944

PCR法

に よる イ ン フル エ ンザ感 染 症 の迅 速 診 断

―イ ン フ ル エ ン ザ ウ イ ル スHA遺

伝 子 の うが い液 か らの 検 出 ―

1)愛知県衛生研究所,2)国立公衆衛生院,3)名古屋市立大学 医学部 森下

高行

小林

磯村

思 元1)中

慎一

島

三宅

節 子2)中

島

恭 司

石原

佑弍

捷 久3)

(平成4年2月17日 受付) (平成4年3月6日

Key

words:

PCR,

influenza

virus,

detection

要 イ ン フル エ ン ザ ウ イ ル ス 感 染 症 診 断 のPCR法 ザ ウ イ ル スAH1,AH3,B型

そ れ ぞ れ のHA遺

受理)

of HA gene,

rapid

diagnosis

旨

に よ る 迅 速 性,有

用 性 の 確 立 を 目的 と し イ ン フ ル エ ン

伝 子 検 出 の た め の プ ラ イ マ ー を 作 製 し,そ の 検 出 感 度,

特 異 性 に つ い て検 討 した.ま た,イ ン フ ル エ ンザ ウ イ ル ス 集 団 発 生 か ら得 られ た うが い 液 か らPCR法 よ りイ ン フ ル エ ソザ ウ イ ル スHA遺

伝 子 の 検 出 を 試 み,MDCK細

に

胞 に よ る 分 離 と比 較 有 用 性 を 検 討 し

た. 今 回,我

々 が 作 製 した3種

類 の プ ラ イ マ ー 対 は 亜 型 お よ び 型 特 異 性 を 示 し,い ず れ の プ ラ イ マ ー も他

の 亜 型,型 の イ ン フル エ ン ザ ウ イ ル ス に 対 し特 異 バ ン ドを 示 さ な か っ た.検 出 感 度 はH1プ 2pfu/50μl,H3で

は3.5pfu/50μl,Bは1.1pfu/50μlで

ソザ 遺 伝 子 の 検 出率 はMDCK細

高 く,PCR法

の イ ンフル エ

用 性 が 示 唆 され た .

は イ ン フ ル エ ソザ 様 疾 患 患 者 の うが い液 につ い て

文

イ ン フル エ ン ザ ウ イル ス は冬 期 に,短 期 間 で 爆 発 的 な 流 行 を 引 き起 こす.こ

ライマ ーでは

に よ る うが い 液 か ら の イ ン フ ル エ

胞 に よ る ウ イ ル ス分 離 率 と比 較 し2∼3倍

ソザ 感 染 症 診 断 に お け る迅 速 性,有

序

あ った.PCR法

の た め 特 に流 行 早 期

行 わ れ 小 学 校 な どの 閉 鎖 集 団 に お け る比 較 検 討 は 行 わ れ ず 検 出感 度 と ウイ ル ス分 離 率 は ほ ぼ 同程 度

の病 因 ウ イ ル ス の 決 定 が 流 行 状 況 の把 握 や 防 疫 対

と され て い る.そ

こで 我 々 はPCR法

に よ るイ ン

策 の た め 要 求 され る.イ

フル エ ン ザ感 染 症 診 断 の迅 速 性,有

効性を確立 す

ン フル エ ン ザ ウ イル ス の

迅 速 診 断 法 と し て はELISA法1)2),IF法3)に

よる

るた めA型

イ ン フ ル エ ンザ ウ イ ル ス(H1,H3)

臨床 材 料 か らの 検 出 が既 に報 告 され て い るが 検 出

とB型

感 度 お よ び そ の 精 度 が 問題 と され て い る.最 近,

プ ラ イ マ ーを 作 製 し,プ ラ イ マ ーの 特 異 性,検

臨 床 材 料 か らPCR法

感 度 に つ い て も検 討 す る と共 に過 去 に イ ン フル エ

に よ るA型

イ ン フル エ ン ザ

イ ン フ ル エ ンザ ウ イ ル ス のHA遺

伝子の 出

ウ イル ス の検 出 が 報 告 され て い る4)5).し か し,B

ン ザ ウイ ル ス に よ る こ とが 確 認 され て い る集 団 発

型 に つ い て は そ の よ うな報 告 は な い.ま

生 の際,採 取 され た63件 の うが い液 に つ い てPCR

法 に よ るHA遺

たPCR

伝 子 の 検 出 と従 来 か ら行 わ れ て

い る ウイル ス分 離法 を 比較 した報 告 は これ まで AH3型

法 に よ るHA遺

伝 子 の検 出 とMDCK細

に つ い て の み で あ る.比 較 対 象 の うが い 液

別 刷 請求 先:(〒462)名

森下

材 料 と方 法 1)RNAの

古屋 市 北 区辻 町字 流7-6

愛知 県 衛 生 研究 所

高行

胞 に よる

ウイ ル ス分 離 の比 較 検 討 を行 った.

