Archives Internationales de Physiologie, de Biochimie el de Biophysique, 1992, 100, A17-A24
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Expos6 didactique
Structure et fonctions des plaquettes sanguines
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D. Blache Nutrition et Physiopathologie Vasculaire, INSERM U.63, 22, Av. Doyen Lepine, 69675 &on, France
Les plaquettes sanguines interagissent avec les facteurs de la coagulation et les composants de la paroi vasculaire pour jouer un r61e primordial d’une part dans le maintien de l’integrite vasculaire et dans l’hemostase et d’autre part dans I’initiation des thromboses et dans le dtveloppement de I’athCrosclerose. L’interaction des plaquettes au niveau d’une brtche de la paioi des vaisseaux aboutit tres rapidement, dans les conditions normales, a la formation d’un thrombus blanc ou clou hemostatique initial. Dans certaines conditions, ce systeme de defense peut &re exagCrC et conduire a une situation thrombotique. La recherche fondamentale a contribue a apporter une meilleure comprehension des mecanismes biochimiques impliques dans ces processus et a permis de mieux comprendre le r6le que joue la plaquette sanguine dans les etats prkthrombotiques et en pathologie cardiovasculaire. A p r b avoir dkcrit les origines et la structure morphologique de la plaquette, nous tenterons au cours de cette breve revue, de decrire les rkponses physiologiques caracteristiques de cette cellule, puis d’envisager les mecanismes de couplage entre les stimuli et ces reponses. Aprts une integration des mecanismes biochimiques complexes mis en jeu, nous terminerons brievement en abordant l’implication des plaquettes sanguines dans la pathologie cardiovasculaire.
I. Origine et structure generale Les plaquettes sont les plus petits elements figures du sang ( 2 a 3 pm). Ce sont des fragments cellulaires provenant des mkgacaryocytes mkdullaires. Ces tnormes cellules de taille moyenne de 30 pm proviennent des mCmes cellules totipotentes qui donnent naissance aux erythrocytes et aux leucocytes. Chaque megacaryocyte produit environ 2000 plaquettes. Ce processus a lieu au niveau de la moelle osseuse. La duree de vie des plaquettes est de 8-10 jours chez I’humain et de 4 jours chez le rat. Dans le sang normal humain, le compte plaquettaire est compris entre 130 OOO a 400 OOO/pI. A 1’Ctat normal, les deux tiers de la masse plaquettaire circulent dans le sang et un tiers est sequestre dans la rate. Les plaquettes presentent a I’etat de repos une forme discoide avec un volume d’environ 6-8 pm3. Les progres de la microscopie electronique ont permis de mieux connaitre la structure plaquettaire.
Cette cellule est depourvue de DNA puisque sans noyau mais contient quelques traces de RNA. La synthese proteique mesuree par incorporation de leucine radiomarqute est faible contrairement a celle des lipides qui peut etre CtudiCe a l’aide d’acktate radioisotopique. La biosynthese du cholesterol n’a pas lieu et par consequent le cholestCrol rencontre dans la plaquette rksulte d’echange avec les lipoprotkines plasmatiques circulantes. La plaquette renferme un grand nombre de granules et d’organelles subcellulaires. On trouve ainsi des mitochondries, des peroxysomes et des particules de glycogene. Trois sortes principales de granules peuvent Ctre observees : les granules denses contenant de 1’ADP, de I’ATP, de la serotonine, des catecholamines et des cations (Ca2+,Mg2+);les granules alpha renfermant le fibrinogene plaquettaire, de la beta-thromboglobuline (8-TG), de la thrombospondine, un facteur de croissance appele “platelet-derived growth factor’ ’ ou PDGF, un facteur plaquettaire neutralisant l’hkparine, le platelet factor 4 ou PF,; et enfin, les lysosomes contenant des hydrolases acides (8-glucoronidase) et des cathepsines. Les elements contenus dans ces granules apportent une importante contribution dans la cascade de reactions conduisant a I’agrCgation plaquettaire discutees plus loin. On trouve Cgalement dans la plaquette un important reseau membranaire : l’un connectk avec le milieu extracellulaire par de profondes invaginations, le systeme canaliculaire ouvert et l’autre, uniquement intracellulaire, appelk le systeme tubulaire dense. 11. Les reponses physiologiques
L’essence m&medes plaquettes est de repondre rapidement a des stimulus. Parmi les agonistes importants du point de vue physiologique, et capables de stimuler les plaquettes, on trouve essentiellement : la thrombine, les fibres de collagene, le thromboxane Az (TXA,), l’ADP, le “platelet aggregating factor” (PAF), la serotonine, la vasopressine, I’adrenaline. Tous ces agonistes sont supposees exercer leurs effets griice a des interactions avec des recepteurs specifiques IocalisCs sur la membrane plasmique. Les reponses plaquettaires sont representees par une ou plusieurs des trois reactions suivantes : le changement de forme (“shape change”), l’agregation et la secretion plaquettaires.
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Le changernentde forme. Au cours du changement de forme et comme le nom l’indique, la plaquette, d’un ttat de repos ou elle presente une forme discoide, subit une restructuration avec la formation de pseudopodes. Cet CvCnement est associe a une complete rkorganisation du cytosquelette de la plaquette. Le changement de forme est un phknomtne important car il reprksente la rtponse plaquettaire la plus sensible aux faibles doses d’agonistes. Cette rkponse est de plus t r b difficile a inhiber. Le changement de forme est souvent CtudiC par la variation de la diffusion de lumiere utiliste pour la mesure de l’agregation, mais le shape-change peut Ctre apprtcik de facon plus precise par la mesure de la lumiere refkchie a 90”’ en particulier si l’on veut s’affranchir des interferences dues a l’agregation. L ’agrkgationplaquettaire. La mesure de I’agrCgation a jouC un grand r81e dans nos connaissances sur les fonctions des plaquettes sanguines. Ceci est dQ en partie au fait que l’agrtgation in vitro est sensee Ctre le reflet de l’agregation in vivo. L’agrCgation peut Ctre facilement mesurte par la mkthode spectrophotomktrique initialement dCcrite par BORN(1962) : quand un agoniste est ajoutt dans la suspension plaquettaire sous agitation et thermostatke a 37”’ l’agregation des plaquettes se traduit par une augmentation de la transmission lumineuse. En utilisant une concentration adequate d’inducteur, l’agregation peut Etre decomposte en deux phases distinctes. La seconde phase (ou vague) reprtsente vraisemblablement le resultat d’un processus qui n’a ettc que partiellement dtclenche par l’inducteur initial. Cette seconde phase d’agrkgation est toujours accompagnee par la skcrktion des granules denses et par la synthtse de prostano’ides. Cette seconde phase est inhibee par I’aspirine. Avec une concentration plus d e v k en agoniste, une agrkgation compltte est observCe mCme si la synthese de prostanoides et la secretion sont inhibtes par l’aspirine. Les termes d’agrtgation primaire et secondaire sont alors utilists pour representer l’agrtgation seule et l’agregation avec secretion. La skcrktion plaquettaire. La secretion est le reflet de la liberation des diffkrents granules plaquettaires par exocytose. C’est ainsi qu’est libere dans le milieu extracellulaire ou, c o m e le montrent differentes etudes, dans le systtme canaliculaire ouvert, le contenu des granules plaquettaires. Du fait de la grande variCt6 des substances liberables, il existe donc plusieurs mtthodes capables d’apprecier la secretion des granules plaquettaires. La mesure de la liberation de la D-TG et/ou du PF4 est surtout reservCe a l’apprkciation de l’hyperactivitk plaquettaire in vivo. En effet, du fait de leur coot relativement eleve, ces mkthodes ne sont que trts peu utilisees pour la mesure de la secretion plaquettaire in vitro. I1 en est de mCme pour la mesure des eniymes lysosomales. D’autres methodes utilisant des electrodes spkcifiques existent pour la mesure de la secretion des ions calcium et peuvent Ctre utiliskes en continu. La secretion d’ATP a 6ttt relativement developpee in vitro par l’utilisation de la luminescence de l’association lucifkrine-luciferase.Des appareils specifiques ont 6ttc tlaborb. Cependant, bien que t r b sensible, cette technique nkessite la presence d’ions Mgz+pour l’activitt de la luciferase; de plus, des interferences ont ete rapportkes, mettant en cause la qualite des reactifs qui potentialiseraient les reactions plaquettaires.
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La mCthode la plus utilisee demeure la mesure de la liberation de skrotonineradiomarquke, prkincorporee dans les plaquettes et sCcrettCe lors de la stimulation (COSTAet MURPHY,1975). En effet, la plaquette est capable d’accumuler de grandes quantitts de skrotonine, si bien que la quasi-totalit6 de la sCrotonine circulante est contenue dans les granules denses plaquettaires. Cependant cette dernihe methode necessite l’utilisation de strotonine radioactive et suppose que la skrotonine captee soit libCree lors de la stimulation; ceci peut ne pas Etre le cas si la 5-HT recaptee ne se trouve pas dans les granules liberables. Par consequent, les methodes mesurant la 5-HT endogene libCree sont prtfkrables lorsqu’elles peuvent Ctre utilisees en routine. Des methodes fluorimitriques sont utiliskes mais elles ont les inconvenients d’Ctre longues et laborieuses. Celles utilisant un materiel relativement lourd comme la chromatographie liquide a haute pression peuvent presenter un certain interst en particulier , couplees avec une detection Clectrochimique qui confere une plus grande sensibilite par rapport a la detection par fluorescence. La mtthode la plus en cours et mise au point dans notre laboratoire utilise la voltametrie impulsionnelle diffkrentielle au moyen de micro-Clectrodesde fibre de C carbone traitees electrochimiquement ( ~ ~ A R C E N A et BLACHE,1985). Ces electrodes et les traitements tlectrochimiques associks ont ettc initialement ClaborCs pour 1’Ctude des neurotransmetteurs par implantation dans le cerveau de rat. Pour la mesure de la secretion de la serotonine plaquettaire, la methode est relativement simple puisqu’elle consiste uniquement a immerger les electrodes dans le surnageant obtenu a p r b breve centrifugation d’une suspension de plaquettes stimulks par un agoniste. La mesure s’effectue aprts calibration par rapport A une solution de serotonine etalon. La methode permet kgalement d’effectuer, si besoin est, un suivi de la secretion en continu et simultanement a l’agrkgation en immergeant les electrodes directement dans la cuvette de l’agrkgomttre. I1 est possible a l’aide de cette mtthode d’apprkcier le contenu total en 5-HT d’une suspension plaquettaire prealablement lydes. Les plaquettes posstdent Cgalement d’autres propriCtCs comme celle d’adhkrer sur du verre ou sur du collagtne. Les etudes de diffkrents inducteurs ont montrC que chacun peut individuellement presenter des effets physiologiques ou biochimiques differents. C’est ainsi que si la thrombine induit des rkponses plaquettaires complttes, I’ADP ou l’adrenaline ne peuvent induire de secretion que si la biosynthese de TXA, est mise en jeu. On parle ainsi d’agonistes forts et d’agonistes faibles. 111. Couplage stimulus-rCponse
Lorsque les plaquettes sont activees, de nombreuses modifications metaboliques ont lieu. Une baisse importante de la charge energetique de la plaquette a pu Ctre mise en evidence de facon concomittante avec une augmentation de la glycolyse sans respiration; il y a transformation du glucose (ou du glycogene) en lactate. D’autres changements ont kgalement lieu dont certains ont fait l’objet d’intenses recherches comme les modifications du metabolisme des phospholipides et de
STRUCTURE ET FONCTIONS DES PLAQUETTES SANGUINES
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l’acide arachidonique, I’activation de proteines kinases et la phosphorylation de prottines contractiles de la plaquette en relation avec de profondes modifications du cytosquelette. Simultankment, la surface de la membrane plaquettaire subit Cgalement des changements, comme l’expression de recepteurs au fibrinogkne et des modifications du potentiel de membrane et du pH intraplaquettaire; de plus il y a des modifications des mouvements ioniques en particulier des ions calcium.
