Originalarbeit Gynäkol Geburtsh Rundsch 1992;32:73-77
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5. Co/cb R. Hayb C. Brölschc Universitäts-Frauenklinik, Würzburg. BRD; Abteilungen für Endokrinologie und Pathologie, und Abteilung für Transplantationsmedizin, Universität von Chicago, USA
Regulation von Sterolträgerprotein-2 in humanen Lutealzellen durch LHund LH-RH
Schlüsselwörter
Zusammenfassung
Humane Lutealzcllcn Sterolträgcrprotein-2 (SCP2) In-vitro-Fcrtilisation (IVF) Luteinisierendes Hormon (LH) Humanes Choriongonadotropin (hCG) LH-Releasing-Hormon (LHRH)
Die Konversion von Cholesterol zu Pregnenolon gilt als der wichtigste und zugleich limitie rende Schritt der Steroidsynthese. Sterolträgerprotein-2 (SCP2) oder nichtspezifisches Lipid transferprotein (nsL-TP) ist ein intrazelluläres Protein, das für den prä- und transmitochon drialen Cholesteroltransport und damit die mitochondriale Pregnenolonsynthese von we sentlicher Bedeutung ist. In den Leydig-Zellen der Ratte kann die Pregnenolonsynthese durch LH und LH-RH stimuliert werden, dabei kommt es nur unter LH zu charakteristischen Ver änderungen der intrazellulären SCP2-Konzentrationen. Dies bedeutet, daß die Pregnenolon synthese über zwei verschiedene Wege reguliert werden kann. Ziel dieser Untersuchung war festzustellen, ob es auch im humanen Corpus luteum einen derartigen «zweiten Weg» der Steroidsynthese gibt. Anhand von humanen Lutealzellen, die bei Follikelpunktionen anfielen und kultiviert wurden, konnten wir zeigen, dass (humanes) LH/hCG auch im humanen Cor pus luteum die Pregnenolonsynthese erhöht und es dabei zu charakteristischen Umverteilun gen von SCP2 sowie einer Aktivitätssteigerung der 7-Dchydrocholesterol-Reduktasc, eines Markerenzyms für SCP2, kommt. LH-RH zeigt an humanen Lutealzellen hingegen keinerlei Effekte, so dass im humanen Corpus luteum kein «zweiter Weg» der Steroidsynthese nachzu weisen ist.
Key Words
Regulation of Sterol Carrier Protein-2 in Human Luteal Cells by LHand LH-RH
Human luteal cells Sterol carrier protein-2 (SCPi) In vitro fertilization Luteinizing hormone (LH) Human chorion gonadotropin (hCG) LH-releasing hormone (LHRH)
Conversion of cholesterol to pregnenolone is the most important and, at the same time, the rate-limiting step of steroidogenesis. Sterol carrier protein-2 (SCPi) or nonspecific lipid trans fer protein (nsL-TP) is an intracellular protein, which plays an important role in the pre- and transmitochondrial transport of cholesterol and for the mitochondrial synthesis of pregneno lone. Synthesis of pregnenolone in rat Leydig cells can be increased by LH and LH-RH; however, only LH leads to characteristic changes in intracellular concentrations of SCP2. This means that synthesis of pregnenolone is regulated in two different ways. In this study we aimed to find out whether such a ‘second way’ of steroidogenesis is also demonstrable for the human corpus luteum (i.e. human luteal cells). Human luteal cells were collected during folli cle punctures and were cultured as described previously. We demonstrate that (human) LH/hCG are able to enhance pregnenolone synthesis; this process is accompagnied by typical changes of SCP2 and an increase in activity of 7-dehydrocholesterol reductase, which is a marker enzyme for SCP2. LH-RH was shown to exert no effect. Thus, we conclude that a second way of steroidogenesis (i.e. synthesis of pregnenolone) cannot be proved for the human corpus luteum.
F.ingcgangcn: 3. D ezem ber 1991 Angenommen:
9. März 1992
Dr. W. Würfel Universitäts-Frauenklinik Würzburg D-W-8700 Würzburg (BRD)
Downloaded by: King's College London 137.73.144.138 - 1/13/2019 5:46:29 AM
W. Würfela M. W. Beckmann b J.R. Schreiberb
La régulation de la stérol carrier protein-2 (SCP2) dans les cellules lutéales humaines par LH et LH-RH La conversion du cholestérol en prégnénolone est considérée comme l’étape la plus impor tante et, en même temps, l’étape qui limite la synthèse des stéroides. La sterol carrier protein2 (SCP2) ou protéine non spécifique du transport des lipides (nsL-TP) est une protéine intra cellulaire, essentielle pour le transport du cholésterol pré- et transmitochondrial et pour la synthèse de la prégnénolone mitochondriale dans les cellules de Leydig du rat. La synthèse de la prégnénolone peut être stimulée par la LH et la LH-RH, mais seule la LH provoque des changements caractéristiques des concentrations intracellulaires de SCP2, ce qui signifie que la synthèse de la prégnénolone est réalisée par deux voies différentes. L’objectif de nos recher ches a été de vérifier s’il existe aussi dans le corpus lutcum humain une telle «deuxième voie» de la synthèse des stéroïdes. Grâce aus cellules lutéales humaines recueillies lors de ponctions de follicules et mises en culture, nous avons démontré que les LH/hCG humaines étaient aussi en mesure d’intensifier la synthèse de la prégnénolone dans le corpus luteum humain. Pendant ce processus nous avons observé des redistributions caractéristiques de SCP2 et une augmentation de l’activité de la 7-déhydrocholcstérol-réductasc, enzyme marqueur de SCP;. Par contre, LH-RH n'a pas montré de tels effets. Il en résulte au’il n’existe pas de deuxième voie pour la synthèse des stéroïdes dans le corpus luteum humain.
