Planta (Berl.) 82, 111--122 (1968)

Regulation der Nucleins~iuren-Synthese durch Polyamine in keimendem Pollen von Petunia I-[. F. L1-NSKENS, A. S. L. KOCRVYT u n d A. So Botanisehes Institut der Universit~t Nijmegen, Holland Eingegangen am 29. Mai 1968

Regulation o/Nucleic Acids Synthesis by Polyamines in Germinating Pollen ol Petunia Summary. Putrescine, spermine, spermidine, and agmatine in concentrations between 5--15 ~g/ml inhibit pollen germination. Whereas spermine reduces pollen tube length, putrecine and agmatine do not affect pollen tube growth. Spermidine effects a small increase (about 5 %) of pollen tube elongation. Spermine and spermidine can be found in pollen. Addition of spermine (7 or 10 ~g/ml) depresses protein synthesis, whilst spermidine does not affect protein synthesis. On the basis of uridine-5-T incorporation it could be shown that both spermine and spermidine increase I~NA synthesis. On tho basis of thymidine-T incorporation in the first hours of germination it seems that DNA synthesis is also stimulated by spermine and spermidine present in the medium. A net increase of nucleic acids was found when spermidine was added to the germination substrate. These results are interpreted as suggesting that, in the pollen tubes investigated, polyamine concentration may be a factor in the regulation of nucleic acid synthesis, resulting in a prolonged synthesis of specific proteins and in this way influencing growth and the developmental pattern of pollen tubes. Einleitung Die Polyamine geh6ren zu den in der N a t u r Weitverbreiteten biogenen Aminen (GuGGV.NHSl~, 1951; TABOg et al., 1961), die aueh in Pollen naehgewiesen wurden (BAG~I et al., 1967). Die Frage nach der regulierenden F u n k t i o n der Polyamine ist noch immer ungeklgrt. Ausgehend yon der Tatsaehe, dub die Polyamine mit den freien Phosphatgruppen der Nucleins~uren u n d mi~ den Phospholipiden einen stabilen K o m p l e x bilden (FnLs]~NF~LD U. HUANG, 1960), konnte m a n fests~ellen, dub sie auf diese Weise D N S u n d andere doppelstr/s PolynucleotidKomplexe gegen thermische Denaturierung stabilisieren (MA~DSL, 1962; TABOg, 1962). Dasselbe gilt f~r s-RNS (GOLDSTEIN, 1966). Der stabilisierende Effekt auf Ribosomen u n d der hohe Gehalt y o n Ribosomen an Polyaminen (12--15%) weisen darauf hin (CoHEn u. LICHT~ST~,IN, 1960), dub m a n an eine regulierende F u n k t i o n auf dem ribosomalen Niveau denken muB. Diese Itypothese wird gestfitzt durch die Tatsache, 8 Planta (Berl.), Bd. 82

112

]-I.F. LI~SK~TS, A. S. L. KOCttUYTund A. So:

d a b S p e r m i d i n T y r o s y l - s - R N S Iest a n R i b o s o m e n binde~ ( T A ~ w ~ , 1967), uncl d u r c h P r ~ i n k u b a t i o n m i t S p e r m i d i n u n d P u t r e s c i n die Assoziation y o n r i b o s o m a l e n P a r t i k e l n be~drkt, sowie die P o l y p h e n y l alanin- (NAKAMOTO U. HAM~L, 1968) u n d P r o t e i n - S y n t h e s e (RAI~A e~ al., 1965; BAG~I u. C o c u c c L 1967, C o e v c c I u. BAG~I, 1968) i n i t i i e r t wird. W i r besitzen in d e m P o l l e n y o n Petunia ein S y s t e m mi~ stabilisierten p o l y s o m a l e n K o m p l e x e n (Lr~sKE~S, 1967), d a s bei d e r K e i m u n g schnell a k t i v i e r t wird. N u c l e i n s ~ u r e s y n t h e s e in P o l l e n u n d Pollenschl~uchen ist sowohI fiir R N S ( W o o ~ g ~ , 1958; T A r o u. T A ~ s ~ , 1964; MASC A g ~ L ~ S , 1966) bewiesen, als a u c h ffir D N S wahrscheinlich g e m a c h t (W~.vEg u. TA~:ATS, 1967). D~ in situ i m Griffel keine V e r m e h r u n g des t o t a l e n R N S - bzw. D N S - G e h a l ~ e s nachgewiesen w e r d e n k o n n t e (Go])~gEu u. L m S K ] ~ S , 1968) erscheint es uns sinnvoll, die regulierende ~ u n k t i o n y o n P o l y a m i n e n attf die }{ucleinsi~uresynthese in k e i m e n d e n Pollen zu u n t e r s u c h e n . D a z u muBte zun~ichst d e r physiologische EinfluB y o n P o l y a m i n e n auf P o l l e n k e i m u n g uncl P o l l e n s c h l a u c h w a c h s t u m u n t e r s u c h t werden. I n k o r p o r a t i o n s s t u d i e n beschri~nken sich auf d e n EinfluB y o n S p e r m i n u n d S p e r m i d i n , d a diese b e i d e n P o l y a m i n e in grSBeren Mengen in Petunia-Pollen g e f u n d e n w u r d e n .

