Planta (Berl.) 96, 326--338 (1971) 9 by Springer-Verlag 1971
Charakterisierung der Microbodies aus Spadix-Appendices yon Arum maculatum L. und Sauromatum guttatum Schott CItI~ISTEL IBERGER u n d BERNT GERHARDT Lehrstuhl f/ir Zellenlehre der Universitgt Heidelberg und Botanisches Institut der Universit~t K61n Eingegangen am 30. Oktober 1970 Studies on Microbodies i n Spadix Appendices of A r u m maculatum L. a n d Sauromatum guttatum Schott Summary. When the sections of the spadix appendix of Arum are incubated in a medium containing diaminobenzidine and HeO2, only the membrane of microbodies is stained. On the other hand, microbodies of Sauromatum show a stained matrix as usual. Catalase-containing cell organelles isolated from spadix appendices of Arum show the same typical membrane staining as the microbodies in situ do. Thus the identity of these organelles with mierobodies seems to be proved. After anthesis the microbodies in situ usually do not give a positive reaction for catalase with diaminobenzidine and H~02. However, cytochemical and biochemical tests for catalase on microbodies isolated during this stage of development clearly demonstrate the presence of this enzyme. Uricase is localized in the microbodies of Arum as well as catalase. No malate dehydrogenase, peroxidase, and allantoinase could be found in the microbodies. Before anthesis the microbodies of spadix appendices of Arum have an equilibrium density in aqueous sucrose of 1.22 gem-3. After anthesis the density changes into 1.23 to 1.24 gem-3.
I n der g i n d e der Spadix-Appendices y o n A r u m maculatum u n d Sauromatum guttatum t r e t e n w~thrend der g e s a m t e n E n t w i c k l u n g aber besonders zahlreich n a c h dem Bltihen Microbodies auf (Berger u n d Sehnepf, 1970). Das nach der Anthese geh/iufte, zeitlich begrenzte AuL t r e t e n der Microbodies bietet einen A n s a t z p u n k t , diese Zellorganellen n/~her zu analysieren. IrL dieser Arbeit soll fiber die I d e n t i t g t der elektronenmikroskopisch in situ nachweisbaren Microbodies m i t den isolier~en, K a t a l a s c e n t h a l t e n d e n Zellorganellen sowie fiber einige biochemische Charakteristika der Mierobodies berichtet werden.
Methodik Spadix-Appendices der Araceen A+'um maculatum L. (Freilandmaterial verschiedener Standorte) und Sauromatum guttatum Schott (Anzucht als Fensterknltur) dienten als Versuchsmaterial.
Microbodies aus Spadix-Appendices
327
Cytochemische Untersuchung yon Gewebeschnitten. Tierische (u. a. Novikoff und Goldfischer, 1968; Fahimi, 1968) und pflanzliche Microbodies (Frederick und Newcomb, 1969; Vigil, 1969, 1970) geben nach einer cytochemischen Reaktion mit 3,3-Diaminobenzidin (DAB)~-I{202 und Nachbehandlung mit OsOt ein elektronendichtes Reaktionsprodukt, das durch die peroxidatische Wirkung der in den Microbodies ]okalisierten Katalase entsteht. Querschnitte der Spadix-Appendices wurden in 2% GlutarMdehyd in 50 mM Phosphatpuffer pit 7,3 vorfixiert, grfindlich gewaschen und darn 45--90 min mit einem Reaktionsgemisch ~us 0,05% DAB-}-0,05% H20 ~ in 50mM .Phosphatpuffer pHT,3 inkubiert. AnschlieBend wurden die Schnitte mehrmals mit Puffer gewaschen (30 rain), mit gepufferter 1% OsO4 nachfixiert und in Epon oder ArMdit eingebettet. Die elektronenmikroskopische Untersuchung der nicht nachkontrastierten Schnitte erfolgte an einem Elmiskop IA (Siemens) und beschr~nkte sich auf die I~indenzone. Ffir die Kontrollen wurden einerseits Gewebesehnitte in gepufferter GlutaraldehydlSsung (2 %) vorfixiert, gewaschen und mit 1% OsO4 nachfixiert; andererseits wurde die Katalase mit 0,2 IV[3-Amino- 1,2,4,-triazol gehemmt (Margoliash et al., 1960; Fahimi, 1968; Frederick und Newcomb, 1969; Vigil, 1969, 1970). lsolierung der