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lären Fraktionen, also auch den Mitochondrien, unter anderem durch exogenes LDL beeinflusst [9]; die spezi fische Aktivität von hl-SCP2 (gemessen durch Aktivie rung der mikrosomalen 7-Dehydrocholesterol-Reduktase) wird unter anderem durch hCG reguliert [8], Aufgrund der Publikation von van Noort et al. [7] er schien es für das grundlegende Verständnis der humanen Lutealfunktion interessant, ob es auch hier einen ähnli chen, «zweiten» Weg der Steroidsynthese gibt. Die nach folgende Untersuchung sollte diese Fragestellung abklären. Material und Methoden Die humanen Lutealzellen entstammten Follikelpunktionen im Rahmen einer Behandlung durch In-vitro-Fcrtilisation (IVF) oder intratubaren Gametentransfer (GIFT), die vorangegangenen Stimula tionsbehandlungen wurden ausschliesslich mit humanem Menopau sengonadotropin (hMG) und/oder follikelstimulierendem Hormon (FSH) durchgeführt. Sie wurden in einem von uns wcitcrentwickelten Mehrschrittverfahren gereinigt und kultiviert [10]. Alle Kulturen wur den ohne Zusatz von humanem «Low-density»-Lipoprotcin (hLDL) durchgeführt, alle Ansätze in Triplikaten. Die Fraktionierung der Lutealzellen nach 72 h erfolgte nach den Angaben von Amerongcn et al. [11], die Überprüfung des Reinheitsgrades der präparierten Frak tionen in typischer Weise im Enzymassay (Zytochrom-c-Oxidase, NADPH-Zytochrom-c-Reduktase, ß-Azetylglukosaminidasc) [11], SCP2-Titer wurden unter Verwendung eines poiyklonalen Antikör pers gegen humanes hepatisches SCP; nach den Angaben von Teer link etal. [12] im ELISA bestimmt. Der polyklonale Antikörper wurde von K.W.A. Wirtz et al. zur Verfügung gestellt, das zur Standardi sierung erforderliche humane SCP2 wurde in einem von Noland et al. [13] beschriebenen und von uns [8] modifizierten Mehrschrittverfah ren aus Resten humaner Donorleber dargestellt (Transplantations chirurgie der Universität von Chicago, Prof. Dr. Ch. Brölsch). Die Ermittlung der spezifischen Aktivität von SCP; erfolgte nach den Angaben von Noland et al. [ 13] durch Aktivitätsbestimmung der mikrosomalen 7-Dehydrocholesterol-Reduktase, die Pregnenolonund Progesteronkonzentrationen wurden mit kommerziell erhältli chen Kits im RIA bestimmt (Radioassay Systems Laboratories®).
Würfel/Beckmann/Schreiber/Holt/Cok/ Hay/Brölsch
SCP; und LH/LH-RH
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«Sterol carrier protcin-2» (SCP2) auch nichtspezifi sches Lipidtransferprotein (nsLTP) genannt [1], ist ein intrazelluläres Protein mit bekanntem Molekulargewicht (etwa 14 kD) und bekannter Aminosäuresequenz. SCP2 aktiviert den intrazellulären Austausch verschiedener Li pide, so auch den von Cholesterol; unklar ist bislang, ob der Wirkmechanismus von SCP2 eher dem eines Träger proteins (Bindung und Transport) oder dem eines Trans ferproteins (erleichterter Austausch zwischen Donor und Akzeptor) entspricht [1-3]. Die Konversion von Cholesterol zu Pregnenolon gilt allgemein als der wichtigste Schritt der gesamten Steroid synthese und zudem als derjenige, der massgebend die weitere Syntheserate bestimmt [4, 5], Die Bereitstellung von Cholesterol zur mitochondrialen Pregnenolonsynthese ist daher ein essentieller Abschnitt dieser «Schlüs selreaktion». Auch wenn die exakte Bedeutung von SCP2 für diesen zentralen Syntheseschritt noch nicht vollständig beschrie ben ist, ist doch festzustellen, dass SCP2 hieran massgeb lich beteiligt ist oder - umgekehrt formuliert - eine Regu lation der Steroid-(Pregnenolon-)synthese ohne Beteili gung von SCP2 nie gefunden wurde [2, 3, 6], mit einer Ausnahme: van Noort et al. [7] konnten für die LeydigZellen der Ratte zeigen, dass sowohl das luteinisierende Hormon (LH) als auch das LH-releasing-Hormon (LHRH) in der Lage sind, die Pregnenolonsynthese und -Sek retion dieser Zellen zu steigern, jedoch nur LH zu intra zellulären Konzentrationsveränderungen von SCP2 führt. Die Autoren kamen zum Schluss, dass es in den LeydigZellen der Ratte zwei Steroidsynthesewege geben müsse, einen mit und einen ohne Beteiligung on SCP2 . Wie wir in früheren Untersuchungen zeigen konnten, existiert SCP2 auch im humanen Corpus luteum [8]. Die intrazelluläre Konzentrationsverteilung von humanem lutealem SCP2 (hl-SCP2 ) wird in verschiedenen subzellu
Die statistischen Untersuchungen erfolgten rechnergestützt (StatWorks®, Anova), wobei p < 0.05 als statistisch signifikant zugrunde gelegt wurde.
