15.12. 1975

1395

Speeialia

Influence of A{etyrapone on the hydroxylation of acetanilide by liver microsomes from guinea-pigs of different aseorbie acid status ([xg of product formed) 5[etyrapone concentration

0

10-6 M

10 4 M

10 3 M

10 2 M

Scorbutic group

17.8

22.0 (+21%)

25.5 (+36%)

29.0 (+51%)

24.5 (+32%)

Controls (5 mg ascorbicacid/100g body-weight daily)

23.5

30.5 (+31%)

26.5 (+13%)

18.0 (--23%)

16.0 (--32%)

Figures in brackets are the percentage deviations from the nonMetyrapone value.

acetanilide h y d r o x y l a t i o n s y s t e m is s u m m a r i z e d in t h e Table. S c u r v y i n d u c e d a 40 % r e d u c t i o n in t h e h y d r o x y lation s y s t e m a f i n d i n g in keeping w i t h earlier observ a t i o n s ~. No decrease in m i c r o s o m a l p r o t e i n was f o u n d a n d t h e a d d i t i o n of a s c o r b i c acid or isomers of ascorbic acid t o liver m i c r o s o m e s did n o t influence t h e r a t e of h y d r o x y l a t i o n . The ' b i p h a s i c ' effect of M e t y r a p o n e , d e s c r i b e d b y L e i b m a n 10 for ' n o r m a l ' r a t liver m i c r o s o m a l f r a c t i o n s was p r e s e n t . H o w e v e r , scorbutic m i c r o s o m a l h y d r o x y l a t i o n was s t i m u l a t e d b y M e t y r a p o n e a t all

c o n c e n t r a t i o n s u s e d ; t h e r e w a s no i n h i b i t i o n a t t h e h i g h e r c o n c e n t r a t i o n as in t h e case of m i c r o s o m e s f r o m c o n t r o l animals. This s t i m u l a t i o n b y M e t y r a p o n e of m i c r o s o m a l a c e t anilide h y d r o x y l a t i o n in s c o r b u t i c a n i m a l s could well i n d i c a t e a s c u r v y - i n d u c e d c h a n g e in t h e l i p o p r o t e i n e n v i r o n m e n t of t h e m e m b r a n e - b a s e d P-450 e n a b l i n g a f a s t e r t r a n s f e r of r e d u c i n g e q u i v a l e n t s . A c h a n g e in liver m i c r o s o m a l m e m b r a n e c o n f o r m a t i o n in s c u r v y h a s also b e e n i n d i c a t e d b y a 100-fold increase in t h e fluorescence emission of t h e p r o b e 1 - a n i l i n o - 8 - n a p h t h a l e n e s u l p h o n a t e 4

Summary. Microsomes f r o m livers of scorbutic guineapigs s h o w e d a r e d u c e d r a t e of a c e t a n i l i d e h y d r o x y l a t i o n . The r e s p o n s e of ' s c o r b u t i c ' liver m i c r o s o m e s t o t h e i n h i b i t o r M e t y r a p o n e ( 2 - m e t h y l - i , 2 di ( 3 - p y r i d y l ) p r o p a n 1-one) was d i f f e r e n t f r o m t h a t of liver m i c r o s o m e s f r o m n o n - s c o r b u t i c guinea-pigs. A. M. FIELDING a n d R. E. HUGHES

Department o/Applied Biology, University o/Wales Imtitute o/Science and Technology, Cardiff (Wales, G.B.), 25 June 7975.

10 j~. C. LEIBMAN,lV[olec. Pharmac. 5, 1 (1969).

Stabilitfit v e r s c h i e d e n e r B r a d y k i n i n a n a l o g a g e g e n Kininase II 1 Stability of s o m e B r a d y k i n i n A n a l o g u e s A g a i n s t Kininase II ~ Fiir H o r m o n - R e z e p t o r - B i n d u n g s s t u d i e n m i t d e m N o n a p e p t i d B r a d y k i n i n a n M e m b r a n f r a k t i o n e n aus R a t t e n u t e r u s bzw. R a t t e n d u o d e n u m ist es erforderlich, d e n r a s c h e n e n z y m a t i s c h e n A b b a u dieses P e p t i d h o r m o n s zu v e r h i n d e r n . Das k a n n m i t E n z y m i n h i b i t o r e n oder d u r c h den E i n s a t z a b b a u s t a b i l e r B r a d y k i n i n a n a l o g a e r r e i c h t 100 % ~.

