Leitthema HNO 2014 · 62:406–414 DOI 10.1007/s00106-014-2874-9 Online publiziert: 6. Juni 2014 © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2014

C. Bergmann Klinik für Hals-Nasen-Ohren-Heilkunde, Universitätsklinikum Essen (AöR)

Regulatorische   T-Zellen und NK-Zellen bei Krebspatienten Forscher wiesen schon früh nach, dass Krebs eine Erkrankung der Gene ist bzw. dass Mutationen im Erbgut die Aktivierung von Onkogenen und ein unkontrolliertes Wachstum von Zellen auslösen [1]. Die Rolle des Immunsystems in der Krebsentstehung und -entwicklung, der Bereich der sog. Tumorimmunologie, blieb lange Zeit nur gering berücksichtigt, auch wenn Paul Ehrlich bereits 1907 darauf hinwies, dass das Immunsystem in der Lage sei, Krebszellen zu erkennen und zu eliminieren [2]. Immunzellen sind prinzipiell in der Lage, mutierte Zellen zu eliminieren oder in Schach zu halten [3].

T-Zellen Das Immunsystem hält eine Reihe von Abwehrmechanismen gegen Krebs bereit. Viele verschiedene Immunzellen – darunter natürliche Killerzellen und TZellen – überwachen ständig die Gewebe und suchen nach Anzeichen für krankhafte Veränderungen. Wenn sie Hinweise für gefährliche Mutationen finden, werden die veränderten Zellen sofort beseitigt [4]. Die Immunzellgruppe der T-Zellen bestehen aus verschiedenen Untergruppen: Neben den CD4+-T-Helfer-Zellen und den zytotoxischen CD8+-T-Zellen, die als wesentliche Komponente des adaptiven Immunsystems agieren, ist in den vergangenen Jahren die Subgruppe der regulatorischen T-Zellen in den Fokus der tumorimmunologischen Forschung gerückt.

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Auch diese Gruppe an Immunzellen subsummiert verschiedene T-Zell-Typen, die allesamt regulatorische Eigenschaften besitzen, was sie kennzeichnet. D Man unterscheidet die natürlichen

regulatorischen T-Zellen von den (tumor)induzierten regulatorischen T-Zellen (auch als nTreg und iTreg bezeichnet). Diese Zellen dienen im gesunden Menschen der Aufrechterhaltung der Selbsttoleranz und der Vorbeugung von Autoimmunität [5]. nTreg werden im Thymus gebildet und über die Oberflächenmarker CD4 und CD25 identifiziert. Gerade jüngere Arbeiten wiesen auf die Diversität im T-Zell-Pool hin, was eine verbesserte Definierung der nTreg erforderlich machte. So wurde insbesondere die Expression des Transkriptionsfaktors FoxP3 bzw. eine spezielle Demethylierungssequenz im Foxp3-Gen als eindeutige Identifikationsmethode für nTreg etabliert und standardisiert [6]. Ferner werden nTreg über die schwächere Expression des IL7-Rezeptors/CD127 gegenüber T-HelferZellen charakterisiert [7]. Insbesondere im Patienten mit KopfHals-Karzinom vermitteln nTreg eine substanzielle zellkontaktabhängige und zytokinvermittelte Hemmung der antitumoralen Immunantwort [8]. iTreg (auch bekannt als Tr1-Zellen) werden durch (Tumor-)Antigenstimulation über einen IL-10-abhängigen Prozess in vitro und in vivo induziert [9, 10]. Auch iTreg sind durch die Expression der Marker CD4

