EMBRYONIC STEM CELLS/INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS   

1

Department  of  Pharmacology,  Weill Cornell Medical College, 1300  York Avenue, New York, NY 10065,  USA;  2Weill  Cornell  Meyer  Cancer  Center,  1300  York  Avenue,  New  York, NY 10065    To  whom  correspondence  should  be  addressed:  Lorraine  J.  Gudas,  Weill  Cornell  Medical  College,  Pharmacology  York  Avenue  New  York,  New  York,  United  States  10065,  E‐mail:  [email protected],  Tele‐ phone:  212‐746‐6250,  Fax:  212‐ 746‐8858    Received  October  28,  2013;  ac‐ cepted for publication February 28,  2014    ©AlphaMed Press   1066‐5099/2014/$30.00/0    This  article  has  been  accepted  for  publication  and  undergone  full  peer  review  but  has  not  been  through  the  copyediting,  typeset‐ ting,  pagination  and  proofreading  process  which  may  lead  to  differ‐ ences between this version and the  Version  of  Record.  Please  cite  this  article as doi: 10.1002/stem.1706 

Retinoic Acid Suppresses the Canonical Wnt  Signaling Pathway in Embryonic Stem Cells and  Activates the Noncanonical Wnt Signaling  Pathway    KWAME OSEI‐SARFO1,2 AND LORRAINE J. GUDAS1,2    Key words. Retinoic acid • Canonical Wnt signaling • Noncanonical Wnt sig‐ naling • embryonic stem cell differentiation • Transcription factor 7  (Tcf1) • Transcription factor 7‐like 1 (Tcf3)    ABSTRACT    Embryonic stem cells (ESCs) have both the ability to self‐renew and to dif‐ ferentiate into various cell lineages. Retinoic acid (RA), a metabolite of Vit‐ amin  A,  has  a  critical  function  in  initiating  lineage  differentiation  of  ESCs  through binding to the retinoic acid receptors (RARs). Additionally, the Wnt  signaling pathway plays a role in pluripotency and differentiation, depend‐ ing  on  the  activation  status  of  the  canonical  and  noncanonical  pathways.  The activation of the canonical Wnt signaling pathway, which requires the  nuclear accumulation of β‐catenin and its interaction with Tcf1/Lef at Wnt  response  elements,  is  involved  in  ESC  stemness  maintenance.  The  noncanonical Wnt signaling pathway, through actions of Tcf3, can antago‐ nize  the canonical pathway. We show  that RA activates the  noncanonical  Wnt signaling pathway, while concomitantly inhibiting the canonical path‐ way.  RA  increases  the  expression  of  ligands  and  receptors  of  the  noncanonical Wnt pathway (Wnt 5a, 7a, Fzd2 and Fzd6), downstream sig‐ naling, and Tcf3 expression. RA reduces the phosphorylated β‐catenin level  by  4‐fold,  though  total  β‐catenin  levels  don’t  change.  We  show  that  RA  signaling  increases  the  dissociation  of  Tcf1  and  the  association  of  Tcf3  at  promoters of genes that regulate stemness (e.g. NR5A2,Lrh‐1) or differen‐ tiation (eg. Cyr61, Zic5). Knockdown of Tcf3 increases Lrh‐1 transcript levels  in mESCs and prevents the RA‐associated, ~4‐fold increase in Zic5, indicat‐ ing that RA requires Tcf3 to effect changes in Zic5 levels. We demonstrate a  novel  role  for  RA  in  altering  the  activation  of  these  two  Wnt  signaling  pathways and show that Tcf3 mediates some actions of RA during differen‐ tiation. STEM CELLS 2014; 00:000–000 

   

INTRODUCTION    Embryonic  stem  cells  (ESCs)  are  pluripotent  and  self‐ renewing  cells  that  can  differentiate  into  all  three  pri‐ mary  germ  layers  by  using  both  extrinsic  and  intrinsic  factors.  Current  research  involving  ESCs  has  demon‐ strated  their  importance  in  the  mechanisms  of  lineage  commitment,  disease  initiation,  and  cell  therapy  (re‐ viewed in [1]). Retinoids, which consist of vitamin A and  its  derivatives,  are  signaling  molecules  that  control  as‐ pects of embryonic development and cellular differenti‐ STEM CELLS 2014;00:00‐00 www.StemCells.com 

ation [2]. The biological effects of all‐trans‐retinoic acid  (RA),  the  major  bioactive  retinoid,  are  mediated  by  its  binding to retinoic acid receptors (RARs) and retinoid X  receptors (RXRs) that then bind as heterodimers at spe‐ cific  DNA  sites,  known  as  retinoic  acid  response  ele‐ ments  (RAREs)  [3].  In  the  nucleus,  RA  binds  to  hetero‐ dimers of either RARα, β, or ϒ and RXRα, β, or ϒ, which  initiates  the  modification  of  chromatin  structure,  changes  the  status  of  various  epigenetic  marks,  and  alters  the  regulation  of  various  signaling  pathways  [3].  Also, RA can mediate its effects through secondary tar‐ ©AlphaMed Press 2014 

2  gets,  which  are  activated  by  RA  in  an  indirect  manner.  Both  primary  and  secondary  response  genes  can  regu‐ late  various  physiological  processes,  such  as  reproduc‐ tion, embryonic development, epithelial differentiation,  tissue repair, and immune function [4]. Additionally, RA  has been used extensively for the treatment of various  malignancies,  such  as  neuroblastoma,  acute  promyelocytic  leukemia,  oral  cavity  cancer,  non‐small  cell lung cancer, and metastatic breast cancer [5].  In  addition  to  the  role  that  RA  and  other  retinoids  have  in  ESC  differentiation,  Wnt  signaling  has  been  shown to act in concert with retinoid signaling [6]. Wnt  ligands  and  their  associated  receptors  act  to  regulate  several cellular processes, such as embryonic cell differ‐ entiation,  modification  of  cellular  polarity  properties,  and determination of cellular fate [7]. However, the role  that  Wnt  signaling  has  in  regulating  ESC  pluripotency  and  differentiation  is  somewhat  controversial.  Several  studies  have  demonstrated  that  activation  of  the  Wnt  signaling  pathway  can  lead  to  differentiation  [8],  whereas  other  studies  show  that  its  activation  main‐ tains  the  pluripotent  state  [9,10].  In  ESCs,  Wnt  ligands  transduce  their  signaling  effects  through  their  corre‐ sponding Frizzled (Fzd) receptors via either the canoni‐ cal  (β‐catenin  dependent)  or  the  noncanonical  (β‐ catenin independent) pathway [11]. The canonical Wnt  signaling pathway is activated through its ligands, which  include Wnt1,  2,  3a, 8a,  8b,  10a, and  10b  and through  its  receptors  Fzd1,  5,  7  or  9  (http://www.stanford.edu/group/nusselab/cgi‐ bin/wnt/).  In  the  canonical  pathway,  the  absence  of  a  canonical  Wnt  ligand  causes  the  sequestration  of  β‐ catenin  by  its  degradation  complex,  which  consists  of  adenomatous  polyposis  coli  (APC),  axin,  disheveled  (Dvl),  casein  kinase  1α  (CK1α)  and  glycogen  synthase  kinase  3β  (GSK3β)  [7].  When  β‐catenin  is  associated  with  its  degradation  complex,  β‐catenin  is  initially  phosphorylated  by  CK1α  on  Ser45,  followed  by  phos‐ phorylation  on  Ser33,  Ser37,  and  Thr41  by  GSK‐3β  [7].  The phosphorylated β‐catenin is then polyubiquitinated  by the β‐transducin repeat‐containing protein (β‐TrCP1)  complex for  proteasomal degradation [7]. In the active  state  of  the  canonical  pathway,  the  degradation  of  β‐ catenin is suppressed by the binding of a canonical Wnt  ligand  to  a  canonical  Fzd  receptor  and  a  Low‐density  lipoprotein  (LDL)  coreceptor.  The  release  of  nonphosphorylated  β‐catenin  from  the  degradation  complex promotes the relocalization of the cytoplasmic  pool  of  β‐catenin  into  the  nucleus,  where  it  forms  a  complex with a specific T‐cell factor/lymphoid enhancer  factor (Tcf/Lef) for transcriptional activation [7]. Canon‐ ical Wnt signaling takes place when β‐catenin and spe‐ cific  Tcf/Lef  induce  the  transcription  of  several  target  genes,  such  as  nuclear  receptor  subfamily  5,  group  A  (NR5A2;  Lrh‐1),  fibroblast  growth  factor  (FGF20),  dickkopf1  (DKK1),  Wnt‐1  inducible  signaling  pathway  1  (WISP1), and cyclin D1 (CCND1), reviewed in [12]. 