Material und Methoden Zu allen Untersuchungen wurde frischer Pollen yon Petunia hybrida, Klon W 166 k (mit den Selbstinkompatibftit~tsallelen $1S2) verwendet, der nach dem Sammeln bei --20~ aufbewahrt wurde. Das durchliiftete Kulturmedium enthielt stets 10% Saccharose und 0,01% Borsiiure. Die Isotopenmarkierung wurde mit 2 %iger TCE abgebrochen. Der gcwaschene Pollen wurde homogenisiert and nach der Messung des TotMeinbaus yon P-32 und Aufbringen auf Filterpapierscheiben ( ~ 23 ram, Whatman3 MMPapier) nach M~Ns u. INOVELLI (1961) sowohl mit 10 % iger kalter TCE (1 h), als auch mit 5 % iger heiter TCE (30 rain, 70 ~C) extrahiert (vgl. KOE~LER U. LnVSKE~S, 1967). Bei den Einbaustudien mit Uridin-5-T (spezifische Aktivit~t 16,3 mC per raM) und Thymidin (Methyl-T, spezifischeAktivit~t 5,0 mC per raM; beide yore Radioehemical Centre, Amersham, England) wurden die markierten PoUenschli~uche nach Abt6tung 3mal mit 1/15 N Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen, um das freie Uridin bzw. Thymidin zu entfernen. Der abzentrifugierte Niederschlag wurde wie oben mit heil3er, bzw. kalter TCE extrahiert und 2mal mit einem ~_ther-J~thanolgemisch (1 : 1) und lmal mit 100% )i_ther ffir jewefts 15 rain auf ~ette extrahiert. Der verbleibende Iqiederschlag wurde mit 10 ml Dioxan gel6st und die Aktivit~t mit einem Packard Tri-Carb Liquid Scintillation Spectrometer (Modell 3375) gemessen. Alle Messungen sind auf Selbstabsorption korrigiert. Es wurden jewefts 20 000 Impulse gez~ihlt, wobei die Standardabweichung nicht grSBer war als 2,5%. Die quantitative Bestimmung der 7Nucleins~uren erfolgte in der ffiiher beschriebenen Weise (GonF~EY U. LI~SK~S, 1968) mit 10% NaC1. Die chromatographische Trenhung der Polyamine aus homogenisierten, mit destilliertem Wasser extrahierten Pollen erfolgte nach Reinigung an einer Amberlite IRC 50 (~+)-S~iule (1 cm • 20 em) (S~x~T~u. RICkeD, 1962) dureh I)finnsehichtehromatographie. Als FlieBmittel der auf eine aktivierte Kieselgelplatte aufgetragenen Gemische und Vet-

Regulation der Nucleins~uren-Synthese durch Polyamine

113

gleichssubstanzen dienten Methoxy~thanol-Propions~ure-Wasser (70:15:15). Der Nachweis erfolgte dutch Besprfiher~ mit folgendcr LSsung: 100 mg Ninhydrin, 47 ml Athanol, 2 ml Pyridin und 0,5 ml 36,4% HC1. Nach Trocknung bei 60~ ergaben sich purpurrote bis violettc Flecken. Alle Chemikalien, sowie die verwendeten Polyamine Spermin (Sigma, St. Louis/USA), Spermidin-3-HC1, Agmatinsulfat, Cadaverin (Scrva, Heidelberg), Putrescin-2-HC1 (Hoffmann-La Roche, Basel) waren yon Analysenqualit~t. Ergebnisse Naehdem durch verschiedene Untersucher fiber wachstums- und zellstreckungsf6rdernde Wirkungen der Polyamine berichtet wurde (BAo~I, 1966; BE~TossI et al., 1965), untersuchten ~ r zun/ichst den Tabelle 1. Pollenkeimung bei Anwesenheit von Polyaminen im Keimungsmedium nach d Std bei 25~ im Dunkeln. Es wurden ]eweil8 1000 Pollen ausgezdhlt Konzentration

Agmatin

Spermidin

Spermin

Putrescin

0 (~ Kontrolle) 5 ~g/ml 10 [zg/ml 15 ~g/ml

63,0 62,0 52,4 47,0

69,0 63,1 57,8 56,2

64,0 49,6 32,1 13,0

66,1 64,2 57,7 61,7

TabeIle 2. 1Jollenschlauchwachstum bei Anwesenheit yon Polyaminen im Keimungsmedium, Mittelwerte von 400 SchlSuchen, nach 4 Std bei 25~ im Dunkeln. Die Experimente mit Spermin/Spermidin bzw. Agmatin/Putrescin wurden gleichzeitig und mit gleichartigem Pollenmaterial ausge/iihrt Konzentration