^ 3 Progesteron tsssssi Pregnenolon
Ergebnisse
Pregnenolon und vor allem Progesteron gelten neben Östradiol als die wesentlichsten steroidalen Synthesepro dukte des humanen Corpus luteum. Ihre Synthese kann durch humanes Choriongonadotropin (hCG) und huma nes luteinisierendes Hormon (hLH) gesteigert werden. hCG und hLH erhöhten in unserer Untersuchung die luteale Pregnennolon- und Progesteronsynthese signifi kant (Abb. 1). Der Stimulationseffekt war bei den gewähl ten Konzentrationen (1 mlE/ml) etwa identisch. Ein Effekt auf die luteale Steroidsynthese war unter Zugabe von LHRH zu beobachten, die gewählte Konzentration (100 p.Vf) entsprach der von van Noort et al. [7] verwendeten. Die mitochondriale Konzentration von SCPi nahm unter Stimulation mit hCG und hLH zu. unter hCG signi fikant (Abb. 2). LH-RH führte zu keinen Veränderungen der SCPj-Konzentration in den Mitochondrien. Im Zytosol, in den Mikrosomen und in der lysosomalperoxisomalcn Fraktion (Abb. 3-5) nahm der Gehalt von SCP2 unter Stimulation mit hCG oder hLH ab, für hCG mit Ausnahme des Zytosols stets signifikant; für hLH ver-
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Abb. 1. Progesteron- und Prcgncnolonkonzentrationen im Kul turmedium. In der Kontrollgruppe erfolgte keine exogene Stimula tion der Lutealzellen, die Konzentration von hCG und LH betrug l mlE/ml, diejenige von LH-RH 100 \iM. Alle Werte sind angegeben in prozentualer Abweichung von der Kontrolle (Mittelwerte + Stan dardabweichung). Es zeigt sich, dass es unter hCG und LH zu einer statistisch signifikanten (•) Steigerung der Steroidsynthcsc kommt (Intraassayvarianz Progesteron 6%, Pregnendon 7%; Interassayvarianz Progesteron 11 %, Pregnenolon 10%. Abb. 2. SCPi-Konzentrationen in den Mitochondrien. Die Ver suchsbedingungen waren mit den in Abb. 1 identisch. Dargestellt sind Mittelwerte + Standardabweichungen aus drei Versuchen. Un ter Stimulation mit hCG oder hLH kommt es zur Zunahme der mit ochondrialen SCP2-Konzentrationen, LH-RH ist ohne nachweisba ren Einfluss. Abb. 3. SCPi-Konzentrationen im Zytosol. Dargestellt sind Mit telwerte + Standardabweichungen. Unter hCG und hLH kommt es zur Abnahme der SCPj-Konzcntration im Zytosol. nicht jedoch unter LH-RH. Abb. 4. SCPi-Konzentrationen in den Mikrosomen. Dargestellt sind Mittelwerte + Standardabweichungen. Unter hCG oder hLH nehmen die mikrosomalen SCPi-Konzentrationen ab, LH-RH zeigt keinen Einfluß. Abb. 5. SCPi-Konzentrationen in der lysosomalcn/peroxisomalcn Fraktion. Dargestellt sind Mittelwerte + Standardabweichungen. Methodisch ist anzumerken, dass diese Fraktion relativ stark durch andere Fraktionen, insbesondere Mikrosomen, kontaminiert war (Ergebnisse nicht dargestellt). Unter hCG oder hLH nehmen die SCPi-Konzentrationen ab, unter LH-RH nehmen sie geringfügig zu, ohne dass statistische Signifikanz erreicht wird.
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Tabelle 1. Aktivität der mikrosomalcn 7-DHC-Reduktase
Kultur ohne exogene Stimulation (Kontrollgruppc) hCG, l.O mlE/ml hLH. l.O mlE/ml LH-RH, lOOpA/
Spezifische Aktivität nmol/2 h/mg
Statistische Signifikanz vs Kontrollgruppe p < 0.05
86.7 ±9.3 182.8 ± 11.7 191.2 ± 12.3 82.1 ±13.1
entfällt ja ja nein
fehlte diese Abnahme das Signifikanzniveau zum Teil nur knapp (Mikrosomen). Unter Zugabe von LH-RH kam es nur in den Lysosomen/Peroxisomen zu einer nennens werten Änderung der SCPi-Konzentration (Zunahme), sie war jedoch nicht signifikant. Die mikrosomale 7-Dehydrocholesterol-Reduktase (7DHC-Reduktase) gilt als Enzymkomplex, dessen Aktivi tät ausschliesslich durch SCP: zu steigern ist [1, 5, 13], Dementsprechend gilt die Aktivität der 7-DHC-Rcduktase als guter Massstab für die (spezifische) Aktivität von SCPi. In Tabelle 1 sind die ermittelten spezifischen Akti vitäten von SCP2 dargestellt: Demnach kam es sowohl unter hCG als auch unter hLH zum signifikanten Anstieg der Aktivität der 7-DHC-Reduktase, während LH-RH zu keiner Veränderung führte.
Diskussion
hCG und hLH stimulierten - wie zu erwarten war - die luteale Synthese und Sekretion von Pregnenolon und Progesteron. Begleitet war diese Stimulation von charak teristischen Veränderungen des Gehaltes an SCP2 in verschiedenen subzellulären Fraktionen: In den Mitochondrien kam es zu einer Zunahme, in den anderen Fraktionen (Mikrosomen. Zytosol und Lysosomen/Per oxisomen) zur Abnahme. Wie schon gezeigt, ist die Zunahme der mitochondria len SCPa-Konzentration nicht abhängig von der gewähl ten hCG-Dosis [8], Für die spezifische Aktivität, die ebenfalls unter hCG-Stimulation ansteigt, besteht jedoch eine klare Korrelation zur hCG-Dosis, so dass die Zu nahme des mitochondrialen SCPi-Gehalts möglicher weise von zweitrangiger Bedeutung ist [8], Obwohl hier noch offene Fragen bleiben, bestätigen diese Ergebnisse doch klar, daß SCP2 auch für die Stimulation der lutealen Steroidogenese mit hCG oder hLH eine wesentliche Rolle spielt, vor allem bei der entscheidenden mitochondrialen Konversion von Cholesterol zu Pregnenolon.