www.StemCells.com 

RA suppresses the canonical Wnt pathway in mESCs  More recently, there have been reports demonstrat‐ ing that the β‐catenin‐independent or the noncanonical  Wnt signaling pathway is involved in many cellular pro‐ cesses,  including  cellular  differentiation  [13].  The  lig‐ ands of the noncanonical Wnt signaling pathway include  Wnt4, 5a, 5b, 6, 7a, 7b and 11 and the receptors of this  pathway  consist  of  Fzd2,  3,  4  and  6  (http://www.stanford.edu/group/nusselab/cgi‐ bin/wnt/).  The  two  major  noncanonical  Wnt  signaling  pathways  are  the  Wnt/jun  N‐terminal  kinase  (JNK)  pathway and the Wnt/calcium (Ca2+) pathway, reviewed  2+ in  [14].  The  activation  of  the  Wnt/calcium  (Ca )  path‐ way ultimately leads to the binding of nuclear factor of  activated  T  cells  (NFAT)  to  specific  DNA  binding  sites  [15].  In  addition,  the  induction  of  CaMKII  can  initiate  the  activation  of  nemo‐like  kinase  (NLK),  which  has  been  shown  to  antagonize  the  downstream  canonical  Wnt  signaling  activities  by  phosphorylating  Tcf1  [15].  Several studies have implicated the interconnectivity of  the canonical and noncanonical Wnt signaling pathways  in stem cell differentiation [16].  One  mechanism  by  which  the  interconnectivity  of  the canonical and noncanonical Wnt signaling pathways  may be achieved is that the noncanonical Wnt signaling  pathway  may  function  as  a  negative  regulator  of  the  canonical pathway, especially through the Tcf/Lef tran‐ scription factors [13]. Although there are several canon‐ ical  and  noncanonical  Wnt  ligands  and  Fzd  receptors,  target  gene  activation  or  repression  is  modulated  through  only  four  transcription  factors:  T‐cell  factor  1  (Tcf1;  Transcription  factor  7,  Tcf7,  NM_201634),  Tcf3  (Transcription factor 7‐like 1, Tcf7l1, NM_031283), Tcf4  (Transcription  factor  7‐like  2,  Tcf7l2,  NM_001198525)  and  Lymphoid  enhancer‐binding  factor  (Lef‐1,  Tran‐ scription factor 7‐like 3, Tcf7l3, NM_016269), reviewed  in [17]. Several reports suggest that Tcf1, Tcf4, and Lef1  function as transcriptional activators and that Tcf3 func‐ tions as a transcriptional repressor [18‐22]. Ishitani and  colleagues  [23]  found  that  upon  activation,  the  noncanonical  pathway  could  repress  the  canonical  pathway through increased phosphorylation of Lef1 on  Thr‐155/Ser166  residues  and  of  Tcf‐4  on  Thr‐178/Thr‐ 189  residues  by  NLK. Phosphorylation of  Lef1 and  Tcf4  prevents  the  binding  of  these  transcription  factors  to  their Wnt responsive elements (WREs) [23].  Tcf3  is  a  functional  component  of  the  Oct4/Sox2/Nanog  circuitry  for  stem  cell  self‐renewal  [24]. Additionally, Chip‐seq analyses demonstrated that  many Tcf3‐bound genes (at least 900 targets) were also  bound  by  Oct4,  Sox2  and  Nanog  [25].  In  regard  to  its  transcriptional  repressive  properties,  Tcf3  binding  to  the  promoter  of  Nanog  reduced  the  transcription  the  stem cell marker, Nanog [19]. However, the loss of Tcf3  by RNA interference (RNAi) blocks the differentiation of  ESCs  [26].  These  contrasting  and  somewhat  contradic‐ tory  results  suggest  that  further  assessment  is  needed  concerning  the  roles  of  Tcf1  and  Tcf3  in  the  activation  and  repression  of  specific  target  genes  in  ESCs  before  and during differentiation.  ©AlphaMed Press 2014 

RA suppresses the canonical Wnt pathway in mESCs 

3  We explored the effects of RA on the canonical and  noncanonical  Wnt  signaling  pathways.  We  found  that  RA  increased  the  expression  of  several  canonical  and  noncanonical  Wnt ligands and Fzd receptors,  culminat‐ ing in the repression of the downstream canonical Wnt  signaling pathway. Additionally, RA treatment increased  the  expression  of  Tcf3,  which  plays  a  role  in  reducing  downstream signaling of the canonical Wnt pathway in  mESCs. Our data will contribute to the understanding of  ESC  biology,  Wnt  signaling,  and  retinoid  pharmacology  by describing a mechanism that delineates the opposing  activities  of  Tcf1  and  Tcf3  in  the  self‐  renewal  and  dif‐ ferentiation of wild type murine ESCs (WT mESCs).   

MATERIALS AND METHODS    Cell culture and chemicals  Wild‐type  murine  ESCs  (WT  mESCs)  and  Cyp26a1  ‐/‐ knockout  (Cyp26a1 )  mESCs  were  cultured  in  media  3 containing 1 x 10  units/ml recombinant murine leuke‐ mia  inhibitory  factor  (LIF;  Cat.  #LIF2010,  Millipore,  Billerica,  MA)  on  gelatin‐coated  culture  plates,  as  de‐ scribed in [27]. Cyp26a1‐/‐ mESCs were generated by the  disruption  of  both  alleles  of  Cyp26a1  through  homolo‐ gous  recombination,  as  previously  described  in  [28].  HPLC  grade  all‐trans‐retinoic  acid  (RA;  Cat.  #R2625,  Sigma, Saint Louis, MO) was dissolved in 100% ethanol.  To induce differentiation, RA was used at a final concen‐ tration of 1 μM by dilution in the culture media and all  experiments  involving  RA  were  performed  under  dim  light conditions.   

RNA isolation, reverse transcription, and  QRT‐PCR 

mESCs  (1  x  104)  were  seeded  in  60  mm  gelatin‐coated  plates. The following day, cells were treated with fresh  culture media containing RA or vehicle. After 48 hours,  mESCs  were  harvested  in  TRIzol  (Cat.  #15596‐026,  Life  Technologies,  Norwalk,  CT)  and  total  RNA  extraction  was performed, as described by the manufacturer. QRT‐ PCR was performed after reverse transcription of isolat‐ ed total RNA. Primers pairs used for PCR analysis can be  found in Supplementary Table 1.   