Agmatin

Spermidin

Spermin

Putrescin

0 (= Kontrolle) 5 ~g/ml 10 ~zg/ml 15 ~g/ml

67 =t=1 69 ~ 1 62 =[=2 68 ~: 2

83 =t=3 83 • 2 88 ~=1 84 :[: 3

83 4- 1 68 =]=0,6 59 • 1 47 :~ 2

67 • 69 • 70 • 69 ~

3 2 1 2

1. Ein]lufl der P o l y a m i n e au/ die Pollenkeimung. Wie aus Tabelle 1 ersichtlich, ergab sich nach 4stfindiger Keimung durch Zusa~z yon Sperrain eine deutliche Keimungshemmung, w/~hrend Spermidin, Agmatin und Putrescin nur einen schwachen Itemmeffekt aufweisen. Alle Messungen erfolgten gleichzeitig mi~ einheitlichem Pollenmaterial. Aus diesen Beobachtungen ergibt sich, dal~ Einbaustudien stets yon der Tatsache ausgehen mfissen, dal~ die Zugabe yon Aminen zu einer Depression der Keimung ffihrt. Die Einbauraten sollten daher stets in Beziehung zu dem Keimungsprozentsatz gebracht werden. 2. Ein/lufi der P o l y a m i n e au/ das Pollenschlauchwachstum. Aus Messungen an jeweils 400 Pollenschl/~uchen nach 4 Std (Tabelle 2) ergib~ sich, dal~ Spermin in allen angewandten Konzen~rationen wachstumshemmend wirk~; Agmatin und Putrescin scheinen ohne Einflul3 auf das

8"

H. F. LINSK]~NS,A. S. L. KOO~tUYTund A. So :

114

Schlauchwaehstum, w a h r e n d bei der K o n z e n t r a t i o n y o n 10 ~g/ml Spermidin eine deutliche (ca. 5%) FSrderung der Pollensehlauchstreekung zur Folge hat. 3. Vorkommen yon Polyaminen in Petunia-Pollen. I n 500 m g PetuniaPollen k o n n t e n diinnschichtehromatographiseh (Tabelle 3) mit Sicherheit Spermin u n d Spermidin, mit Wahrscheinlichkeit A g m a t i n u n d Cadaverin nachgewiesen werden. Wiihrend Spermin stets nur in Spuren anwesend war, k a n n die Spermidin-Menge auf ca. 200 ~g/g Trockengewicht gesehgtzt werden. Tabelle 3. Vorkommen yon Polyaminen in Pollen nach diinnschichtchromatographischer Trennung. Die angegebenen R]-Werte gelten ]iir das .Flieflmittel MethoxydthanolPropions~iure-Wasser /i~r eine SteighShe yon 10 cm

l~l-Wert Vorkommen in Petunia-Pollen

Agmatin

Spermidin

Spermin

Putrescin

Cadaverin

0,72 + ?

0,65 ++ +

0,51 +

0,77 --

0,71 + ?

Tabelle 4. Einbau yon radioaktivem Phosphat (3 mC P-32) in keimenden Pollen. Einbaurate gemessen in Impulsen/Minute (IpM) in ]eweils I mg Pollen KeiKontrolle mungs- (ohne Zusatz yon zeit Polyaminen) (Std) Protein I~NS (IpM)

ProteinFr~ktion (IpM)

Differenz gegeniiber Kontrolle (%)

RNSFraktion (Ip~l)

Differenz gegeniiber Kontrolle (%)

1 2 3 4

172 1161 2364 3332

132 866 997 1109

--23 --25 --57 --70

359 437 1760 947

--29 --36 --48 --56

1 5

Kontrolle 246 298

592 682 3398 2386 231 229

Zusatz yon Spermin (10 ~g/ml)

Zusatz yon Spermidin (7 ~g/ml) 370 +51 301 367 +23 339

+30 +47

4. Ein/lufi der Polyamine au] die P-32 Inkorporation. Zusatz y o n Spermin h a t eine Depression des Phosphateinbaus zur Folge, der mit der Keimungszeit z u n i m m t (Tabelle 4). W ~ h r e n d bei der Kontrolle (Keimung ohne Spermin) der E i n b a u in die sog. Proteinfraktion stetig zunimmt, wird der E i n b a u in die sog. t~NS-Fraktion naeh 3 Std riiekl/~ufig. Zusatz y o n Spermidin h a t sowohl einen erhShten E i n b a u in die Proteinfraktion, als such in die R N S - F r a k t i o n zur Folge. 5. Einflufi yon Spermin und Spermidin au] die Proteinsynthese. Aktitivierung der EiweilL Synthese u n t e r dem Einflul] yon P o l y a m i n e n wurde