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LH-RH führte zu keinerlei signifikanten Veränderun gen der mitochondrialen SCP2-Konzentration, auch blieb die Synthese von Pregnenolon und Progesteron in unse ren Kulturen unbeeinflußt. Aufgrund dieser beiden Er gebnisse kann daher festgestellt werden, dass LH-RH für die Regulation der Steroidogenese im humanen Corpus luteum keine Bedeutung spielt, ein «zweiter» Synthese weg ist nicht nachzuweisen. Die Abnahme des SCP2-Gehalts im Zytosol könnte vordergründig als «Abwandern von SCP2 » zu den Mitochondrien hin, also entlang des Cholesteroltransportwe ges, interpretiert werden. Die hier gefundenen Verände rungen erreichen jedoch keinerlei statistische Signifikanz, zudem gibt es in der Literatur auch konträre Mitteilungen [ 14], Hier ist die Diskussion noch im Gange. Einfacher ist die Abnahme des SCP2-Gehalts in den Mikrosomen zu deuten. Das Cholesterol, das für die Steroidsynthese unter Stimulation mit hCG oder hLH benötigt wird, enstammt in der Regel nicht der De-novo-Synthese [3, 15, 16], hierzu wäre mikrosomales SCP2 erforderlich [3,5]. Zu dem ist unter den Bedingungen der hCG/hLH-Stimulation die «Zwischenlagerung» von Cholesterol in den Li pidtröpfchen als Cholesterolester von keiner Bedeutung [2], die Lipidtröpfchen nehmen - im Gegenteil - sogar an Zahl und Durchmesser ab [4], Kaum einzuordnen sind wiederum die Ergebnisse bei den Lysosomen/Peroxisomen. Dies hängt vor allem mit methodischen Problemen zusammen: Lysosomen/Per oxisomen sind sehr schwierig zu präparieren [17], auch hier war die Fraktion vor allem durch Mikrosomen kon taminiert. Grundsätzlich spielen Peroxisomen hauptsäch lich für die Aufnahme von exogenem LDL, also auch Cholesterol, eine große Rolle [15], LH-RH führte auch in diesen Zellfraktionen zu keinen signifikanten Verände rungen von SCP2 . Unabhängig davon, welche Funktion SCP2 in diesen Fraktionen genau zukommt, unterstrei chen auch diese Ergebnisse die schon erwähnte Feststel lung, dass LH-RH in der Regulation des humanen Corpus luteum keine wesentliche Bedeutung besitzt.
Würfel/Beckmann/Schreiber/Holt/Cok/ Hay/Brölsch
SCP2 und LH/LH-RH
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Dargestellt sind Mittelwerte ± Standardabweichung. Eine Stimulation mit hCG oder hLH steigert die Aktivität der 7-DHC auf mehr als das Doppelte, eine Zugabe von LH-RH führt zu keinen Veränderungen der Aktivität.
Literatur 8 Würfel W. Beckmann MW, Schreiber JR, Holt JA. Cok S, Hay R, Brölsch C, W irtz KWA: Evi dence for sterol carrier protein 2 (SCPj) or a SCPi-like protein in cultured human luteal cells and its regulation by human chorionic gonadotropin (hCG). Jahresversammlung Soc Gynec Invest, März 1991, Abstract 392. 9 Würfel W, Beckmann MW. Schreiber JR. Holt JA, Cok S. Hay R. Brölsch C, Wirtz KWA: Human LDL increases the concentration of non-specific lipid transfer protein (nsL-TP) [sterol carrier protein 2 (SCP?)] in different subcellular fractions of cultured human luteal cells. Jahresversammlung The Endocrine Soci ety USA, Juni 1991, Abstract 631. 10 Beckmann MW. Würfel W. Seung L. Schreiber JR: Die hochgercinigtc Kultur luteinisierter humaner Granulosazellen - ein Modell zum Studium intrazellulärer Synthesewege. Arch Gynecol Obstet. 1991; in Druck. 11 van Amerongen A, van Noort M, van Beck hoven JRCM, Rommerts FFG, Orly J, Wirtz KWA: The subcellular distribution of the non specific lipid transfer protein (sterol carrier protein 2) in rat liver and adrenal gland. Biochim BiophysActa 1989:1001:243.
12 Teerlink T, van der Krift TP, van Heusden GPH. Wirtz KWA: Determination of nonspe cific lipid transfer in rat tissues and Morris hep atomas by enzyme immunoassay. Biochim BiophysActa 1984:793:251. 13 Noland BJ. Arebalo RE, Hansbury E, Scallen TJ: Purification and properties of sterol carrier protein-2. J Biol Chem 1980:255:4282. 14 van Noort M, Rommerts FFG, van Ame rongen A, Wirtz KWA: Intracellular redistribu tion of (SCPj) in Leydig cells after hormonal stimulation may contribute to increased preg nenolone production. Biochem Biophys Res Commun 1988; 154:60. 15 Goldstein JL, Brown MS: The low-density lipo protein pathway and its relation to atheroscle rosis. Annu Rev Biochem !977;46:897. 16 GolosTG, Soto EA, Tureck WT, StraussJF III: Human chorionic gonatropin and 8-bromoadenosine 3',5'-monophosphate stimulate [lî5]I low density lipoprotein uptake and me tabolism by luteinized human granulosa cells in culture. J Clin Endocrinol Metab 1985:61: 633. 17 Fujiki Y. Fowler S, Shio H, Hubbard AL. Lazarow PB: Polypeptide and phospholipid compo sition of the membrane of rat liver peroxi somes: Comparison with endoplasmatic reticu lum and mitochondrial membranes. J Cell Biol 1982:93:103.
