1550
Polymerase
chain
法 を用 いた 日和見感染症 の早期診断 と治療
reaction
久留米大学医学部第1内 科
本田
順一
横山
俊伸
川山
智隆
時沢
安田
佳織
田中
健
名取
英世
大泉耕太郎
Key
words:
(平成4年6月26日
受 付)
(平成4年8月10日
受 理)
polymerase
chain
cytomegalovirus,
reaction , Pneumocystis
史郎
carinii
要 旨 血 液悪 性疾 患患者 で肺 炎 を併発 した症例 の血 液,尿, 喀 痰 を 材 料 と し て,PCR法
を 用 い た サ イ トメ ガ
ロ ウ イル ス 肺 炎 と カ リ ニ ー肺 炎 の 早 期 診 断 を 試 み た
.サ イ トメ ガ ロ ウ イ ル ス に 関 し て は8例 中2例 に 陽 性 所 見 が 得 ら れ た が,1例 の み 喀 痰 よ り陽 性 所 見 が 得 ら れ た .そ の 症 例 は ガ ン シ ク ・ ビル 投 与 に よ り肺 炎 を 治 癒 させ る こ とが 可 能 で あ っ た .カ リ ニ ー セ こ関 して は8例 中3例 が 喀 痰 よ 賜 性 所 見 が 得 られ た そ . の3例 と もST合 剤 の 投 与 に よ り肺 炎 を 治 癒 させ る こ とが で きた .今 回 はPCR法 を ル ー チ ン検 査 と す る こ とを 目的 と し,試 料 のDNA抽 出 を 簡 便 化 し,検 体 の 処 理 時 間 を 短 縮 した が,良 好 な 結 果 を え る こ と が で きた. PCR法
は,日 和 見 感 染 症,特
,カ リニ ー肺 炎 の 早 期 治 療 を 目的 と した 早 変 有 用 で あ り,積 極 的 に 施 行 さ れ る べ き検 査 法 で あ る .
期 診 断 を 考 え た 場 合,大
序
に サ イ トメ ガ ロ ウ イ ル ス 肺 炎
文
の で 報 告 す る.
重 症 免 疫 不 全 患 者 にお け る 日和 見 感 染 症 は そ の 患 者 の 予 後 を 大 き く左 右 す る .そ
材 料 と方 法
の な か で もサ イ
トメ ガ ロ ウ イ ル ス に よ る 間 質 性 肺 炎 や カ リニ ー 肺
血 液 悪 性 疾 患 患 者 で 肺 炎 を 併 発 し た 症 例 の血 液,尿,喀
炎 は 時 と して 致 死 的 とな る. 現 在,サ
リ ニ ー に 対 し て はsulfamethoxa
zole-Trimethoprim合 剤 が あ り,早
(DNA試
イ トメ ガ ロ ウ イ ル ス に 対 し て は ガ ン シ
ク ロ ピ ル,カ
.
剤 な ど治療 効 果 の 高 い 薬
期 治 療 を 開 始 施 行 す る こ とで肺 炎 治
癒 を の ぞ む こ と が で き る よ う に な っ て き た1).し か し,早 期 治 療 の た め に は 早 期 診 断 が 必 至 で あ る 今 回,Saikiら2)が reaction
を 利 用 し,サ
た.そ
の 結 果,早
.
断 を試 み
期 診 断 が 可 能 で あ った 症 例 に早
期 治 療 を 施 行 し,良 別 刷 請 求先:(〒830)福
好 な結 果 を得 る こ とが で きた
本田
(Fig.1).血 mM
Tris-HCI,
順一
.