Regulation der Nucleinsi~uren-Synthese durch Polyamine

115

schon in Gewebe yon Helianthus gefunden (CocuccI u. BAGNI, 1968). Durch Einbau von radioaktiven Aminos~uren (Tabelle 5) liel] sich dieser Befund zwar nicht deutlich bes~tigen; ein depressiver EinfluB yon Spermidin und Spermin auf die Proteinsynthese konn~e in Pollenschl/~uchen jedoch nich~ gefunden werden. Tabelle 5. Einbau yon radioa~tiven Aminosguren (algal hydrolysate, general labelled C-14) in keimenden Pollen unter Zusatz von Spermin bzw. Spermidin zum Medium (2 ml), gemessen m# Methanzghler unerden 10000 Impulse, umgerechnet in I p M

Keimungszeit (Std)

Kontro]le (ohne Polyamine) (IpM)

Zusatz yon 7 [zg/ml Spermidin (IpM)

% der Kontrolle

2 3 4 4

939 1149 1808 1323

938 1159 1806

~:0 q-1 :k0

Zusatz yon 10 [zg/ml Spermidin (Ipl~)

% der Kontrolle

811

--15

1240

--6

Tabelle 6. Uridine-5- T Einbau in PoUenschlgiuchebei Zusatz von Polyaminen. Prozentsatz der Inkorporation gegeniiber der KontroUe. Mittel aus 5 Versuchen

Keimungszeit (Std)

Bei Zusatz von Spermidin (10 ~zg/ml)

Bei Zusatz yon Spermin (10 ~g/ml)

1

128 ~ 19

2 3 4

125 ::k 5 114• 7 l13=k 6

138 ~ 16 126 =k 13 120 q- 10 113• 7

6. Ein/lufi yon Spermin und Spermidin au/ die NucleinsdurenSynthese. Neu war hingegen die Beobachtung der F6rderung der Nuclein-

si~uren-Synthese. Sie wurde durch den Einbau yon spezifischen Nucleosiden n/iher untersucht. Wie aus Abb. 1 ersichtlich, in der alle Einbau-MeBwerte in Beziehung zum Keimungsprozentsatz dargestellt sind, zeigt sich zuns dab Spermin in einer Konzentration yon 10 ~g/ml sts keimungshemmend wirk~, als Spermidin bei der gleichen Konzentration. Beim Einbau yon Uridin ergeben sich bei kurzen Keimungszeiten sehr wechselnde Ergebnisse, die wahrscheinlich den Schwankungen der Keimung zugeschrieben werden mfissen. Aus den Einbauversuchen mit Uridin ergibt sich, dab die Poly~mine Spermin und Spermidin einen verst/irkten Einbau in die RNS-Fraktion zur Folge haben. Zwar ist die Streuung ziemlich groB; die gemittelten Werte (Tabelle 6) zeigen jedoch keine Ausnahme.

Uridin-lnkorporation

Thymidin-lnkorporation

% I.p.M.

% I.p.M.

120

120 xx

100

/ x

lh

80 40

/// 80

//

//

/x

I

I

I

?

20

40

60

80

///

x//

///

////

// 9

100

I

I

1

I

I

20

40

60

80

100 x

140 |

xx

x /// oe

60

|

e

//

/

//

//

/

/I

x

x

60

20

I

I

I

I

40

60

80

e ex /

//

//

//

//

//

I 20

I

100

140

~///

| //

40

20

///" ///

80

// //

120

el /

// %

//

/

x

100

//

40

1 4O

I 60

I 80

ee

x

I 100

140

120

// x

x

o

80

e

60

e

9 9/ /

x

///

x / / x/

80

/z

e

/

/

/x

//

//

60

///

40

// / //

/

20 I

I

I

I

~

20

40

60

80

100

140

/

/

I

I

I

I

I

20

40

60

80

100

140

x

e

120

120

100

x x

100 /

8O 60

x

/

80

20

/ /

/

40

7/ /. /

/

/

60

// //

40

,

/

100

/

/

40

120

///

x

100

4h

//

//

80

20

x

x /

20

//

120

3h

x

|174

40

100

20

e

60

140

2h

e |

100

/// ///

|

/J

///*

//

6O

2O

/

/ /

20

/

/

/ / /

//

/11"

eex/ x 1/ 9

G

/

~'o

I

.o

I

~o 8'0

Keimung (% der KontroLte)

'

100

~

0

I

40

I

60

I

80

I

100

K e l m u n g ( % d e r KontroLLe)

Abb. 1. Inkorporation von radioaktivem Uridin bzw. Thymidin in Pollen nach verschieden lunger Keimungszeit in Beziehung zum Keimungsprozents~tz. Q Bei ~ n wesenheit yon 10 Fg/ml Spermin im Medium. X Bei Anwesenheit yon 10 {zg/ml Spermidin im Medium