i".'i'~.--------.--..2"=::'"..... :"..................... - ~.~..7.7._. \\

"\, \\

5O

1'o

-~

~'o

io

~o

w e r d e n . So u n t e r d r i i c k t z.B. d e r E i n s a t z v o n orthoP h e n a n t h r o H n die e n z y m a t i s c h e I n a k t i v i e r u n g des H o r m o n s d u r c h die M i k r o s o m e n - u n d M e m b r a n f r a k t i o n e n 2. E s m u s s j e d o c h d a m i t g e r e c h n e t w e r d e n , dass die A n w e s e n h e i t y o n ortho-Phenanthrolin die H o r m o n R e z e p t o r - B i n d u n g s u n t e r s u c h u n g e n verf/ilscht. W i r waren d e s h a l b b e m f i h t , k i n i n a s e s t a b i l e B r a d y k i n i n a n a l o g a m i t h o h e r biologischer A k t i v i t g t a u f z u f i n d e n . Wie wir in friiheren A r b e i t e n d u r c h E i n s a t z y o n vers c h i e d e n e n K i n i n a s e h e m m s t o f f e n zeigen k o n n t e n , e n t h a l t e n M i k r o s o m e n - u n d M e m b r a n f r a k t i o n aus R a t t e n u t e r u s K i n i n a s e I I 2. Dieses s t r u k t u r g e b u n d e n e p r o t e olytische E n z y m s p a l t e t v o n d e m N o n a p e p t i d A r g - P r o P r o - G l y - P h e - S e r - P r o - P h e - A r g das C - t e r m i n a l e D i p e p t i d ab 3. W i r h a b e n d e s h a l b eine R e i h e y o n B r a d y k i n i n a n a l o g a m i t V a r i a t i o n e n in d e n P o s i t i o n e n 8 u n d 9 a u f i h r e n A b b a u d u r c h die 1V[embranfraktion aus R a t t e n u t e r u s u n d die M i k r o s o m e n f r a k t i o n aus R a t t e n d u o d e n u m untersucht. Methode. Die S y n t h e s e n u n d die biologischen A k t i vitXten der als S u b s t r a t e i n g e s e t z t e n B r a d y k i n i n a n a l o g a

iOr~~

Inkubati0n(37~ Abbau von Bradykinin und verschiedenen Bradykininanaloga durch die Membranfraktion aus Rattenuterus (75 ~xg Protein Uterusmemmembranen pro Inkubationsansatz). -Bradykinin; . . . . . . [8-erythro-Phenylserin]-Bradykinin; . . . . . . . . [8-t hreo- Phenylserin]B r a d y k i n i u ; - - - [8-erythro-~-Amino-~-phenylbutters~iure]-Bradykinin; .......... [8-Cyelohexylalanin~-Bradykinin ; ............ [6Glycin, 8-Tyrosin]-Bradykinin ; . . . . . . . . . . E9-Homoarginin-Bradykinin.

1 2.Mitteilung: Untersuchungen an bradykininbindenden Zellfraktionen. T. JANKOVA, I. PAEGELOW, S. REISSMANN and H. AROLD, Acta biol. med. germ. 34, 9 (1975). 3 H, Y. T. YANGund E. G. ERD6S, Nature, Lond. 215. 1402 (1967).

1396

Specialia

EXPERIENTIA 31/12

Abbau voii Bradykinin uiid versehiedener Bradykininanaloga dureh die Mikrosomenfraktion aus Ratteiiduodenum (2 ~tg Protein pro Inkubationsaiisatz) Substrat

Konzentration

Restaktivit/it all Substrat

an Substrat (~xg)

naeh Inkubation bei 37 ~ 40 Min.