料 は ル ー チ ン検
力 簡 便 な 方 法 で 行 った
液 は ヘ パ リ ン 血 と し,TE 1mM
EDTA
buffer
, pH7.5)で
(10 溶 血
さ せ た も の を 試 料 と し た .喀 痰 は ス プ タ ザ イ ム(小
れ1,600×gで
理 後,尿
遠 心 後,沈
ロ テ ナ ー ゼK処
は そ の ま ま,そ
渣 をTE
bufferで
理(80μg/ml)し
れ ぞ 再浮遊
た もの を
試 料 と し た. (PCR):サ
イ トメ ガ ロ ウ イル ス 検 出 の た め の
プ ラ イ マ ー は,前 初 期 遺 伝 子 を コ ー ド し ,159塩 を 増 幅 す るIE1(5'-C CC-3'),IE2(5'-C
岡県 久 留 米 市旭 町67
久 留米 大 学 医学 部 第1内 科
査 を 目 的 と し た た め,極
し,プ
イ トメ ガ ロ ウ イ ル
ス 肺 炎 と カ リ ニ ー 肺 炎 の 早 期DNA診
料 の 作 成):DNA試
林 製 薬 株 式 会 社)処
開 発 し たPolymerasechain
(PCR)法
痰 を 材 料 と し た(Table1)
CG3')3)をDNA合
基
C A C C C G T G G T G C C A G C T-
C C G C T C C T C C T G A G G G C A C成 機(Milli
Geb/Biosearch
感染症学雑誌 第66巻
第11号
PCR法 社)で 作 製 し た.カ ら4)が
報 告
に よる 日和 見感 染 症 の早 期 診 断
リ ニ ー に 関 し て は,Wakefield
し たPAZ102-E(5'G
Table
A T G G C T-
G T T T C C A A G C C C A-3'),
1
pnumonia
1551
Characteristics
of
and results
of PCR
patients
with
PAZ102-H(5'-
G T G T A C G T T G C A A A G T A C T C-3')を,同
様 に
作 製 し た. Therma1プ
ロ フ ィ ー ル は サ イ トメ ガ ロ ウ イ ル
ス の 場 合,(1)danature94℃
min,(2)anniring50℃
min,(3)extension72℃min,35サ
イ ク ル と し た.
カ リ ニ ー に 関 し て は,(1)94℃1.5min,(2)53℃1 min,(3)72℃1.5min,3.5サ PCR産
イ ク ル と し た.
物 の 検 出 は,ア
よ る 分 離 後,臭
化 エ チ ジ ウ ム 染 色 に よ り行 っ た 。 成
Table1に す.サ
ガ ロー ス ゲル 電 気 泳 動 に
績
そ れ ぞ れ の 症 例 のPCR結
果 を 示
イ トメ ガ ロ ウ イ ル ス に 関 し て は8例
例 に 陽 性 所 見 が 得 ら れ た が,症
例4の
中,2
み 喀痰 よ り
陽 性 所 見 が 得 ら れ た.カ
リ ニ ー に 関 し て は8例
3例 が 陽 性 で あ っ た.そ
の3例
は い ず れ も喀 痰 よ
り陽 性 所 見 が 得 ら れ,血
液,尿
に関 しては陰性で
あ っ た.症 PCRに
例4の
臨 床 経 過 表 をTable2に
示 す.
て陽 性 結 果 が 得 られ た 直 後 よ りガ ン シ ク
ロ ビ ル 投 与 を 開 始 し た 。 治 療 開 始 後6日 PCR陰 た.症
中
性 と な り,2週 例14の
臨 床 経 過 をTable3に
陽 性 所 見 が 得 られ た 日 よ りST合
示 す.PCRで
Table
平 成4年11月20日
目には
間 後 には肺 炎像 も消失 し
2
Clinical
剤 の 点滴 治 療 を
開 始 し,治 療 開 始 よ り10日 目 に はPCR所
course
of patient
No. 4
見 が陰
1552
本田 Table
Fig. 1
Preparing
samples
3
Clinical
for PCR.
順一 他
course
of patient
Fig. 2
No. 14
Photomicrograph
(patient
No.14)
of
TBLB
specimen
stained
with
grocott
stain . (x
考
察
400)
性 化 した.1ヵ
月 後 に は肺 炎 像 も完 全 に 消 失 した .