Microbodies. Die Microbodies wurden ausschlieglich aus dem Rindengewebe der Spadix-Appendices isoliert, ttomogenisationsmedium, Differential- und Gradientenzentrifugation zur Isolierung der Microbodies sind bei Gerhardt und Beevers (1970) beschrieben. Cytochemische Untersuchung isolierter Microbodies. Arum: Die vereinigten zwei oder drei Fraktionen eines Saccharosegradienten mit hSehster Katalaseaktivitiit wurden zur Vorfixierung der Zellorganellen mit einer so eingestellten L6sung Glutaraldehyd in Saccharose versetzt, dag eine Endkonzentration yon 3% Glut~rMdehyd in 45% Saccharose (d = 1,20 gem-a) erreieht wurde. AnschlieBend wurden die Partikel bei 330000 • g auszentrifugiert. Die Reaktion mit DAB/H20 e auf Katalase wurde wie bei den Gewebeschnitten durchgefiihrt, doch enthielten Mle L6sungen 40% Sacch~rose (d = 1,18 gem-8). Auch die Waschvorg~nge und die Fixierung mit 0,5% 0s04 erfolgten mit 40% Saecharose. Danach wurde mit 25% und 10% Saccharose und schlieBlich mit Wasser gewaschen. Es folgten kontinuierliche Entwi~sserung (Sitte, 1962) und Einbettung in Vestopal. Die Kontrollen wurden unter Auslassung der Inkubation mit DAB/H20 e in gleicher Weise behandelt. Sauromatum: Die isolierten )/licrobodies wurden mit 0,5 % OsQ in 48 % Saccharose (d = 1,22 gcm-3) fixiert. Enzymbe~timmungen. Alle Enzymbestimmungenerfolgten nach optischen Tests. KatMase wurde mit geringfiigigen Abi~nderungen nach der Methode yon Lfick (1965) bestimmt unter Zugrundelegung des Extinktionskoeffizienten 6,7 • 10* cm2/Mol fiir I-I~O2 (Naehly and Chance, 1954). Die Bestimmung der Succinatdehydrogenase erfolgte nach Hiatt (1961) unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten 1,56 • 10~cm2/Mol fiir Dichlorphenolindophenol (Seubert, 1965). MMatdehydrogenase (MDH), Uricase und Peroxidase wurden nach Vorschriften der Firma Boehringer (Mannheim) bestimmt, Allantoinase nach Vogels et M. (1966) unter Zusatz yon 5 • 10-3M MnC12. Protein wurde nach einer Modifikation der Lowry-Methode bestimmt (Gerhardt und Beevers, 1968). Die Dichtebestimmung der Saccharosekonzentrationen geschah fiber den Brechungsindex.
Ergebnisse
Microboclies in situ Die cytochemische Nachweisreaktion m i t DAB/H20~ auf K a t a l a s e a n Gewebeschnitten aus der R i n d e der Spadix-Appendices y o n Sauro-
328
C. Berger und B. Gerhardt: Microbodies aus Spadix-Appendices
mature guttatum fiihrt zu ciner kr/~ftigen ,,F/~rbung" der Microbodies (Abb. 2, 3); die kontrastierte Matrix der Organellen erscheint deutlieh grobk6rniger als in den unbehandelten Kontrollen (Abb. 4). I m Gegensatz zum Ergebnis der vollst/~ndig ,,gefgrbten" Mierobodies yon Santomature stehen die Befunde an A r u m maculatum. Bei A r u m wird nur die Membran der Mierobodies kontrastiert - - oft aueh der Bereich zwischen den Microbodies und dem umgebendert glatten Endoplasmatischen Reticulum (ER) - - , w~hrend in der Matrix keine Ablagerung des elektronendiehten l~eaktionsprodnktes zu beobachten ist (Abb. 1, 5; Kontrolle: Abb. 7). I n Gewebeschnitten der Appendices verblfihter Pflanzen yon A r u m und Sauromatum zeigen die Microbodies eine wesentlich schw/~chere Reaktion mit DAB/HeO 2 als in denen yon Pflanzen vor dem Blfihen. Werden Gewebesehnitte der Appendices yon Ar't~m mit dem spezifischen Katalasehemmstoff Aminotriazol behandelt, tritt naeh der Reaktion auf Katalase gelegentlieh eine sehwaehe, meist jedoeh keine ,,F~rbung" der Membran der Microbodies auI (Abb. 6). Trotz der Katalasehemmung sind aber im Gewebe noch Sehwgrzungen zu beobaehten: Dietyosomen (Abb. 8) sowie die Mittellamellen der Zellw/~nde, vor allem im Bereich der GefiiBbfindel und in der N/~he yon Intercellularen (Abb. 6), sind deutlich kontrastiert. Isolierte Microbodies Abb. 9 gibt die Anftrennung einer groben