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1 Wirtz KWA, Gadella TW Jr: Properties and modes of action of specific and non-specific phospholipid transfer proteins. Experientia 1990:46:592. 2 Holt JA, Würfel W, Beckmann MW: Control and trafficking of cholesterol and other lipids within the ovary. Sem Reprod Endocrinol 19 9 1;9:303. 3 Reinhart MP: Intracellular sterol trafficking. Experientia 1990:46:599. 4 Holt JA: Regulation of progesterone produc tion in the rabbit corpus luteum. Biol Reprod 1989:40:201. 5 Vahouny GV. Chanderbhan R. Kharroubi A, Noland BJ, Pastuszyn A, Scallcn TJ: Sterol car rier and lipid transfer proteins. Adv Lipid Res 1987;22:83. 6 Jefcoate CR. DiBartholomeis MJ, Williams CA, McNamara BC: ACTH-Regulation of cho lesterol movements in isolated adrenal cells. J Steroid Biochem 1987;27:721. 7 van Noort M, Rommerts FFG, van Amerongen A, Wirtz KWA: Regulation of sterol carrier protein 2 (SCPi) levels in the soluble fraction of rat Leydig cells. Kinetics and possi ble role o f calcium influx. Mol Cell Endocrinol 1988:56:133.
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5. Co/cb R. Hayb C. Brölschc Universitäts-Frauenklinik, Würzburg. BRD; Abteilungen für Endokrinologie und Pathologie, und Abteilung für Transplantationsmedizin, Universität von Chicago, USA
Regulation von Sterolträgerprotein-2 in humanen Lutealzellen durch LHund LH-RH
Schlüsselwörter
Zusammenfassung
Humane Lutealzcllcn Sterolträgcrprotein-2 (SCP2) In-vitro-Fcrtilisation (IVF) Luteinisierendes Hormon (LH) Humanes Choriongonadotropin (hCG) LH-Releasing-Hormon (LHRH)
Die Konversion von Cholesterol zu Pregnenolon gilt als der wichtigste und zugleich limitie rende Schritt der Steroidsynthese. Sterolträgerprotein-2 (SCP2) oder nichtspezifisches Lipid transferprotein (nsL-TP) ist ein intrazelluläres Protein, das für den prä- und transmitochon drialen Cholesteroltransport und damit die mitochondriale Pregnenolonsynthese von we sentlicher Bedeutung ist. In den Leydig-Zellen der Ratte kann die Pregnenolonsynthese durch LH und LH-RH stimuliert werden, dabei kommt es nur unter LH zu charakteristischen Ver änderungen der intrazellulären SCP2-Konzentrationen. Dies bedeutet, daß die Pregnenolon synthese über zwei verschiedene Wege reguliert werden kann. Ziel dieser Untersuchung war festzustellen, ob es auch im humanen Corpus luteum einen derartigen «zweiten Weg» der Steroidsynthese gibt. Anhand von humanen Lutealzellen, die bei Follikelpunktionen anfielen und kultiviert wurden, konnten wir zeigen, dass (humanes) LH/hCG auch im humanen Cor pus luteum die Pregnenolonsynthese erhöht und es dabei zu charakteristischen Umverteilun gen von SCP2 sowie einer Aktivitätssteigerung der 7-Dchydrocholesterol-Reduktasc, eines Markerenzyms für SCP2, kommt. LH-RH zeigt an humanen Lutealzellen hingegen keinerlei Effekte, so dass im humanen Corpus luteum kein «zweiter Weg» der Steroidsynthese nachzu weisen ist.
Key Words
Regulation of Sterol Carrier Protein-2 in Human Luteal Cells by LHand LH-RH
Human luteal cells Sterol carrier protein-2 (SCPi) In vitro fertilization Luteinizing hormone (LH) Human chorion gonadotropin (hCG) LH-releasing hormone (LHRH)
Conversion of cholesterol to pregnenolone is the most important and, at the same time, the rate-limiting step of steroidogenesis. Sterol carrier protein-2 (SCPi) or nonspecific lipid trans fer protein (nsL-TP) is an intracellular protein, which plays an important role in the pre- and transmitochondrial transport of cholesterol and for the mitochondrial synthesis of pregneno lone. Synthesis of pregnenolone in rat Leydig cells can be increased by LH and LH-RH; however, only LH leads to characteristic changes in intracellular concentrations of SCP2. This means that synthesis of pregnenolone is regulated in two different ways. In this study we aimed to find out whether such a ‘second way’ of steroidogenesis is also demonstrable for the human corpus luteum (i.e. human luteal cells). Human luteal cells were collected during folli cle punctures and were cultured as described previously. We demonstrate that (human) LH/hCG are able to enhance pregnenolone synthesis; this process is accompagnied by typical changes of SCP2 and an increase in activity of 7-dehydrocholesterol reductase, which is a marker enzyme for SCP2. LH-RH was shown to exert no effect. Thus, we conclude that a second way of steroidogenesis (i.e. synthesis of pregnenolone) cannot be proved for the human corpus luteum.