Chromatin immunoprecipition (ChIP) assays 

Approximately 1 x 106 WT mESCs and were treated with  RA or vehicle. Post 48 hrs, treated cells were subjected  to  the  one‐step  ChIP  protocol,  which  employs  formal‐ dehyde cross‐linking, as described in [27]. The following  antibodies  (2  μg)  were  used  for  these  assays:  rabbit  polyclonal anti‐Tcf3 (D15G11) antibody (Cat. #2883, Cell  Signaling Technologies, Danvers, MA), rabbit polyclonal  anti‐β‐catenin  (Cat.  #ab6302,  Abcam,  Cambridge,  MA),  rabbit  polyclonal  anti‐HA  antibody  (Cat.  #ab9110,  Abcam),  or  secondary  rabbit  IgG  (Cat.  #sc‐2027,  Santa  Cruz  Biotechnology,  Inc.,  Dallas,  TX).  The  primer  pairs  used  in  these  assays  can  be  found  in  Supplementary  Table 2.  www.StemCells.com 

 

Immunoprecipitation (IP) and Western blot  analyses  WT  mESCs  were  seeded  and  treated  with  RA  as  de‐ scribed  above.  For  the  IPs,  cell  lystates  (500  μg)  were  incubated  with  either  1  μg  rabbit  polyclonal  anti‐β‐ catenin  or  secondary  rabbit  IgG.  For  Western  blotting,  the following antibodies were used: mouse monoclonal  anti  β‐actin  (1:10,000;  Cat.  #MAB1501,  EMD  Millipore,  Billerica,  MA),  rabbit  polyclonal  anti‐β‐catenin  (1:4000;  Cat.  #ab6302,  Abcam),  rabbit  polyclonal  anti‐Tcf3  (de‐ scribed  above),  and  rabbit  polyclonal  anti‐phospho  (Ser33/37/Thr41)‐β‐catenin  (1:1000;  Cat  #9561,  Cell  Signaling Technology).   

Luciferase assays  WT  mESCs were  transiently  cotransfected  with  3  μg of  TOPFlash [29], FOPflash [29], NFAT luciferase [30] (Cat.  #10959, Addgene, Cambridge, MA), or Cyp26a1 lucifer‐ ase  (Cyp26a1‐luc)  construct  with  500  ng  pRL  Renilla  luciferase  vector  control  by  using  Lipofectamine  LTX  reagent  (Cat.#  15338‐100,  LifeTechnologies),  as  de‐ scribed  by  the  manufacturer’s  protocol.  Post‐ transfection  (24  hours),  WT  mESCs  were  treated  with  either RA or vehicle for 24 hours. Luciferase activity was  determined  as  described  by  the  manufacturer’s  proto‐ col  in  the  Dual‐Luciferase  Reporter  Assay  System  (Cat.  #E1910, Promega, Madison, WI).   

Generation of stable Luciferase and Tcf1 cell  lines  To generate stable luciferase cell lines, WT mESCs were  co‐transfected  pLKO.1  and  either  TOPFlash,  FOPflash,  NFAT‐luc  [30]  or  Cyp26a1‐luc.  Also,  the  mESC‐Tcf1HA  cell line was generated by transfecting a HA‐tagged Tcf1  cDNA driven by the CMV promoter [31]. Finally, shRNA  constructs,  cloned  into  the  pLKO.1  puro  vector  [32],  targeting Tcf3 were transduced into mESCs by lentiviral  infection.   

Statistical analysis  All experiments were  conducted in at least three inde‐ pendent biological assays and results, where applicable,  are  presented  as  mean±SEM.  All  statistical  analyses  were performed using Prism 4.0a (GraphPad, Inc.).   

Additional materials and methods  RNA isolation and reverse transcription, the ChIP assays,  the IP/Western blotting analyses, and the generation of  stable cell  lines  are further  detailed  in  the  Supplemen‐ tary Materials and Methods.              ©AlphaMed Press 2014 



RESULTS    Retinoic acid (RA) increases the expression of  canonical and noncanonical Wnt ligands and  Frizzled (Fzd) receptors.  To  determine  if  RA treatment  could  initiate the  activa‐ tion of upstream Wnt signaling events, we assessed the  transcript  levels  of  various  Wnt  ligands  and  Fzd  recep‐ tors  of  the  both  the  canonical  and  noncanonical  Wnt  signaling  pathways  after  treating  WT  mESCs  with  RA.  Interestingly,  we  found  increased  expression  of  both  canonical  (Figure  1  A)  and  noncanonical  (Figure  1  B)  Wnt ligands and Fzd receptors. There was at least a 3‐ fold increase (as compared to that of untreated mESCs)  in  the  transcript  levels  of  the  canonical  Wnt  ligands  (Wnt 2, Wnt 3a and Wnt 8a) as well as the canonical Fzd  receptor  (Fzd  1)  in  cells  treated  with  RA  for  48  hours  (Figure  1 A).  After 48  hrs of  RA administration we also  detected significant fold increases in the transcript lev‐ els of the noncanonical Wnt ligands and receptors ‐ Wnt  5a (~4.5 fold increase), Wnt 7a (~6.0 fold increase), Fzd  2  (~3.2  fold  increase),  and  Fzd  6  (~6.0  fold  increase)  (Figure 1 B).   

RA reduces the phosphorylation of β‐catenin  in a time‐dependent manner.  Changes  in  the  phosphorylation  status  of  β‐catenin  have been implicated in stem cell self‐renewal and dif‐ ferentiation [9]. WT mESCs treated with RA for 48 hours  showed approximately a 50% decrease in the amount of  phosphorylated β‐catenin compared to that of vehicle‐ treated WT mESCs (Figure 2 Aiii and 2 Bii). Also, we ob‐ served  a  significant  reduction  in  phosphorylated  β‐ catenin compared to that of vehicle‐treated WT mESCs  at 24 hr after RA treatment (Figure 2 Aiii and 2 Bii), indi‐ cating that the reduced phosphorylation of β‐catenin is  likely to be a secondary RA response. In contrast, we did  not  see  significant  changes  in  the  levels  of  nonphosphorylated  β‐catenin  (total  β‐catenin)  protein  in  RA‐treated  cells  (Figure  2  Ai  and  2Bi).  We  conclude  that  RA  reduces  (as  a  secondary  response)  the  phos‐ phorylation of β‐catenin, which would lead to the asso‐ ciation  of  β‐catenin  with  transcription  factors  involved  in differentiation, such as Tcf3.  Since  there  was  a  significant  decrease  in  the  phos‐ phorylated  β‐catenin  levels  at  24  hours  post‐RA  addi‐ tion,  we  determined  possible  changes  in  the  transcript  levels  of  the  members  of  the  β‐catenin  degradation  complex. At 48 hours post RA addition, we detected no  significant  changes  in  the  transcript  levels  of  Axin  1,  Disheveled 1, and Caesin kinase 1α (Supplementary Fig.  1).         

www.StemCells.com 

RA suppresses the canonical Wnt pathway in mESCs 

The activities of the canonical and  noncanonical Wnt signaling pathways are  modified by RA.  To  determine  the  potential  crosstalk  between  the  ca‐ nonical  and  noncanonical  Wnt  signaling  pathways  in‐ duced  by  RA,  we  performed  luciferase  assays  that  measure  the  activities  of  the  canonical  (TOPFlash‐ luciferase) and noncanonical (NFAT‐luciferase) Wnt sig‐ naling pathways in WT mESCs cultured in the presence  of  RA  or  vehicle.  The  8X  TOPFlash  construct  has  been  used  extensively  to  characterize  the  activation  of  ca‐ nonical  Wnt  signaling  downstream  events  [16,29].  We  employed the NFAT‐luciferase construct, which contains  NFAT  binding  sites,  to  determine  the  activity  of  the  noncanonical  Wnt  signaling  pathway  [33].  In  vehicle‐ treated  WT  mESCs,  there  was  a  higher  amount  of  TOPFlash‐luciferase  activity  (~35  units)  compared  to  that  of  NFAT‐luciferase  activity  (~20  units;  Figure  3  A).  After  24  hours  of  RA  treatment,  we  detected  an  18%  decrease  in  TOPFlash‐luciferase  activity,  compared  to  the TOPFlash activity in RA (‐) cells. Also, we detected a  significant  increase  (65%  increase)  in  NFAT‐luciferase  activity after RA addition (Figure 3 A).  Additionally,  the effects  of  RA  on downstream Wnt  signaling were dose‐dependent (Figure 3 B). WT mESCs  stably  expressing  comparable  levels  of  exogenous  TOPFlash luciferase, NFAT luciferase or Cyp26a1 lucifer‐ ase  constructs  were  used  for  these  luciferase  assays  (Supplementary  Fig.  2  A).  The  Cyp26a1  luciferase  con‐ struct,  which  contains  two  RAREs  in  the  Cyp26a1  pro‐ moter, functioned as a positive indicator of induction by  RA (Supplementary Fig. 2 B). Here, we found that ESCs  treated with RA had increased noncanonical Wnt signal‐ ing at the expense of downstream canonical Wnt signal‐ ing,  suggesting that  differentiation  of  ESCs  may  in  part  be dependent on the noncanonical Wnt signaling path‐ way.   

