fant une c o n c e n t r a t i o n encore plus importante. Dans la pratique, il est diffieile de r f a l i s e r des c h a m p s magn6tiques hornogbnes s u r u n volume de l ' o r d r e de 1 cm ~ au-delfi de 100 Tesla. Actuellement, on ne salt pas faire mieu.x que 75-80 Tesla, avee des b o b i n e s s u p r a con duetrices. D'autre part, des c h a m p s plus 61ev6s con.duiraient ~ u n 61argissernent des raies d ' a b s o r p t i o n p a r a u g m e n t a t i o n de la viscositd d u solvant, ce qui est n n e atttre lirnite i m p o r t a n t e . I1 est possible de faire des sondes de d6tection a y a n t le r a p p o r t signal sur b r u i t th6orique. Le b r u i t lirnitant est le b r u i t thermique, qui c o r r e s p o n d A la temp6ratare de la

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sonde, 300°K e n v i r o n . La seule am6lioration techn i q u e que l'on peut esp6rer faire est d'utiliser des sondes h basses temp6ratures (en dessous de .t~'K) en u t i l i s a n t Feffet Josephson, ce qui perrnettrait n n gain th6orique en sensibilit6 de l ' o r d r e de 100 et p,e r m e t t r a i t d ' a t t e i n d r c les c o n c e n t r a t i o n s biologiques (10 aM). Une deuxibme observation s'impose : l'6nergie Zeernan qui s6pare ces deux p o p u l a t i o n s est si faible que la probabilit6 de t r a n s i t i o n radiative est ndgligeable, en cons6quence l ' 6 q n i l i b r e des deux p o p u l a t i o n s dans la solution se fern selo.n u n processus de r e l a x a t i o n qui e x p r i m e la facon dont s ' 6 q u i l i b r e n t les p o p u l a t i o n s en f o n c t i o n de l ' e n v i r o n n e m e n t g6n6ral : c'est ]a r e l a x a t i o n spinr~seau caract6ris6e p a r un temps de r e l a x a t i o n T 1. T 1 i n d i q u e donc l ' o r d r e de g r a n d e u r du temps qu'il taut p o u r que les p o p u l a t i o n s soient h leur valeur d ' 6 q u i l i b r e lorsqne l'on 6tablit ou qne l'on coupe le champ magn6tique. Cette p r 6 s e n t a t i o n q u a n t i q u e p e r m e t de compren~dre facilement la faible sensibilit6. Nous v e r r o n s plus loin u n e d e s c r i p t i o n plus classique et plus intuitive.

-

-

Les ddplacements chimiqaes. Le c h a m p i m p o r t a n t p o u r u n n o y a u d o n n 6 est le c h a m p m a g n 6 t i q u e local; or le n o y a u ne voit le c h a m p impos6 Ho q u ' a u travers des orbitales 61ectroniques qui l ' e n t o u r e n t . I1 subit doric n n effet d ' 6 c r a n caract6ristique de son e n v i r o n n e merit W = ~H o (l-z) On caractGrise alors l e n o y a u p a r son d6placemerit c h i m i q u e 8, p a r r a p p o r t /~ u n e r6fGrence (on choisit souvent u n n o y a u tr6s ¢ 6crant6 >> comrne les p r o t o n s des gro,upes methyle du t e t r a m e t h y l silane (CH3)4Si , ce qui e n t r a i n e qne la p l u p a r t des p r o t o n s a b s o r b e n t de l'6nergie c o r r e s p o n d a n t /~ des champs plus faibles qne le TMS). Exemple : 8 =

H-HTa:S ce qui se mesure en Ho parties p a r m i l l i o n (ppm). P o u r los protons, la largeur m a x i m u m des spectres est de r o r d r e de 30 ppm, g6n6ralement, en fait, de 15 p p m seulement. Quelques d 6 p l a c e m e n t s c h i m i q u e s typiqnes.

aromatiques

~CH2

equatoriaux

I ~a

,

- OH

-CH~

I ,/,

[ fl

~rns i o

Des exceptions existent darts t o u s l e s cas lorsque l ' e n v i r o n n e m e n t est trbs p a r t i c u l i e r .