und CD25 gekennzeichnet, jedoch ist der wesentliche Unterschied zur nTreg-Zelle die Expression der Zytokine IL-10 und TGF-β. Darüber hinaus definieren beide Zytokine nicht nur den Phänotyp der iTreg, sondern auch deren Funktion. Durch Sekretion der immunsuppressiven Zytokine IL-10 und TGF-β sind iTreg in der Lage, die Effektor-T-Zell-Proliferation – z. B. im Rahmen einer Immunantwort – zu unterdrücken und herunterzuregulieren sowie die Ausbildung von kostimulatorischen Rezeptoren und die Zytokinproduktion von antigenpräsentierenden Zellen (z. B. dendritische Zellen) abzuschwächen [10]. Im Gesunden spielen iTreg insbesondere in der mukosalen Immunität eine große Rolle. iTreg werden durch Nahrungsmittelantigenkontakt im T-Helfer-Zell-Pool induziert und verhindern die Ausbildung einer Immunantwort gegen die Nahrungsmittelproteine. Sie hemmen somit die Ausbildung einer Nahrungsmittelallergie bzw. -unverträglichkeit [11]. Der Autor und andere Arbeitsgruppen haben berichtet, dass beide Untergruppen regulatorischer T-Zellen im Blut von Patienten mit Krebs verschiedener Entitäten, wie z. B. Kopf-Hals-Karzinome, Brustkrebs, kolorektale Karzinome und Ovarialkarzinome, nachzuweisen sind und Einfluss auf die Progression der Krankheit und das Überleben haben [8, 12, 13, 14, 15].

Anton-von-Tröltsch-Preisträger 2013.

NK-Zellen Natürliche Killer(NK)-Zellen stellen potente Effektorzellen des angeborenen Immunsystems dar und schützen den Wirt gegen fremde Eindringlinge wie Viren, Parasiten, Bakterien oder entartete Zellen [16]. Nach Stimulation von NKZellen werden große Mengen von immunstimulierenden Zytokinen wie IFN-γ und TNF-α freigesetzt. Dies triggert den Zelltod der Zielzelle durch den serinproteasevermittelten Weg über Perforin und Granzym oder über den extrinsischen Weg der Apoptose (Fas/Fas-Ligand oder TRAIL, [17]). Potenzielle Zielzellen werden durch das „Missing-Self-Prinzip“ der NK-Zelle erkannt, wie es Klas Kärre bereits 1985 beschrieb [18]. Hierbei kommt es durch die Expression von aktivierenden oder hemmenden Rezeptoren zu einer NK-Zell-Aktivierung und zur Lyse der Zielzelle [19]. Die Familie der aktivierenden NKZell-Rezeptoren (z. B. NKG2D) sowie die plasmaständigen NK-Zell-Immunglobulin-artigen Rezeptoren (KIR, z. B. CD158a und CD158b) koordinieren die Erkennung der befallenen oder entarteten Zelle. Diese interagieren über NKZell-membranständige Majorhistokompatibilitätskomplexe vom Typ I (MHC I) mit nachfolgender Eliminierung von Zielzellen, während die Vermeidung der Zerstörung von körpereigenem gesundem Gewebe sichergesellt ist [20]. Je nach Lage des Gleichgewichts zwischen den hemmenden und aktivierenden Signale auf den NK-Zellen kommt es zur Erkennung oder Ignorierung der Zielzelle. Beispielsweise interagieren NKG2D – Liganden mit MHC-Klasse-I-verwandten Ketten A und B (MICA und MICB) und kontrollieren damit die Entwicklung von epithelialen Tumoren. Diesen Kontrollmechanismus haben sich jedoch epitheliale Tumorzellen zu Nutze gemacht und hemmen die NK-Zell-Aktivierung durch Freisetzung von MIC-Proteinen [21]. Dieses Phänomen wird zum Komplex der Tumorfluchtphänomene gezählt.