The levels of transcripts of downstream ca‐ nonical and noncanonical Wnt signaling tar‐ get genes are changed by RA signaling.  Many studies have demonstrated that Tcf1 functions to  maintain  the  activation  of  the  canonical  Wnt  signaling  pathway,  while  Tcf3  can  suppress  this  pathway  [18,19,24,26,34,35]. To delineate further the role of RA  on  the  transcript  levels  of  Wnt  signaling  downstream  targets, we also used Cytochrome P450 hydroxylase A1‐ null (Cyp26a1‐/‐) mESCs. Cyp26a1 is responsible for me‐ tabolizing  RA  into  its  polar  metabolites,  4‐oxo‐  and  4‐ hydroxy‐RA  [28].  Thus,  Cyp26a1‐deficient  mESCs  have  higher  intracellular  concentrations  of  RA  compared  to  those  of  their  wild‐type  counterparts  [28,36].  We  ob‐ served  a  ~0.5  fold  and  a  ~0.75  decrease  in  Tcf1  tran‐ script  levels  in  WT  and  Cyp26a1‐/‐  mESCs,  respectively  (Figure 4 Ai). In contrast, we detected at least a 3.5 fold  increase  in  Tcf3  transcript  levels  in  WT  and  Cyp26a1‐/‐  mESCs after RA administration. Also, the  differences in  the  Tcf3  transcript  levels  between  WT  and  Cyp26a1‐/‐  ©AlphaMed Press 2014 

5  mESC  were  statistically  significant  (Figure  4  Aii).  In  line  with these data, we found a significant decrease in Liver  receptor  homolog‐1  (Lrh‐1;  also  known  as  Nuclear  re‐ ceptor  subfamily  5,  group  A,  member  2,  NR5A2)  tran‐ script in both WT and Cyp26a1‐/‐ mESCs; Lrh‐1 is a direct  target  of  Tcf1  [24]  (Figure  4  Aiii)  and  Lrh‐1  has  been  implicated  in  maintaining  the  pluripotent/stem  cell  state  of  mESCs  [37].  Also,  there  were  significant  in‐ creases  in  the  transcripts  of  Cysteine‐rich,  angiogenic  inducer,  61  (Cyr61;  ~3.8  for  WT  mESCs  and  ~7.7  for  Cyp26a1‐/‐ mESCs ) and Zinc finger protein family mem‐ ber  5  (Zic5;  ~3.5  for  WT  mESCs  and  ~5.0  Cyp26a1‐/‐  mESCs) after 48 hours of RA treatment (Figure 4 Biv and  v). Therefore,  RA  decreases  the  transcript  levels  of the  stem  cell  marker,  Lrh‐1,  and  increases  the  transcript  levels  of  the  differentiation  markers,  Cyr61  and  Zic5.  These  data  suggest  that  RA  reduces  the  downstream  signaling events of Tcf1 and enhances those of Tcf3.  To determine if the expression of downstream Wnt  targets  could  be  altered  by  the  combination  of  RA  ad‐ ministration and changes in Tcf3 expression, we gener‐ ated  two  mESC  lines  in  which  Tcf3  was  knocked  down  by two different shRNA constructs (Supplementary Fig.   3 A and C). Additionally, we found that the shRNA con‐ structs  targeting  Tcf3  were,  in  fact,  Tcf3‐specific  be‐ cause there were no significant changes in Tcf1 expres‐ sion  (Supplementary  Fig.   3  B).  In  mESCs  in  which  Tcf3  expression  was  ectopically  reduced  by  shRNA  (sh310  and  sh353),  the  transcript  level  of  Lrh‐1  was  increased  in  both  vehicle‐  and  RA‐treated  mESCs  (Figure  4  Bi).  Interestingly, in sh310 mESCs we observed a significant  increase in the expression of Lrh‐1 after RA administra‐ tion compared to vehicle‐treated sh310 mESCs (Figure 4  Bi). In sh310 and sh353 mESCs, we found levels of Zic5  expression  comparable  to  that  of  WT  mESCs  (Figure  4  Bii). Also, we did not detect increased Zic5 expression in  sh310  and  sh353  mESCs  after  RA  administration.  For  mESCs  transduced  with  the  empty  pLKO.1  vector  (Emp.), the expression of both Lrh‐1 and Zic5 was simi‐ lar to that of the parental mESCs after administration of  both vehicle and RA (Figure 4 B).   

RA influences the binding properties of the  transcription factors, Tcf1 and Tcf3, at their  target promoter regions.  Chromatin  immunoprecipition  (ChIP)  assays  were  used  to determine how RA alters the levels of Tcf1 and Tcf3  at target promoter regions (Figure 5). At the Lrh‐1 pro‐ moter, a target of Tcf1 [24], we observed a statistically  significant  decrease  in  Tcf1  occupancy  in  WT  mESCs  treated  with  RA  (~0.45  bound  DNA/input  DNA  versus  ~0.25 bound DNA/input; Figure 5 A, left panel). In con‐ trast,  we  observed  an  increase  in  Tcf3  binding  to  the  promoter  of  Lrh‐1  in  WT  mESCs  treated  with  RA  (~0.2  bound  DNA/input  DNA  versus  ~0.5  bound  DNA/input  DNA;  Figure  5  A,  right  panel).  The  data  from  the  ChIP  analysis confirm that Tcf3 functions as a transcriptional  repressor of Lrh‐1.  www.StemCells.com 

RA suppresses the canonical Wnt pathway in mESCs  At  the  promoter  regions  of  Cyr61  and  Zic5,  targets  of  Tcf3,  we  detected  higher  amounts  of  bound  Tcf3  in  the  (+)  RA  condition  (Figure  5  B  and  5C).  The  ratios  of  bound  DNA  to  input  DNA  for  the  Tcf3  ChIPs  were  as  follows:  Cyr61  (~0.3  bound  DNA/input  DNA  in  the  ab‐ sence and ~0.55 bound DNA/input DNA in the presence  of RA) and Zic5 (~0.1 bound DNA/input DNA in the ab‐ sence and ~0.45 bound DNA/input DNA in the presence  of RA) (Figure 5B and 5C, right panels). Conversely, the  ChIP  analyses  showed  that  the  level  of  Tcf1  binding  at  the promoters of Cyr61 and Zic5 was statistically signifi‐ cantly  reduced  by  ~50%  for  Cyr61  and  by  ~66.7%  for  Zic5 by RA treatment (Figure 5 B and C, left panels).  Since  it  is  well  established  that  RA  plays  a  critical  role in reducing the pluripotency of mESCs [38,39] and  Tcf3  is  involved  in  the  Oct4,  Sox2  and  c‐myc  stem  cell  network  [24],  ChIP  analysis  was  performed  to  deter‐ mine  if  there  is a correlation  between the  reduced ex‐ pression of these stem cell target genes by RA and pro‐ moter occupancy by Tcf3. We found that Sox2 and Oct4  transcripts were reduced in WT mESCs treated with RA  (Supplementary  Fig.  4).  We  detected  a  higher  amount  of Tcf3 binding at these target gene promoters (Figure 5  D  and  5E,  right  panels).  Also,  the  increased  binding  of  Tcf3 at these promoters was in contrast to reduced Tcf1  binding at the Sox2 and Oct4 promoters (Figure 5 D and  5E, left panels). These data are consistent with the ob‐ servation that the transcript levels of Sox2 and Oct4 are  statistically  significantly  reduced  in  WT  mESCs  that  are  cultured  in  the  presence  of  RA  for  48  hours  (Supple‐ mentary Fig. 4). Thus, RA has a role in the stem versus  differentiated  states  of  ESCs  by  modifying  the  associa‐ tion or dissociation of the transcription factors, Tcf1 and  Tcf3, at specific promoter regions (Figure 5).   