F.ingcgangcn: 3. D ezem ber 1991 Angenommen:
9. März 1992
Dr. W. Würfel Universitäts-Frauenklinik Würzburg D-W-8700 Würzburg (BRD)
Downloaded by: King's College London 137.73.144.138 - 1/13/2019 5:46:29 AM
W. Würfela M. W. Beckmann b J.R. Schreiberb
La régulation de la stérol carrier protein-2 (SCP2) dans les cellules lutéales humaines par LH et LH-RH La conversion du cholestérol en prégnénolone est considérée comme l’étape la plus impor tante et, en même temps, l’étape qui limite la synthèse des stéroides. La sterol carrier protein2 (SCP2) ou protéine non spécifique du transport des lipides (nsL-TP) est une protéine intra cellulaire, essentielle pour le transport du cholésterol pré- et transmitochondrial et pour la synthèse de la prégnénolone mitochondriale dans les cellules de Leydig du rat. La synthèse de la prégnénolone peut être stimulée par la LH et la LH-RH, mais seule la LH provoque des changements caractéristiques des concentrations intracellulaires de SCP2, ce qui signifie que la synthèse de la prégnénolone est réalisée par deux voies différentes. L’objectif de nos recher ches a été de vérifier s’il existe aussi dans le corpus lutcum humain une telle «deuxième voie» de la synthèse des stéroïdes. Grâce aus cellules lutéales humaines recueillies lors de ponctions de follicules et mises en culture, nous avons démontré que les LH/hCG humaines étaient aussi en mesure d’intensifier la synthèse de la prégnénolone dans le corpus luteum humain. Pendant ce processus nous avons observé des redistributions caractéristiques de SCP2 et une augmentation de l’activité de la 7-déhydrocholcstérol-réductasc, enzyme marqueur de SCP;. Par contre, LH-RH n'a pas montré de tels effets. Il en résulte au’il n’existe pas de deuxième voie pour la synthèse des stéroïdes dans le corpus luteum humain.
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lären Fraktionen, also auch den Mitochondrien, unter anderem durch exogenes LDL beeinflusst [9]; die spezi fische Aktivität von hl-SCP2 (gemessen durch Aktivie rung der mikrosomalen 7-Dehydrocholesterol-Reduktase) wird unter anderem durch hCG reguliert [8], Aufgrund der Publikation von van Noort et al. [7] er schien es für das grundlegende Verständnis der humanen Lutealfunktion interessant, ob es auch hier einen ähnli chen, «zweiten» Weg der Steroidsynthese gibt. Die nach folgende Untersuchung sollte diese Fragestellung abklären. Material und Methoden Die humanen Lutealzellen entstammten Follikelpunktionen im Rahmen einer Behandlung durch In-vitro-Fcrtilisation (IVF) oder intratubaren Gametentransfer (GIFT), die vorangegangenen Stimula tionsbehandlungen wurden ausschliesslich mit humanem Menopau sengonadotropin (hMG) und/oder follikelstimulierendem Hormon (FSH) durchgeführt. Sie wurden in einem von uns wcitcrentwickelten Mehrschrittverfahren gereinigt und kultiviert [10]. Alle Kulturen wur den ohne Zusatz von humanem «Low-density»-Lipoprotcin (hLDL) durchgeführt, alle Ansätze in Triplikaten. Die Fraktionierung der Lutealzellen nach 72 h erfolgte nach den Angaben von Amerongcn et al. [11], die Überprüfung des Reinheitsgrades der präparierten Frak tionen in typischer Weise im Enzymassay (Zytochrom-c-Oxidase, NADPH-Zytochrom-c-Reduktase, ß-Azetylglukosaminidasc) [11], SCP2-Titer wurden unter Verwendung eines poiyklonalen Antikör pers gegen humanes hepatisches SCP; nach den Angaben von Teer link etal. [12] im ELISA bestimmt. Der polyklonale Antikörper wurde von K.W.A. Wirtz et al. zur Verfügung gestellt, das zur Standardi sierung erforderliche humane SCP2 wurde in einem von Noland et al. [13] beschriebenen und von uns [8] modifizierten Mehrschrittverfah ren aus Resten humaner Donorleber dargestellt (Transplantations chirurgie der Universität von Chicago, Prof. Dr. Ch. Brölsch). Die Ermittlung der spezifischen Aktivität von SCP; erfolgte nach den Angaben von Noland et al. [ 13] durch Aktivitätsbestimmung der mikrosomalen 7-Dehydrocholesterol-Reduktase, die Pregnenolonund Progesteronkonzentrationen wurden mit kommerziell erhältli chen Kits im RIA bestimmt (Radioassay Systems Laboratories®).
Würfel/Beckmann/Schreiber/Holt/Cok/ Hay/Brölsch
SCP; und LH/LH-RH
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«Sterol carrier protcin-2» (SCP2) auch nichtspezifi sches Lipidtransferprotein (nsLTP) genannt [1], ist ein intrazelluläres Protein mit bekanntem Molekulargewicht (etwa 14 kD) und bekannter Aminosäuresequenz. SCP2 aktiviert den intrazellulären Austausch verschiedener Li pide, so auch den von Cholesterol; unklar ist bislang, ob der Wirkmechanismus von SCP2 eher dem eines Träger proteins (Bindung und Transport) oder dem eines Trans ferproteins (erleichterter Austausch zwischen Donor und Akzeptor) entspricht [1-3]. Die Konversion von Cholesterol zu Pregnenolon gilt allgemein als der wichtigste Schritt der gesamten Steroid synthese und zudem als derjenige, der massgebend die weitere Syntheserate bestimmt [4, 5], Die Bereitstellung von Cholesterol zur mitochondrialen Pregnenolonsynthese ist daher ein essentieller Abschnitt dieser «Schlüs selreaktion». Auch wenn die exakte Bedeutung von SCP2 für diesen zentralen Syntheseschritt noch nicht vollständig beschrie ben ist, ist doch festzustellen, dass SCP2 hieran massgeb lich beteiligt ist oder - umgekehrt formuliert - eine Regu lation der Steroid-(Pregnenolon-)synthese ohne Beteili gung von SCP2 nie gefunden wurde [2, 3, 6], mit einer Ausnahme: van Noort et al. [7] konnten für die LeydigZellen der Ratte zeigen, dass sowohl das luteinisierende Hormon (LH) als auch das LH-releasing-Hormon (LHRH) in der Lage sind, die Pregnenolonsynthese und -Sek retion dieser Zellen zu steigern, jedoch nur LH zu intra zellulären Konzentrationsveränderungen von SCP2 führt. Die Autoren kamen zum Schluss, dass es in den LeydigZellen der Ratte zwei Steroidsynthesewege geben müsse, einen mit und einen ohne Beteiligung on SCP2 . Wie wir in früheren Untersuchungen zeigen konnten, existiert SCP2 auch im humanen Corpus luteum [8]. Die intrazelluläre Konzentrationsverteilung von humanem lutealem SCP2 (hl-SCP2 ) wird in verschiedenen subzellu
Die statistischen Untersuchungen erfolgten rechnergestützt (StatWorks®, Anova), wobei p < 0.05 als statistisch signifikant zugrunde gelegt wurde.