447

Rdsonance magndtique des acides nucl~iques. Le d 6 p l a c e m e n t c h i m i q u e que nous v e n o u s de d6crire p r o v i e n t des 61ectrons qui entouren~ le noyan. E n fail, l ' i n t e r a c t i o n avec les autres atomes peut fortement distordre cet e n v i r o n n e m e n t , soit par ddlocalisation de certains 61ectrons (c'est par exemple le d@lacement de contact, p r o d u i t sur les ligands d ' u n ion p a r a m a g n 6 t i q u e par la d61ocalisation de son spin 61ectronique [6]), soil p a r un champ magn6tique anisotope p r o d u i t par des atomes riches en 61ectrons (balog~nes p a r exemple), soit enfin p a r les courants 61ectroniques prod uits duns les mol6cules cyeliques. L'exemple le plus fv6quent est celni des mol6cules aromatiq u e s : duns ces moldeules, les 61eclrons, plac6s duns u n c h a m p magn6tique, f o r m e n t usa c o u r a n t a n n u l a i r e et p r o d u i s e n t un fort c h a m p local, tr6s anisotope. I1 s'en suit que les p r o t o n s 6quatoriaux ont leur rate d ' a b s o r p t i o n fortement d6plac6e vers les champs faibles, mats que, au contraire. les p r o t o n s qui se t r o u v e n t duns l'axe du cycle ont leur rate d ' a b s o r p t i o n d6plac6e vers les c h a m p s forts. Par cons6quent, p o u r les acides nucl6iques, on observera deux grandes cat6gories de rates d'abs o r p t i o n : n n ensemble c o r r e s p o n d a n t aux sucres situ6 vers 5 p p m du TMS et u n ensemble corresp o n d a n t aux bases aromatiques situ6 vers 8-10 ppm. D'autre part, les m d t h y l a t i o n s p o u r r o n t 6ventuellement 6tre observ6es "h haut champ, de m~,nle que la s a t u r a t i o n de certains cycles (dihyd r o u r i d i n e par exemple) [5]. Bien sot, il c o n v i e n t de dissoudre ces mol6cules duns D20 afin d'6viter l ' o b s e r v a t i o n de la rate de H20 (vers 5 ppm) dont les p r o t o n s se t r o u v e n t h la c o n c e n t r a t i o n fantastique de 110 M ! Mats t o u s l e s p r o t o n s susceptibles d't'tre dchang6s seront ah)rs invisibles ~7i et seul u n r6sultat global peu intdressant p o u r r a ~tre obtenu, car l ' e n s e m b l e des r6sonances 6taut rotsines, on n ' o b t i e n d r a q u ' u n e enveloppe tr6s large des diffbrentes rates d ' a b s o r p t i o n . Comment peuton am61iorer ce rbsultat ?

Un n o y a u dou6 de spin se comporte comme un petit a i m a n I darts u n c h a m p magn6tique soumis h u n couple vI ^ H ; il va donc t o u r n e r clans ce c h a m p avec u n m o u v e m e n t de pr6cession de fr6quence co = vH si v est le r a p p o r t gyromagndtique du noyau.

~^iH L Y

Que se passe-t-il h l'6tablissement ou fi l'arr~t du c h a m p ? Le m o u v e m e n t magn6tique ~volue en fonction du temps s u i v a n t la lot classique : dM

~ =vM^H dt La magn6tisation "h l'6quilibre est Mo, ce qui permet de r6sondre l'6quation, en i n t r o d u i s a n t le temps de relaxation scion l'axe du champ (T 1) et le temps de r e l a x a t i o n de la composante p e r p e n diculaire (T2). dM x "

dt

Prdsentation classique. Une analyse plus i n t u i t i v e de la situation va nous permettre de r 6 p o n d r e et d ' i n t r o d u i r e la d y n a m i q u e locale duns le syst6me.

Nogaux de spin ½ el fr~quence de Larmor. Pr6cession dans uo champ de t0 Tesla en MH~

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dM~. • dt dM~ dt

TABLEAU I.