この 症 例 は 経 気 管 支 肺 生 検 を 施 行 し,組 織 学 的 に も カ リ ニ ー原 虫 を 証 明 す る こ と が 可 能 で あ った (Fig.1).症
例10,症 例11に お い て もPcRの
を も と にST合
結果
剤 に よ る カ リニ ー肺 炎 の 治 療 を 早
期 に 開 始 す る こ とが 可 能 で あ った .症 例10は,原
Saikiら2)が
開 発 したPCR法
は分子 生化学 分野
で 画 期 的 な 方 法 と な っ た.PCR法 野 に 応 用5)∼7)され て い る が,今 見 感 染 症,特
は い ろ い ろ な分 回 わ れ わ れ は,日 和
に サ イ トメ ガ ロ ウイ ル ス肺 炎 と カ リ
ニ ー肺 炎 の 遺 伝 子 診 断 に 用 い た イ ル ス は 成 人 の80∼90%が
.サ
イ トメ ガ ロ ウ
感 染 陽 性 者 で あ る8).
病 の悪 化 と とも に再 び肺 炎 を併 発 し死 亡 した が,
し か し,骨
この と きの 肺 炎 の原 因 は 解 剖 の結 果 ,ム
に 陥 っ た 患 者 に 日 和 見 感 染 症 を 起 こ し ,特
炎 で あ っ た.
コー ル肺
髄 移 植 や,悪
性腫 瘍 の た め に 免 疫 不 全
性 肺 炎 は 予 後 不 良 で あ る9).又,サ 感染症学雑誌
に間 質
イ トメ ガ ロ ウイ 第66巻
第11号
PCR法
に よ る 日和 見 感染 症 の 早期 診 断
ル ス肺 炎 の確 定 は 非 常 に 困難 で あ っ た.し か し, 今 回 わ れ わ れ はPCR法
を用 い て8例
イ トメ ガPウ イ ル スDNAを
中2例
にサ
証 明す る こ とが で き
た.ま た,喀 痰 よ りDNAが
証 明 され た 患 者 は,サ
1553
の 組 織 学 的 証 明 に 限 ら れ て い た .こ の た め カ リ ニ ー肺 炎 を 生 前 に診 断 で き る確 率 は非 常 に 低 か っ た.し か し,今 回PCR法 例 中3例
を用 い る こ とに よ り,8
に喀 痰 よ りカ リニ ー原 虫DNAを
早期 に
イ トメ ガ ロ ウ イ ル ス に よ る間 質 性肺 炎 と診 断 し,
証 明 す る こ とが 出 来 た.ま た,ST合
ガ ン シ ク ロ ビル の早 期 投 与 を行 い,肺 炎 を治 癒 さ
に よ りカ リニ ー肺 炎 を 改 善,治 癒 させ る こ とが 可
せ る こ とが 可 能 で あ った.も
能 で あ った.カ
りDNAが
証 明 され た た め,ガ
を 行 わ ず,細
ン シ ク ロ ビル 投 与
菌 と真 菌 の 治 療 を 施 行 した とこ ろ,
肺 炎 は 改 善 し た.サ PCR法
う1例 は 血 液 の み よ
イ トメ ガ ロ ウ イ ル ス 肺 炎 の
に よ る診 断 は これ ま で 多 の 報 告 が あ る.
剤 の点 滴 治 療
リニ ー に関 して は サ イ トメ ガ ロ ウ
イ ル ス とは 異 な り,血 液,尿 な どのPCR結
果など
を 考 慮 す る必 要 は な い と思 わ れ る.今 回 の わ れ わ れ の結 果 で も,す べ て の 症 例 で,血 液,尿 のPCR は 陰 性 で あ った.カ
リニ ー肺 炎 が 極 度 に 進 行 す れ
Eiseleら10)は 骨 髄 移 植 後 の18例 を検 討 し,血 液 よ
ば 血 中 に も原 虫 が 出現 す る こ と も考 え られ るが,
りのPCRの