Partikelfraktion aus Spadix-Appendiees yon A r u m am linearen Saccharose-Gradienten wieder. Die Lage der Katalase enthaltenden Zellorganellen am Gradienten ist durch das Verteilungsprofil des Enzyms gegeben. Fiir die elektronenmikroskopisehen Untersuehungen wurden aus den Fraktionen mit der hSchsten Katalaseaktivit~t die Partikel auszentrifugiert (s. Methodik). Sie zeigen mit ihrer einfachen Membran und der feinkSrnigen Matrix die gleichen Charakteristika wie die Microbodies des Gewebes (Abb. 10). Bei der Isolierung wird aber die enge Beziehung der Microbodies zum E R (Berger und Schnepf, 1970) gel6st. Auch bei Sauromatum zerfallen die wesentlich ausgepr~gteren Komplexe yon Et~ und Mierobodies bei der
Abb. 1. Arum, kurz vor der Anthese. Katalase-Reaktion mit DAB/H~O2. Vergr. 30000 • Abb. 2. Sauromatum, eine Woche vor der Anthese. Katalase-Reaktion mit DAB/H202. Vergr. 30000 x Abb. 3. Sauromatum, eine Woche vor der Anthese. Katalase-Reaktion mit DAB/It20e. Vergr. 32000 • Abb. 4. Sauromatum, bltihend, Kontrolle. * : Microbody. Vergr. 28000 X
Abb. 1--4. l~[icrobodies in gindenzelten der Spadix-Appendices. Glutaraldehyd-- 0sO~. Nicht n~chkontrastiert.
Fixierung:
330
C. Berger und B. Gerherdf~:
A b b 5--8. Arum. Rindenzellen aus dem Spadix-Appendix kurz vor der Anthese. Fixierung: Glutaraldehyd - - O s Q . Nicht nachkontrastierg. * = Mierobody
Microbodies aus Spadix-Appendices
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1.187 g c m -3 - 1.49 300-
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- 1.47
123 - 1.45
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Charakterisierung der Microbodies aus Spadix-Appendices yon Arum maculatum L. und Sauromatum guttatum Schott CItI~ISTEL IBERGER u n d BERNT GERHARDT Lehrstuhl f/ir Zellenlehre der Universitgt Heidelberg und Botanisches Institut der Universit~t K61n Eingegangen am 30. Oktober 1970 Studies on Microbodies i n Spadix Appendices of A r u m maculatum L. a n d Sauromatum guttatum Schott Summary. When the sections of the spadix appendix of Arum are incubated in a medium containing diaminobenzidine and HeO2, only the membrane of microbodies is stained. On the other hand, microbodies of Sauromatum show a stained matrix as usual. Catalase-containing cell organelles isolated from spadix appendices of Arum show the same typical membrane staining as the microbodies in situ do. Thus the identity of these organelles with mierobodies seems to be proved. After anthesis the microbodies in situ usually do not give a positive reaction for catalase with diaminobenzidine and H~02. However, cytochemical and biochemical tests for catalase on microbodies isolated during this stage of development clearly demonstrate the presence of this enzyme. Uricase is localized in the microbodies of Arum as well as catalase. No malate dehydrogenase, peroxidase, and allantoinase could be found in the microbodies. Before anthesis the microbodies of spadix appendices of Arum have an equilibrium density in aqueous sucrose of 1.22 gem-3. After anthesis the density changes into 1.23 to 1.24 gem-3.
I n der g i n d e der Spadix-Appendices y o n A r u m maculatum u n d Sauromatum guttatum t r e t e n w~thrend der g e s a m t e n E n t w i c k l u n g aber besonders zahlreich n a c h dem Bltihen Microbodies auf (Berger u n d Sehnepf, 1970). Das nach der Anthese geh/iufte, zeitlich begrenzte AuL t r e t e n der Microbodies bietet einen A n s a t z p u n k t , diese Zellorganellen n/~her zu analysieren. IrL dieser Arbeit soll fiber die I d e n t i t g t der elektronenmikroskopisch in situ nachweisbaren Microbodies m i t den isolier~en, K a t a l a s c e n t h a l t e n d e n Zellorganellen sowie fiber einige biochemische Charakteristika der Mierobodies berichtet werden.