III-I. Role du calcium extra- et intracellulaire Le calcium est certainement le plus Ctudie et le plus gCnCralement accept6 des seconds messagers plaquettaires. Bien que ceci decoule d’analogie avec d’autres cellules, cela rksulte Cgalement de conclusions de travaux utilisant des ionophores specifiques et d’antogonistes. En effet, la plaquette est de trop petite taille pour permettre des etudes de type electrophysiologique par l’introduction d’electrodes. L’analyse des mouvements calciques intracellulaire n’a pu progresser que grace a la mise au point d’indicateurs performants. Les indicateurs metallochromiques (murexide, arsenazo I11 et antipyrylazo 111) ne purent pas &treutilises pour les plaquettes puisqu’ils necessitent d’&tre internalises. Apres la chlortetracycline, fluorescente en presence de Ca“ dans un environnement lipidique et dont il fallait par consequent mesurer la baisse de fluorescence, il y eut alors la mise au point de sondes telles que le Quin 2, le Fura 2 ou I’Indo 1 . Ces derniers indicateurs sont incorporks dans les cellules sous forme d’esters lipophiles et deviennent preferentiellement cytosoliques apres action d’estkrases cellulaires non spkcifiques. 11s presentent alors les proprietes de fluorescer lorsqu’ils chelatent spkcifiquement des ions calcium. Une autre mCthode utilise la proprittk de certaines photoprotkines sensibles au Ca2+telles que l’aequorine, apres incorporation dans la plaquette. Depuis les travaux de LEBRETON et al. (1976), on sait que la stimulation de plaquettes par des agents agregants provoque une redistribution du calcium intraplaquettaire. Ces auteurs utiliskent la dkcroissance de la fluorescence de la chlortktracycline insCree dans des plaquettes humaines. Ces resultats ont CtC recemment retvalues et confirmts par comparaison avec les methodes recentes d’apprkciation du calcium libre mise au point par TSIEN(1982) utilisant le Quin 2. L’ensemble de ces rbultats, ainsi que ceux obtenus avec d’autres techniques de mesure permet d’apporter des evidences aussi bien en faveur d’une decharge interne de calcium que d’une entree du calcium extracellulaire. Ces deux possibilites et les arguments experimentaux qui les soustendent seront successivement envisages. Evidences en faveur d’une dkcharge interne de calcium. Une bonne partie des riponses plaquettaires a une stimulation peut Ctre obtenue en l’absence de calcium dans le milieu. De mCme, la stimulation par l’ionophore A23287 permet d’obtenir le changement de forme et la secretion plaquettaire en l’absence de calcium externe. Par rapport a nos connaissances sur la propriCtC d’un ionophore, qui est de transporter les ions de faGon plus ou moins specifique a travers les membranes, ceci suggere la presence de reserves internes
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mobilisables de Ca’+. Celles-ci seraient contenues dans un systeme analogue au reticulum sarcoplasmique et ayant la propriete d’accumuler du calcium en presence d’ATP. Cette structure serait le systeme tubulaire dense plaquettaire initialement dCcrit par les microscopistes. Les experiences sur la decroissance de la fluorescence de la chlortetracycline avaient deja montre qu’en presence d’EGTA, on pouvait mettre en evidence une certaine difference entre les inducteurs. En effet, en l’absence de calcium extracellulaire, I’adrCnaline et le collagkne se sont revelks incapables de mobiliser le calcium interne de plaquettes traitkes par l’aspirine. Les experiences plus recentes de RINK et al. (1982) utilisant le Quin 2 ou le Fura 2 montrent que la concentration calcique de base de plaquettes au repos est inferieure a 100 nM. Apres stimulation par la thrombine en presence d’EGTA, ce taux s’eleve a 300 nM avec le Quin et plus (500-1000 nM) avec le Fura 2 qui possede un meilleur rendement quantique. De plus, certaines evidences ont pu Ctre obtenues en faveur de mecanismes independants de l’elevation de calcium interne, en particulier lors de stimulation par les esters de phorbol ou le diacylglycerol. Des resultats opposes ont par contre, ete obtenus lors de I’utilisation de I’aequorine. Ces differences ne seraient pas dues uniquement au fort pouvoir tampon vis-a-vis du calcium, du Quin 2 par rapport a I’aequorine, mais plut8t au fait que cette derniere detecte des variations de calcium plus localiskes. Ces conclusions sont Cgalement renforcees par l’observation d’un meilleur suivi du “shape change” avec l’aequorine qu’avec le Quin 2. Quelle est la source du calcium plaquettaire liberable ? M&mesi les granules denses contiennent plus de 60% du calcium plaquettaire, celui-ci n’est pas en kquilibre avec le cytosol et ne peut pas jouer un r81e de second messager. I1 en est de meme du calcium contenu dans les mitochondries. Un des meilleurs candidats serait le calcium du systeme tubulaire dense qui renferme une Ca-Mg ATPase analogue a celle decrite pour le reticulum sarcoplasmique. Evidences en faveur d’une entree de calcium. Plusieurs faits experimentaux sont en faveur d’une entree de calcium extracellulaire au cours de la stimulation des plaquettes sanguines. Tout d’abord, une augmentation importante de la capture du radiocalcium sous I’effet de nombreux inducteurs; ensuite, l’tlevation de la concentration en calcium libre interne, apprtcite aussi bien avec le Quin 2, le Fura 2 ou l’aequorine est plus importante en presence de calcium extracellulaire qu’en son absence. Ceci a Ct6 systkmatiquement retrouve par de nombreux auteurs et pour des inducteurs aussi varies que la thrombine, le PAF, la vasopressine, 1’ADP, les mimttiques du thromboxane A*. L’entrte de cations peut &tre egalement mise en evidence par la stimulation de plaquettes chargees en Quin 2, en presence de Mn2+.L’influx de ce cation est alors rCvClte par sa propriete d’affaiblir le signal de fluorescence du Quin. De plus, l’utilisation de cations pouvant se substituer au Ca2+,tels que le Sr’’ et le Ba2+ et susceptibles d’emprunter Ies m@mesvoies de penetration pour entrainer les reponses physiologiques est Cgalement un Clement important. Enfin, le fait que des
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A20 inhibiteurs inorganiques de mouvements calciques comme le Ni”, le CdZ+,le MnZ+et organiques comme certaines dihydropyridines, inhibent I’augmentation de la concentration libre de Ca2+,la secretion et l’agrtgation plaquettaire sont d’autres elements en faveur de l’existence d’un influx de calcium lors de stimulation. Par ailleurs, il faut signaler que l’influx de calcium peut lui-mCme dkclencher une liberation a partir de reserves internes (“Caz+-induced Ca2+ release”, FAJHATO, 1979). Cette possibilite peut Ctre raisonnablement envisagee par analogie avec le fonctionnement de la cellule cardiaque. Le canal calcique plaquettaire. Les ions calcium M transitent selon le gradient de concentration ( a I’extCrieur, lo-’ M a I’interieur) a travers des structures spkcialisees appelees canaux calciques. Les propriCtCs de ces canaux ont Ctt tres Ctudites du point de vue Clectrophysiologique et pharmacologique. C’est ainsi que I’on distingue actuellement 3 types de canaux : 1/ les canaux de type L : ils sont sensibles aux dihydropyridines et possedent une sClectivit6 pour le Ca2+,Sr2+,Ba2+,une cinetique d’activation et d’inactivation lente; 2/ les canaux de type T : ils ont d’abord etC observes dans des preparations neuronales. 11s possedent des cinktiques d’activation et d’inactivation rapides. 11s sont peu sensibles au Cd2+ et aux dihydropyridines; 3/ les canaux de type N : ils ne prksentent les caractkristiques ni des canaux L, ni des T. 11s sont caracterisks par une conductance unitaire intermediaire entre celles des canaux L et T, une grande sensibilitk au Cd2+, une insensibilitk aux dihydropyridines. En ce qui concerne la plaquette sanguine, de nombreuses evidences experimentales sont en faveur de l’implications de structures de type canal calcique dans le fonctionnement plaquettaire. Les experiences de reconstitution de vtsicules membranaires plaquettaires dans des bicouches lipidiques ont permis l’enregistrement de courants calciques (ZSCHAUER et al., 1988). I1 faut noter que ces courants n’ont pu Stre mis en evidence que lorsque les vCsicules membranaires provenaient de plaquettes prealablement stimulCes par la thrombine. De plus, ces courants sont insensibles aux dihydropyridines et sensibles aux inhibiteurs inorganiques (Ni,’). Les structures impliquies n’ont pas 6tC etudiees de maniere plus approfondie par les auteurs, mais de bons candidats semblent Ctre les glycoproteines IIb et IIIa. En effet, ces glycoproteines s’associent en un complexe lors de la stimulation et representent le recepteur du fibrinogene. Parmi les evidences susceptibles d’impliquer le complexe GPIlb-IIIa dans les mouvements calciques, on peut trouver : 1/ le complexe prisente des sites de fixation du calcium; 2/ les plaquettes provenant de sujets thrombastheniques agregent moins et sont dificientes en ce complexe; 3/ la liaison de 45Caz+ sur des plaquettes de thrombastheniques est rCduite de 50% par rapport aux sujets normaux. RCcemment, au moyen d’anticorps monoclonaux, il a ettc suggere que le canal calcium plaquettaire n’etait pas les GPIIb-IIIa, mais qu’il Ctait situC a proximite (PowLING et HARDISTY, 1985). Des travaux japonais pretendaient le contraire, en utilisant des anticorps
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monoclonaux et des plaquettes chargees d’aequorine (YAMAGUSHI et af., 1987). Plus rkcemment, des auteurs ont incorpore ces glycoproteines dans des vksicules phospholipidiques en presence de Fura 2 (RYBAKet al., 1988). I1 a ete montrC que le complexe GPIIb-IIIa pourrait fonctionner comme un canal a condition que ces glycoproteines soient incorporees dans les vtsicules sous forme de complexe tel qu’il peut Ctre obtenu lors de stimulation par la thrombine. Rkemment, des auteurs ont CtudiC par des techniques electrophysiologiques, la capacite du complexe GPIIb-IIIa purifie et rkincorpore dans des bicouches phospholipidiques a fonctionner comme un canal calcique. Les auteurs concluent que ce complexe peut se comporter comme un canal et af., 1991). permeable aux cations divalents (FUJIMOTO 111-2. Les mkcanismes mis en jeu
111.2.1-Activation des phospholipases