~H 13C t~N 31p

~--- o~O My - -

42.577 10.705 - - 4.316 17.235

--

Mx ---To_

toO Mx

M~. T,,

(M. - - Mo) T1

Que se passe-t-il si l'on i n t r o d u i t u n c h a m p s u p p l 6 m e n t a i r e H1, p e r p e n d i c u l a i r e h H 0 et tourn a n t p a r r a p p o r t h H 0 avec une vitesse to ? On peut 6crire des 6quations analogues aux pr6c6dentes, mats il est, cette fois c o m m o d e de les r6soudre dans u n r?f~rentiel tournant dont l'axe OX c o i n c i d e avec H, et Oz est te m6me que le r6f6r e n t i e l fixe.

A. Danchin.

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On r e m a r q u e alors que T~.-1 est la largeur de la raie ~ mi-hauteur. Ce qui d o n n e u n m o y e n

Ho

c o m m o d e d e m e s u r e r T z.

M

z

Y

/ /

Cas de l'~change.

/

Les composantes (u, v, Mz) du m o m e n t magn6tique dans ee r6f6rentiel sont donn6es par les 6quations de Bloch. du

(o)o--o))

-

dt dv . . . . dt dMz --

dt

v--

--

u

T,,

v ( o ) 0 - tO) U + yH1Mz --- - T.2 (Mz - - Mo)

7HlV

T1

Ce qui d o n n e h l ' 6 q u i l i b r e : u~M

0

v ~---Mo M~ = Mo

Si H~ est trop fort, ou T 1 trop long, la raie s'61argit c o n s i d 6 r a b l e m e n t et d i m i n u e d'intensit6. Or T~ repr6sente la r e l a x a t i o n due au c h a n g e m e n t d ' e n v i r o n n e m e n t m o y e n d ' u n spin, p a r r a p p o r t au r6seau. T 1 est s e n s i b l e m e n t i n v e r s e m e n t p r o p o r t i o n n e l a u temps m o y e n de rotation de ce noyau. P o u r u n n o y a u r i g i d e m e n t li6 h une mol6cule, ce temps varie comme le cube du r a y o n de la mol6cule. I1 s'en suit que T 1 augmente trbs rite. On ne peut donc esp6rer 6tudier les aeides nucl6iques que dens le cas de petites mol6cules (RNA de transfert) ou de molecules e x t r b m e m e n t flexibles (Poly U, Poly A a l c a l i n ou h haute temp6rature).

Les 6quations de Bloch nous ont p e r m i s d'analyser b r i 6 v e m e n t la forme de la raie d ' a b s o r p t i o n (T2) et Ie r61e de la d y n a m i q u e locale (T 0 dens l ' o b s e r v a t i o n du spectre. Que se passe-t-il m a i n t e n a n t si l'on consid6re u n n o y a u qui change d ' e n v i r o n n e m e n t avec u n e certaine p r o b a b i l i t 6 de t r a n sition 9 Si l'~change entre deux positions correspond a n t aux fr6quences o)~, et O~B est tr6s lent, il est clair que l'on observera deux raies distinctes et de la forme habituelle. Supposons m a i u t e n a n t que la p r o b a b i l i t 6 de t r a n s i t i o n de A vers B et de B vers A est p. On peut 6crire p o u r A et B des 6quations de Bloch, en t e n a n t compte du fait que les m o m e n t s magn6tiques locaux fi ci~aque i n s t a n t sont pond6r6s par la p r o b a b i l i t 6 de t r a n s i t i o n : dM~

~H1T22 (o)0 - - o))

dt

1 + T.22 ( o ) O - o))2 + 72H12TIT2

1 + T.22 ( o ) O - (.0)2 ~t- y2HI2T1T2

Si t'on fair v a r i e r le mou.vement de pr6cession de H1, on voit q u ' a u voisinage de o)0 la composante v p r o d u i t , selon 1'axe z u n t o r s e u r dont la composante n'est pas nulle, vH, ce qui e n t r a i n e une a b s o r p t i o n d'6nergie. I1 s'agit donc d ' u n m o y e n simple de d6tecter la p o s i t i o n d ' u n e a b s o r p t i o n : on balaie h l'aide d ' u n champ H l u n e zone de fr6quences voisines de celle qui corresp o n d au champ M0. Si H~ n'est pas trop dlev6 (ou plut6t si 72HlZT1T2 est petit) l ' a b s o r p t i o n se proT2 d u i r a s u i v a n t u n e loi du type 1 -f- ]'22 ((0 - - 0)0)2 qui repr6sente la forme de la raie d ' a b s o r p t i o n . BIOCHIMIE, 1975, 57, n ° 4.