早 期 診 断 を 目的 とす れ ば,喀 痰 やTBLB,BALな
結 果 は,ガ
ン シ ク ロ ビル 治 療 の 良 い
指 標 と な る と報 告 し て い る.ま
たIshigakiら11)
どの 肺 組 織 由来 の 材 料 を用 い たPCR法
は,血 液 悪 性 疾 患 患 者 の サ イ トメ ガ ロ ウイ ル ス肺
思 わ れ た.事 実,カ
炎 を 検 討 し,血
PCR陽
DNA量
清 中 の サ イ トメ ガ ロ ウ イ ル ス
と肺 炎 の 病 状 経 過 に 関 連 が あ る と して い
リニ ー肺 炎 に関 して,今 回 の
性 率 は37.5%(3例/8例)と
あ った.カ
で十 分 と
か な り高 率 で
リ ニ ー肺 炎 は 現 在 問 題 と な って い る
る.今 回 の わ れ わ れ の結 果 で は症 例 数 が 少 な い の
AIDSな
で 明 確 な事 は 言 え な い が,血
率l5)に発 病 して く る.今 回 の症 例 は 血 液 悪 性 疾 患
ロ ウ イル スDNAの
中 よ りの サ イ トメ ガ
検 出 は サ イ トメ ガ ロ ウ イル ス
肺 炎 の 証 明 に は な らな か った.PCRの 題 が あ る だ ろ うが,や
感 度 に も問
は りサ イ トメ ガ ロ ウ イ ル ス
肺 炎 の 確 定 診 断 は 局 所 材 料(喀
痰,経
気管支肺生
検,気 管 支 肺 胞 洗 浄 液)な どか らのDNAの
証 明が
ど の 非 常 に 免 疫 力 が 低 下 した 場 合 に 高
患 者 で あ り,免 疫 力 の低 下 が考 え られ る も の の, 極 端 な低 下 は認 め られ て い な か った.カ
リニ ー 肺
炎 の発 症 機 序 に言 及 す る こ とは,今 回 の 症 例 だ け で は無 理 で あ るが,カ
リニ ー肺 炎 は 決 して 特 殊 な
肺 炎 で は な い こ とを理 解 す る必 要 が あ る と思 わ れ
必 要 で あ る と思 わ れ る.ま た 最 近 ウイ ル ス の 活 性
た.少
しで も免 疫 力 の低 下 の 可 能 性 が あ る場 合 に
化 をmRNAを
は,カ
リニ ー肺 炎 を考 慮 に 入 れ る こ とが 必 要 で あ
捕 捉 す る こ とで 直 接 証 明 す る
ReverseTranscription-PCR法
も 開 発12)∼14)さ れ
応 用 され て い る.以 上 の よ うにPCR法 高 い こ とで,極
の感 度 が
め て 早 期 に サ イ トメ ガ ロ ウ イル ス
ろ う. 今 回 はPCR法
を ル ー チ ン検 査 とす る こ とを 目
的 と し て,試 料 のDNA抽
出を 簡 便 化 し,フ ェ ノ ー
の 活 性 化 を 証 明 で き る よ うに な って き た.又,我 々
ル 抽 出 な どの操 作 を 行 わ な か った.本 法 を 用 い る
の と ころ で は,サ
以 前 は フ ェ ノー ル 抽 出,エ
イ トメ ガ ロ ウ イル ス抗 体 陽 性 者
タ ノ ール 沈 澱 な どを 行
で ス テ ロイ ドの 長 期 治 療 を受 け て い る患 者 の血 液
い,本 法 と比 較 して い た.そ
を 用 い て サ イ トメ ガ ロ ウ イ ル ス のPCR法
抽 出 法 陽 性 例 と今 回 の 方 法 に よ る陽 性 例 は す べ て 一 致 した .ま た,フ ェノ ー ル抽 出 法 で 陽 性 の 場 合
して い る が,患 者 の 約70%で
を施 行
陽 性 所 見 が得 られ る.