Tumorfluchtphänomene In den vergangenen Jahren wurde eine Vielzahl von Tumorfluchtphänomenen

Leitthema

Interaktion von iTreg und NK-Zellen

Monozyten IL-4 GM-CSF

5 Tage

immature dentritische Zellen (iDC)

Mitomycin-Cbehandelte Tumorzellen

iDC : T-Zellen : Tumorzellen 1 : 10 : 1 8 Tage

IL-2 IL-10 IL-15

iTreg 24 h

αCD3

iTreg : NK-Zellen 2:1

IL-2 (18/36 h)

NKG2D NKp44 IFNγ CD107a

Ziel (6 h)

IL-2 (18 h) + Ziel (6 h)

CD107a CD107a Chromfreisetzung

Abb. 1 8 Experimentelles Design der Studie. (Aus [53], mit freundl. Genehmigung des JohnWiley-Verlags)

charakterisiert, die sog. Tumor-EscapePhänomene. Hierbei handelt es sich um molekulare oder zellstrukturelle Veränderungen auf bzw. in den Tumorzellen, die dazu führen, dass diese Zellen nicht vom Immunsystem als fremd bzw. entartet erkannt werden und somit ihrer Eliminierung entgehen [22]. Ein entscheidender Mechanismus hierbei ist neben der gezielten NK-Zell-Hemmung die Rekrutierung von nTreg oder die Induktion von iTreg durch den Tumor. Der Tumor erreicht dies beispielsweise durch die Sekretion von endogenen Gefahrensignalen, wie HMGB1 [23]. Im Rahmen der Tumor-Escape-Mechanismen wurde kürzlich eine wichtige Interaktion von NK-Zellen mit nTreg von der Arbeitsgruppe um Ghiringhelli berichtet. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die Effektorfunktionen von NK-Zellen durch nTreg in vitro und in vivo herunterreguliert werden [24, 25]. Durch nTreg freigesetztes TGF-β führte zur Hemmung der zytolytischen Aktivität der NK-Zellen, die der Herunterregulierung des aktivierenden NK-Zellrezeptors NKG2D dient. Die Produktion von IFN-γ durch NK-Zellen blieb hierbei unbeeinträchtigt [24].

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Zellgeneration Studien zur Interaktion von iTreg und NK-Zellen wurden bislang nicht durchgeführt. Der Autor des vorliegenden Beitrags hat zur Analyse einer solchen Interaktion bestehende Protokolle seiner Arbeitsgruppe weiterentwickelt [9] und die zellulären und funktionellen Zusammenhänge näher beleuchtet (. Abb. 1). In dieser Studie hat er untersuchen können, wie tumorinduzierte iTreg die NKZell-Funktion modulieren. Tumorinduzierte regulatorische T-Zellen (iTreg) wurden in dieser Studie nach einem früher beschriebenen Protokoll [9] generiert und zeigten eine Reinheit von >99%.

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iTreg lassen sich in vitro in einem Tumormikromilieu generieren In diesen Zellen ließ sich eine hohe Expression der inhibitorischen Zytokine IL10 und TGF-β nachweisen, aber sie exprimierten nicht den Oberflächenrezeptor für die IL-2-Rezeptorenkette α (CD25), der beispielsweise charakteristisch für die nTreg, aber auch für T-Effektor-Zellen ist. Dieser Phänotyp wird derzeit für iTreg-/ Tr1-Zellen von Patienten mit Krebs oder Autoimmunerkrankungen definiert [12, 26, 27, 28]. Das hier verwendete Generierungsprotokoll nutzt in der In-vitro-Situation wesentliche Komponenten eines Tumormikromilieus, wie z. B. Tumorzellen vom Kopf-Hals-Karzinom, antigenpräsentierende Zellen, T-Effektor-Zellen und immunsuppressive Zytokine (IL2, IL-10, IL-15). Es ließ sich eine deutliche immunsuppressive Wirkung dieser Zellen gegenüber der Proliferation von aktivierten CD4+-T-Zellen von 100 auf 8% im CFSE-T-Zell-Proliferationsassay nachweisen. Das ein Tumormikromilieu simulierende In-vitro-Assay ist also in der Lage, Zellen zu generieren, die sowohl phänotypisch als auch funktionell den iTreg entsprechen (. Abb. 2).