La phospholipase A, (PLA,) hydrolyse essentiellement les phosphatidyl-choline, -ethanolamine et inositol membranaires pour en liberer l’acide arachidonique qui est alors metabolist par la cyclooxygCnase et par la lipoxygknase. La PLA, a ete purifiee aussi bien a partir de fractions membranaires que de fractions solubles. La PLA, plaquettaire est fortement calcium-dependantebien que les etudes sur sa sensibilitk au Ca2+fassent Ctat de concentrations optimales allant de plusieurs mM a moins de 1 pM. L’activation de la PLA, a lieu par les differents inducteurs mais seule I’augmentation du calcium causee par ceux-ci pourrait &treun element activateur suffisant. I1 a etC rapporte recemment que les plaquettes contiennent une famille de protkines, les lipocortines, qui inhiberaient la PLA,. Si un effet inhibiteur direct sur l’enzyme semble de moins en moins evident, il faudrait plutbt retenir une action sur le substrat phospholipidique. Phospholipase C. RITTENHOUSE (1983) fut la premiere montrer que les phosphatidylinositol des plaquettes stirnulees par la thrombine subissent l’action d’une phospholipase C pour produire du diacylglyckrol (DAG) qui s’accumule de faqon rapide mais transitoire. Cette phopholipase avait CtC initialement mise en evidence par MAUCO et al. (1979) dans des surnageant plaquettaires en presence de Caz+.Tres rapidement, le DAG se transforme en acide phosphatidique dont le taux Cleve avait etC montre aprks stimulation par de nombreux agonistes. Cette liberation de DAG et d’acide phosphatidique intervient egalement en presence d’aspirine, ce qui montre une activation independante de la phospholipase C par les inducteurs. De plus, le fait que les polyphosphoinositidesqui peuvent lier une grande quantite de calcium soient egalement substrat de la phospholipase C, et puissent produire du DAG, a engendrk un regain d’interet pour ces phospholipides. Cette hypothese a cependant faibli lorsque la dkcouverte a CtC faite que le co-produit de I’action de la phospholipase C, l’inositol triphosphate (Ins 1,4,5 P3), Ctait capable d’induire la liberation du calcium a partir du reticulum sarcoplasmique de nombreuses cellules. De plus des recepteurs pour l’inositol triphosphate ont kttc rnis en evidence sur des microsomes de diffkrentes cellules, y compris les plaquettes sanguines. L’Ctude du metabolisme et de I’interconver-
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sion des produits de la phospholipase C derives de I’inositol plus ou moins phosphoryles et tenant compte egalement des derives cycliques, fait l’objet d’une intense recherche dans differentes cellules, en particulier, le derive Ins (1,3,4,5) P, qui pourrait Etre un stimulateur direct de l’influx transmembranaire de calcium. Phospholipase D. Rtcemment, il y a de plus en plus d’evidences experimentales en faveur de I’implication de la phospholipase D dans I’activation cellulaire. Dans certaines cellules, comme les neutrophiles, la production d’acide phosphatidique a partir de phophatidylcholine peut representer une source importante de diacylglycerol. Dans les plaquettes sanguines, I’activation de cette phospholipase D a egalement lieu et jouerait donc un r6le dans la transduction du signal. III-2.2-Rele des proteines G Bien que les protiines liant les nucleotides guaniliques ou proteines G , soient connues depuis longtemps pour leur couplage a I’activation (G,) ou l’inhibition (GJ de l’adenylate cyclase lors de I’action hormonale, un renouveau pour cette famille de proteines a eu lieu quand leurs proprietes d’activer les phospholipases C ont CtC mises en evidence. Ces proteines sont constituees d’un complexe trimirique compost5 d’une sous-unite alpha liant specifiquement les nucleotides guaniliques et d’un dimere bCta-gamma. L’occupation des recepteurs stimule le remplacement du GDP lie a la sous-unite alpha par du GTP, ce qui conduit a la dissociation de la prottine en ses composants alpha et b&ta-gamma.Le GTP est hydrolyse et le complexe ternaire alpha-beta-gamma se reforme. Comme ce cycle se repete tant que le rkcepteur est occupe, l’activite GTPase se trouve stirnulee d’ou l’interet d’utiliser des derives non-hydrolysables du GTP (comme le GTPyS) qui induisent une stimulation permanente de l’activite. Comme les plaquettes sont imperrnkables aux derives guaniliques, il est necessaire d’utiliser des modeles de plaquettes permeabiliskes soit par la digitonine, soit par Clectro-permeabilisation. Ainsi, la stimulation des proteines G par le GTPyS par exemple, abaisse fortement la concentration en calcium necessaire pour induire la secretion plaquettaire. Mais dans ces conditions, la production de diacylglycerol est Cgalement augmentee; par consequent, les proteines G jouent Cgalement un rBle dans I’hydrolyse des phosphoinositides (voir MANNING et BRASS,1991). 111-2.3-La proteine kinase C ~~~~~
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Les proteines kinases C sont une famille d’enzymes de 80 kDa qui catalysent la phosphorylation de proteines spkcifiques a partir d’ATP en presence de Caz+ et de phosphatidylserine. Le groupe de NISHIZUKA et al. (1984) demontra que I’addition du diacylglycerol abaisse la concentration en calcium necessaire a des taux physiologiques (0.1-1 pM).I1 a donc CtC propose que le diacylglycerol forme par l’action de la phospholipase C agirait comme un second messager dans la plaquette. Par ailleurs, il a Cte montre que les esters de phorbol, qui sont des promoteurs, sont de puissants stimulants de la p r o t h e kinase C et stimulent les reponses plaquettaires. On connait au moins deux substrats importants pour la proteine kinase C qui sont
deux proteines majeures phophorylees en presence de thrombine : 1/ la chaine legere de la myosine plaquettaire (PM 20 kDa) qui est le substrat de la kinase regulee par le Ca2+et la calmoduline; 2/ la proteine appelee P47 dont la fonction est encore relativement obscure. Selon cette hypothese, moins en vogue actuellement, cette derniere prottine presenterait certaines analogies avec une lipocortine. Une autre hypothese, plus recente, serait en faveur d’une identite avec la 5-phosphomonoesterase. Le modele de Nishizuka int6gre parfaitement le r61e du CaZ+et de la proteine kinase C a travers les phophorylations de la myosine et de la P47 lors de la stimulation des plaquettes par la thrornbine. La prot h e kinase C a ete egalement irnpliquee dans l’induction du rkepteur au fibrinogene represente par le complexe GPIIb-GPIIIa de plaquettes permkabilides. De plus, la stimulation de la proteine kinase C semble Ctre de plus en plus reliee a un effet de “feed-back” nkgatif sur la fonction plaquettaire. En effet, ces conclusions resultent d’observations d’inhibition de la formation d’acide phosphatidique et de la mobilisation du calcium causke par les esters de phorbol. Des travaux l’impliquerait plutat dans la terminaison du signal calcique et dans l’extraction du calcium pour reconstituer le taux basal. I1 faut cependant noter que I’utilisation de stimulateurs de la proteine kinase C, tels que les esters de phorbol, ne sont pas le reflet fidele de reactions physiologiques car ils engendrent une stimulation permanente et non transitoire. III-2.4-Rble des nucleotides cycliques L’activation des plaquettes est modulee par des processus capables d’attenuer ou d’inhiber Ies rkponses induites par les agonistes. C’est ainsi que I’AMP cyclique joue un r61e d’une grande importance. Ce dernier est produit dans la plaquette sous l’activite de l’adenylate cyclase gtntralement a partir de stimulation exogene, comme par exemple la prostacycline (PGI,) de source vasculaire. Le mecanisme semble mettre en jeu des prottines kinases dependantes de I’AMP cyclique. Ce nucleotide entraine de nombreux effets comme la diminution du nombre de recepteurs a la thrombine, la production de DAG. L’AMPc semble Cgalement affecter directement l’activite de la proteine kinase C. Un des r6le les plus importants est peut-Etre l’existence d’interactions avec le metabolisme des ions calcium. Certains travaux montrent que 1’AMPc influence la concentration calcique intracytosolique vraisemblablement en agissant sur le syst6me tubulaire dense. Ces faits expkrimentaux ont ete obtenus aussi bien de faqon indirecte par des stimulants de l’adenylate cyclase comme les prostaglandines D, et I, ou de maniere plus directe par des derives photoactivables de 1’AMPc. Ces derniers derives comme celui synthetise par J . NERBONNE el al. (1984) passent d’un etat inactif du point de vue physiologique, a un ttat actif par liberation d’AMPc apres photoactivation. Ainsi, nous avons pu definir dans un premier temps les conditions d’utilisation de cet analogue sur l’agrtgation et la secretion de plaquettes. Cette technique a ensuite ete couplee avec l’utilisation d’un indicateur fluorescent pour le suivi de la concentration de Caz+libre intraplaquettaire. En utilisant des plaquettes humaines, nos resultats ont mon-
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trt que I’AMPc libere par photo-irradiation entrainait une inhibition de l’amplitude de rCponse du signal fluorescent induit par la thrombine. De plus, lorsque I’AMPc est libere, une fois que le signal calcique attaint son maximum, la baisse de la fluorescence est accentuee par rapport aux condition contrdles (absence de flash lumineux). Ces rksultats tendent A confirmer l’idte que 1’AMPc est implique dans la recapture du Ca2+cytosolique pour le retour au niveau de base et al., 1987). (BLACHE En ce qui concerne les autres nuclkotides cycliques, et en particulier le GMPc, ce dernier a CtC moins ttudiC et son mecanisme d’action reste plus obscur. La plaquette renferme une guanylate cyclase qui est stimulCe lors de l’activation plaquettaire. Le GMPc inhiberait les rtponses plaquettaires aux agonistes, peutZtre en agissant sur l’activationde la phospholipase C. RCcemment, il a ettt montrC un effect inhibiteur du GMPc sur les phosphodiesttrases de I’AMPc. Par consequent, les effets inhibiteurs du GMPc sur les fonctions plaquettaires, s’expliqueraient par une participation a l’augmentation de 1’AMPc. Ce pourrait &re Cgalement un des mkcanismes possibles responsable des effets du(des) EDRF (“endothelial derived relaxingfactor”) qui serait le monoxyde d’azote.