しか し,殆 どの 場 合,病
的 な意 味 は な い と考 え ら
れ る.こ の よ うにPCR法
の高感 度ゆ えの 問題 も
あ る.今 後,多
くの症 例 の 多 種 類 の 材 料 を 用 い て
検 討 す る必 要 が あ る と思 わ れ た. ま で非 常 に困 難 で あ った.す
来 の カ リニ ー肺 炎 の 確 定 診 断 法 は,カ 平 成4年11月20日
に,本 法 で 陽 性 とな る場 合 もあ った.フ 抽 出 法 は 操 作 が繁 雑 と な りDNAの
ェノール
ェ ノ ール
ロス が 多 い こ
とが考 え られ た. 本 法 の 施 行 に よ り検 体 の 処 理 が極 め て 簡 便 化 さ
サ イ トメ ガ ロ ウ イ ル ス と同 様 カ リニ ー肺 炎 の診 断 は,今
の 結 果,フ
な わ ち,従 リニ ー原 虫
れ,短
時 間 に行 わ れ る よ うに な った た め,ル
ーチ
ン検 査 化 す る こ とが で きた. PCR法
は,そ の 性 質 上 偽 陽 性,偽 陰 性 な どの 問
1554
本田
題 が 残 っ て い るが,日 和 見 感 染 症,特 ガ ロ ウ イル ス肺 炎,カ
に サ イ トメ
リニ ー肺 炎 の 早 期 治療 を 目
的 と した 早 期 診 断 を考 えた 場 合,極
め て有 用 で あ
り,積 極 的 に 施 行 され るべ き検 査 法 で あ る と考 え られ た. 本論文の要 旨は,第66回 日本感染症学会総会において発 表 した. 文 1)
Reed,
E. C.,
leby,
K. E.
Bowden &
Meyer,
cytomegalovirus and
2)
intravenous in
plants.
Ann.
Saiki,
R. K., Horn,
-1354
Intern.
Med.,
15:
Scharf,
S ., Faloona,
G. T.,
Erlich,
sickle
restriction cell
H. A.
Lilof
gandiclovir immunog-
bone
and of
with
with
amplification
sequences
P. S.,
Treatment
cytomegalovirus
patients
Enzymatic
nosis
Dandiker,
J. D .:
pneumonia
lovulin
B.,
献 , R. A.,
marrow
trans-
783-788, F., &
1988 Mullis,
Arnheim
, N.:
of ƒÀ-globin
genomic
site
for
anemia.
analysis Science
. K.
, 230:
diag1350
, 1985.
3) Sbata, D.: Detection of human cytomegalo virus. In PCR Protool . (Innis, MA. A., Gelfand, D.H., Sninsky, J .J. & White, T. J., ed.), p.368 -371
, Academic
Press, Califomia, 1990.
4) Wakefie, A.E., Pixley, F. J., Banerji , S., Sinclair, K., Miller, R. F., Moxon , E.R. & Hopkin, J. M.: Detection of pneumocystis carinii with DNA amplification. Lancet, 336: 451-453 , 1990. 5) Schart, S.J., Horn, G.T. & Erlich, H. A.; Direct cloning and sequence analysis of en zymatically amplified genomic sequences . Science, 233: 1076-1078, 1986. 6) Quednau, B., Rosskopf , D., Guttler, H.W. & Siffert, W.: Detection of Na+/H+ exchanger mRNA in human neutrophils and lymphocytes using the polymerase chain rection . F. E.B. S., 289: 221-223, 1991. &) 7) Kenten, J. H ., Casadei, J., Link , J., Lupold, S., Willey, J., Powell, M., Reea , A. & Massey, R.: Rapid electrochemiluminescense assays of polymerase chain reaction. 1626-1632, 1991.
Clin. Chem ., 37:
順一 他
8) Bevan, I. S., Daw, P. J. R., Ala, F. A . & Walker, M.R.: Polymerase chain reaction for detection of human cytomegalovirus infection in a blood donor population. Brit. J. Haematol ., 78: 94-99, 1991. 9) Meyers, J. D., Flournoy , N. & Thomas, E. D.: Risk factor for cytomegalovirus infection after human marrow transplantation . J. Infect. Dis., 153: 478-488, 1986. 10) Einsele, H., Ehninger, G., Steidle , M., Vallbracht, A., Muller, M., Schmidt , H., Saal, & Waller, H. D.: Polymerase chain reaction to evaluate antiviral therapy for cytomagalovirus disease. Lancet, 338: 1170-1172 , 1991. 11) Ishigaki, S., Takeda , M., Kura, T., Ban, N., Saitoh, T., Sakamaki, S ., Watanabe, N., Kohgo, Y. & Nitsu, Y.: Cytomegalovirus DNA in the sera of patients with cytomegalovirus pneumonia . Brit. J. Haematol., 79: 198-204 , 1991. 12) Roberts, R. G., Bentley , D.R., Barby, R. F. M., Manners, E. & Bobrow, M .: Direct diagnosis of carriers of Duvhnne and Becker muscular dystrophy by amplification of lymphocyt . Lancet, 336: 1523-1526, 1990. 13) Chang, H. L., Zaroukian, M .H. & Esselman, W. J.: T200 alternate exon use in urine lymphoid cells determined by reverse transcrip tion polymerase. J. Immunol ., 143: 315-321, 1989. 14) Sorg, R., Enczmann , J., Sorg, U., Heermeier, K., Schneider, E.M. & Wernet , P.: Rapid and sensitive mRNA phenotyping for interleukins (IL-1 to IL-6) and colony-stimulating factors (G-CSF, M-CSF, and GM-CSF) by reverse transcription and subsequent polymerase chain reaction. Exp. Hamatol., 19: 882-887 , 1991. 15) Bigby, R.D., Margolskee , D., Curtis, J. L., Michael, P. F., Sheppard, D., Hadley , W. K. & Hopewell, P. C.: The usefulness of induced sputum in the diagnosis of pneumocystis carinii pneumonia in patients with the acquired immunodeficiency syndrome . Ann. Rev. Respir. Dis., 133: 515-518 , 1986.