H. F. LizqSKE~setal.:RegulationderNueleinsEuren-SynthesedurchPolyamine 117 Bei d e m E i n b a u y o n T h y m i d i n in D N S e r g i b t Zusatz y o n S p e r m i d i n stets eine f 6 r d e r n d e W i r k u n g (Tabelle 7), w~hrenc[ S p e r m i n bis zu e t w a 3 S t d n a c h K e i m u n g s b e g i n n e i n b a u f S r d e r n d wirkt, d a n n a b e r einen hemmenden Effekt hat. Tabelle 7. Thymidin (Methyl-T) Einbau in Pollenschlguche bei Zusatz yon Polyaminen zum Keimungsmedium. Prozentsatz der Inkorporation gegeniiber der Kontrolle Mittet aus 5 Versuchen Keimungszeit (Std)

Bei Zusatz yon Spermidin (10 tzg/ml)

Bei Zusatz yon Spermin (10 ~zg/ml)

1 2 3 4

120:=kl3 123:~15 ll0=k 9 ll6:j=10

162~13 110::[= 6 126-4- 9 --7~11

Tabelle 8. Nucleins~uregehalt in Pollenschl~iuchen in Prozentsatz der Kontrollen (ohne Zusatz yon Polyaminen zum Keimungsmedium) Medium

Keimungs-Keimungsze~ prozent (Std)

Nucleins~uregehalt auf Grund yon

Spermidin -k Uridin-5-T

2 2

92 80

131 108

107 104

Spermin ~- Uridin-5-T

2 2

75 72

88 88

80 82

Spermidin -k Uridin-5-T

4 4

102 70

106 73

104 73

Spermin -k Uridim5-T

4 4

67 63

69 63

76 63

Spermidin -k Thymidin-T

2 2

91 77

96 84

94 94

Spermin -~ Thymidin-T

2 2

89 70

95 71

91 71

Inkorporation UV-Absorption in NS-Fraktion ~260 nm

7. Netto-Synthese der Nucleinsiiuren unter Ein/lu[3 yon Polyaminen. N a c h E x t r a k t i o n d e r Iqucleins~uren n a e h I n k u b a t i o n v o n 2 bzw. 4 S t d m i t S p e r m i n bzw. S p e r m i d i n k e i m e n d e m Pollen (Tabelle 8) w a r w i e d e r u m S p e r m i n sowohl ffir R N S , als auch D N S h e m m e n d . Bei 2stiindigem E i n b a u m i t S p e r m i d i n war d e r R N S - G e h a l t in beiden E x p e r i m e n t e n erhSht, bei 4stfindigem E i n b a u n u r in e i n e m d e r Duplos. l~ach 2st/indiger I n k u b a t i o n m i t S p e r m i d i n ergab d e r E i n b a u in d e r D N S - F r a k t i o n keine E r hShung.

118

H. F. LX~SKE~S,A. S. L. Koc~v~-r und A. So:

Diskussion Die Polyamine Putrescin, Spermin, Spermidin und Agmatin haben einen keimungshemmenden EinfluB auf Pollen yon Petunia (Tabelle 1). W~hrend Spermin auBerdem einen starken, konzentrationsabhi~ngigen Itemmeffekt auf das Pollenschlauchwaehstum hat, Agmatin und Putrescin indifferent sind, verursaeht Spermidin eine schwache FSrderung des L~ngenwaehstums der Pollenschl~uche (TabeHe 2). Auf den gekeimten Pollen haben sowohl Spermin, als auch vor allem Spermidin einen die RNS- Synthese fSrdernden EinfluB (Abb. 1), der sieh aus der erhShten Einbaurate von Uridin ergibt. Mit fortschreitender Keimungszeit wird dieser fSrdernde Einflul~ kleiner. Dies dfirfte darauf hinweisen, dab w/~hrend des Keimungsprozesses Veranderungen in der I~NS auftreten, ws beim Streckenwachstum der Pollenschli~uche nur in geringem MaBe neue RNS synthetisiert wird. Es ist bekannt (LA~so~, 1965), da~ in Pollen dureh den Golgi-Apparat kleine Vesikel gebildet werden, die bei Einsetzen der Keimung in grSBere Blasen fibergehen. Es ist wahrseheinlich, dab diese I~NS enthalten ( D A s ~ u. R o s ~ , 1966). Da die Polyamine eine grol~e Affinit/it zu den ~qucleins/iuren haben (FELsv~]~LD U. HVANG, 1960) und der stabilisierende EinfluB der Polyamine auf Zellorganelle, wie Ribosomen (Co~EN u. LICgTENST~, 1960; COLBUR~ et al., 1961), Mikrosomen (K~Aw~ u. S~]~v~Ns, 1967) und Nucleolen (Busc~ et al., 1967) bekannt ist, darf man annehmen, dab die Behinderung der Transformation von Zellorganellen depressiv auf den KeimungsprozeB wirkt. Ist die Transformation naeh Ablaufen der Keimung jedoch einmal zustande gekommen und sind die entstandenen Vesikel in die Pollenschlauehwand aufgenommen, dann dfirften die Polyamine auf die I~NS stabilisierend wirken (GoLDsT~IN, 1966), SO dab sie ihre Funktion im Rahmen der Protein-Synthese li~nger ausfiben kSnnen. Dies resultiert dann, zumindest ffir Spermidin, in einer VergrSBerung der Pollensehlauehls Fiir diesen StreekungsprozeB muBte also keine neue RNS synthetisiert werden, sondern lediglich die bereits ribosomal gebundene Form ffir die Protein-Synthese aktiviert werden (LI~SKENS,1967). Die Zunahme der I~NS ware also die Folge einer verringerten Abbaugesehwindigkeit unter dem Einflul~ der Polyamine. Die abnehmende Wirkung der Polyamine mit fortsehreitender Keimung kann darauf hinweisen, dab die Transskription yon der DNS zu einem hSheren RNS-Gehalt fiihrt. Man sollte zur Bests jedoeh die Bfldung yon Polynueleotiden unter dem Einflul~ von Polymerasen untersuehen.