N.Integration des mkcanismes Le couplage stimulus-reponse dans la plaquette met en jeu un ensemble de regulations complexes qui ont
fait l’objet d’ouvrages spCcialisCs (PHILLIPS et S m , 1986). L’intkgration de toutes ces interactions necessite la comprehension de chacun des mdcanismes, de leur implication specifique dans le processus general et la sequence des evenements. I1 peut ne pas y avoir une sequence lineaire unique a partir de la liaison d’un agoniste sur un recepteur jusqu’a la riponse finale. Mais plusieurs mkcanismes pourraient CvoIuer en parallele avec des possibilitks de regulations croiskes ou d’amplifications (voir schema). Les rkponses peuvent &treclasskes en reponses primaires et secondaires suivant leurs situations par rapport a la liaison aux recepteurs. C’est ainsi que la production de DAG et d’IP3 par activation de la phospholipase C d’une part et l’influx de calcium et la liberation du calcium membranaire d’autre part apparaissent comme &ant des evenements primaires. Parmi les evenements secondaires, on trouve alors l’augmentation du calcium libre cytosolique conduisant d’une part, a la phosphorylation de prottines contractiles et d’autre part a l’activation de la phospholipase A, et a la liberation subsequente d’acide arachidonique engendrant la synthese de prostanoides. V. Implication des plaquettes sanguines dans les maladies cardiovasculaires L’athCrosclCrose est une maladie multifactorielle. De nombreux facteurs interagissent les uns avec les autres et sont rarement complhement independants.
membrane plaquettaire
I
Ca”
acide arachidonique
Ca
’+
rbserves calciques
Schema illustrant la transduction du signal mddiee par les recepteurs au cows de I’activation des plaquettes sanguines. Abrkviations :AC : adenylate cyclase; Gi, Gs :protemes G inhibitrice et sthulatrice, respectivement; Ga, Gp, protkine G c o u p k B la phospholipase A, ou a la phospholipase C, respectivement; IP,, inositol 1,4,5-triphosphate; IP,, inositol 1,3,4,5-tktrakisphosphatee; PA, acide phosphatidique; PC, phosphatidylcholine; PE, phosphatidylkthanolamine; PIP,, phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate; stimulation; inhibition. (inspire de NOZAWA et al., 1991)
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STRUCTURE ET FONCTIONS DES PLAQUETTES SANGUINES
Les etudes epidkmiologiques ont permis de degager un certain nombre de facteurs de risque dont l’implication semble de mieux en mieux etablie. I1 en est ainsi du tabac, de l’hypertension, du diabete et des hyperlipidemies. Cependant, il est estimC que ces facteurs permettent d’expliquer pleinement environ 60% de la mortalit6 par maladies cardiovasculaires.Par consequent, d’autres facteurs peuvent Etre proposes et parmi eux, l’hyperactivite des plaquettes sanguines. En effet, de par leur faible demi-vie, les plaquettes rtagissent relativement rapidement a w variations de leur environnement. La rCactivitC de ces cellules se modifie profondement par des variations de leur composition membranaire ou de facteurs pouvant agir sur leurs fonctions. I1 semble que se soit par ce biais que des facteurs comme la nutrition, en particulier la composition en lipides, en vitamines et oligoClCments de la ration soient impliques dans ces pathologies. En effet, dans la plupart des situations ou sont presents des facteurs de risques, une hyperactivitk des plaquettes est mise en evidence. Des plaquettes provenant de sujets diabktiques, hypertendus, hyperlipidhiques ou prenant des contraceptifs oraux agregent plus facilement, secretent plus et synthktisent des quantitks plus importantes de thromboxane A,. D’une faGon gtnerale, ces plaquettes prksentent des modifications de leur homeostasie calcique : influx et/ou concentration libre interne augmentb. Les plaquettes de sujets supplimentes en vitamines (E, C, R-carotene) agrkgent moins, comme le montrent des etudes d’intervention nutritionelle effectuees en Europe du Nord (SALONEN et al., 1991). De nombreuses etudes ont montrt que les composes libires par les plaquettes lors de leur activation, peuvent &re impliques dans I’athtrogenkse. I1 en est ainsi pour la skrotonine, le thromboxane A2, des facteurs mitogkniques et d’endoperoxydes. Les lipoperoxydes peuvent egalement entrainer des modifications de I’activitt des plaquettes mais Cgalement perturber le metabolisme normal des LipoprotCines plasmatiques (en particulier, les lipoprotkines de basse densite, LDL) pour renforcer une situation atherogene (WITZTUMet STEINBERG, 1991). Nous avons dans ce contexte, montrC que les derives de lipoperoxydation, derives d’acides gras polyinsatures ou derives oxygtnts du cholesterol, sont capables de potentialiser les fonc1988; POLETTE tions plaquettaires (BLACHEet BONTOUX, et BLACHE,1992). VI. Perspectives
De nombreuses Ctapes de l’activation des plaquettes sanguines restent a decouvrir. I1 reste egalement A determiner avec precision quelles sont celles qui sont obligatoires pour entrainer les reponses plaquettaires primaires. En effet, du fait de l’importance des plaquettes dans les processus relies a l’atherogenese, cela permettra de nouveaux dkveloppementspharmacologiques dans la thkrapie par la mise au point d’antiplaquettaires plus ciblCs. Ces recherches nkcessistent la mise au point de modeles animaux pour mettre en Cvidence les facteurs responsables et impliquks dans la modulation de l’activite de ces cellules.
Resum6 Les plaquettes sanguines sont des fragments cellulaires discoides anuclkes provenant de cellules prkcurseurs, les megacaryocytes. Les plaquettes sont capables de repondre rapidement a une varittk de stimulus se liant sur la surface plaquettaire a des recepteurs sptcifiques. Ce processus a lieu lors de lesions vasculaires et se traduit par un changement de forme, l’adhksion aux tissus sous-endothehaw nouvellement exposes, la secretion de diverses substances et par I’agrtgation plaquettaire. Au cours de ces phenomenes, un grand nombre de reactions biochimiques sont dkclenchkes telles que l’activation de phospholipases, la liberation de nombreux mkdiateurs, la phosphorylation de protkines. A l’origine de ces reponses, l’augmentation de la concentration en calcium libre intraplaquettaire provenant par I’intermCdiaire de canaux calciques du calcium extracellulaire et de reserves internes, joue un role important. Enfin, on peut considkrer qu’une intensification de ces propriktks est a l’origine de I’implication des plaquettes sanguines dans les maladies cardiovasculaires.
Mots clks : Plaquettes sanguines - agrkgation - s h e tion - activation - calcium - canaux calciques phospholipases - prostanoides - AMPc - protkines G - inositides - maladies cardiovasculaires- lipoperoxydes. Summary Blood platelets are discoid cellular fragments without nucleus originating from megakaryocytes. Platelets are able to respond to a great variety of agonists which bind to specific receptors localized on the plasma membrane. This process takes place when blood vessels are cut. Platelets then change their shape, adhere to newly exposed subendothelial tissues, release the content of numerous secretory granules and aggregate together. During this process, a great numbers of biochemical reactions are triggered such as phospholipases activation, synthesis of mediators and protein phosphorylation. These events result from increased cytoplasmic free calcium originating through calcium channels from the extracellular medium and from internal stores. Involvement of blood platelets in cardiovascular diseases may result from an exageration of these mechanisms by risk factors and are also discussed.
Key words : Blood platelet - aggregation - secretion - activation - calcium - calcium channel - phospholipase - prostanoids - AMPc - G proteins - inositides - cardiovascular diseases - lipoperoxides. Bibliographie BETTERRIDGE, J. (1987) Nutrition and platelet in atherogenesis, Roc. Nutr. SOC. 46, 345-359. BLACHE, D., CIAVATTI, M. &OJEDA,A. (1987) The effects of calcium blockers on blood platelet function, especially calcium uptake, Biochim. Biophys. Acta 923, 401-412. BLACHE,D., CIAVATTI, M., PONSLN, G. & NARCEOT, J. (1987) Direct evidence for the modulation of human platelet cytosolic free Ca by intracellular cyclic AMP produced with a photoactivatable derivative, Biochem. Biophys. Res. Comm. 146, 321-331.