Methodik Spadix-Appendices der Araceen A+'um maculatum L. (Freilandmaterial verschiedener Standorte) und Sauromatum guttatum Schott (Anzucht als Fensterknltur) dienten als Versuchsmaterial.
Microbodies aus Spadix-Appendices
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Cytochemische Untersuchung yon Gewebeschnitten. Tierische (u. a. Novikoff und Goldfischer, 1968; Fahimi, 1968) und pflanzliche Microbodies (Frederick und Newcomb, 1969; Vigil, 1969, 1970) geben nach einer cytochemischen Reaktion mit 3,3-Diaminobenzidin (DAB)~-I{202 und Nachbehandlung mit OsOt ein elektronendichtes Reaktionsprodukt, das durch die peroxidatische Wirkung der in den Microbodies ]okalisierten Katalase entsteht. Querschnitte der Spadix-Appendices wurden in 2% GlutarMdehyd in 50 mM Phosphatpuffer pit 7,3 vorfixiert, grfindlich gewaschen und darn 45--90 min mit einem Reaktionsgemisch ~us 0,05% DAB-}-0,05% H20 ~ in 50mM .Phosphatpuffer pHT,3 inkubiert. AnschlieBend wurden die Schnitte mehrmals mit Puffer gewaschen (30 rain), mit gepufferter 1% OsO4 nachfixiert und in Epon oder ArMdit eingebettet. Die elektronenmikroskopische Untersuchung der nicht nachkontrastierten Schnitte erfolgte an einem Elmiskop IA (Siemens) und beschr~nkte sich auf die I~indenzone. Ffir die Kontrollen wurden einerseits Gewebesehnitte in gepufferter GlutaraldehydlSsung (2 %) vorfixiert, gewaschen und mit 1% OsO4 nachfixiert; andererseits wurde die Katalase mit 0,2 IV[3-Amino- 1,2,4,-triazol gehemmt (Margoliash et al., 1960; Fahimi, 1968; Frederick und Newcomb, 1969; Vigil, 1969, 1970). lsolierung der Microbodies. Die Microbodies wurden ausschlieglich aus dem Rindengewebe der Spadix-Appendices isoliert, ttomogenisationsmedium, Differential- und Gradientenzentrifugation zur Isolierung der Microbodies sind bei Gerhardt und Beevers (1970) beschrieben. Cytochemische Untersuchung isolierter Microbodies. Arum: Die vereinigten zwei oder drei Fraktionen eines Saccharosegradienten mit hSehster Katalaseaktivitiit wurden zur Vorfixierung der Zellorganellen mit einer so eingestellten L6sung Glutaraldehyd in Saccharose versetzt, dag eine Endkonzentration yon 3% Glut~rMdehyd in 45% Saccharose (d = 1,20 gem-a) erreieht wurde. AnschlieBend wurden die Partikel bei 330000 • g auszentrifugiert. Die Reaktion mit DAB/H20 e auf Katalase wurde wie bei den Gewebeschnitten durchgefiihrt, doch enthielten Mle L6sungen 40% Sacch~rose (d = 1,18 gem-8). Auch die Waschvorg~nge und die Fixierung mit 0,5% 0s04 erfolgten mit 40% Saecharose. Danach wurde mit 25% und 10% Saccharose und schlieBlich mit Wasser gewaschen. Es folgten kontinuierliche Entwi~sserung (Sitte, 1962) und Einbettung in Vestopal. Die Kontrollen wurden unter Auslassung der Inkubation mit DAB/H20 e in gleicher Weise behandelt. Sauromatum: Die isolierten )/licrobodies wurden mit 0,5 % OsQ in 48 % Saccharose (d = 1,22 gcm-3) fixiert. Enzymbe~timmungen. Alle Enzymbestimmungenerfolgten nach optischen Tests. KatMase wurde mit geringfiigigen Abi~nderungen nach der Methode yon Lfick (1965) bestimmt unter Zugrundelegung des Extinktionskoeffizienten 6,7 • 10* cm2/Mol fiir I-I~O2 (Naehly and Chance, 1954). Die Bestimmung der Succinatdehydrogenase erfolgte nach Hiatt (1961) unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten 1,56 • 10~cm2/Mol fiir Dichlorphenolindophenol (Seubert, 1965). MMatdehydrogenase (MDH), Uricase und Peroxidase wurden nach Vorschriften der Firma Boehringer (Mannheim) bestimmt, Allantoinase nach Vogels et M. (1966) unter Zusatz yon 5 • 10-3M MnC12. Protein wurde nach einer Modifikation der Lowry-Methode bestimmt (Gerhardt und Beevers, 1968). Die Dichtebestimmung der Saccharosekonzentrationen geschah fiber den Brechungsindex.