Aktivierung NK-Zellen exprimieren eine Vielzahl von unterschiedlichen Zelloberflächenrezeptoren, die Aktivierungssignale vermitteln, einschließlich des Transmembranrezeptors NKG2D und des natürlichen Zytotoxizitätrezeptors NKp44 [29, 30]. Zunächst war es in der hier vorliegenden Studie wichtig, eine Aktivierung der NKZellen mit Interleukin 2 (IL-2) in vitro zu erreichen. Diese Aktivierung führte zu einer 3,8-fachen Erhöhung der NKG2DExpression und einer 10,7-fachen Erhöhung der NKp44-Expression im Vergleich zur basalen Expression von nichtstimulierten NK-Zellen. Dennoch vermittelten tumorinduzierte iTreg eine signifikante Hemmung dieser IL-2-aktivierten NK-Zellen im Vergleich zur Kontrollgruppe; die Expression von NKG2D reduzierte sich durch den Einfluss von iTreg vom 3,8- auf das 1,8-Fache und NKp44 vom 10,7- auf das 3,9-Fache. Auch die Inkubation von IL-2-aktivierten NK-Zellen in Gegenwart von nTreg führte zu einer signifikanten Hemmung der Hochregulierung von NKG2D (vom 2,6- auf das 2,0-Fache; p=0,01). Die Hemmung der Expression von NKp44 war hierdurch jedoch nicht signifikant. In Übereinstimmung mit zuvor veröffentlichten Arbeiten, die eine TGF-β-vermittelte Modulation der NK-Zellen durch nTreg zeigten [24, 31], führte eine IL-2-Aktivierung von NK-Zellen in Gegenwart von TGF-β zu keiner Induktion des aktivierenden Rezeptors NKG2D.

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Tumorinduzierte iTreg beeinträchtigen die Aktivierung von NK-Zellen Ebenso führte die Aktivierung von NKZellen mit IL-2 zu einer erheblichen Freisetzung des immunstimulierenden Zytokins Interferon γ (IFN-γ). In weiteren Versuchsläufen schwächten sowohl nTreg als auch iTreg sowie TGF-β [32] die IFNγ-Sekretion aus NK-Zellen signifikant. Es konnte in diesen Versuchsläufen also nachgewiesen werden, dass die Aktivierung von NK-Zellen mit IL-2 erheblich durch beide Treg-Subtypen, insbesonde-

Zusammenfassung · Abstract re durch den tumorassoziierten Typ iTreg, gehemmt werden.

Zytotoxizität Die Zytotoxizität von NK-Zellen wird i. Allg. insbesondere durch die Freisetzung von Perforin und Granzyme vermittelt, um viral infizierte oder Tumorzellen zu eliminieren. Ein sensitiver Marker für die NK-Zell-Funktion ist die Degranulation, die über den Marker CD107a gemessen wird. Die Degranulation, also die Exozytose von sekretorischen Lysosomen, kann durch die Freisetzung von Hexosaminidase oder Granzym B im Zellüberstand von NK-Zellen bestimmt werden oder durch den Nachweis der Expression von CD107a, dem lysosomalen Membranglykoprotein-1 (LAMP-1), das nach der Degranulation auf der Oberfläche zytotoxischer Zellen kurzzeitig erscheint.

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Tumorinduzierte iTreg verbessern die Tumorzellabtötung durch NK-Zellen ohne Voraktivierung mit IL-2