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Expos6 didactique
Structure et fonctions des plaquettes sanguines
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D. Blache Nutrition et Physiopathologie Vasculaire, INSERM U.63, 22, Av. Doyen Lepine, 69675 &on, France
Les plaquettes sanguines interagissent avec les facteurs de la coagulation et les composants de la paroi vasculaire pour jouer un r61e primordial d’une part dans le maintien de l’integrite vasculaire et dans l’hemostase et d’autre part dans I’initiation des thromboses et dans le dtveloppement de I’athCrosclerose. L’interaction des plaquettes au niveau d’une brtche de la paioi des vaisseaux aboutit tres rapidement, dans les conditions normales, a la formation d’un thrombus blanc ou clou hemostatique initial. Dans certaines conditions, ce systeme de defense peut &re exagCrC et conduire a une situation thrombotique. La recherche fondamentale a contribue a apporter une meilleure comprehension des mecanismes biochimiques impliques dans ces processus et a permis de mieux comprendre le r6le que joue la plaquette sanguine dans les etats prkthrombotiques et en pathologie cardiovasculaire. A p r b avoir dkcrit les origines et la structure morphologique de la plaquette, nous tenterons au cours de cette breve revue, de decrire les rkponses physiologiques caracteristiques de cette cellule, puis d’envisager les mecanismes de couplage entre les stimuli et ces reponses. Aprts une integration des mecanismes biochimiques complexes mis en jeu, nous terminerons brievement en abordant l’implication des plaquettes sanguines dans la pathologie cardiovasculaire.
I. Origine et structure generale Les plaquettes sont les plus petits elements figures du sang ( 2 a 3 pm). Ce sont des fragments cellulaires provenant des mkgacaryocytes mkdullaires. Ces tnormes cellules de taille moyenne de 30 pm proviennent des mCmes cellules totipotentes qui donnent naissance aux erythrocytes et aux leucocytes. Chaque megacaryocyte produit environ 2000 plaquettes. Ce processus a lieu au niveau de la moelle osseuse. La duree de vie des plaquettes est de 8-10 jours chez I’humain et de 4 jours chez le rat. Dans le sang normal humain, le compte plaquettaire est compris entre 130 OOO a 400 OOO/pI. A 1’Ctat normal, les deux tiers de la masse plaquettaire circulent dans le sang et un tiers est sequestre dans la rate. Les plaquettes presentent a I’etat de repos une forme discoide avec un volume d’environ 6-8 pm3. Les progres de la microscopie electronique ont permis de mieux connaitre la structure plaquettaire.
Cette cellule est depourvue de DNA puisque sans noyau mais contient quelques traces de RNA. La synthese proteique mesuree par incorporation de leucine radiomarqute est faible contrairement a celle des lipides qui peut etre CtudiCe a l’aide d’acktate radioisotopique. La biosynthese du cholesterol n’a pas lieu et par consequent le cholestCrol rencontre dans la plaquette rksulte d’echange avec les lipoprotkines plasmatiques circulantes. La plaquette renferme un grand nombre de granules et d’organelles subcellulaires. On trouve ainsi des mitochondries, des peroxysomes et des particules de glycogene. Trois sortes principales de granules peuvent Ctre observees : les granules denses contenant de 1’ADP, de I’ATP, de la serotonine, des catecholamines et des cations (Ca2+,Mg2+);les granules alpha renfermant le fibrinogene plaquettaire, de la beta-thromboglobuline (8-TG), de la thrombospondine, un facteur de croissance appele “platelet-derived growth factor’ ’ ou PDGF, un facteur plaquettaire neutralisant l’hkparine, le platelet factor 4 ou PF,; et enfin, les lysosomes contenant des hydrolases acides (8-glucoronidase) et des cathepsines. Les elements contenus dans ces granules apportent une importante contribution dans la cascade de reactions conduisant a I’agrCgation plaquettaire discutees plus loin. On trouve Cgalement dans la plaquette un important reseau membranaire : l’un connectk avec le milieu extracellulaire par de profondes invaginations, le systeme canaliculaire ouvert et l’autre, uniquement intracellulaire, appelk le systeme tubulaire dense. 11. Les reponses physiologiques
L’essence m&medes plaquettes est de repondre rapidement a des stimulus. Parmi les agonistes importants du point de vue physiologique, et capables de stimuler les plaquettes, on trouve essentiellement : la thrombine, les fibres de collagene, le thromboxane Az (TXA,), l’ADP, le “platelet aggregating factor” (PAF), la serotonine, la vasopressine, I’adrenaline. Tous ces agonistes sont supposees exercer leurs effets griice a des interactions avec des recepteurs specifiques IocalisCs sur la membrane plasmique. Les reponses plaquettaires sont representees par une ou plusieurs des trois reactions suivantes : le changement de forme (“shape change”), l’agregation et la secretion plaquettaires.
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Le changernentde forme. Au cours du changement de forme et comme le nom l’indique, la plaquette, d’un ttat de repos ou elle presente une forme discoide, subit une restructuration avec la formation de pseudopodes. Cet CvCnement est associe a une complete rkorganisation du cytosquelette de la plaquette. Le changement de forme est un phknomtne important car il reprksente la rtponse plaquettaire la plus sensible aux faibles doses d’agonistes. Cette rkponse est de plus t r b difficile a inhiber. Le changement de forme est souvent CtudiC par la variation de la diffusion de lumiere utiliste pour la mesure de l’agregation, mais le shape-change peut Ctre apprtcik de facon plus precise par la mesure de la lumiere refkchie a 90”’ en particulier si l’on veut s’affranchir des interferences dues a l’agregation. L ’agrkgationplaquettaire. La mesure de I’agrCgation a jouC un grand r81e dans nos connaissances sur les fonctions des plaquettes sanguines. Ceci est dQ en partie au fait que l’agrtgation in vitro est sensee Ctre le reflet de l’agregation in vivo. L’agrCgation peut Ctre facilement mesurte par la mkthode spectrophotomktrique initialement dCcrite par BORN(1962) : quand un agoniste est ajoutt dans la suspension plaquettaire sous agitation et thermostatke a 37”’ l’agregation des plaquettes se traduit par une augmentation de la transmission lumineuse. En utilisant une concentration adequate d’inducteur, l’agregation peut Etre decomposte en deux phases distinctes. La seconde phase (ou vague) reprtsente vraisemblablement le resultat d’un processus qui n’a ettc que partiellement dtclenche par l’inducteur initial. Cette seconde phase d’agrkgation est toujours accompagnee par la skcrktion des granules denses et par la synthtse de prostano’ides. Cette seconde phase est inhibee par I’aspirine. Avec une concentration plus d e v k en agoniste, une agrkgation compltte est observCe mCme si la synthese de prostanoides et la secretion sont inhibtes par l’aspirine. Les termes d’agrtgation primaire et secondaire sont alors utilists pour representer l’agrtgation seule et l’agregation avec secretion. La skcrktion plaquettaire. La secretion est le reflet de la liberation des diffkrents granules plaquettaires par exocytose. C’est ainsi qu’est libere dans le milieu extracellulaire ou, c o m e le montrent differentes etudes, dans le systtme canaliculaire ouvert, le contenu des granules plaquettaires. Du fait de la grande variCt6 des substances liberables, il existe donc plusieurs mtthodes capables d’apprecier la secretion des granules plaquettaires. La mesure de la liberation de la D-TG et/ou du PF4 est surtout reservCe a l’apprkciation de l’hyperactivitk plaquettaire in vivo. En effet, du fait de leur coot relativement eleve, ces mkthodes ne sont que trts peu utilisees pour la mesure de la secretion plaquettaire in vitro. I1 en est de mCme pour la mesure des eniymes lysosomales. D’autres methodes utilisant des electrodes spkcifiques existent pour la mesure de la secretion des ions calcium et peuvent Ctre utiliskes en continu. La secretion d’ATP a 6ttt relativement developpee in vitro par l’utilisation de la luminescence de l’association lucifkrine-luciferase.Des appareils specifiques ont 6ttc tlaborb. Cependant, bien que t r b sensible, cette technique nkessite la presence d’ions Mgz+pour l’activitt de la luciferase; de plus, des interferences ont ete rapportkes, mettant en cause la qualite des reactifs qui potentialiseraient les reactions plaquettaires.
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La mCthode la plus utilisee demeure la mesure de la liberation de skrotonineradiomarquke, prkincorporee dans les plaquettes et sCcrettCe lors de la stimulation (COSTAet MURPHY,1975). En effet, la plaquette est capable d’accumuler de grandes quantitts de skrotonine, si bien que la quasi-totalit6 de la sCrotonine circulante est contenue dans les granules denses plaquettaires. Cependant cette dernihe methode necessite l’utilisation de strotonine radioactive et suppose que la skrotonine captee soit libCree lors de la stimulation; ceci peut ne pas Etre le cas si la 5-HT recaptee ne se trouve pas dans les granules liberables. Par consequent, les methodes mesurant la 5-HT endogene libCree sont prtfkrables lorsqu’elles peuvent Ctre utilisees en routine. Des methodes fluorimitriques sont utiliskes mais elles ont les inconvenients d’Ctre longues et laborieuses. Celles utilisant un materiel relativement lourd comme la chromatographie liquide a haute pression peuvent presenter un certain interst en particulier , couplees avec une detection Clectrochimique qui confere une plus grande sensibilite par rapport a la detection par fluorescence. La mtthode la plus en cours et mise au point dans notre laboratoire utilise la voltametrie impulsionnelle diffkrentielle au moyen de micro-Clectrodesde fibre de C carbone traitees electrochimiquement ( ~ ~ A R C E N A et BLACHE,1985). Ces electrodes et les traitements tlectrochimiques associks ont ettc initialement ClaborCs pour 1’Ctude des neurotransmetteurs par implantation dans le cerveau de rat. Pour la mesure de la secretion de la serotonine plaquettaire, la methode est relativement simple puisqu’elle consiste uniquement a immerger les electrodes dans le surnageant obtenu a p r b breve centrifugation d’une suspension de plaquettes stimulks par un agoniste. La mesure s’effectue aprts calibration par rapport A une solution de serotonine etalon. La methode permet kgalement d’effectuer, si besoin est, un suivi de la secretion en continu et simultanement a l’agrkgation en immergeant les electrodes directement dans la cuvette de l’agrkgomttre. I1 est possible a l’aide de cette mtthode d’apprkcier le contenu total en 5-HT d’une suspension plaquettaire prealablement lydes. Les plaquettes posstdent Cgalement d’autres propriCtCs comme celle d’adhkrer sur du verre ou sur du collagtne. Les etudes de diffkrents inducteurs ont montrC que chacun peut individuellement presenter des effets physiologiques ou biochimiques differents. C’est ainsi que si la thrombine induit des rkponses plaquettaires complttes, I’ADP ou l’adrenaline ne peuvent induire de secretion que si la biosynthese de TXA, est mise en jeu. On parle ainsi d’agonistes forts et d’agonistes faibles. 111. Couplage stimulus-rCponse
Lorsque les plaquettes sont activees, de nombreuses modifications metaboliques ont lieu. Une baisse importante de la charge energetique de la plaquette a pu Ctre mise en evidence de facon concomittante avec une augmentation de la glycolyse sans respiration; il y a transformation du glucose (ou du glycogene) en lactate. D’autres changements ont kgalement lieu dont certains ont fait l’objet d’intenses recherches comme les modifications du metabolisme des phospholipides et de
STRUCTURE ET FONCTIONS DES PLAQUETTES SANGUINES
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l’acide arachidonique, I’activation de proteines kinases et la phosphorylation de prottines contractiles de la plaquette en relation avec de profondes modifications du cytosquelette. Simultankment, la surface de la membrane plaquettaire subit Cgalement des changements, comme l’expression de recepteurs au fibrinogkne et des modifications du potentiel de membrane et du pH intraplaquettaire; de plus il y a des modifications des mouvements ioniques en particulier des ions calcium.