調製

Fig.1にRNAの

調 製 方 法 を 示 した.検 体50μl 感 染 症 学雑 誌

第66巻

第7号

イ ソ フル エ ンザ の迅 速 診 断 Fig.

1

Preparation

945

of RNA

1) 4.2 M Guanidium thiocyanate, 25 mM Tris-HC1 pH 8 .0, 0.5% Sarkosyl 2) 1 M tris-HC1 pH 8.0, 100mM EDTA pH 8 .0, 10% SDS

よ り グ ア ニ ジ ン,ホ RNAを

抽 出,イ

ッ ト フ ェ ノー ル 法 に よ り

HA遺

8.3,

イ ン フル エ ンザ ウ イ ル ス の

伝 子 の う ち 過 去 の 遺 伝 子 情 報6)-11)を も と に

変 異 の な い 領 域 を 選 び,そ

れ ぞ れ20塩

マ ー を 作 製 し た(Table1)

.

Table

1

Origonucleotide

1) The nuclotide bases are numbered gene6). 2) The nuclotide bases are numbered gene9). 3) The nuclotide gene11) 平 成4年7月20日

ペ レ ッ ト を14.5μ1のRT反

濃 度:RT

イマ ー

AH1,AH3,B型

調 製

cDNAは

を ペ レ ッ ト と し た. 2)フ.ラ

3)cDNAの

ソ プ ロ パ ノ ー ル 沈 殿 に よ りRNA

bases are numbered

基 の プ ライ

reaction

50mM

KCI,1.5mM

40U

RNasin(生

sense

間,37℃,15分

according according according

for PCR amplification

DTT

primer)に

of influenza

to the positive strand sequence

溶 解 し

AMVRT(生

1μ1,10mM

dNTPs

viruses

(H1N1)

HA

to the positive strand sequence of A/Aichi/2/68

(H3N2)

HA

Lakes/54

HA

strand sequence

of B/Great

トし た . 化

of A/PR/8/34

to the positive

終 pH

(W/

間 イ ンキ ュ ベ ー

化 学 工 業),7U

学 工 業),100mM

primers

Tris-HCI

MgCl2,0.01%

V)gelatin〕,1.25μM 100℃,2分

応 液(最

buffer〔10mM

2μl

森下 高行 他

946

を 加 え,全

量20μlと

し43℃,60分

間 イ ソ キ ュベ ー

液50μ1を

ト した.