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Regulatorische T-Zellen und NK-Zellen bei Krebspatienten Zusammenfassung NK-Zellen stellen die effektivsten Zellen des Immunsystems zur Bekämpfung von infizierten und entarteten Zellen dar. Regulatorische T-Zellen und ihre beiden Hauptuntergruppen, die natürlich vorkommenden nTreg und die tumorassoziierten induzierten Treg (iTreg), spielen eine wichtige Rolle bei der antitumoralen Immunantwort bei Krebspatienten. In der vorliegenden Arbeit werden die interzellulären Wechselwirkungen dieser Zellgruppen bei Tumorpatienten, insbesondere mit einem Kopf-Hals-Karzinom, dargestellt. Entscheidende Wechselwirkungen zwischen diesen Zellen und den Krebszellen wurden in umfassenden experimentellen Analysen beobachtet. So ließen sich zunächst tumorassoziierte iTreg in einer speziellen humanen Kultur generieren und anschließend im autologen System verschiedene phänotypische und funktionelle Zusammenhänge zwischen die-

sen Zellen, nTreg, NK-Zellen und Tumorzellen überprüfen. iTreg führten zu einer Verstärkung der Aktivität von naiven NK-Zellen in der Gegenwart von Tumorzellen, wohingegen NK-Zellen, die mit Interleukin-2 aktiviert wurden, durch iTreg und nTreg deutlich in ihrer zytotoxischen Funktion gehemmt wurden. Die Arbeitsgruppe des Autors hat neue Einblicke in die komplexe Regulation der menschlichen NK-Zellen und regulatorische T-Zellen im Tumormikromilieu dokumentiert. Dies kann für ein besseres Verständnis der antitumoralen Immunantwort und für die Weiterentwicklung von immuntherapeutischen Strategien von Bedeutung sein. Schlüsselwörter Immunantwort · Immunologische Zytotoxizität · Immunologie · Kopf-HalsKarzinom · Tumor escape

Regulatory T cells and NK cells in cancer patients Abstract NK cells represent the cells of the immune system most effective for eradication of infected or neoplastic cells. Regulatory T cells and the two main subgroups thereof—the naturally occurring nTregs and the tumor-associated induced Tregs (iTregs)—play an important role in the antitumor immune response in cancer patients. The current study explores the intercellular interactions of these groups of cells in tumor patients, particularly in head and neck cancer. Critical interactions between these cells and the cancer cells could be observed in extensive experimental analyses. Firstly, we generated tumor-associated iTregs in a specific human culture. Subsequently, various phenotypic and functional relationships between these cells, nTregs, NK cells and tumor cells were analyzed in an

CD107a findet sich zusammen mit Perforin in sekretorischen Lysosomen und wird bei der Fusion der Granula mit der Zellmembran an die Oberfläche der Zellen transportiert und später wieder internalisiert. Durch Färbung von CD107a kann so die Degranulation der NK-Zellen innerhalb von Minuten nach Stimulation bzw. Aktivierung bestimmt werden. In den Versuchsreihen des Autors führte die Behandlung von NK-Zellen mit IL-2 zu starker Degranulation (das 4,5-Fache im Vergleich zu basalen Expression, gemessen mittels Durchflusszytometrie). Die Kokultivierung der aktivierten NK-Zellen mit iTreg, nTreg oder TGF-β führte zu einer signifikanten Hemmung der Degranulation bis nahezu Basalniveau. Dies lieferte den funktionellen Nachweis für die Hemmung der NK-Zellen durch Treg.

rung durch die Tumorzellen zu beleuchten, führte der Autor die Experimente in Abwesenheit der IL-2-Stimulation durch (. Abb. 3).

Degranulation

D Tumorinduzierte iTreg fördern

Im Fokus der nachfolgenden Untersuchungen stand die Interaktion der NKZellen mit den Tumorzellen. Um speziell den Effekt der NK-Zell-Aktivie-

Die NK-Zellen wurden über Nacht mit iTreg (1:2) oder nTreg (1:2) ohne zusätzliche IL-2. kokultiviert. Für das Degra-

NK-Zell-Zytotoxizität.