III-I. Role du calcium extra- et intracellulaire Le calcium est certainement le plus Ctudie et le plus gCnCralement accept6 des seconds messagers plaquettaires. Bien que ceci decoule d’analogie avec d’autres cellules, cela rksulte Cgalement de conclusions de travaux utilisant des ionophores specifiques et d’antogonistes. En effet, la plaquette est de trop petite taille pour permettre des etudes de type electrophysiologique par l’introduction d’electrodes. L’analyse des mouvements calciques intracellulaire n’a pu progresser que grace a la mise au point d’indicateurs performants. Les indicateurs metallochromiques (murexide, arsenazo I11 et antipyrylazo 111) ne purent pas &treutilises pour les plaquettes puisqu’ils necessitent d’&tre internalises. Apres la chlortetracycline, fluorescente en presence de Ca“ dans un environnement lipidique et dont il fallait par consequent mesurer la baisse de fluorescence, il y eut alors la mise au point de sondes telles que le Quin 2, le Fura 2 ou I’Indo 1 . Ces derniers indicateurs sont incorporks dans les cellules sous forme d’esters lipophiles et deviennent preferentiellement cytosoliques apres action d’estkrases cellulaires non spkcifiques. 11s presentent alors les proprietes de fluorescer lorsqu’ils chelatent spkcifiquement des ions calcium. Une autre mCthode utilise la proprittk de certaines photoprotkines sensibles au Ca2+telles que l’aequorine, apres incorporation dans la plaquette. Depuis les travaux de LEBRETON et al. (1976), on sait que la stimulation de plaquettes par des agents agregants provoque une redistribution du calcium intraplaquettaire. Ces auteurs utiliskent la dkcroissance de la fluorescence de la chlortktracycline insCree dans des plaquettes humaines. Ces resultats ont CtC recemment retvalues et confirmts par comparaison avec les methodes recentes d’apprkciation du calcium libre mise au point par TSIEN(1982) utilisant le Quin 2. L’ensemble de ces rbultats, ainsi que ceux obtenus avec d’autres techniques de mesure permet d’apporter des evidences aussi bien en faveur d’une decharge interne de calcium que d’une entree du calcium extracellulaire. Ces deux possibilites et les arguments experimentaux qui les soustendent seront successivement envisages. Evidences en faveur d’une dkcharge interne de calcium. Une bonne partie des riponses plaquettaires a une stimulation peut Ctre obtenue en l’absence de calcium dans le milieu. De mCme, la stimulation par l’ionophore A23287 permet d’obtenir le changement de forme et la secretion plaquettaire en l’absence de calcium externe. Par rapport a nos connaissances sur la propriCtC d’un ionophore, qui est de transporter les ions de faGon plus ou moins specifique a travers les membranes, ceci suggere la presence de reserves internes
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mobilisables de Ca’+. Celles-ci seraient contenues dans un systeme analogue au reticulum sarcoplasmique et ayant la propriete d’accumuler du calcium en presence d’ATP. Cette structure serait le systeme tubulaire dense plaquettaire initialement dCcrit par les microscopistes. Les experiences sur la decroissance de la fluorescence de la chlortetracycline avaient deja montre qu’en presence d’EGTA, on pouvait mettre en evidence une certaine difference entre les inducteurs. En effet, en l’absence de calcium extracellulaire, I’adrCnaline et le collagkne se sont revelks incapables de mobiliser le calcium interne de plaquettes traitkes par l’aspirine. Les experiences plus recentes de RINK et al. (1982) utilisant le Quin 2 ou le Fura 2 montrent que la concentration calcique de base de plaquettes au repos est inferieure a 100 nM. Apres stimulation par la thrombine en presence d’EGTA, ce taux s’eleve a 300 nM avec le Quin et plus (500-1000 nM) avec le Fura 2 qui possede un meilleur rendement quantique. De plus, certaines evidences ont pu Ctre obtenues en faveur de mecanismes independants de l’elevation de calcium interne, en particulier lors de stimulation par les esters de phorbol ou le diacylglycerol. Des resultats opposes ont par contre, ete obtenus lors de I’utilisation de I’aequorine. Ces differences ne seraient pas dues uniquement au fort pouvoir tampon vis-a-vis du calcium, du Quin 2 par rapport a I’aequorine, mais plut8t au fait que cette derniere detecte des variations de calcium plus localiskes. Ces conclusions sont Cgalement renforcees par l’observation d’un meilleur suivi du “shape change” avec l’aequorine qu’avec le Quin 2. Quelle est la source du calcium plaquettaire liberable ? M&mesi les granules denses contiennent plus de 60% du calcium plaquettaire, celui-ci n’est pas en kquilibre avec le cytosol et ne peut pas jouer un r81e de second messager. I1 en est de meme du calcium contenu dans les mitochondries. Un des meilleurs candidats serait le calcium du systeme tubulaire dense qui renferme une Ca-Mg ATPase analogue a celle decrite pour le reticulum sarcoplasmique. Evidences en faveur d’une entree de calcium. Plusieurs faits experimentaux sont en faveur d’une entree de calcium extracellulaire au cours de la stimulation des plaquettes sanguines. Tout d’abord, une augmentation importante de la capture du radiocalcium sous I’effet de nombreux inducteurs; ensuite, l’tlevation de la concentration en calcium libre interne, apprtcite aussi bien avec le Quin 2, le Fura 2 ou l’aequorine est plus importante en presence de calcium extracellulaire qu’en son absence. Ceci a Ct6 systkmatiquement retrouve par de nombreux auteurs et pour des inducteurs aussi varies que la thrombine, le PAF, la vasopressine, 1’ADP, les mimttiques du thromboxane A*. L’entrte de cations peut &tre egalement mise en evidence par la stimulation de plaquettes chargees en Quin 2, en presence de Mn2+.L’influx de ce cation est alors rCvClte par sa propriete d’affaiblir le signal de fluorescence du Quin. De plus, l’utilisation de cations pouvant se substituer au Ca2+,tels que le Sr’’ et le Ba2+ et susceptibles d’emprunter Ies m@mesvoies de penetration pour entrainer les reponses physiologiques est Cgalement un Clement important. Enfin, le fait que des
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A20 inhibiteurs inorganiques de mouvements calciques comme le Ni”, le CdZ+,le MnZ+et organiques comme certaines dihydropyridines, inhibent I’augmentation de la concentration libre de Ca2+,la secretion et l’agrtgation plaquettaire sont d’autres elements en faveur de l’existence d’un influx de calcium lors de stimulation. Par ailleurs, il faut signaler que l’influx de calcium peut lui-mCme dkclencher une liberation a partir de reserves internes (“Caz+-induced Ca2+ release”, FAJHATO, 1979). Cette possibilite peut Ctre raisonnablement envisagee par analogie avec le fonctionnement de la cellule cardiaque. Le canal calcique plaquettaire. Les ions calcium M transitent selon le gradient de concentration ( a I’extCrieur, lo-’ M a I’interieur) a travers des structures spkcialisees appelees canaux calciques. Les propriCtCs de ces canaux ont Ctt tres Ctudites du point de vue Clectrophysiologique et pharmacologique. C’est ainsi que I’on distingue actuellement 3 types de canaux : 1/ les canaux de type L : ils sont sensibles aux dihydropyridines et possedent une sClectivit6 pour le Ca2+,Sr2+,Ba2+,une cinetique d’activation et d’inactivation lente; 2/ les canaux de type T : ils ont d’abord etC observes dans des preparations neuronales. 11s possedent des cinktiques d’activation et d’inactivation rapides. 11s sont peu sensibles au Cd2+ et aux dihydropyridines; 3/ les canaux de type N : ils ne prksentent les caractkristiques ni des canaux L, ni des T. 11s sont caracterisks par une conductance unitaire intermediaire entre celles des canaux L et T, une grande sensibilitk au Cd2+, une insensibilitk aux dihydropyridines. En ce qui concerne la plaquette sanguine, de nombreuses evidences experimentales sont en faveur de l’implications de structures de type canal calcique dans le fonctionnement plaquettaire. Les experiences de reconstitution de vtsicules membranaires plaquettaires dans des bicouches lipidiques ont permis l’enregistrement de courants calciques (ZSCHAUER et al., 1988). I1 faut noter que ces courants n’ont pu Stre mis en evidence que lorsque les vCsicules membranaires provenaient de plaquettes prealablement stimulCes par la thrombine. De plus, ces courants sont insensibles aux dihydropyridines et sensibles aux inhibiteurs inorganiques (Ni,’). Les structures impliquies n’ont pas 6tC etudiees de maniere plus approfondie par les auteurs, mais de bons candidats semblent Ctre les glycoproteines IIb et IIIa. En effet, ces glycoproteines s’associent en un complexe lors de la stimulation et representent le recepteur du fibrinogene. Parmi les evidences susceptibles d’impliquer le complexe GPIlb-IIIa dans les mouvements calciques, on peut trouver : 1/ le complexe prisente des sites de fixation du calcium; 2/ les plaquettes provenant de sujets thrombastheniques agregent moins et sont dificientes en ce complexe; 3/ la liaison de 45Caz+ sur des plaquettes de thrombastheniques est rCduite de 50% par rapport aux sujets normaux. RCcemment, au moyen d’anticorps monoclonaux, il a ettc suggere que le canal calcium plaquettaire n’etait pas les GPIIb-IIIa, mais qu’il Ctait situC a proximite (PowLING et HARDISTY, 1985). Des travaux japonais pretendaient le contraire, en utilisant des anticorps
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monoclonaux et des plaquettes chargees d’aequorine (YAMAGUSHI et af., 1987). Plus rkcemment, des auteurs ont incorpore ces glycoproteines dans des vksicules phospholipidiques en presence de Fura 2 (RYBAKet al., 1988). I1 a ete montrC que le complexe GPIIb-IIIa pourrait fonctionner comme un canal a condition que ces glycoproteines soient incorporees dans les vtsicules sous forme de complexe tel qu’il peut Ctre obtenu lors de stimulation par la thrombine. Rkemment, des auteurs ont CtudiC par des techniques electrophysiologiques, la capacite du complexe GPIIb-IIIa purifie et rkincorpore dans des bicouches phospholipidiques a fonctionner comme un canal calcique. Les auteurs concluent que ce complexe peut se comporter comme un canal et af., 1991). permeable aux cations divalents (FUJIMOTO 111-2. Les mkcanismes mis en jeu
111.2.1-Activation des phospholipases