cDNA20μlの

HCl

接 種 し,初

う ち10μlを 使 用 し た.PCR反

終 濃 度:PCR

reation

pH8.3,50mM

pairs,1.25U

buffer〔10mM

KC1,1.5mM

(M/V)gelatin〕,200μM

MgCl2,0.01%

間 で35サ

cler: Perkin HA特

系 で さ ら にPCRを

イ ク ル 実 施 し,さ

Elmer,

異DNAバ

Cetus,

を 示 し た.さ

USA) ロダク

衝 液 に て 作 製 し た1.5%ア

ガ

ロ ー ス ゲ ル を 用 い 電 気 泳 動 を 行 っ た 後,EtBr染 色 に よ りHA特 5)PCRの

chuan/2/87,B型

か らRNAを 用 い1stPCRを

検 出感 度

行 うこ とに よ り

異DNAバ

ン ドの 検 出 が 可

今 回 我 々が 作 製 し た プ ラ イ マ ーを 使 々 が 分 離 し た ウ イ ル ス と標 準 株3種

ウ イ ル ス は450basesに,AH3型

ル ス は727basesに,B型

ウイ

ウ イ ル ス は549basesに

れ ぞ れ の 培 養 上 清 を10

れ ぞ れ の プ ラ イ マ ーを

行 い さ ら に2ndPCRを

ち ウ イ ル スHA特

は110pfu/50μ1の

の ア ガ ロース ゲ ル電 気 泳 動 像 を 示 し

た.AH1型

で の 希 釈 液 を 作 製 し50μl

調 整 し た.そ

は200pfu/50μ1,AH3

ライマーの特異性

のPCR後

養 上 清 を 使 用 し ブ ラ ッ ク法 に よ り ウ

イ ル ス 力 価 を 測 定 し た.そ

果

ら に2ndPCRを

でHA特

用 し 近 年,我

ウ イ ル スA/

ウ イ ル ス はA/Si-

段 階 希 釈 し10-2∼10-6ま

pfu/50μ1ま

Fig.2に

ウ イ ル スB/Yamagata/16/88

のMDCK培

り50μlの

AH1型2.Opfu/50μ1,AH3型3.5pfu/50μ1,B型1.1

2)プ

検 出感 度

使 用 し た ウ イ ル ス はAH1型

目の

能 と な っ た.

異 バ ン ドの 検 出 を 行 っ た.

Yamagata/120/86,AH3型

物 か ら5μlと

お い てAH1型

型 は350pfu/50μ1,B型

Thermalcy,

ン ドの 検 出 はPCRプ

ト10μ1をTBE緩

実 施 し た.1回

ラ イ マ ーの 検 出感 度

1stPCRに

ら に72℃,

らRNAを

異 バ ン ドが 検 出 さ れ な か っ

結 1)プ

間,

よ るHA

行 っ た,

間 イ ン

間,55℃,2分

7分 間 イ ン キ ュ ベ ー トし た.(DNA

作 製 しPCRを

物 か らHA特

た 検 体 に つ い て はPCR産

primer

度 設 定 ぱ94℃,5分

キ ュ ベ ー ト し た 後94℃,1分

抽 出,cDNAを

が い

認 め られ な か っ

継 代 し た.PCRに

遺 伝 子 の 検 出 は う が い 液 か ら50μlか

PCR産

Polymerase(TAKARA))50

μlの 系 で 行 っ た.温

72℃,3分

Tris-

dNTPs,0.5μM

Taq

応

胞 を 使 用 し,う

代 でCPEの

た 検 体 に つ い て は2代

4)PCR

液(最

ウ イ ル ス の 分 離 はMDCK細

異DNAバ

Fig.

2

Agarose

gel

electrophoresis

analysis

of HA

gene

行 った の

ン ドの 検 出 を 行 っ

た. 6)プ AH1型

ライ マ ーの 特 異 性 はA/PR/8/34,A/FM/1/47,A/NJ/8/

76,A/Bangkok/10/83,A/Yamagata/32/89, AH3型

はA/Victoria/3/75,A/Philippines/2/

82,A/Hukuoka/CL29/85,A/Sichuan/2/87,A/ Aichi/1/91,B型

はB/Lee/40,B/Kagoshima/1/

68,B/Virtoria/2/87,B/Yamagata/16/88,B/ Aichi/1/90ま 上 清50μlを 7)う るHA遺

で の そ れ ぞ れ5種

類 のMDcK培

養

使 用 し た.

が い 液 か ら の ウ イ ル ス 分 離 とPCRに

よ

伝 子 の検 出

1986年 か ら91年 の 問 に イ ン フ ル エ ン ザ ウ イ ル ス 集 団 発 生 よ り得 ら れ た うが い 液63件

を 使 用 し た. 感 染症 学 雑誌

第66巻

第7号

イ ソ フル エ ンザ の迅 速 診 断 HA特

異DNAバ

ン ドを 確 認 す る こ と が で き る .