p (M~

+

Ms)

--

p (MA +

Ms)

dMz

YH1T2 1 + T22 ( o ) o - ¢°)'2 + "t'°H12T1T2 1 + T22 (o)o--- 0))2

--

dt

La composante v, dans le r6f~rentiel t o u r n a n t , d o n n e la forme de la raie d ' a b s o r p t i o n V

P (o)A - -

½ 7H1Mo (O) - avec

-o) - -

O)A )2 (¢0 - -

°~B) 2

O)B) 2 ~-

4p2 (¢0 - - ~)2

O)A ~- °)]3

2 La forme des raies d'absorptio,n d6pend fortem e n t d.u r a p p o r t entre p e t 0)A - - °~B ~ Ao). Echange lent : Lorsque p est petit, on observe deux lignes b i e n s6par6es a y a n t la forme simplifi6e (pour o) ~ o)a) v = ½ vH1Mo

P to)-

o)A)2 + p~

Rdsonance magndtiqtte des acides nucldiques. Ce qui repr6sente une ligne l o r e n t z i e n n e de largeur 1 / T 2 = p, p a r cons6quent 61argie p a r l'6change, avec de s u r c r o l t u n 16get d 6 p l a c e m e n t 2pZ vers la ligue B de l ' o r d r e de - - . Les deux raies sont sym~triques p a r r a p p o r t h et s 6 p a r & s p a r la valeur ~/'A¢o-° - - 8.p2. Dans l'6change Ient, la forme de la rate p e r m e t donc d'6valuer l ' o r d r e de g r a n d e u r du temps de r6sidence du p r o t o n darts u n e n v i r o n n e m e n t chimique donn6.

Echange rapide : lorsque p eroit, les rates s'61argissent. Leurs m a x i m a sont sym6triques p a r r a p p o r t h ~- et s6par6es de ~ / ~ --- 8p2. Lorsque p croit, ces m a x i m a se r a p p r o c h e n t et sont confondus, en ~o lorsque ho) = p / 2 V 2 : on observe alors u ne seule rate tr6s large. Au-delh de eette valeur, le m a x i m u m est situ6 en ¢0 mats la l a r g e u r de la rate d i m i n u e : on dit que la rate est r~trdcie Ao)2 par l'&hange et 1/T2 ---ce qui, en cas 8p d'6ehauge tr~s r a p i d e d o n n e u n e rate trbs 6troite. Nous avons v u que tes liaisons h y d r o g 6 n e qui t o r m e n t les paires de bases W a t s o n - C r i c k des acides nucl6iqttes sont 6changeables, p u i s q u ' o n n ' o b s e r v e a u e u n e r 6 s o n a n c e de ces p r o t o n s dans DeO. On peut 6valu'er que leur r6sonance d e v r a i t se situer h des c h a m p s assez bas (~ plus de 5 p p m de la r6sonance des p r o t o n s de l'eau). Mats cela suppose u n 6change assez lent, comme nous v e n o n s de le voir. P o u r u n c h a m p correspond,ant h 300 MHz p o u r le p r o t o n , u n e distance de 5 p p m c o r r e s p o n d 1500 Hz ; il taut donc que la p r o b a b i l i t 6 d'6change soit i n f 6 r i e u r e ~ 50'0 Hz e n v i r o n p o u r que t'ou puisse esp6rer o,bserver ces protons. Or, u n temps d'6change de ce type ne p a r a i t pas a b s u r d e p o u r de teltes tiaisons h y d r o g b n e . Ce qui fait que l'exp6r i e n c e est tout ~ fait envisageable. I1 taut cepend a n t u n c h a m p e x t r 6 m e m e n t homog6ne, faute de quoi la rate d ' a b s o r p t i o n de H20 (h 110 m o l a i r e !) 61argie p a r l'inhomog6n6it6, e n v a b i r a i t tout le spectre ! En 1971, Kearns et coll. ,~7q o.nt en effet, m o n t r 6 q u ' o n est en mesure d'observer, dans H.,O u n spectre du RNA de transfert r e m a r q u a b l e m e n t r6solu h bas c h a m p par r a p p o r t h HeO. Une premi6re dtude du t-RNAehe de la levure suggbre que l'on observe bien les p r o t o n s engag6s duns les liaisons h y d r o g 6 n e s N-H des n o y a n x aromatiques. On pent c o m p t e r ces protons, et on trouve 23 _+_ 3, ce qui c o r r e s p o n d au n o m b r e des paires de base du mod6Ie en feuille de tr6fle [8] d u RNA de transfert.