Einbaustudien mit radioaktivem Thymidin unter dem EinfluB yon Spermin und Spermidin im Keimungsmedinm zeigen, dab mit Spermidin die gleichen f6rdernden Effekte beobachtet werden kSnnen, wie bei der

Regulation der Nucleinsauren-Synthese durch Polyamine

119

Inkorporation mit Uridin. Bei Anwesenheit yon Spermin tritt jedoch naeh einer anf~ngliehen FSrderung (1 Std) eine deutliehe Hemmung der Thymidiu-Inkorporation auf. Dies deutet darauf bin, dab sieh Spermin so stark an Nucleins~uren binder, dab die normalen Abl~ufe in der weiteren Keimung gestSrt sind. Offensichtlich wird die Teilung des generariven Kernes unterbunden; hemmende Wirkungen yon Spermin auf Ze]lteilungen wurden bereits frfiher beobachtet (DAVIDSONU. ANDEI~SOI~, 1960). Die Messungen der totalen Nucleinsguren (Tabelle 8) sind nieht so auffallend wie die Einbaustudien, da natfirlieh der Gesamtgehalt aller, auch der nieht aktiven, 1WS gemessen wurde. Aueh die Mengen in den nicht gekeimten Pollen wurden ja mit erfaBt. Der Wirkungsmechanismus der Polyamine in Pflanzen ist noeh nicht eindeutig; sicher scheint lediglich, dab sie nieht bloB an e i n e r Stelle eingreifen. Neben der FSrderung der Synthese yon ribosomaler RNS (]~AI~~OS u. GIUDIC~, 1967), der Bindung yon s-I%NS an die l~ibosomen (TAnNER, 1967) und der allgemeinen Stimulation der RNS-Synthese auch nach Behandlung mit Chloromycetin (Mn~ns u. DvBI~, 1966), wird die Stabilits der an der Nucleins~uresynthese teilnehmenden Zellorganelle erhSht. Die yon uns beobachtete Zunahme der 1Wucleinsguren unter dem EinfluB vor allem yon Spermidin diirfte die Folge des Zusammenspiels mehrer Faktoren sein: 1. Der normale Abbau der 1Wueleins~uren wird dureh Stabilit~tserh6hung verlangsamt, so dab die vorhandenen Ribosomen ls funktionieren und sowohl die r-RNS, als aueh die s-I%NS zu einer erhShten Protein-Synthese beitragen kSnnen. 2. Die strukturellen Gene bleiben 1/inger f~hig, RNS zu synthetisieren. Dies kann ermSglicht werden dureh Stabilisieren der doppelstrangigen DNS ira Synthesezustand. 3. Es ist jedoeh auBerdem m6glieh, dab die Polyamine das Wirksamwerden der Repressoren verhindern, indem das lC~egulatorgen dutch das Polyamin bloekiert wird; auch ist es denkbar, dab das Operon durch ein Polyamin-MolekfiI derartig besetzt wird, dab der Repressor darauf nicht angreifen und das Operon so seine Funktion nicht ausfiben kann. Es bestehen einige Hinweise dafiir, dab die Polyamine in der Zelle nicht im gleiehen Zustande wirksam sind, in dem sie dem Medium zugeffigt wurden. In vielen Zellen wurde ein Enzym gefunden, das in der Lage ist Polyamine zu oxydieren (K]~NT~S U. M A ~ , 1952; TA~O~ et al., 1964a, b), jedoeh dureh Peroxydase inaktiviert werden kann (ItILL 1967). Oxydiertes Spermin hat jedoeh einen s~ark hemmenden EinfluB sowohl auf S~ugetierzellen (ALAeCO~, 1964), a]s aueh auf Ehrlich, Ascites-Zellen (BACHRACHet al., 1967). Aus der Untersuchung yon oxydiertem Spermin (FuxA~r~ et al., 1967) hat sich gezeigt, dab die 1WIt(CH2)4-NH-Grnppe notwendig zur Erkennung ist, wghrend die terminalen