ま た 過 去 の 標 準 ウ イ ル ス に 対 し て もAH1型

フ.ラ

イ マ ー はA/PR/8/34,A/FM/1/47,A/NJ/8/76, で の

養 上 清 に 対 し450basesの

異 ノミン ドを,AH3型

A/Sichuan/2/87,A/Aichi/1/91の,B型

プ ラ イ

マ ー はB/Lee/40,B/Kagoshima/1/68

,B/Victo-

ria/2/87,B/Yamagata/16/88,B/Aichi/1/90の

A/Bangkok/10/83,A/Yamagata/32/89ま MDCK培

947

ウイ ル ス特

MDCK培

養 上 清 に 対 し そ れ ぞ れ727bases,549

basesの

ウ イ ル ス 特 異 バ ソ ドを 認、 め た.い

ずれ の

プ ラ イ マ ー も異 な っ た型 の ウ イ ル ス に 対 し て用 い

フ.ライ マ ー はA/Victoria/3/

75,A/Philippines/2/82,A/Fukuoka/C-29/85,

ら れ た 場 合 に はHA特

異 ノミン ド は 検 出 さ れ な

か っ た(Table2). 3)イ Table

2

Specificity

of primer

for PCR

ン フ ル エ ン ザ ウ イ ル ス のMDCK細

よ る 分 離 とPCR法

胞 に

に よる ウイル ス検 出 の比 較

(Table3) 1.MDCK細

胞 に よ る イ ン フ ル エ ンザ ウ イ ル ス

の 分 離/ 1985/86,1987/88に

採 取 さ れ たAH1型

行 で あ る こ と が 確 認 さ れ た 集 団23名 (13.0%)のAH1ウ 年AH3型

に よ る流 か ら は3株

イ ル ス が 分 離 さ れ た.1990/91

ウ イ ル ス に よ る流 行 で あ る こ と が 確 認

さ れ た 集 団20名 か ら は11株(55%)のAH3型 ル ス が,1989/90年B型

ウイ

ウ イ ル ス に よ る流 行 で あ

る こ と が 確 認 さ れ た 集 団20名 か ら は8株(40%) のB型

ウ イ ル ス がMDCK細

胞 に よ り分 離 さ れ

た. 2.PCR法 AH1型 1) 450 base pair band was visible when samples were amplified using AH1 primers. 2) 727 base pair band was visible when samples were amplified

using AH3 primers.

amplified using B primers. 4) No visible band was detected

virus

3

で は2件(8.7%),AH3型

で は10件(50.0%),B

型11件(55.0%)か

さ ら に1stPCRで 産 物 の1/10を

Comparison isolation

1) Samples

伝 子の検 出

らそ れ ぞ れ ウイ ル ス 特 異 バ ン

ドが ア ガ ロ ー ス ゲ ル 電 気 泳 動 に よ り検 出 さ れ た.

3) 549 base pair band was visible when samples were

Table

に よ るHA遺

の 流 行 が 確 認、 さ れ た 集 団 か ら は1stPCR

for detection

of influenza

virus

検 出 さ れ な か っ た 検 体 のPCR 用 い,2ndPCRを

in gargle

between

and PCR

were obtained

from the outbrake

school children. 2) Virus isolation was carried

of influenza

(AH1, AH3, B) in

out using MDCK cells.

3) HA gene was detected by ethidium bromide staining after agarose gel electrophoresis. 平 成4年7月20日