Ergebnisse
Microboclies in situ Die cytochemische Nachweisreaktion m i t DAB/H20~ auf K a t a l a s e a n Gewebeschnitten aus der R i n d e der Spadix-Appendices y o n Sauro-
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C. Berger und B. Gerhardt: Microbodies aus Spadix-Appendices
mature guttatum fiihrt zu ciner kr/~ftigen ,,F/~rbung" der Microbodies (Abb. 2, 3); die kontrastierte Matrix der Organellen erscheint deutlieh grobk6rniger als in den unbehandelten Kontrollen (Abb. 4). I m Gegensatz zum Ergebnis der vollst/~ndig ,,gefgrbten" Mierobodies yon Santomature stehen die Befunde an A r u m maculatum. Bei A r u m wird nur die Membran der Mierobodies kontrastiert - - oft aueh der Bereich zwischen den Microbodies und dem umgebendert glatten Endoplasmatischen Reticulum (ER) - - , w~hrend in der Matrix keine Ablagerung des elektronendiehten l~eaktionsprodnktes zu beobachten ist (Abb. 1, 5; Kontrolle: Abb. 7). I n Gewebeschnitten der Appendices verblfihter Pflanzen yon A r u m und Sauromatum zeigen die Microbodies eine wesentlich schw/~chere Reaktion mit DAB/HeO 2 als in denen yon Pflanzen vor dem Blfihen. Werden Gewebesehnitte der Appendices yon Ar't~m mit dem spezifischen Katalasehemmstoff Aminotriazol behandelt, tritt naeh der Reaktion auf Katalase gelegentlieh eine sehwaehe, meist jedoeh keine ,,F~rbung" der Membran der Microbodies auI (Abb. 6). Trotz der Katalasehemmung sind aber im Gewebe noch Sehwgrzungen zu beobaehten: Dietyosomen (Abb. 8) sowie die Mittellamellen der Zellw/~nde, vor allem im Bereich der GefiiBbfindel und in der N/~he yon Intercellularen (Abb. 6), sind deutlich kontrastiert. Isolierte Microbodies Abb. 9 gibt die Anftrennung einer groben Partikelfraktion aus Spadix-Appendiees yon A r u m am linearen Saccharose-Gradienten wieder. Die Lage der Katalase enthaltenden Zellorganellen am Gradienten ist durch das Verteilungsprofil des Enzyms gegeben. Fiir die elektronenmikroskopisehen Untersuehungen wurden aus den Fraktionen mit der hSchsten Katalaseaktivit~t die Partikel auszentrifugiert (s. Methodik). Sie zeigen mit ihrer einfachen Membran und der feinkSrnigen Matrix die gleichen Charakteristika wie die Microbodies des Gewebes (Abb. 10). Bei der Isolierung wird aber die enge Beziehung der Microbodies zum E R (Berger und Schnepf, 1970) gel6st. Auch bei Sauromatum zerfallen die wesentlich ausgepr~gteren Komplexe yon Et~ und Mierobodies bei der
Abb. 1. Arum, kurz vor der Anthese. Katalase-Reaktion mit DAB/H~O2. Vergr. 30000 • Abb. 2. Sauromatum, eine Woche vor der Anthese. Katalase-Reaktion mit DAB/H202. Vergr. 30000 x Abb. 3. Sauromatum, eine Woche vor der Anthese. Katalase-Reaktion mit DAB/It20e. Vergr. 32000 • Abb. 4. Sauromatum, bltihend, Kontrolle. * : Microbody. Vergr. 28000 X
Abb. 1--4. l~[icrobodies in gindenzelten der Spadix-Appendices. Glutaraldehyd-- 0sO~. Nicht n~chkontrastiert.
Fixierung:
330
C. Berger und B. Gerherdf~:
A b b 5--8. Arum. Rindenzellen aus dem Spadix-Appendix kurz vor der Anthese. Fixierung: Glutaraldehyd - - O s Q . Nicht nachkontrastierg. * = Mierobody
Microbodies aus Spadix-Appendices
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1.187 g c m -3 - 1.49 300-
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- 1.47
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