^ 3 Progesteron tsssssi Pregnenolon
Ergebnisse
Pregnenolon und vor allem Progesteron gelten neben Östradiol als die wesentlichsten steroidalen Synthesepro dukte des humanen Corpus luteum. Ihre Synthese kann durch humanes Choriongonadotropin (hCG) und huma nes luteinisierendes Hormon (hLH) gesteigert werden. hCG und hLH erhöhten in unserer Untersuchung die luteale Pregnennolon- und Progesteronsynthese signifi kant (Abb. 1). Der Stimulationseffekt war bei den gewähl ten Konzentrationen (1 mlE/ml) etwa identisch. Ein Effekt auf die luteale Steroidsynthese war unter Zugabe von LHRH zu beobachten, die gewählte Konzentration (100 p.Vf) entsprach der von van Noort et al. [7] verwendeten. Die mitochondriale Konzentration von SCPi nahm unter Stimulation mit hCG und hLH zu. unter hCG signi fikant (Abb. 2). LH-RH führte zu keinen Veränderungen der SCPj-Konzentration in den Mitochondrien. Im Zytosol, in den Mikrosomen und in der lysosomalperoxisomalcn Fraktion (Abb. 3-5) nahm der Gehalt von SCP2 unter Stimulation mit hCG oder hLH ab, für hCG mit Ausnahme des Zytosols stets signifikant; für hLH ver-
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Abb. 1. Progesteron- und Prcgncnolonkonzentrationen im Kul turmedium. In der Kontrollgruppe erfolgte keine exogene Stimula tion der Lutealzellen, die Konzentration von hCG und LH betrug l mlE/ml, diejenige von LH-RH 100 \iM. Alle Werte sind angegeben in prozentualer Abweichung von der Kontrolle (Mittelwerte + Stan dardabweichung). Es zeigt sich, dass es unter hCG und LH zu einer statistisch signifikanten (•) Steigerung der Steroidsynthcsc kommt (Intraassayvarianz Progesteron 6%, Pregnendon 7%; Interassayvarianz Progesteron 11 %, Pregnenolon 10%. Abb. 2. SCPi-Konzentrationen in den Mitochondrien. Die Ver suchsbedingungen waren mit den in Abb. 1 identisch. Dargestellt sind Mittelwerte + Standardabweichungen aus drei Versuchen. Un ter Stimulation mit hCG oder hLH kommt es zur Zunahme der mit ochondrialen SCP2-Konzentrationen, LH-RH ist ohne nachweisba ren Einfluss. Abb. 3. SCPi-Konzentrationen im Zytosol. Dargestellt sind Mit telwerte + Standardabweichungen. Unter hCG und hLH kommt es zur Abnahme der SCPj-Konzcntration im Zytosol. nicht jedoch unter LH-RH. Abb. 4. SCPi-Konzentrationen in den Mikrosomen. Dargestellt sind Mittelwerte + Standardabweichungen. Unter hCG oder hLH nehmen die mikrosomalen SCPi-Konzentrationen ab, LH-RH zeigt keinen Einfluß. Abb. 5. SCPi-Konzentrationen in der lysosomalcn/peroxisomalcn Fraktion. Dargestellt sind Mittelwerte + Standardabweichungen. Methodisch ist anzumerken, dass diese Fraktion relativ stark durch andere Fraktionen, insbesondere Mikrosomen, kontaminiert war (Ergebnisse nicht dargestellt). Unter hCG oder hLH nehmen die SCPi-Konzentrationen ab, unter LH-RH nehmen sie geringfügig zu, ohne dass statistische Signifikanz erreicht wird.
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Tabelle 1. Aktivität der mikrosomalcn 7-DHC-Reduktase
Kultur ohne exogene Stimulation (Kontrollgruppc) hCG, l.O mlE/ml hLH. l.O mlE/ml LH-RH, lOOpA/
Spezifische Aktivität nmol/2 h/mg
Statistische Signifikanz vs Kontrollgruppe p < 0.05
86.7 ±9.3 182.8 ± 11.7 191.2 ± 12.3 82.1 ±13.1
entfällt ja ja nein
fehlte diese Abnahme das Signifikanzniveau zum Teil nur knapp (Mikrosomen). Unter Zugabe von LH-RH kam es nur in den Lysosomen/Peroxisomen zu einer nennens werten Änderung der SCPi-Konzentration (Zunahme), sie war jedoch nicht signifikant. Die mikrosomale 7-Dehydrocholesterol-Reduktase (7DHC-Reduktase) gilt als Enzymkomplex, dessen Aktivi tät ausschliesslich durch SCP: zu steigern ist [1, 5, 13], Dementsprechend gilt die Aktivität der 7-DHC-Rcduktase als guter Massstab für die (spezifische) Aktivität von SCPi. In Tabelle 1 sind die ermittelten spezifischen Akti vitäten von SCP2 dargestellt: Demnach kam es sowohl unter hCG als auch unter hLH zum signifikanten Anstieg der Aktivität der 7-DHC-Reduktase, während LH-RH zu keiner Veränderung führte.