行 う事 に よ り

森下

948

PCR法

に よ る 検 出 率 はAH1型

ウ イ ル ス侵 淫 集 団

HA遺

示 し た.ま

た,MDCK細

胞分離陽性 で

イ ソ フ ル エ ソザ ウ イ ル ス の よ うに冬 期 短 期 間 に 爆 発 的 な 流 行 を 引 き 起 こ し,さ

出 され た.PCR法

らに経 過 の 早 い感

伝 子 が検

に よ る ウイ ル ス遺 伝 子 の 検 出率

胞 に よ る 分 離 と比 較 し2∼3倍

出 率 を示 しPCR法

察

行 う こ とに よ り

胞 で 分 離 陰 性 の 検 体 もHA遺

はMDCK細

伝 子 の 検 出 さ れ な か っ た も の は な か っ た. 考

程 度 の検 出 を 示 し,2ndPCRを MDCK細

は8件(34.7%),AH3型20件(100%),B型20件 (100%)を

高行 他

の検

の 有 効 性 を示 唆 した,通

常ウ

イ ル ス 分 離i陽性 者 中 の うが い 液 に は3×102∼5× 103pfu/m1の

ウイ ル ス粒 子 が 存 在 す る と言 わ れ て

染 症 に と って 流 行 早 期 の 病 因 ウイ ル スの 決 定 が 防

い る12).今 回 我 々 が 作 製 した プ ラ イ マ ーの 検 出 感

疫 上 要 求 さ れ る.現

度 を比 較 し て み る と1stPCRで

分 離 はMDCK細

在 イ ン フル エ ソザ ウイ ル ス の

胞 お よ び ふ 化 鶏 卵 法 に よ り行 わ

れ て い る.MDCK細

胞,ふ

化 鶏 卵 法 は分 離 同 定 ま

で に あ ら か じ め 細 胞,ふ

艀 化 鶏 卵 が 用 意 され て い

る場 合 で も早 くて3∼4日

の 分 離 同定 期 間 を 要 す

る.ま

た イ ン フル エ ンザ ウ イル ス集 団 発 生 の よ う

MDCKで PCRに

分 離 さ れ る ウ イ ル ス は す べ て2回

短1日

で,2ndPCRを

緊 急 を 要 し,ま た,ウ

ン フル

の よ うにPCR法

は

イ ル スが 分 離 され に くい こ

とが 多 い イ ン フル エ ソ ザ ウ イル ス の初 発 な らび に

エ ソザ ウ イ ル ス 集 団 発 生 の初 発 か らは ウイ ル スが

流 行 閑 期 に お け るMDCK分

分 離 さ れ に く い こ と が 多 い.そ

て も ウイ ル スが 検 出 され る可 能 性 を 示 し,イ

こ で イ ン フル エ ソ

を

行 う と1日 半 で 病 因 ウ イ ル

胞,ふ

ら に,イ

の

用 い る こ と に よ り検 体 搬 入 か ら抗 原 の 検 出 まで 最

に 突 発 的 な 検 体 の 搬 入 に そ な え 絶 え ずMDCK細

力 的 に も か な りの 負 担 と な る.さ

行 うこ とに よ り

よ り検 出 で き る と考 え られ る.PCR法

ス の 決 定 が 可 能 と な った.こ

化 鶏 卵 を用 意 して お く こ とは 経 済 的 に も労

得 られ る検 出感 度

とほ ぼ 一 致 し,さ らに2ndPCRを

離陰性 の検体 におい ソフ

ザ ウ イ ル ス の 迅 速 診 断法 の 確 立 を 目的 と して イ ン

ル エ ソ ザ ウ イル ス の サ ーベ ラ ンス に 有 用 で あ る と

フ ル エ ンザ 集 団 発 生 か ら得 ら れ た うが い 液 か ら

考 え られ る.

PCR法

に よ りHA遺

伝 子 の 検 出 を 試 みMDCK

細 胞 に よ る ウ イ ル ス が 分 離 法 と比 較 検 討 を 行 っ た.今

回 我 々 が作 製 した プ ライ マ ー は そ れ ぞ れ の

型,亜

型 特 異 性 を 示 し,AH1型

プ ラ イ マ ー はA/

PR/8/34,A/FM/1/47,A/NJ/8/76,A/Bangkok/10/83,A/Yamagata/32/89,AH3型

はA/

Victoria/3/75,A/Philippines/2/82,A/Fukuoka/C-29/85,A/Sichuan/2/87,A/Aichi/1/91,B 型 はB/Lee/40,B/Kagoshima/1/68,B/Victoria/2/87,B/Yamagata/16/88,B/Aichi/1/90の 5種 類 の ウ イ ル ス に 対 し て ウ イ ル ス 特 異 バ ン ドを 検 出 し た.ま た 検 出 感 度 は1stPCRで 200pfu/50μ1,AH3型 pfu/50μ1で