β‐catenin interactions with transcription fac‐ tors remain constant in (‐) RA‐ and (+) RA‐ treatment groups.  In addition to the association of Tcf1 and Tcf3 at target  promoters, we wanted to determine if RA could modify  the  binding  of  β‐catenin  to  the  target  promoters  men‐ tioned  in  Figure  5.  Based  on  ChIP  assays,  we  found  no  significant changes in the association of β‐catenin at the  promoters of Lrh‐1, Oct4, Cyr61, and Zic5 (Figure 6 A‐D).  As  determined  by  immunoprecipitation/Western  blot‐ ting assays, we found that β‐catenin interacts with Tcf3  in  both  the  absence  and  presence  of  RA  (Figure  6  E).  Although RA modifies the binding of Tcf1 and Tcf3 tran‐ scription  factors  to  target  promoters,  β‐catenin  still  interacts  with  these  transcription  factors  in  both  the  presence and absence of RA.                ©AlphaMed Press 2014 



DISCUSSION    RA can induce changes in activation of both  the canonical and the noncanonical Wnt sig‐ naling pathway in ESCs.  Despite the large body of information regarding the role  of Wnt  signaling  in  stem  cell  and  cancer  biology,  there  are  still  many  unanswered  questions  concerning  the  mechanistic  events  involved  in  Wnt  signaling  and  ESC  differentiation. The focus of this study was to augment  knowledge  in  this  field  by investigating  the role of  ret‐ inoic  acid  (RA)  has  in  the  canonical  and  noncanonical  Wnt signaling pathways in ESCs. Here, we found that RA  increased  the  expression  of  the  upstream  targets  of  both the canonical (Wnt ligands, Frizzled receptors, and  the  reduction  of  phosphorylated  β‐catenin)  and  noncanonical  (Wnt  ligands  and  Frizzled  receptors)  Wnt  signaling pathways (Figures 1 and 2).  Although  we  observed  increased  expression  of  up‐ stream targets of both the  canonical and  noncanonical  Wnt  upstream  signaling  events,  RA  treatment  of  WT  mESCs  reduced  downstream  canonical  Wnt  signaling  events  as  determined  by  reduced  TOPFlash  luciferase  activity  (Figure  3)  and  reduced  target  gene  expression  after  RA  treatment  (Figure.  4).  Conversely,  WT  mESCs  treated  with  RA  exhibited  increased  NFAT‐luciferase  activity, a reporter for noncanonical Wnt signaling acti‐ vation  (Figure  3),  increased  Tcf3  gene  expression,  and  increased  Tcf3  target  gene  transcript  levels  (Figure  4).  Here,  we  observed  that  RA  could  activate  one  arm  of  the Wnt signaling pathway (Figure 3) while suppressing  the  second  arm  of  this  pathway.  It  has  been  demon‐ strated that the noncanonical Wnt signaling pathway, at  the  expense  of  the  canonical  Wnt  signaling  pathway,  has  the  ability  to  promote  murine  endothelial  cell  dif‐ ferentiation  [40],  and  the  differentiation  of  human  mesenchymal stem cells into various lineages [41].   

RA modifies the expression and promoter  binding of the transcription factors, Tcf1 and  Tcf3.  There is a wealth of information regarding the roles that  Tcf1  and  Tcf3  play  in  embryonic  stem  cell  pluripotency/self‐renewal  and  differentiation.  The  ma‐ jority  of  these  studies  suggest  that Tcf3  acts  as  a  tran‐ scriptional  repressor  in  murine  embryonic  stem  cells  [18,19,26]. Tcf3 has been described as a component of  the core regulatory circuitry of ESCs, which also includes  Oct4,  Nanog,  and  Sox2  [18,24].  In  addition,  the  tran‐ scriptional  repressive  activities  of  Tcf3  have  been  ob‐ served during gastrulation in the mouse [21], hair folli‐ cle stem cell differentiation in the mouse [21], and neu‐ ral  pattering  in  zebrafish  [42].  Here,  we  found  that  RA  reduced  the  expression  of  the  stem  cell  markers  Sox2  and  Oct4  (Supplementary  Fig.  4),  as  well  as  the  tran‐ scription  factor,  Lrh‐1  (NR5A2)  (Figure  4  Aiii).  Reduced  transcript  levels  of  these  genes,  after  RA  treatment,  www.StemCells.com 

RA suppresses the canonical Wnt pathway in mESCs  could result in part from increased Tcf3 expression (Fig.  4Aii).  Additionally,  the  effects  of  RA  on  the  transcript  levels  of  Tcf1,  Tcf3,  Lrh‐1,  Cyr61,  and  Zic5  were  en‐ hanced  in  the  Cyp26a1‐deficient  mESCs  compared  to  WT  mESCs  (Figure  4  A).  The  increased  expression  of  Tcf3  (Figure  4  Aii)  upon  RA  addition  would  increase  transcriptional  repression  by  occupying  promoter  re‐ gions  of  these  genes  (Lrh‐1,  Sox2  and  Oct4)  that  are  involved  in  maintaining  the  self‐renewal  properties  in  mESCs (Figure 5). Interestingly, we found that after RA  treatment there were: 1) an increase in transcript levels  of Zic5 and Cyr61 (Figure 4 iv and v), proteins involved  in  mediating  stem  cell  differentiation,  and  2)  an  in‐ crease in binding of Tcf3 to these promoters (Figure 5).  Here, we examined if Tcf3 possibly could function as  a  gatekeeper  regulating  the  expression  of  genes  in‐ volved in stemness and differentiation. In mESCs trans‐ duced  with  shRNA  targeting  Tcf3  (Supplementary  Fig.  3), we found higher transcript levels for Lrh‐1 and lower  transcript  levels  for  Zic5,  compared  to  those  of  WT  mESCs and Emp. mESCs (Figure 4 Bi and ii). Also, there  was  no  increase  in  the  transcript  level  of  Zic5  after  RA  administration.  This  observation  stands  in  contrast  to  Zic5  transcripts  in  WT  mESCs  after  RA  administration  (Figure 4 Bii). These results suggest that in the absence  of Tcf3 there is increased transcription of Lrh‐1 (a gene  related  to  stemness)  and  reduced  transcription  of  Zic5  (a  gene  related  to  differentiation).  One  explanation  is  that  in  mESCs  with  diminished  Tcf3  levels  there  is  no  competitor  for  promoter  binding  of  Tcf1  to  induce  or  repress  transcription.  Similar  to  these  data,  in  mESCs  with  ablated  Tcf3  Yi  and  colleagues  observed  an  in‐ crease in various stem cell markers such as Nanog, Klf4,  Esrrb  and  Tbx3  [19].  Conversely,  they  found  that  in  TCF3‐/‐  mESCs  markers  of  differentiation,  including  Id2,  Cyr61,  and  Krt8,  were  reduced  [19].  This  information  suggests  that  proper  regulation  of  both  the  noncanonical and canonical Wnt signaling paths is criti‐ cal  for  maintaining  stemness  or  promoting  differentia‐ tion.  Interestingly,  we  found  that  the  association  of  β‐ catenin at the promoters of Lrh‐1, Oct4, Cyr61, and Zic5  remains relatively unchanged in  both (‐) RA and (+) RA  treatment groups (Fig. 6). This observation of relatively  constant  β‐catenin/target  promoter  association  in  (‐)  RA‐  versus  (+)  RA‐treatment  groups  may  be  explained  by  the  fact  that  Tcf1,  Tcf3,  Tcf4,  and  Lef1  all  have  the  same β‐catenin binding domain at their N‐termini [43].  Based  on  these  data,  β‐catenin  can  associate  with  ei‐ ther Tcf1 or Tcf3 at target promoters and may not have  a  direct  role  in  the  binding  of  these  transcription  fac‐ tors.  In  a  model  proposed  by  Cole  and  colleagues  [44],  which was based on ChIP‐on‐chip microarrays, Tcf3 can  exist  in  either  an  activating  or  a  repressive  complex  in  standard conditions. Thus, Tcf3 can have dual functions:  1)  it  can  repress  β‐catenin  target  genes  by  recruiting  specific  co‐repressor  factors;  2)  it  can  function  as  an  activator  by  recruiting  different  sets  of  cofactors  [45].  ©AlphaMed Press 2014 