感 染 症学 雑誌
第66巻
第11号
PCR法
Rapid Diagnosis
に よ る 日和 見 感 染症 の 早期 診 断
of Cytomegalovirus Pneumonia and Pneumocystis carinii Pneumonia Using Polymerase Chain Reaction DNA Amplification
1555
by
Junichi HONDA, Toshinobu YOKOYAMA, Tomotaka KAWAYAMA, Shiro TOKISAWA, Kaori YASUDA, Ken TANAKA, Hideyo NATORI & Kotaro OIZUMI First Department of Internal Medicine, Kurume University
We attempted to detect cytomegalvorius DNA (CMV-DNA)and Pneumocystiscarinii DNA (cariniiDNA) in urine, blood and sputum samples of 16 leukemia patients with pneumonia, using the polymerase chain reaction (PCR). Synthetic oligonucleotide primer pair were used to amplify DNA from the major immediateearly genes of CMV and genes for the large subunit of mitochondrial ribosomal RNA of P. carinii. Amplified products were detected by gel electrophoresis. In two cases, CMV-DNAwas detected at about the time the pneumonia occurred, and in one of the two cases, CMV-DNAwas detected in the sputum sample. This patient was treated immediately with ganciclovir. After ganciclovir treatment, clinical and biochemical signs of CMV pneumonia disappeared. In three cases, carinii-DNA was detected in their sputum samples. In their blood and urine samples, carinii-DNA were not detected. This three cases were treated with sulfamethoxazoletrimethoprim and successfully treated episodes of P. carinii pneumonia. We conclude that PCR amplification may be a valuable tool for rapid diagnosing CMVpneumonia and P. carinii pneumonia.
平 成4年11月20日
Polymerase
chain
法 を用 いた 日和見感染症 の早期診断 と治療
reaction
久留米大学医学部第1内 科
本田
順一
横山
俊伸
川山
智隆
時沢
安田
佳織
田中
健
名取
英世
大泉耕太郎
Key
words:
(平成4年6月26日
受 付)
(平成4年8月10日
受 理)
polymerase
chain
cytomegalovirus,
reaction , Pneumocystis
史郎
carinii
要 旨 血 液悪 性疾 患患者 で肺 炎 を併発 した症例 の血 液,尿, 喀 痰 を 材 料 と し て,PCR法
を 用 い た サ イ トメ ガ
ロ ウ イル ス 肺 炎 と カ リ ニ ー肺 炎 の 早 期 診 断 を 試 み た
.サ イ トメ ガ ロ ウ イ ル ス に 関 し て は8例 中2例 に 陽 性 所 見 が 得 ら れ た が,1例 の み 喀 痰 よ り陽 性 所 見 が 得 ら れ た .そ の 症 例 は ガ ン シ ク ・ ビル 投 与 に よ り肺 炎 を 治 癒 させ る こ とが 可 能 で あ っ た .カ リ ニ ー セ こ関 して は8例 中3例 が 喀 痰 よ 賜 性 所 見 が 得 られ た そ . の3例 と もST合 剤 の 投 与 に よ り肺 炎 を 治 癒 させ る こ とが で きた .今 回 はPCR法 を ル ー チ ン検 査 と す る こ とを 目的 と し,試 料 のDNA抽 出 を 簡 便 化 し,検 体 の 処 理 時 間 を 短 縮 した が,良 好 な 結 果 を え る こ と が で きた. PCR法
は,日 和 見 感 染 症,特
,カ リニ ー肺 炎 の 早 期 治 療 を 目的 と した 早 変 有 用 で あ り,積 極 的 に 施 行 さ れ る べ き検 査 法 で あ る .