La phospholipase A, (PLA,) hydrolyse essentiellement les phosphatidyl-choline, -ethanolamine et inositol membranaires pour en liberer l’acide arachidonique qui est alors metabolist par la cyclooxygCnase et par la lipoxygknase. La PLA, a ete purifiee aussi bien a partir de fractions membranaires que de fractions solubles. La PLA, plaquettaire est fortement calcium-dependantebien que les etudes sur sa sensibilitk au Ca2+fassent Ctat de concentrations optimales allant de plusieurs mM a moins de 1 pM. L’activation de la PLA, a lieu par les differents inducteurs mais seule I’augmentation du calcium causee par ceux-ci pourrait &treun element activateur suffisant. I1 a etC rapporte recemment que les plaquettes contiennent une famille de protkines, les lipocortines, qui inhiberaient la PLA,. Si un effet inhibiteur direct sur l’enzyme semble de moins en moins evident, il faudrait plutbt retenir une action sur le substrat phospholipidique. Phospholipase C. RITTENHOUSE (1983) fut la premiere montrer que les phosphatidylinositol des plaquettes stirnulees par la thrombine subissent l’action d’une phospholipase C pour produire du diacylglyckrol (DAG) qui s’accumule de faqon rapide mais transitoire. Cette phopholipase avait CtC initialement mise en evidence par MAUCO et al. (1979) dans des surnageant plaquettaires en presence de Caz+.Tres rapidement, le DAG se transforme en acide phosphatidique dont le taux Cleve avait etC montre aprks stimulation par de nombreux agonistes. Cette liberation de DAG et d’acide phosphatidique intervient egalement en presence d’aspirine, ce qui montre une activation independante de la phospholipase C par les inducteurs. De plus, le fait que les polyphosphoinositidesqui peuvent lier une grande quantite de calcium soient egalement substrat de la phospholipase C, et puissent produire du DAG, a engendrk un regain d’interet pour ces phospholipides. Cette hypothese a cependant faibli lorsque la dkcouverte a CtC faite que le co-produit de I’action de la phospholipase C, l’inositol triphosphate (Ins 1,4,5 P3), Ctait capable d’induire la liberation du calcium a partir du reticulum sarcoplasmique de nombreuses cellules. De plus des recepteurs pour l’inositol triphosphate ont kttc rnis en evidence sur des microsomes de diffkrentes cellules, y compris les plaquettes sanguines. L’Ctude du metabolisme et de I’interconver-
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STRUCTURE ET FONCTIONS DES PLAQUETTES SANGUINES
sion des produits de la phospholipase C derives de I’inositol plus ou moins phosphoryles et tenant compte egalement des derives cycliques, fait l’objet d’une intense recherche dans differentes cellules, en particulier, le derive Ins (1,3,4,5) P, qui pourrait Etre un stimulateur direct de l’influx transmembranaire de calcium. Phospholipase D. Rtcemment, il y a de plus en plus d’evidences experimentales en faveur de I’implication de la phospholipase D dans I’activation cellulaire. Dans certaines cellules, comme les neutrophiles, la production d’acide phosphatidique a partir de phophatidylcholine peut representer une source importante de diacylglycerol. Dans les plaquettes sanguines, I’activation de cette phospholipase D a egalement lieu et jouerait donc un r6le dans la transduction du signal. III-2.2-Rele des proteines G Bien que les protiines liant les nucleotides guaniliques ou proteines G , soient connues depuis longtemps pour leur couplage a I’activation (G,) ou l’inhibition (GJ de l’adenylate cyclase lors de I’action hormonale, un renouveau pour cette famille de proteines a eu lieu quand leurs proprietes d’activer les phospholipases C ont CtC mises en evidence. Ces proteines sont constituees d’un complexe trimirique compost5 d’une sous-unite alpha liant specifiquement les nucleotides guaniliques et d’un dimere bCta-gamma. L’occupation des recepteurs stimule le remplacement du GDP lie a la sous-unite alpha par du GTP, ce qui conduit a la dissociation de la prottine en ses composants alpha et b&ta-gamma.Le GTP est hydrolyse et le complexe ternaire alpha-beta-gamma se reforme. Comme ce cycle se repete tant que le rkcepteur est occupe, l’activite GTPase se trouve stirnulee d’ou l’interet d’utiliser des derives non-hydrolysables du GTP (comme le GTPyS) qui induisent une stimulation permanente de l’activite. Comme les plaquettes sont imperrnkables aux derives guaniliques, il est necessaire d’utiliser des modeles de plaquettes permeabiliskes soit par la digitonine, soit par Clectro-permeabilisation. Ainsi, la stimulation des proteines G par le GTPyS par exemple, abaisse fortement la concentration en calcium necessaire pour induire la secretion plaquettaire. Mais dans ces conditions, la production de diacylglycerol est Cgalement augmentee; par consequent, les proteines G jouent Cgalement un rBle dans I’hydrolyse des phosphoinositides (voir MANNING et BRASS,1991). 111-2.3-La proteine kinase C ~~~~~
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Les proteines kinases C sont une famille d’enzymes de 80 kDa qui catalysent la phosphorylation de proteines spkcifiques a partir d’ATP en presence de Caz+ et de phosphatidylserine. Le groupe de NISHIZUKA et al. (1984) demontra que I’addition du diacylglycerol abaisse la concentration en calcium necessaire a des taux physiologiques (0.1-1 pM).I1 a donc CtC propose que le diacylglycerol forme par l’action de la phospholipase C agirait comme un second messager dans la plaquette. Par ailleurs, il a Cte montre que les esters de phorbol, qui sont des promoteurs, sont de puissants stimulants de la p r o t h e kinase C et stimulent les reponses plaquettaires. On connait au moins deux substrats importants pour la proteine kinase C qui sont
deux proteines majeures phophorylees en presence de thrombine : 1/ la chaine legere de la myosine plaquettaire (PM 20 kDa) qui est le substrat de la kinase regulee par le Ca2+et la calmoduline; 2/ la proteine appelee P47 dont la fonction est encore relativement obscure. Selon cette hypothese, moins en vogue actuellement, cette derniere prottine presenterait certaines analogies avec une lipocortine. Une autre hypothese, plus recente, serait en faveur d’une identite avec la 5-phosphomonoesterase. Le modele de Nishizuka int6gre parfaitement le r61e du CaZ+et de la proteine kinase C a travers les phophorylations de la myosine et de la P47 lors de la stimulation des plaquettes par la thrornbine. La prot h e kinase C a ete egalement irnpliquee dans l’induction du rkepteur au fibrinogene represente par le complexe GPIIb-GPIIIa de plaquettes permkabilides. De plus, la stimulation de la proteine kinase C semble Ctre de plus en plus reliee a un effet de “feed-back” nkgatif sur la fonction plaquettaire. En effet, ces conclusions resultent d’observations d’inhibition de la formation d’acide phosphatidique et de la mobilisation du calcium causke par les esters de phorbol. Des travaux l’impliquerait plutat dans la terminaison du signal calcique et dans l’extraction du calcium pour reconstituer le taux basal. I1 faut cependant noter que I’utilisation de stimulateurs de la proteine kinase C, tels que les esters de phorbol, ne sont pas le reflet fidele de reactions physiologiques car ils engendrent une stimulation permanente et non transitoire. III-2.4-Rble des nucleotides cycliques L’activation des plaquettes est modulee par des processus capables d’attenuer ou d’inhiber Ies rkponses induites par les agonistes. C’est ainsi que I’AMP cyclique joue un r61e d’une grande importance. Ce dernier est produit dans la plaquette sous l’activite de l’adenylate cyclase gtntralement a partir de stimulation exogene, comme par exemple la prostacycline (PGI,) de source vasculaire. Le mecanisme semble mettre en jeu des prottines kinases dependantes de I’AMP cyclique. Ce nucleotide entraine de nombreux effets comme la diminution du nombre de recepteurs a la thrombine, la production de DAG. L’AMPc semble Cgalement affecter directement l’activite de la proteine kinase C. Un des r6le les plus importants est peut-Etre l’existence d’interactions avec le metabolisme des ions calcium. Certains travaux montrent que 1’AMPc influence la concentration calcique intracytosolique vraisemblablement en agissant sur le syst6me tubulaire dense. Ces faits expkrimentaux ont ete obtenus aussi bien de faqon indirecte par des stimulants de l’adenylate cyclase comme les prostaglandines D, et I, ou de maniere plus directe par des derives photoactivables de 1’AMPc. Ces derniers derives comme celui synthetise par J . NERBONNE el al. (1984) passent d’un etat inactif du point de vue physiologique, a un ttat actif par liberation d’AMPc apres photoactivation. Ainsi, nous avons pu definir dans un premier temps les conditions d’utilisation de cet analogue sur l’agrtgation et la secretion de plaquettes. Cette technique a ensuite ete couplee avec l’utilisation d’un indicateur fluorescent pour le suivi de la concentration de Caz+libre intraplaquettaire. En utilisant des plaquettes humaines, nos resultats ont mon-
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trt que I’AMPc libere par photo-irradiation entrainait une inhibition de l’amplitude de rCponse du signal fluorescent induit par la thrombine. De plus, lorsque I’AMPc est libere, une fois que le signal calcique attaint son maximum, la baisse de la fluorescence est accentuee par rapport aux condition contrdles (absence de flash lumineux). Ces rksultats tendent A confirmer l’idte que 1’AMPc est implique dans la recapture du Ca2+cytosolique pour le retour au niveau de base et al., 1987). (BLACHE En ce qui concerne les autres nuclkotides cycliques, et en particulier le GMPc, ce dernier a CtC moins ttudiC et son mecanisme d’action reste plus obscur. La plaquette renferme une guanylate cyclase qui est stimulCe lors de l’activation plaquettaire. Le GMPc inhiberait les rtponses plaquettaires aux agonistes, peutZtre en agissant sur l’activationde la phospholipase C. RCcemment, il a ettt montrC un effect inhibiteur du GMPc sur les phosphodiesttrases de I’AMPc. Par consequent, les effets inhibiteurs du GMPc sur les fonctions plaquettaires, s’expliqueraient par une participation a l’augmentation de 1’AMPc. Ce pourrait &re Cgalement un des mkcanismes possibles responsable des effets du(des) EDRF (“endothelial derived relaxingfactor”) qui serait le monoxyde d’azote.