autologous system. Although the activity of naive NK cells was enhanced by iTregs in the presence of tumor cells, the cytotoxic function of NK cells activated by interleukin-2 was markedly inhibited by iTregs and nTregs. Our group was able to document new insights into the complex regulation of human NK cells and regulatory T cells in the tumor microenvironment. These new insights may be of relevance for an improved understanding of the antitumor immune response and the development of immunotherapeutic strategies. Keywords Immune response · Immunologic cytotoxicity · Immunology · Head and neck cancer · Tumor escape

nulationsassay wurden Colo699-Tumorzellen als Zielzellen für NK-Zellen weitere 6 h am folgenden Tag eingesetzt. Die Daten werden in . Abb. 3a als Prozent der CD107a+-NK-Zellen dargestellt. Die arithmetischen Mittelwerte ± Standardabweichung des vielfachen Anstiegs von 4 bzw. 7 unabhängigen Experimenten sind angegeben (. Abb. 3a). Der Einfluss der iTreg auf die NK-Zell-Zytotoxizität gegen Colo699-Tumorzellen wurde in einem HNO 6 · 2014 

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CD4

∆M=0

1:0

Ereignisse

∆M=11

Ereignisse

Ereignisse

100%

CD25

Ereignisse

CD132

a

5:1

IL-10

∆M=37

TGF-β

Ereignisse

∆M=35

1:1

b

Ereignisse

∆M=35

Ereignisse

Ereignisse

23%

8%

Verhältnis CD4 : iTreg

CFSE

Abb. 2 8 Phänotypische und funktionelle Eigenschaften der tumorinduzierten iTreg. a CD4+- und CD25-T-Zellen wurden innerhalb von 10 Tagen in Kokultur mit autologen iDC- und PCI-13-Zellen in Gegenwart von IL-2, IL-10, IL-15 generiert. a Dargestellt ist die durchflusszytometrische Analyse der CD4+-Zellen repräsentativ für 5 Einzelversuche mit verschiedenen Spendern. Die Isotypenkontrollen sind als graue Histogramme und die spezifischen Antikörper als weiße Histogramme dargestellt. b Autologe CD4+-Responder-T-Zellen wurden mit fluoreszierenden CFSE markiert und mit Anti-CD3 und Anti-CD28 in Gegenwart von IL-2 für 5 Tage stimuliert. Histogramme zeigen die T-Zell-Proliferation in der Gegenwart oder Abwesenheit von kokultivierten iTreg. (Aus [53], mit freundl. Genehmigung des John-Wiley-Verlags)

6-h-Chromfreisetzungsassay untersucht (. Abb. 3b). NK-Zellen wurden über Nacht mit iTreg (1:2) kokultiviert. Am folgenden Tag wurden die chrommarkierten Tumorzellen der Kokultur hinzugefügt. Die Daten werden als Mittelwerte aus 7 unabhängigen Experimenten ± SEM („standard error of mean“) dargestellt. Die NK-Zellen wurden mit iTreg über Nacht kokultiviert (. Abb. 3c). Für die Degranulationsassays wurden verschiedene Tumorzellen als Zielzellen verwendet und für weitere 6 h der Kokultur beigefügt. Die Generation von iTreg wurde mit den entsprechenden Tumorzellen durchgeführt. Die Zahlen in % im oberen rechten Quadranten zeigen die Degranulation von NK-Zellen (CD56+ und CD107a+). Die Diagramme zeigen Daten, die repräsentativ für 2–7 Experimente sind und die unter den jeweiligen experimentellen Bedingungen durchgeführt wurden (. Abb. 3c). Die Kokultivierung der NK-Zellen mit der Adenokarzinomzelllinie Colo699, die genetisch modifiziert für den NKG2DLiganden MICA vorlag, führte zu einer leichten Induktion der Degranulation im

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Vergleich zu nichtstimulierten NK-Zellen. Die Degranulation verbesserte sich sogar durch die Zugabe von iTreg deutlich (10,4% gegenüber 39,5%; p

[Regulatory T cells and NK cells in cancer patients].

NK cells represent the cells of the immune system most effective for eradication of infected or neoplastic cells. Regulatory T cells and the two main ...
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