RA suppresses the canonical Wnt pathway in mESCs 

7  The repressive role (Lrh‐1, Fig. 5) and activator role (Zic5  and  Cyr61,  Figure  5)  of  Tcf3  may  be  explained  by  the  fact that many isoforms of the Tcf family are generated  by  alternative  splicing  and  dual  promoter  usage  [43].  For instance, Tcf3 isoforms that contain LVPQ and SXXSS  motifs in their C‐terminal context‐dependent regulatory  domain  have  been  identified  as  repressors  [46].  Also,  Wnt target genes are regulated through the binding of  Tcf/LEF  factors  to  Wnt  responsive  elements  (WREs)  at  the  consensus  sequence  CCTTTGWW  (W=A/T)  via  the  high  mobility  group  (HMG)  box  of  Tcf/LEF  factors  [47,48]. Even  though  the  HMG  box  is  highly  conserved  among  the  Tcf  family  members,  each  member  or  iso‐ form can have different affinities for specific WREs [49].  A possible hypothesis as to how Tcf3 may function both  as  a  repressor  and  as  an  activator  is  that  RA  increases  the  expression  of  Tcf3  and  may  also  increase  the  ex‐ pression of specific isoforms that repress specific WREs,  i.e.  Lrh‐1  (Figs.  4  and  5),  and  activate  other  WREs,  i.e.  Zic5  and  Cyr61  (Figures  4  and  5).  Further  studies  will  have  to  be  performed  to  determine  if  RA  can  change  the expression patterns of the various isoforms of Tcf1  and Tcf3.   

The noncanonical Wnt signaling pathway may  cooperate with RA‐induced ESC differentia‐ tion by antagonizing the canonical Wnt sig‐ naling pathway.  A  possible  mechanism  connecting  retinoid  signaling  to  the antagonistic effects of the noncanonical Wnt signal‐ ing pathway to that of the canonical pathway in mESCs  is that the increased activation of the noncanonical Wnt  pathway suppresses downstream events of the canoni‐ cal pathway. Nemo‐like kinase (NLK) and nuclear factor  of activated T cells (NFAT) are downstream effectors in  the noncanonical Wnt pathway and NLK can phosphory‐ late Tcf/Lef, prompting Tcf/Lef dissociation from target  promoters  and  allowing  increased  Tcf3  binding  [11].  Potentially, RA contributes to increased Tcf3 binding via  activation  of  the  noncanonical  Wnt  signaling  pathway  because we demonstrate that RA increases the expres‐ sion of noncanonical Wnt ligands and Frizzled receptors  (Figure  1).  A  recent  study  by  Hoffman  and  colleagues  found that Tcf3 functions as a transcriptional repressor  to prepare mESCs for lineage differentiation [35]. Based  on  previous  work  [50],  which  employed  ChIP‐on‐chip  microarrays to determine potential RAREs in promoters  in ESCs, we suggest that RA modifies the transcript lev‐ els of Tcf1 and Tcf3 as a secondary response because no  RAREs were found in the promoters of Tcf1 or Tcf3. 

Here, we outline a novel role for RA in stem cell bi‐ ology  through  its  activation  of  the  noncanonical  Wnt  signaling  pathway,  which  has  been  demonstrated  to  antagonize the canonical Wnt signaling pathway. Here,  we used a mechanistic approach to determine the role  of RA in Wnt signaling; however, we are currently inves‐ tigating the biological effects (e.g. modification of cellu‐ lar fate) that RA and noncanonical Wnt signaling have in  ESC differentiation. In the absence of RA, canonical Wnt  signaling  is  activated,  which  allows  the  binding  of  Tcf1  to specific WREs and maintains the expression of mark‐ ers of stemness (Figure 7 A). RA reduces Tcf1 transcript  level and increases Tcf3 transcripts, which promotes the  expression  of  Tcf3‐specific  targets.  Through  the  activa‐ tion  of  the  noncanonical  Wnt  signaling  pathway  RA  in‐ creases  the  binding  of  Tcf3  to  WREs,  where  Tcf3  func‐ tions as a transcriptional repressor or activator (Figure 7  B). These results could help to answer questions regard‐ ing the roles of Wnt signaling in regulating the balance  between  stemness  and  the  differentiation  of  ESCs.  Co‐ ordinating and modifying the expression of self‐renewal  and  differentiation  target  genes  in  the  canonical  and  noncanonical Wnt signaling pathways by using pharma‐ cological  agents,  such  as  RA,  could  be  useful  in  driving  differentiation for therapeutic uses of stem cells.    ACKNOWLEDGMENTS    We  thank  Drs.  Kristian  Laursen  and  Alison  Urvalek  for  discussion  regarding  data  from  the  ChIP  analysis,  and  the  members  of  the  Gudas  laboratory  for  scientific  in‐ put.    DISCLOSURE OF POTENTIAL CONFLICTS OF INTEREST    The authors indicate no potential conflicts of interest. 

  Grant Support  The research  was supported by NIH grants NCI R01  CA43796  and  NIAAA  R01  AA018332  to  LJG.  For  a  por‐ tion  of  this  work,  KOS  was  supported  by  NCI  T32  CA062948.   

AUTHOR CONTRIBUTIONS    K.O.‐S.: Conception and design, data analysis and inter‐ pretation,  and  manuscript  writing;  L.J.G.:  Conception  and  design,  data  analysis  and  interpretation,  financial  support, and manuscript writing   

   

REFERENCES    1 Alvarez, C.V., Garcia‐Lavandeira, M., Garcia‐ Rendueles,  M.E.,  Diaz‐Rodriguez,  E.,  Garcia‐ Rendueles,  A.R.,  Perez‐Romero,  S.,  Vila,  T.V.,  Rodrigues,  J.S.,  Lear,  P.V.  and  Bravo,  S.B.  (2012)  Defining  stem  cell  types: 

www.StemCells.com 

understanding  the  therapeutic  potential  of  ESCs, ASCs, and iPS cells. J Mol Endocrinol, 49,  R89‐111.  2  Gudas,  L.J.  (1994)  Retinoids  and  vertebrate  development.  The  Journal  of  biological chemistry, 269, 15399‐402. 

3 Mark, M., Ghyselinck, N.B. and Chambon,  P.  (2006)  Function  of  retinoid  nuclear  receptors:  lessons  from  genetic  and  pharmacological  dissections  of  the  retinoic  acid  signaling  pathway  during  mouse  embryogenesis.  Annual  review  of  pharmacology and toxicology, 46, 451‐80. 