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Une 6tude plus d~taill6e de plusieurs RNA de t r a n s f e r t m o u t r e de la m~me m a n i b r e la validit6 du mod61e en feuille de tr6fle. Mats de n o u v e a u x rdsultats ont aussi 6t6 obtenus : d ' u n e part, il est p r o b a b l e que le bras qui e o n t i e n t l'aeide amin6 et le bras de la boucle GTmC t o r m e n t une double h61iee contit~ue ; d ' a u t r e part, le bras de la boucle d i h y d r o n r i d i n e et te bras de l ' a n t i c o d o n t o r m e n t deux h61iees d'axes parallbles et peut-6tre m~me s e n s i b l e m e n t confondus. L ' a n a l y s e des r6sultats en f o n c t i o n de la t e m p 6 r a t u r e m o n t r e de plus que ees deux derni~res h61iees se m e u v e n t l ' u n e par r a p p o r t h l ' a u t r e avee p r o b a b l e m e n t plusieurs 6tats stables possibles. Enfin, la fragilit6 des paires de base an voisinage des boucles e n t r a l n e l e u r fusion prdeoee [9-HI. 1,a largeur des rates ( e n v i r o n 50Hz h 300 Hz) d o n n e une id4e du temps d'dchange (de l ' o r d r e de 0,02 s) ee qui est effeetiv e m e n t u n 5ehange lent. L ' a n a l y s e fine de leur p o s i t i o n est assez bien correl6e avee le cale ul th6orique que l'on pent faire h p a r t i r de la structure e o n n u e de ees RNA de transfert. I1 est done p r o b a b l e que eette m6thode e o n t i n u e r a h d o n n e r des r e n s e i g n e m e n t s int6ressants sur les t-RNA, en p a r t i e u l i e r si l'on 6tudie des mol6eules qui ne diff6rent q u ' e n u n petit h o m b r e de p o i n t s (par exemple, le tRNAT~p de colt et le m u t a n t SUt~GA qui en diff6re p a r u n e m u t a t i o n ponetuelle). En ee qui c o n e e r n e de plus grosses molecules, on ne peut esp~rer o b t e n i r un spectre r~solu que p o u r des mol6eules de faille pas trop i m p o r t a n t e eomme le RNA 5S. W o n g et coll. [12] out m o n t r 6 qu'il sera possible d'~tablir avec u n e relative certitude le type de s t r u c t u r e s e e o n d a i r e du RNA 5S grace h son spectre RMN dans H,,O, de la m6me m a n i 6 r e que p o u r le t-RNA. Cependant, eomme eette mot6eule est s e n s i b l e m e u t plus grosse, I%iude en sera plus longue. Enfin, u n e 6tude pr61iminaire [13] du t-RNA p a r r6sonance du p h o s p h o r e p e r m e t d'esp6rer o b t e n i r des r6sultats directs sur la e h a l n e ribosephosphates.

Techniques de Relaxation. Ce qu'il i m p o r t e de c o n n a i t r e , dans u n e structure mol6culaire, n'est pas s e u l e m e n t l'architeeture, mats la d y n a m i q u e , locale et globale. Les acides nucldiques sont des polyphosphates, ils interagissent, par cons6quent, avec des cations, le m a g n d s i u m en p a r t i c u l i e r . I1 est alors possible d ' u t i l i s e r des analogues du m a g n 6 s i u m comme sondes locales p a r a m a g n 6 l i q u e s et d'~tudier leurs sites de fixation ainsi que les m o u v e m e n l s ]oeaux. Le choix d ' u n ion p a r a m a g n 6 t i q u e p e r m e t d'6ttldier les sites p a r la m6thode de s t i m u l a t i o n de la 32