さ ら に2ndPCRを

は は110

行 う とそ れ ぞ れ

2.Opfu/50μ1,3.5pfu/50μ1,1.1pfu/50μ1で た.こ

はAH1型

は350pfu/50μ1,B型

れ ら の プ ラ イ マ ー を 使 用 し,小

あ っ 学校 な どの

イ ソ フ ル エ ソ ザ ウ イ ル ス 集 団 発 生 と い う閉 鎖 集 団 か ら のMDCK細 法 に よ るHA遺 結 果,1stPCRに

胞 に よ る ウ イ ル ス 分 離 とPCR 伝 子 の 検 出 の 比 較 を 行 っ た.そ お い て は ほ ぼMDCK細

の

胞 と同

文 献 1) Berg, P. A., Yolken, R. H., Ronnard, S. I., Dolin, R., Murphy, B.R. & Straus, S. E.: New enzyme immunoassays of influenza A/Victria/3/75 virus in nasal wash-es. Lancet, 1: 851-853, 1980. 2) Coonrod, J. D., Karathanasis, P. F. & Donofio, J. C.: Enzyme-linked immunosorbent assay of core antigen for clinical diagnosis of influenza. J. Med. Virol., 25: 399-409, 1988. 3) Daisy, J. A., Lief, F. S. & Friedman, M. H.: Rapid diagnosis of influenza A infection by direct immunofluoresence of nasopharyngeal aspirates in adult. J. Clin. Microbiol., 9: 688 691, 1970. 4) Katz, J. M., Wang, M. & Webster, R.G.: Direct sequencing of HA gene of influenza (H3N2) virus in original clinical samples reveals sequence identity with mammalian cell-grown virus. J. Virol., 64: 1808-1811, 1990. 5) Yamada, A., Imanishi, J., Nakajima, E., Nakajima, K. & Nakajima, S.: Detection of influenza virus in threat swab by using polymerase chain reaction. munol., 35: 259-265, 1991. 感 染症 学 雑誌

Microbiol.

第66巻

Im-

第7号

イ ン フル エ ンザ の迅 速 診 断

6) Winter, G., Fields, S. & Brownlee, G.G.: Nucleotide sequence of haemagglutinin gene of a human influenza virus H1 subtype. Nature, 292: 72-75, 1981. 7) Concannon, P. C., Cummings, I.W. & Salser, W. A.: Nucleotide sequence of the influenza virus A/USSR/90/77 hemagglutinin gene. J. Virol., 49: 276-278, 1984. 8) Nakajima, S., Nakamura, K., Nishikawa, F. & Nakajima, K.: Genetic relationship between the HA gene of type A influenza viruses isolated in off-seasons and laterepidemic seasons. Epidemiol. Infect., 106 : 383-395, 1991. 9) Verhoeyen, M., Fang, R., Jou, W.M., Devos, R., Huylebroeck, D., Saman, E. & Fiers, W.: Antigenic drift between the hemagglutinin of

Rapid

Diagnosis

of Influenza Virus

949

the Hong Kong influenza strains A/Aichi/2/68 and A/Victoria/3/75. Nature, 286: 771-776, 1980. 10) Nakajima, S., Takeuchi, Y. & Nakajima, K.: Location on the evolutionary tree of influenza H3 hemagglutinin genes of Japanese strains isolated during 1985-6 season. Epidemiol . Infect., 100: 301-310, 1988. 11) Yamashita, M., Krystal, M., Fitch, W.M. & Palese, P.: Influenza B virus evolution: Cociculating lineages and comparison of evolutionary pattern with those of influenza A and C viruses. Virology, 163: 112-122, 1988. 12)

中 村 和 幸, 西 沢 修 一:

MDCK細

胞 の浮 遊 培 養 お よ

び浮 遊 培 養 細胞 を用 い た イ ン フル エ ンザ ウイ ル ス の 分 離 に つ い て.

Infection

by PCR Method

HA Gene

in Throat

感 染 症 誌,

—Detection

54: 306-312,

1980 .

of Influenza

Swab

Takayuki MORISHITA, Shin-ichi KOBAYASHI, Takashi MIYAKE, Yuichi ISHIHARA, Shin ISOMURA1, Setsuko NAKAJIMA2) & Katsuhisa NAKAJIMA3) 1)Aichi Prefectual

Institute

2)The Institute

of Pablic

of Pablic

3)Nagoya City University

Health

Health

Medical

School

We studied the detection of the HA gene of human influenza viruses in throat swabs obtained from the outbreakes of influenza in school children utilizing the polymerease chain reaction (PCR) method. Sensitivity and specificity of the PCR method was compared to conventional virus isolation using MDCK cells. Three pairs of primers for PCR in detecting the HA genes of AH1, AH3, and B influenza viruses showed both subtype and type specificity. The dilution experiments showed that influenza viruses , as few as 1.1-3.5 plaque-forming units per 50 p1, were sufficient for the detection of HA genes by PCR method and the detection rate by PCR method was 2-3 fold higher than that by conventional method . Our results showed that the PCR method was a fast, sensitive and reliable method for the diagnosis of influenza infections.

平 成4年7月20日