120

It. F. LI~SKnb;S, A. S. L. KOCmZYTund A. So:

C t t O - G r u p p e n ffir d e n W i r k u n g s m e c h a n i s m u s v e r a n t w o r t l i c h sind. E s w u r d e j e d o c h schon frfiher (IS~AV.L et al., 1965) suggeriert, d a b die W i r k u n g y o n S p e r m i n v o n d e n t e r m i n a l e n IqH~-(CH~)3-NH-Gruppen abh/~ngt, d a diese G r u p p e n ebenfalls d u r c h S p e r m i n - O x y d a s e u m g e s e t z t werden, w ~ h r e n d dieses E n z y m auf M o d i f i k a t i o n dieser E n d g r u p p e n i c h t anspricht. M a n k a n n a n n e h m e n , d a b die P o l y a m i n e S p e r m i n u n d S p e r m i d i n innerh~lb d e r Zelle eine regulierende F u n k t i o n haben. D a b e i diiffte in e r s t e r Linie die s t a r k e B i n d u n g s n e i g u n g zu den Nucleins~uren, a b e r auch die Ver/~nderung in d e n E n d g r u p p e n eine wesentliche Rolle spielen. D a s Z u s a m m e n s p i e l dieser b e i d e n W i r k u n g e n e r g i b t eine E r h J h u n g d e r N u c l e i n s ~ u r e n - S y n t h e s e , die u . U . zu einer zeitweise e r h J h t e n P r o t e i n S y n t h e s e u n d d a n n zu e i n e m g e f J r d e r t e n P o l l e n s c h l ~ u c h w a c h s t u m f/ihren k a n n .

Literatur ALA~CO~, R. A. : Isolation of acrolein from incubated mixtures of spermine with calf serum and its effects on mammalian cells. Arch. Biochem. 106, 240--242 (1964). BAcm~c~,U., S. ABZVG, and A. BEKIERKUNST: Cytotoxic effect of oxidized spermine on Ehrlich ascites cells. Biochim. biophys. Acta (Amst.) 184, 174--181 (1967). Bxo~I, 1~. : Aliphatic amines and a growth-factor of coconut milk as stimulating cellular proliferation of Helianthus tuberosus (Jerusalem artichoke) in vitro. Experientia (Basel) 22, 732 (1966). - - C . 1~. CALDtkRERA, and G.~[ORUZZI: Spermine and spermidine distribution during wheat growth. Experientia (Basel) 28, 139 (1967). - - , and S. CocuccI: On the possible role of poly~mines in the activation of protein synthesis in Helianthus tuberosus slices. G. bot. ital. 1Ol, 285--286 (1967). BA~os, C., and G. GIUDICE: Effect o~ polyamines on ribosomal RNA synthesis in sea urchin embryos. Biol. Bull. 133, 457-458 (1967). BERTOSSI,F., N. BAGI~I, G. MORUZZI, and C. M. CALDE~ERX: Spermine as a new growth promoting substance for Helianthus tuberosus (Jerusalem artichoke) in vitro. Experientia (Basel) 21, 80 (1965). Bvsc~, H., K. S~tA~K~ I~A~XYAN, and J. tt~i~LTON: Isolation of nucleoli in a medium containing spermine and magnesium acetate. Exp. Cell Res. 47,329--336 (1967). CocvccI. S., and N. BxG~z: Polyamine-induced activation of protein synthesis in ribosomal preparation from Helianthus tuberosus tissue. Life Sci. 7, 113--120 (1968). C o ~ , S. S., and J. LICn'rE~ST~I:~: Polyamines and ribosome structure. J. biol. Chem. 235, 2112--2116 (1960). CoL~vR~q, J. L., B. H. WIT~E~SrOO~, and E. J. HERBST: Effect of intrace]lular spermine on ribosomes in Escherichia coll. Biochim. biophys. Acta (Amst.) 49, 422--424 (1961). ])ASHEK, W. V., and W. G. ROSE~: Electron microscopical localization of chemical components in the growth zone of Lily pollen tubes. Protoplasma 61, 192--204 (1966).