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r e l a x a t i o n nucI6aire [14, I;5]. L'effet de spins 61ect r o n i q u e s n o n appari6s sur des s p i n s nucl6aires se manifeste p a r u n c h a n g e m e n t des temps de r e l a x a t i o n T~ et T2 de ces spins. Ce c h a n g e m e n t reflbte, sous certaines conditions, la d y n a m i q u e locale. Dans ce eas, il est done c o m m o d e d'6tudier le co.mportement des mol~oules d'eau au voisinage d ' u n ion p a r a m a g n 6 t i q u e en pr6sence et en absence de l'acide n u c l 6 i q u e que l'on On die. Cornme il ne s'agil cette fois que de l'eau, (dent les p r o t o n s se t r o u v e n t h 110 Mo/aire) le problbme de la sensibilit~ ne se pose plus ce qui p e r m e t de t r a v a i l l e r dans des c o n d i t i o n s de d i l u t i o n p r o c h e des c o n d i t i o n s biologiques.

oJi) ; zc et ~ enfin, s e n t les temps de c o r r e l a t i o n dipolaire et scalaire, qui i n d i q u e n t la > T~ ~ ":s ~ za domine Tu mats pas T l Th = ~hc e ]~/RT ddcroit avec T

Zr ~ =h domine TI, pas T2, suit comme ci-dessus Mn une lot en ~I/T

(H-20)6 St 100oC

zh ~ ~r ne domine pas

Proton hydroxyle mdthanol en prdsence de cobalt fi h a u t e tempdrature R N A - t h 100oC

ne domine pas

RNA4 h h a u t e frdquence ( > 30 MHz) e t ~ tempdrature ambiante

obtient avec des polym~res [16]. C e p e n d a n t , l'observation de deux points d'atiachemenl h basse tempdrature laisse penser qu'il pourrait s ' a g i r d ' u n p o n t a g e e n t r e les c h a i n e s r i b o s e - p h o s p h a t c d e s b r i n s c o m p l d m e n t a i r e s , d ' a u t a n t q u e le n o m b r e d e ces s i t e s est s e m b l a b l e h c e l u i d e s p a i r e s d e b a s e s u r le m o d b l e e n f e u i l l e d e trbfle. I1 p o u r r a i t s ' a g i r lh d ' u n p h d n o m ~ n e i m p o r t a n t p e r m e l t a n t la r e c o n n a i s s a n c e d e s d q u e n c e s d a n s d e s f r a g m e n t s e n d o u b l e h61ice ; le p e t i t s i l l o n est d a n s ce c a s d i m i n u d , ce q u i a u g m e n t e l ' a c c e s s i b i l i t 6 d u g r a n d s i l l o n et p e r m e t u n e d v e n t u e l l e r e connaissance.

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U n e e x p b r i e n c e t e n d fi c o n f i r m e r ce r d s u l t a t [21, 2 2 ] : si l ' o n a s s o c i e d e m a n i 6 r e c o v a l e n t e u n c a t i o n (Co III) a u t-RNA, o n o b s e r v e d e u x c l a s s e s d e s i t e s et la f u s i o n d u R N A ( o u d u DNA) est t e l l e q u e l ' o n est e n d r o i t d e p e n s e r q u ' i l y a d a n s ce c a s u n p o n t a g e e n t r e les b r i n s c o m p l 6 m e n t a i r e s . En conclusion, nous pouvons remarquer que la t e c h u i q u e d~e la r 6 s o n a n c e m a g n b t i q u e a p p l i q u 6 e a u x a c i d e s nucldiqLles est p a r t i c u l i 6 r e m e n t ddlie a t e m a i s q u ' e l l e a p e r m i s , grfice h s o n u t i l i s a t i o n darts d e s c o n d i t i o n s t r 6 s s p 6 c i a l e s , d ' o b t e n i r d e s r 6 s u l t a t s p o s i t i f s . I1 est p e r m i s d ' e s p d r . e r q u e l a t m u t e rbsolutio.n, e n p r b s e n c e d ' e s p b c e s m o l 6 e u l a i r e s v o i s i n e s , ou d e n o u v e a u x n o y a u x (31p,13C) d o n n e r o n t les r b s u l t a t s q u e l ' o n est e n d r o i t d'attendre d'une technique aussi sensible aux c o n f o r m a t i o n s m o l 6 c u l a i r e s . C o m b i n 6 e fi d e s m 6 r h o d e s i n e r r a n t e n jet~ d e s i o n s p a r a m a g n 6 t i q u e s covaleHts (chrome III par exemple) cetle lechn i q u e d.evrait p e r m e t t r e d e c o m p r e n d r e quelles s o n t les fo,rc.es q u i m a i n t i e n n e n t u n e s t r u c t u r e aussi complexe que celle des RNA de transfert a i n s i q u e la d y n a m i q u e d e ces m o l 6 c u l e s q u i interagissent avec tant de prot6ines diff6rentes a u c o u r s d e la s y n t h 6 s e d e s p r o t 6 i n e s .