©AlphaMed Press 2014 

8  4 Love, J.M. and Gudas, L.J. (1994) Vitamin  A, differentiation and cancer. Current opinion  in cell biology, 6, 825‐31.  5  Tang,  X.H.  and  Gudas,  L.J.  (2011)  Retinoids, retinoic acid receptors, and cancer.  Annual review of pathology, 6, 345‐64.  6  Nusse,  R.  (2008)  Wnt  signaling  and  stem  cell control. Cell research, 18, 523‐7.  7 Logan, C.Y. and Nusse, R. (2004) The Wnt  signaling  pathway  in  development  and  disease. Annu Rev Cell Dev Biol, 20, 781‐810.  8 Lindsley, R.C., Gill, J.G., Kyba, M., Murphy,  T.L.  and  Murphy,  K.M.  (2006)  Canonical  Wnt  signaling  is  required  for  development  of  embryonic  stem  cell‐derived  mesoderm.  Development, 133, 3787‐96.  9 Miyabayashi, T., Teo, J.L., Yamamoto, M.,  McMillan, M., Nguyen, C. and Kahn, M. (2007)  Wnt/beta‐catenin/CBP  signaling  maintains  long‐term  murine  embryonic  stem  cell  pluripotency.  Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America, 104, 5668‐73.  10  Takao,  Y.,  Yokota,  T.  and  Koide,  H.  (2007)  Beta‐catenin  up‐regulates  Nanog  expression  through  interaction  with  Oct‐3/4  in  embryonic  stem  cells.  Biochemical  and  biophysical  research  communications,  353,  699‐705.  11 Katoh, M. (2007) WNT signaling pathway  and  stem  cell  signaling  network.  Clinical  cancer  research  :  an  official  journal  of  the  American Association for Cancer Research, 13,  4042‐5.  12  Watanabe,  K.  and  Dai,  X.  (2011)  A  WNTer  Revisit:  New  Faces  of  {beta}‐Catenin  and TCFs in Pluripotency. Science signaling, 4,  pe41.  13 Kuhl, M., Sheldahl, L.C., Park, M., Miller,  J.R.  and  Moon,  R.T.  (2000)  The  Wnt/Ca2+  pathway:  a  new  vertebrate  Wnt  signaling  pathway takes shape. Trends in genetics : TIG,  16, 279‐83.  14  Rao,  T.P.  and  Kuhl,  M.  (2010)  An  updated  overview  on  Wnt  signaling  pathways:  a  prelude  for  more.  Circulation  research, 106, 1798‐806.  15  Ishitani,  T.,  Kishida,  S.,  Hyodo‐Miura,  J.,  Ueno, N., Yasuda, J., Waterman, M., Shibuya,  H.,  Moon,  R.T.,  Ninomiya‐Tsuji,  J.  and  Matsumoto, K. (2003) The TAK1‐NLK mitogen‐ activated  protein  kinase  cascade  functions  in  the  Wnt‐5a/Ca(2+)  pathway  to  antagonize  Wnt/beta‐catenin  signaling.  Molecular  and  cellular biology, 23, 131‐9.  16  Elizalde,  C.,  Campa,  V.M.,  Caro,  M.,  Schlangen, K., Aransay, A.M., Vivanco, M. and  Kypta,  R.M.  (2011)  Distinct  roles  for  Wnt‐4  and  Wnt‐11  during  retinoic  acid‐induced  neuronal  differentiation.  Stem  cells,  29,  141‐ 53.  17  Wray,  J.  and  Hartmann,  C.  (2012)  WNTing  embryonic  stem  cells.  Trends  Cell  Biol, 22, 159‐68.  18  Cole,  M.F.,  Johnstone,  S.E.,  Newman,  J.J.,  Kagey,  M.H.  and  Young,  R.A.  (2008)  Tcf3  is  an  integral  component  of  the  core  regulatory  circuitry  of  embryonic  stem  cells.  Genes & development, 22, 746‐55.  19 Yi, F.,  Pereira, L. and  Merrill,  B.J. (2008)  Tcf3  functions  as  a  steady‐state  limiter  of  transcriptional programs of mouse embryonic  stem  cell  self‐renewal.  Stem  cells,  26,  1951‐ 60. 

www.StemCells.com 

RA suppresses the canonical Wnt pathway in mESCs  20 Pereira, L.,  Yi, F. and  Merrill,  B.J. (2006)  Repression  of  Nanog  gene  transcription  by  Tcf3  limits  embryonic  stem  cell  self‐renewal.  Molecular and cellular biology, 26, 7479‐91.  21  Merrill,  B.J.,  Pasolli,  H.A.,  Polak,  L.,  Rendl, M., Garcia‐Garcia, M.J., Anderson, K.V.  and  Fuchs,  E.  (2004)  Tcf3:  a  transcriptional  regulator  of  axis  induction  in  the  early  embryo. Development, 131, 263‐74.  22  Hikasa,  H.  and  Sokol,  S.Y.  (2011)  Phosphorylation  of  TCF  proteins  by  homeodomain‐interacting  protein  kinase  2.  The  Journal  of  biological  chemistry,  286,  12093‐100.  23  Ishitani,  T.,  Ninomiya‐Tsuji,  J.  and  Matsumoto, K. (2003) Regulation of lymphoid  enhancer  factor  1/T‐cell  factor  by  mitogen‐ activated  protein  kinase‐related  Nemo‐like  kinase‐dependent  phosphorylation  in  Wnt/beta‐catenin  signaling.  Molecular  and  cellular biology, 23, 1379‐89.  24 Yi, F., Pereira, L., Hoffman, J.A., Shy, B.R.,  Yuen,  C.M.,  Liu,  D.R.  and  Merrill,  B.J.  (2011)  Opposing effects of Tcf3 and Tcf1 control Wnt  stimulation  of  embryonic  stem  cell  self‐ renewal. Nature cell biology, 13, 762‐70.  25  Marson,  A.,  Levine,  S.S.,  Cole,  M.F.,  Frampton, G.M., Brambrink, T., Johnstone, S.,  Guenther,  M.G.,  Johnston,  W.K.,  Wernig,  M.,  Newman,  J.,  Calabrese,  J.M.,  Dennis,  L.M.,  Volkert,  T.L.,  Gupta,  S.,  Love,  J.,  Hannett,  N.,  Sharp,  P.A.,  Bartel,  D.P.,  Jaenisch,  R.  and  Young,  R.A.  (2008)  Connecting  microRNA  genes  to  the  core  transcriptional  regulatory  circuitry  of  embryonic  stem  cells.  Cell,  134,  521‐33.  26  Tam,  W.L.,  Lim,  C.Y.,  Han,  J.,  Zhang,  J.,  Ang, Y.S., Ng, H.H., Yang, H. and Lim, B. (2008)  T‐cell  factor  3  regulates  embryonic  stem  cell  pluripotency  and  self‐renewal  by  the  transcriptional  control  of  multiple  lineage  pathways. Stem cells, 26, 2019‐31.  27  Kashyap,  V.  and  Gudas,  L.J.  (2010)  Epigenetic regulatory mechanisms distinguish  retinoic  acid‐mediated  transcriptional  responses  in  stem  cells  and  fibroblasts.  The  Journal  of  biological  chemistry,  285,  14534‐ 48.  28  Langton,  S.  and  Gudas,  L.J.  (2008)  CYP26A1  knockout  embryonic  stem  cells  exhibit  reduced  differentiation  and  growth  arrest  in  response  to  retinoic  acid.  Developmental biology, 315, 331‐54.  29 Veeman, M.T., Slusarski, D.C., Kaykas, A.,  Louie,  S.H.  and  Moon,  R.T.  (2003)  Zebrafish  prickle,  a  modulator  of  noncanonical  Wnt/Fz  signaling,  regulates  gastrulation  movements.  Current biology : CB, 13, 680‐5.  30  Ichida,  M.  and  Finkel,  T.  (2001)  Ras  regulates NFAT3 activity in cardiac myocytes.  The  Journal  of  biological  chemistry,  276,  3524‐30.  31  Wang,  C.,  Lee,  J.E.,  Cho,  Y.W.,  Xiao,  Y.,  Jin, Q., Liu, C. and Ge, K. (2012) UTX regulates  mesoderm  differentiation  of  embryonic  stem  cells  independent  of  H3K27  demethylase  activity. Proceedings of the National Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America,  109, 15324‐9.  32  Moffat,  J.,  Grueneberg,  D.A.,  Yang,  X.,  Kim, S.Y., Kloepfer, A.M., Hinkle, G., Piqani, B.,  Eisenhaure,  T.M.,  Luo,  B.,  Grenier,  J.K.,  Carpenter,  A.E.,  Foo,  S.Y.,  Stewart,  S.A.,  Stockwell,  B.R.,  Hacohen,  N.,  Hahn,  W.C., 