Bradykinin Bradykinin + o-Phenanthrolin

1,25 1,25

[8-erythro- Phenylserin]-Bradykinin a, a [8-threo-Phenylserin]-BradyMnin4, 6 [8-erythro-oc-Amino-fl-phenylbut ters~iure]-Bradykinin 4, ~ [6-Glycin, 8-Tyrosin] -Bradykinin s [8-fl-Cyelohexylalanin- Bradykinin ~ [9-Homoarginin]-Bradykinin 4, i0

4,5

Biologische Aktivit/it

Ratten-Uterus

Meersehw.-Ileum

60 Mill. 100

100

2,5 1,25

91 98 30

87 98 22

13 8

6 3

1,25 5,0 1,25 1,25

77 32 12 73

78 24 2 59

52 0,4 14 10

sind v o n uns in friiheren A r b e i t e n b e s c h r i e b e n w o r d e n 4-10. M i k r o s o m e n - u n d 3/iembranfraktion aus U t e r u s u n d D u o d e n u m v o n W i s t a r - R a t t e i i isolierten wir n a c h einer y o n uiis a u s g e a r b e i t e t e n M e t h o d e 3,11. Die k i n i i i a b b a u e n d e AktivitAt der M e m b r a n - u n d M i k r o s o m e n f r a k t i o n (75 ~g P r o t e i n U t e r u s m e m b r a n e n ; 2 ~g P r o t e i n D u o d e n u m m i k r o s o m e n ) w u r d e d u t c h Inkubation mit Bradykinin und Bradykininanaloga (1,25 his 5 ~g in 0,4 m l 0,1 M Tris-Puffer, p H 7,5) bei 37~ b e s t i m m t . Die R e s t a k t i v i t / i t des B r a d y k i n i n s e r m i t t e l t e n wir n a c h 10, 20, 30, 40 u n d 60 Min. a m isoliert e n M e e r s c h w e i n c h e n i l e u m (Tyrode-L6sung, Carbogenbegasung). D a r i i b e r h i n a u s b e s t i m m t e n wir die A b b a u g e s c h w i n d i g k e i t y o n N e - T r i t i u m a c e t y l - B r a d y k i n i n (1,1 Ci/mMol) u n d einigen A n a l o g a m i t t e l s p a p i e r e l e k t r o p h o r e t i s c h e r T r e i i n u n g (feuchte K a m m e r , Schleicher u n d Schtill~Papier 2040A, 6~o Essigs/~ure als E l e k t r o l y t , 23V/cm) voii A u s g a n g s - u n d S p a l t p r o d u k t u n d anschliess e n d e r Szintillationsz/ihlung. Die n a c h b e i d e n M e t h o d e n e r h a l t e n e n W e r t e s t i m m e n tiberein. Ergebnisse und Diskussion. D e r A b b a u d e r B r a d y k i n i n a n a l o g a d u r c h die M e m b r a n f r a k t i o n aus R a t t e n u t e r u s ist g r a p h i s c h dargestellt. Die Tabelle g i b t d e n A b b a u d u r c h die M i k r o s o m e n f r a k t i o n aus R a t t e n d u o d e n u m wieder. Als stabil gegen d e n e n z y m a t i s c h e n A b b a u d u r c h die Uterus-lV[embranfraktioii erwiesen sich die b e i d e n B r a d y k i n i i i a n a l o g a [8-erythro-a-Amino-flp h e n y l b u t t e r s / i u r e ] - B r a d y k i i i i i i u n d [8-erythro-C]-Phenyls e r i n ] - B r a d y k i n i m D a das l e t z t e r e n u r eine biologische A k t i v i t / i t y o n 13 %, b e z o g e n auf Bradykiiiin, a m U t e r u s besitzt, ist das [ 8 - e r y t h r o - e - A m i n o - f l - p h e n y l b u t t e r s / i u r e ] t3radykinin m i t einer A k t i v i t / i t voii 52 % fiir H o r m o n t ~ e z e p t o r - B i n d u n g s s t u d i e n geeigneter. A u c h bei der e n z y m a t i s c h e n I n a k t i v i e r u n g d u r c h die M i k r o s o m e n f r a k t i o n aus R a t t e n d u o d e n u m zeigt sich, dass die b e i d e n A n a l o g a IIicht oder n u r l a n g s a m a b g e b a u t w e r d e n . Das [ 8 - e r y t h r o - e - A m i n o - ~ - p h e n y l b u t t e r s g u r e ~ - B r a d y k i n i n ist gegen diese M i k r o s o m e n f r a k t i o n n i c h t so stabil wie gegen die M e m b r a n f r a k t i o n aus R a t t e n u t e r u s . D a s ist w a h r scheinlich auf die A n w e s e n h e i t n o c h a n d e r e r b r a d y k i n i n a b b a u e n d e r E n z y m e zurtickzufiihren. Die S u b s t i t u t i o n des fi-C-Atoms des P h e n y l a l a n i n restes in P o s i t i o n 8 d e r B r a d y k i n i i i s e q u e n z v e r h i n d e r t bei Vorliegen der e r y t h r o - K o n f i g u r a t i o n die e n z y m a t i sche A b s p a l t u n g des C-terminaleii D i p e p t i d e s 8-9 d u r c h die K i n i n a s e I I der u n t e r s u c h t e n M e m b r a n - bzw. Mikrosomenfraktion. Die K i n i n a s e I I der b e i d e n Pr/~parationen s p a l t e t s e h r stereospezifisch. W ~ h r e n d [ 8 - e r y t h r o - ~ - P h e n y l s e r i n ] - B r a d y k i n i n s t a b i l ist, w i r d [ 8 - t h r e o - f l - P h e n y l s e r i n ] - B r a d y -