Les applications de la rfisonance m a g n 6 t i q n e n u clgaire aux acides nucldiques sont discutdes iei en f o n c t i o n de l'dtude envisag~e, ~tude s t r u e t u r a l e et conf o r m a t i o n n e l l e , et ~tude d y n a m i q u e . Les t e c h n i q u e s de relaxation, n t i l i s a n t p a r exemple des ions p a r a m a gnAtiques co.mine sondes locales, r e n s e i g n e n t s u r la d y n a m i q u e locale ; les techniques de h a u t e r~solution r e n s e i g n e n t sur la s t r u c t u r e t r i d i m e n s i o n n e l l e : rfison-

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nance des protons ou du carbone 13 p o u r l'fitude globale, rfisonance du p h o s p h o r e 31 p o u r l'~tude de la c h a l n e polyrib,ose phosphate. BIBLIOGRAPHIE. 1. McTagere, J. P., Ross, V. & Gibbs, J. H. (1964) Biopolymers, 2, 163-184. 2. McDonald, C. C., Phillips, W. D. & P e n m a n , S. (1964) Science, 144, 1234-1238. 3. McDonald, C. C., Phillips, XV. D. & Penswick, J. (1965) Biopolymers, 3, 609. 4. McDonald, C. C., Phillips, W. D. a Lazar, J. (1967) J.A.C.S., 8'9, 4166. 5. Smith, I. C. P., Yamane, T. & S h u l m a n n , R. G. (1969) Can. J. Biochemistry, 47, 480-484. 6. Kowalsky, A. (1962) J. Biol. Chem., 237, 1807. 7. Kearns,, D. R., Patel, D. J. & S h u l m a n , R. G. (1971) Nature, 229, 338-339. 8. Holley, R. W., Apgar, J., Everett, G. A., Madison, J. T., Marquisee, M., Merrill, S. M., Penswick, J. R. & Zamir, A. (1965) Science, 147, 1462. 9. Wong, Y. P., Kearns, D. R., S h u l m a n , R. G., Yamane, T., Chang, S., C h i r i k j i a n , J. R. ~ Fresco (1973) J. MoL Biol., 74, 403-406. 10. S h u l m a n , R. G., Hilbers, C. W., Kearns, D. R., Reid, B. R. & ~¢-ong, Y. P. (1973) J. MoL Biol., 78, 57-69. 11. Light foot, D. R., Lira Wong, K., Kearns, D. R., Reid, B. R. & Shltlman, R. G. (1973) J. MoI. Biol., 78, 71-89. 12. Wong, Y. P., Kearns, D. R., Reid, B. R. & S h u l m a n , R. G. (1972) J. Mol. Biol., 72, 741-749. 13. Gu~ron, M. (19'71) FEBS Letters, 19, 264-266. 14. Cohn, M., Leigh, J. S. (1962) Nature, 193, 1037. 15. Eisinger, J., S h u l m a n , R. G., Szymanski, J. M. (1962) J. Chem. Phys., 36, 1721. 16. Eisinger, J., F a w a z - E s t r u p , F., S h u l m a n , R. G. (1965) J. Chem. Phys., 42, 43. 17. Cohn, M., Danchin, A. a Grunberg-Manago, M. (1969.) J. Mol. Biol., 39, 199-217. 18. Danchin, A. & Gu6ron, M. (1970) J. Chem. Phys., 53, 3599-3609. 19. Danchin, A. & Gugron, M. (1970) Enr. J. Biochem., 1~, 532-536. 0. Danchin, A. (1972) Biopolymers, 11, 1317-1333. 1. Danchin, A. (1971) C. R. Acad. Sci., 273D, 1636-1639. 22. Danchin, A. (1973) Biochimie, 55, 17-27.