Lander,  E.S.,  Sabatini,  D.M.  and  Root,  D.E.  (2006) A lentiviral RNAi library for human and  mouse genes applied to an arrayed viral high‐ content screen. Cell, 124, 1283‐98.  33  Fromigue,  O.,  Hay,  E.,  Barbara,  A.  and  Marie,  P.J.  (2010)  Essential  role  of  nuclear  factor  of  activated  T  cells  (NFAT)‐mediated  Wnt  signaling  in  osteoblast  differentiation  induced by strontium ranelate. The Journal of  biological chemistry, 285, 25251‐8.  34  Hikasa,  H.,  Ezan,  J.,  Itoh,  K.,  Li,  X.,  Klymkowsky,  M.W.  and  Sokol,  S.Y.  (2010)  Regulation  of  TCF3  by  Wnt‐dependent  phosphorylation  during  vertebrate  axis  specification. Developmental cell, 19, 521‐32.  35  Hoffman,  J.A.,  Wu,  C.I.  and  Merrill,  B.J.  (2013)  Tcf7l1  prepares  epiblast  cells  in  the  gastrulating  mouse  embryo  for  lineage  specification. Development, 140, 1665‐75.  36  Ricard,  M.J.  and  Gudas,  L.J.  (2013)  Cytochrome p450 cyp26a1 alters spinal motor  neuron  subtype  identity  in  differentiating  embryonic  stem  cells.  The  Journal  of  biological chemistry, 288, 28801‐13.  37  Wagner,  R.T.,  Xu,  X.,  Yi,  F.,  Merrill,  B.J.  and  Cooney,  A.J.  (2010)  Canonical  Wnt/beta‐ catenin regulation of liver receptor homolog‐ 1  mediates  pluripotency  gene  expression.  Stem cells, 28, 1794‐804.  38 Gudas, L.J. (2013) Retinoids induce stem  cell  differentiation  via  epigenetic  changes.  Seminars in cell & developmental biology.  39  Gudas,  L.J.  and  Wagner,  J.A.  (2011)  Retinoids  regulate  stem  cell  differentiation.  Journal of cellular physiology, 226, 322‐30.  40  Hwang,  Y.S.,  Chung,  B.G.,  Ortmann,  D.,  Hattori,  N.,  Moeller,  H.C.  and  Khademhosseini,  A.  (2009)  Microwell‐ mediated  control  of  embryoid  body  size  regulates  embryonic  stem  cell  fate  via  differential expression of WNT5a and WNT11.  Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences of the United States of America, 106,  16978‐83.  41  Sonomoto,  K.,  Yamaoka,  K.,  Oshita,  K.,  Fukuyo,  S.,  Zhang,  X.,  Nakano,  K.,  Okada,  Y.  and  Tanaka,  Y.  (2012)  Interleukin‐1beta  induces  differentiation  of  human  mesenchymal  stem  cells  into  osteoblasts  via  the  Wnt‐5a/receptor  tyrosine  kinase‐like  orphan  receptor  2  pathway.  Arthritis  Rheum,  64, 3355‐63.  42  Kim,  C.H.,  Oda,  T.,  Itoh,  M.,  Jiang,  D.,  Artinger,  K.B.,  Chandrasekharappa,  S.C.,  Driever, W. and Chitnis, A.B. (2000) Repressor  activity  of  Headless/Tcf3  is  essential  for  vertebrate head formation. Nature, 407, 913‐ 6.  43  Mao,  C.D.  and  Byers,  S.W.  (2011)  Cell‐ context  dependent  TCF/LEF  expression  and  function:  alternative  tales  of  repression,  de‐ repression  and  activation  potentials.  Crit  Rev  Eukaryot Gene Expr, 21, 207‐36.  44  Cole,  M.F.  and  Young,  R.A.  (2008)  Mapping  key  features  of  transcriptional  regulatory  circuitry  in  embryonic  stem  cells.  Cold  Spring  Harbor  symposia  on  quantitative  biology, 73, 183‐93.  45  Hoppler,  S.  and  Kavanagh,  C.L.  (2007)  Wnt signalling: variety at the core. Journal of  cell science, 120, 385‐93.  46  Pukrop,  T.,  Gradl,  D.,  Henningfeld,  K.A.,  Knochel, W., Wedlich, D. and Kuhl, M. (2001)  Identification  of  two  regulatory  elements 

©AlphaMed Press 2014 

RA suppresses the canonical Wnt pathway in mESCs 

9  within  the  high  mobility  group  box  transcription  factor  XTCF‐4.  The  Journal  of  biological chemistry, 276, 8968‐78.  47  Giese,  K.,  Cox,  J.  and  Grosschedl,  R.  (1992)  The  HMG  domain  of  lymphoid  enhancer  factor  1  bends  DNA  and  facilitates  assembly  of  functional  nucleoprotein  structures. Cell, 69, 185‐95. 

48  van  de  Wetering,  M.  and  Clevers,  H.  (1992)  Sequence‐specific  interaction  of  the  HMG  box  proteins  TCF‐1  and  SRY  occurs  within  the  minor  groove  of  a  Watson‐Crick  double helix. The EMBO journal, 11, 3039‐44.  49  Hecht,  A.  and  Stemmler,  M.P.  (2003)  Identification  of  a  promoter‐specific  transcriptional  activation  domain  at  the  C  terminus  of  the  Wnt  effector  protein  T‐cell 

factor  4.  The  Journal  of  biological  chemistry,  278, 3776‐85.  50  Delacroix,  L.,  Moutier,  E.,  Altobelli,  G.,  Legras, S., Poch, O., Choukrallah, M.A., Bertin,  I., Jost, B. and Davidson, I. (2010) Cell‐specific  interaction  of  retinoic  acid  receptors  with  target  genes  in  mouse  embryonic  fibroblasts  and  embryonic  stem  cells.  Molecular  and  cellular biology, 30, 231‐44. 

 

See www.StemCells.com for supporting information available online. STEM  CELLS ; 00:000–000   

www.StemCells.com 

©AlphaMed Press 2014 

10

RA suppresses the canonical Wnt pathway in mESCs 

Figure 1. Treatment of WT mESCs with RA results in higher transcript levels of canonical and noncanonical Wnt lig‐ ands and receptors.  Quantitative  Real‐Time  (QRT)  PCR  analysis  was  used  to  determine  the  transcript  levels  of  canonical  (A)  and  noncanonical  (B)  Wnt  ligands  and  Frizzled  receptors  in  WT  mESCs  cultured  as  untreated  (white  bars),  with  vehicle  (grey bars), or with 1 μM RA (black bars) for 48 hours.  Bars represent the mean of three independent experiments ± SEM where **, p

Retinoic acid suppresses the canonical Wnt signaling pathway in embryonic stem cells and activates the noncanonical Wnt signaling pathway.

Embryonic stem cells (ESCs) have both the ability to self-renew and to differentiate into various cell lineages. Retinoic acid (RA), a metabolite of V...
1MB Sizes 0 Downloads 5 Views