Regulation der Nucleins~nren-Synthesedurch Polyamine

121

DAVIDSO~-,D., and N. G. ANDERSON: Chromosome coiling: Abnormalities induced by polyamines. Exp. Cell t~es. 20, 610--613 (1960). FELSElgF:ELD, G., and S. HUA~G: The interaction of polynucleotides with metal ions, amino acids and polyamides. Biochim. biophys. Acta (Amst.) 87, 425---433 (1960). FUKA~IM,H., I. TAMIDA, T. M ~ o , H. YAMADA, T. OKI, It. KXWASAKI, and K. OGATA:Phagacidal action of oxidized spermine and its analogues. Biochem. biophys. Res. Commun. 28, 14--34 (1967). GODFREY, C. A., and H. F. LI~SKE~S: Nucleic acid estimation in pollinated styles of Petunia hybrida. Planta (Berl.) 80, 185--190 (1968). GOL])ST~, J. : Resistance of RNA to thermal denaturation in the presence of polyamines,. Biochim. biophys. Aeta (Amst.) 123, 620--623 (1966). G~GG~.N~EI~,M. : Die biogenen Amine und ihre Bedeutung fiir die Physiologie und Pathologic des pflanzlichen und tierischen Stoffwechsels. Basel u. New York: Karger 1951. HILL, J. M. : The inactivation of pea-seedling diamine oxidase by peroxidase and 1,5-diaminopentane. Biochem. J. 104, 1048--1056 (1967). KE~TEI~', R. H., and P. J. G. M ~ : The oxidation of amines by extracts of peaseedlings. Biochem. J. 50, 360--369 (1952). KHAWJA, J. A., and L. STEVENS: The effect of isolation conditions on the polyamine content of rat-liver microsomes. Biochem. J. 104, 43P (1967). KoEm~Etr L. D., and H. F. LII~SKE~s:Incorporation of protein and RNA precursors into fertilized $'ucus eggs. Protoplasma 64, 209--212 (1967). LARSO~, D. A.: Fine-structural changes in the cytoplasm of germinating pollen. Amer. J. Bot. 52, 139-154 (1965). LINSKENS, H. F. : Isolation of ribosomes from pollen. Planta (Berl.) 78, 194--200 (1967). M~NDEL, M.: The interaction of spermine and native DNA. J. molec. Biol. 5, 435--441 (1962). MAxs, R. J., and G. D. NOVELLI: Measurement of the incorporation of radioactive amino acids into protein by a filter-paper disk method. Arch. Biochem. 94, 4:8--53 (1961). MASCAI~EN~AS,J. P.: Pollen tube growth and ribonucleic acid synthesis by vegetative and generative nuclei of Tradeseantia. Amer. J. Bot. 58, 563--569 (1966). MILLS, J., and D. T. DUBI~: Some effect of spermine on E. coli. Mo]ecul. Pharmacol. 2, 311--318 (1966). NAK~TOMO,T., and E. HAZEL: The activation of 50S and 30S E. eoli ribosomes for polyphenylalaninesynthesis. Proc. nat. Acad. Sci. (Wash.) 59, 238-245 (1968). RA/NA, A., J. JX~C~A,and M. S ~ E S : Polyamines and nucleic acids in regenerating rat liver. Abstr. 2. Meeting Fed. Europ. Biochem. Sot., p. 79, Vienna 1965. S~ITg, T. A., and F. J. RIcm~Ds: The biosynthesis of pntrescine in higher plants and its relation to potassium nutrition. Biochem. J. 84, 292--294 (1962). TABOR,C. W., H. TABOR,and U. Bxcm~Ac~: Identification of the aminoaldehydes produced by the oxidation of spermine and spermidine with purified plasma amine oxidase. J. biol. Chem. 289, 2194--2203 (1964a). - - - - C. M. McEwE~, J~., and P. D. KELLOG~: Further studies on the aminoaldehydes formed by the oxidation of spermine and spermidine. Fed. Proc. 23, 385 (1964b).

122 H . F . L~sEENS et al. : Regulation der Nucleinsguren- Synthese durch Polyamine TABO~, H. : The protective effect of spermine and other polyamines against heat denaturation of DNA. Biochemistry 1, 496--500 (1962). - - C . W . T ~ o R , and S.M. ROSE~T~AL: The biochemistry of the polyamines spermine and spermidine. Ann. Rev. Biochem. 30, 576--604 (1961). TANNEg, iK. ft. A. : The effect of polyamines on the binding of aminoacyl transfer ribonucleic acid to ribosomes in a yeast system. Biochemistry 6, 2686--2693 (1967). TAro, S., and H. T A ~ A s ~ I : Nucleic acid synthesis in growing pollen tubes. J. Biochem. 56, 578--580 (1964). WEVEg, G., and S. T. TAK~TS: DNA polymerase activity in young Tradescantia pollen grain nuclei. J. Cell Biol. 85, 141 A (1967). WOODARD,J. W.: Intracellular amounts of nucleic acids and proteins during pollen grain growth in Tradescantia. J. biophys, biochem. Cytol. 4, 383--389 (1958). Prof. Dr. H. F. LI~SKnXs Marine Biological Lab. Woods Hole, Mass. (USA) A. S. L. K O C H U Y T Botan. Laborat., Universiteit

Driehuizerweg 200 Nijmegen, The Netherlands drs. A ~ n ~ So Gruenenthal Chemie Wissenschaftliche Abteflung Stolberg (Rhld.)