4,5

kinin m i t a n n / i h e r n d gleicher B r a d y k i n i n selbst a b g e b a u t .

21 0,6 11 24

Geschwindigkeit

wie

Summary. Some analogues of b r a d y k i n i n , especially w i t h r e p l a c e m e n t s b y o t h e r a m i n o acids of p h e n y l a l a i i i n e in p o s i t i o n 8, h a v e b e e n i n v e s t i g a t e d for e n z y m a t i c stabili t y a g a i n s t kininase I I f r o m r a t d u o d e n u m m i c r o s o m e s a n d r a t u t e r u s p l a s m a m e m b r a n e s , respectively. As c o m p a r e d w i t h b r a d y k i n i n , t w o of t h e analogues, [8e r y t h r o - f l - p h e n y l s e r i n e ] - a n d [8-erythro-~-Amino-/%phen y l b u t y r i c a c i d ] - B r a d y k i n i n were s t a b l e to e n z y m a t i c d e g r a d a t i o n . Therefore, t h e l a t t e r m a y be used for studies in h o r m o n e - r e c e p t o r i n t e r a c t i o n . S. REISSMANN, I. PAEGELOV, I-I. LEISNER u n d ~I. AROLD 12

Sektion Biologie, Wissenscha/tsbereich A llgemeine Biochemie der Friedrich-Schiller- Universitiit, A ugust-Bebel- Strasse 6-8, DDR-69 Jena (Deutsche Demokratische Republik, DDR), und [nstitut liar Pharmakologie und Tozikologie tier Universitdt Rostock, Leninallee 70, DD R-25 Rostock (Deutsche Demokratische Republik, DDR), 28. M a i 7975.

4 S. REISSMANN,I. PAEGELOWund H. AROLD, Acta biol. reed. germ. 33, 77 (1974). H. AROLD und H. FEIST, J. prakt. Chem. 312, 1145 (1970). 6 H. AROLI) und S. REISSMANN, J. prakt. Chem. 312, 1130 (1970). 7 H. AROLD, S. REISSMANNund M. EULE, J. prakt. Chem. 376, 93

(1974). s S. REISS~ANN, M. P; FILATOVA,H. AROLD und V. T. IVANOV,J. prakt. Chem., im Druek. 9 Das [8-CyclohexylaIanin]-Bradykinin wurde mls freundIicherweise yon dem Shemyakin-Institute ftir Bioorganische Chemie der Akademie der Wissensehaften der UdSSR, Moskau, zur Verfiigung gestellt. 10 H. AROLD und D. STIBENZ, J. prakt. Chem. 312, 1161 (1970). 11 T. JANKOVA, C. LIEBMANN, R. REISSMANN, H. STEINMETZGER,

S. REISSMANNund H. AROLD,Expl. Path., in Vorbereitung. x2 Frau Dr. M. P. FILATOVAaus dem Shemyakin-Institut ftir Bioorganische Chemie der Akadeiilie der Wissenschaften der UdSSR, Moskau, danken Wir ftir ihre Mitarbeit bei der Erstellung der Arbeitskonzeption. Ftir die Prfiparation der Membranen sei Frau T. JANKOVA,Herrn C. LIEBMANN und Herrn H. STEINMETZ~R herzlich gedankt. Wir danken Frl. R. RASrE, Frl. B. SCHILLINGund Frau I. AGRICOLAftir die gute technische Mitarbeit bei der biologischen Wertbestimmung und der Prfiparation der Membran - bzw. Mikrosomenfraktion.