Diskussion
hCG und hLH stimulierten - wie zu erwarten war - die luteale Synthese und Sekretion von Pregnenolon und Progesteron. Begleitet war diese Stimulation von charak teristischen Veränderungen des Gehaltes an SCP2 in verschiedenen subzellulären Fraktionen: In den Mitochondrien kam es zu einer Zunahme, in den anderen Fraktionen (Mikrosomen. Zytosol und Lysosomen/Per oxisomen) zur Abnahme. Wie schon gezeigt, ist die Zunahme der mitochondria len SCPa-Konzentration nicht abhängig von der gewähl ten hCG-Dosis [8], Für die spezifische Aktivität, die ebenfalls unter hCG-Stimulation ansteigt, besteht jedoch eine klare Korrelation zur hCG-Dosis, so dass die Zu nahme des mitochondrialen SCPi-Gehalts möglicher weise von zweitrangiger Bedeutung ist [8], Obwohl hier noch offene Fragen bleiben, bestätigen diese Ergebnisse doch klar, daß SCP2 auch für die Stimulation der lutealen Steroidogenese mit hCG oder hLH eine wesentliche Rolle spielt, vor allem bei der entscheidenden mitochondrialen Konversion von Cholesterol zu Pregnenolon.
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LH-RH führte zu keinerlei signifikanten Veränderun gen der mitochondrialen SCP2-Konzentration, auch blieb die Synthese von Pregnenolon und Progesteron in unse ren Kulturen unbeeinflußt. Aufgrund dieser beiden Er gebnisse kann daher festgestellt werden, dass LH-RH für die Regulation der Steroidogenese im humanen Corpus luteum keine Bedeutung spielt, ein «zweiter» Synthese weg ist nicht nachzuweisen. Die Abnahme des SCP2-Gehalts im Zytosol könnte vordergründig als «Abwandern von SCP2 » zu den Mitochondrien hin, also entlang des Cholesteroltransportwe ges, interpretiert werden. Die hier gefundenen Verände rungen erreichen jedoch keinerlei statistische Signifikanz, zudem gibt es in der Literatur auch konträre Mitteilungen [ 14], Hier ist die Diskussion noch im Gange. Einfacher ist die Abnahme des SCP2-Gehalts in den Mikrosomen zu deuten. Das Cholesterol, das für die Steroidsynthese unter Stimulation mit hCG oder hLH benötigt wird, enstammt in der Regel nicht der De-novo-Synthese [3, 15, 16], hierzu wäre mikrosomales SCP2 erforderlich [3,5]. Zu dem ist unter den Bedingungen der hCG/hLH-Stimulation die «Zwischenlagerung» von Cholesterol in den Li pidtröpfchen als Cholesterolester von keiner Bedeutung [2], die Lipidtröpfchen nehmen - im Gegenteil - sogar an Zahl und Durchmesser ab [4], Kaum einzuordnen sind wiederum die Ergebnisse bei den Lysosomen/Peroxisomen. Dies hängt vor allem mit methodischen Problemen zusammen: Lysosomen/Per oxisomen sind sehr schwierig zu präparieren [17], auch hier war die Fraktion vor allem durch Mikrosomen kon taminiert. Grundsätzlich spielen Peroxisomen hauptsäch lich für die Aufnahme von exogenem LDL, also auch Cholesterol, eine große Rolle [15], LH-RH führte auch in diesen Zellfraktionen zu keinen signifikanten Verände rungen von SCP2 . Unabhängig davon, welche Funktion SCP2 in diesen Fraktionen genau zukommt, unterstrei chen auch diese Ergebnisse die schon erwähnte Feststel lung, dass LH-RH in der Regulation des humanen Corpus luteum keine wesentliche Bedeutung besitzt.
Würfel/Beckmann/Schreiber/Holt/Cok/ Hay/Brölsch
SCP2 und LH/LH-RH
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Dargestellt sind Mittelwerte ± Standardabweichung. Eine Stimulation mit hCG oder hLH steigert die Aktivität der 7-DHC auf mehr als das Doppelte, eine Zugabe von LH-RH führt zu keinen Veränderungen der Aktivität.
Literatur 8 Würfel W. Beckmann MW, Schreiber JR, Holt JA. Cok S, Hay R, Brölsch C, W irtz KWA: Evi dence for sterol carrier protein 2 (SCPj) or a SCPi-like protein in cultured human luteal cells and its regulation by human chorionic gonadotropin (hCG). Jahresversammlung Soc Gynec Invest, März 1991, Abstract 392. 9 Würfel W, Beckmann MW. Schreiber JR. Holt JA, Cok S. Hay R. Brölsch C, Wirtz KWA: Human LDL increases the concentration of non-specific lipid transfer protein (nsL-TP) [sterol carrier protein 2 (SCP?)] in different subcellular fractions of cultured human luteal cells. Jahresversammlung The Endocrine Soci ety USA, Juni 1991, Abstract 631. 10 Beckmann MW. Würfel W. Seung L. Schreiber JR: Die hochgercinigtc Kultur luteinisierter humaner Granulosazellen - ein Modell zum Studium intrazellulärer Synthesewege. Arch Gynecol Obstet. 1991; in Druck. 11 van Amerongen A, van Noort M, van Beck hoven JRCM, Rommerts FFG, Orly J, Wirtz KWA: The subcellular distribution of the non specific lipid transfer protein (sterol carrier protein 2) in rat liver and adrenal gland. Biochim BiophysActa 1989:1001:243.
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