N.Integration des mkcanismes Le couplage stimulus-reponse dans la plaquette met en jeu un ensemble de regulations complexes qui ont
fait l’objet d’ouvrages spCcialisCs (PHILLIPS et S m , 1986). L’intkgration de toutes ces interactions necessite la comprehension de chacun des mdcanismes, de leur implication specifique dans le processus general et la sequence des evenements. I1 peut ne pas y avoir une sequence lineaire unique a partir de la liaison d’un agoniste sur un recepteur jusqu’a la riponse finale. Mais plusieurs mkcanismes pourraient CvoIuer en parallele avec des possibilitks de regulations croiskes ou d’amplifications (voir schema). Les rkponses peuvent &treclasskes en reponses primaires et secondaires suivant leurs situations par rapport a la liaison aux recepteurs. C’est ainsi que la production de DAG et d’IP3 par activation de la phospholipase C d’une part et l’influx de calcium et la liberation du calcium membranaire d’autre part apparaissent comme &ant des evenements primaires. Parmi les evenements secondaires, on trouve alors l’augmentation du calcium libre cytosolique conduisant d’une part, a la phosphorylation de prottines contractiles et d’autre part a l’activation de la phospholipase A, et a la liberation subsequente d’acide arachidonique engendrant la synthese de prostanoides. V. Implication des plaquettes sanguines dans les maladies cardiovasculaires L’athCrosclCrose est une maladie multifactorielle. De nombreux facteurs interagissent les uns avec les autres et sont rarement complhement independants.
membrane plaquettaire
I
Ca”
acide arachidonique
Ca
’+
rbserves calciques
Schema illustrant la transduction du signal mddiee par les recepteurs au cows de I’activation des plaquettes sanguines. Abrkviations :AC : adenylate cyclase; Gi, Gs :protemes G inhibitrice et sthulatrice, respectivement; Ga, Gp, protkine G c o u p k B la phospholipase A, ou a la phospholipase C, respectivement; IP,, inositol 1,4,5-triphosphate; IP,, inositol 1,3,4,5-tktrakisphosphatee; PA, acide phosphatidique; PC, phosphatidylcholine; PE, phosphatidylkthanolamine; PIP,, phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate; stimulation; inhibition. (inspire de NOZAWA et al., 1991)
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STRUCTURE ET FONCTIONS DES PLAQUETTES SANGUINES
Les etudes epidkmiologiques ont permis de degager un certain nombre de facteurs de risque dont l’implication semble de mieux en mieux etablie. I1 en est ainsi du tabac, de l’hypertension, du diabete et des hyperlipidemies. Cependant, il est estimC que ces facteurs permettent d’expliquer pleinement environ 60% de la mortalit6 par maladies cardiovasculaires.Par consequent, d’autres facteurs peuvent Etre proposes et parmi eux, l’hyperactivite des plaquettes sanguines. En effet, de par leur faible demi-vie, les plaquettes rtagissent relativement rapidement a w variations de leur environnement. La rCactivitC de ces cellules se modifie profondement par des variations de leur composition membranaire ou de facteurs pouvant agir sur leurs fonctions. I1 semble que se soit par ce biais que des facteurs comme la nutrition, en particulier la composition en lipides, en vitamines et oligoClCments de la ration soient impliques dans ces pathologies. En effet, dans la plupart des situations ou sont presents des facteurs de risques, une hyperactivitk des plaquettes est mise en evidence. Des plaquettes provenant de sujets diabktiques, hypertendus, hyperlipidhiques ou prenant des contraceptifs oraux agregent plus facilement, secretent plus et synthktisent des quantitks plus importantes de thromboxane A,. D’une faGon gtnerale, ces plaquettes prksentent des modifications de leur homeostasie calcique : influx et/ou concentration libre interne augmentb. Les plaquettes de sujets supplimentes en vitamines (E, C, R-carotene) agrkgent moins, comme le montrent des etudes d’intervention nutritionelle effectuees en Europe du Nord (SALONEN et al., 1991). De nombreuses etudes ont montrt que les composes libires par les plaquettes lors de leur activation, peuvent &re impliques dans I’athtrogenkse. I1 en est ainsi pour la skrotonine, le thromboxane A2, des facteurs mitogkniques et d’endoperoxydes. Les lipoperoxydes peuvent egalement entrainer des modifications de I’activitt des plaquettes mais Cgalement perturber le metabolisme normal des LipoprotCines plasmatiques (en particulier, les lipoprotkines de basse densite, LDL) pour renforcer une situation atherogene (WITZTUMet STEINBERG, 1991). Nous avons dans ce contexte, montrC que les derives de lipoperoxydation, derives d’acides gras polyinsatures ou derives oxygtnts du cholesterol, sont capables de potentialiser les fonc1988; POLETTE tions plaquettaires (BLACHEet BONTOUX, et BLACHE,1992). VI. Perspectives
De nombreuses Ctapes de l’activation des plaquettes sanguines restent a decouvrir. I1 reste egalement A determiner avec precision quelles sont celles qui sont obligatoires pour entrainer les reponses plaquettaires primaires. En effet, du fait de l’importance des plaquettes dans les processus relies a l’atherogenese, cela permettra de nouveaux dkveloppementspharmacologiques dans la thkrapie par la mise au point d’antiplaquettaires plus ciblCs. Ces recherches nkcessistent la mise au point de modeles animaux pour mettre en Cvidence les facteurs responsables et impliquks dans la modulation de l’activite de ces cellules.
Resum6 Les plaquettes sanguines sont des fragments cellulaires discoides anuclkes provenant de cellules prkcurseurs, les megacaryocytes. Les plaquettes sont capables de repondre rapidement a une varittk de stimulus se liant sur la surface plaquettaire a des recepteurs sptcifiques. Ce processus a lieu lors de lesions vasculaires et se traduit par un changement de forme, l’adhksion aux tissus sous-endothehaw nouvellement exposes, la secretion de diverses substances et par I’agrtgation plaquettaire. Au cours de ces phenomenes, un grand nombre de reactions biochimiques sont dkclenchkes telles que l’activation de phospholipases, la liberation de nombreux mkdiateurs, la phosphorylation de protkines. A l’origine de ces reponses, l’augmentation de la concentration en calcium libre intraplaquettaire provenant par I’intermCdiaire de canaux calciques du calcium extracellulaire et de reserves internes, joue un role important. Enfin, on peut considkrer qu’une intensification de ces propriktks est a l’origine de I’implication des plaquettes sanguines dans les maladies cardiovasculaires.
Mots clks : Plaquettes sanguines - agrkgation - s h e tion - activation - calcium - canaux calciques phospholipases - prostanoides - AMPc - protkines G - inositides - maladies cardiovasculaires- lipoperoxydes. Summary Blood platelets are discoid cellular fragments without nucleus originating from megakaryocytes. Platelets are able to respond to a great variety of agonists which bind to specific receptors localized on the plasma membrane. This process takes place when blood vessels are cut. Platelets then change their shape, adhere to newly exposed subendothelial tissues, release the content of numerous secretory granules and aggregate together. During this process, a great numbers of biochemical reactions are triggered such as phospholipases activation, synthesis of mediators and protein phosphorylation. These events result from increased cytoplasmic free calcium originating through calcium channels from the extracellular medium and from internal stores. Involvement of blood platelets in cardiovascular diseases may result from an exageration of these mechanisms by risk factors and are also discussed.
Key words : Blood platelet - aggregation - secretion - activation - calcium - calcium channel - phospholipase - prostanoids - AMPc - G proteins - inositides - cardiovascular diseases - lipoperoxides. Bibliographie BETTERRIDGE, J. (1987) Nutrition and platelet in atherogenesis, Roc. Nutr. SOC. 46, 345-359. BLACHE, D., CIAVATTI, M. &OJEDA,A. (1987) The effects of calcium blockers on blood platelet function, especially calcium uptake, Biochim. Biophys. Acta 923, 401-412. BLACHE,D., CIAVATTI, M., PONSLN, G. & NARCEOT, J. (1987) Direct evidence for the modulation of human platelet cytosolic free Ca by intracellular cyclic AMP produced with a photoactivatable derivative, Biochem. Biophys. Res. Comm. 146, 321-331.
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