期 診 断 を 考 え た 場 合,大
序
に サ イ トメ ガ ロ ウ イ ル ス 肺 炎
文
の で 報 告 す る.
重 症 免 疫 不 全 患 者 にお け る 日和 見 感 染 症 は そ の 患 者 の 予 後 を 大 き く左 右 す る .そ
材 料 と方 法
の な か で もサ イ
トメ ガ ロ ウ イ ル ス に よ る 間 質 性 肺 炎 や カ リニ ー 肺
血 液 悪 性 疾 患 患 者 で 肺 炎 を 併 発 し た 症 例 の血 液,尿,喀
炎 は 時 と して 致 死 的 とな る. 現 在,サ
リ ニ ー に 対 し て はsulfamethoxa
zole-Trimethoprim合 剤 が あ り,早
(DNA試
イ トメ ガ ロ ウ イ ル ス に 対 し て は ガ ン シ
ク ロ ピ ル,カ
.
剤 な ど治療 効 果 の 高 い 薬
期 治 療 を 開 始 施 行 す る こ とで肺 炎 治
癒 を の ぞ む こ と が で き る よ う に な っ て き た1).し か し,早 期 治 療 の た め に は 早 期 診 断 が 必 至 で あ る 今 回,Saikiら2)が reaction
を 利 用 し,サ
た.そ
の 結 果,早
.
断 を試 み
期 診 断 が 可 能 で あ った 症 例 に早
期 治 療 を 施 行 し,良 別 刷 請 求先:(〒830)福
好 な結 果 を得 る こ とが で きた
本田
(Fig.1).血 mM
Tris-HCI,
順一
.
料 は ル ー チ ン検
力 簡 便 な 方 法 で 行 った
液 は ヘ パ リ ン 血 と し,TE 1mM
EDTA
buffer
, pH7.5)で
(10 溶 血
さ せ た も の を 試 料 と し た .喀 痰 は ス プ タ ザ イ ム(小
れ1,600×gで
理 後,尿
遠 心 後,沈
ロ テ ナ ー ゼK処
は そ の ま ま,そ
渣 をTE
bufferで
理(80μg/ml)し
れ ぞ 再浮遊
た もの を
試 料 と し た. (PCR):サ
イ トメ ガ ロ ウ イル ス 検 出 の た め の
プ ラ イ マ ー は,前 初 期 遺 伝 子 を コ ー ド し ,159塩 を 増 幅 す るIE1(5'-C CC-3'),IE2(5'-C
岡県 久 留 米 市旭 町67
久 留米 大 学 医学 部 第1内 科
査 を 目 的 と し た た め,極
し,プ
イ トメ ガ ロ ウ イ ル
ス 肺 炎 と カ リ ニ ー 肺 炎 の 早 期DNA診
料 の 作 成):DNA試
林 製 薬 株 式 会 社)処
開 発 し たPolymerasechain
(PCR)法
痰 を 材 料 と し た(Table1)
CG3')3)をDNA合
基
C A C C C G T G G T G C C A G C T-
C C G C T C C T C C T G A G G G C A C成 機(Milli
Geb/Biosearch
感染症学雑誌 第66巻
第11号
PCR法 社)で 作 製 し た.カ ら4)が
報 告
に よる 日和 見感 染 症 の早 期 診 断
リ ニ ー に 関 し て は,Wakefield
し たPAZ102-E(5'G
Table
A T G G C T-
G T T T C C A A G C C C A-3'),
1
pnumonia
1551
Characteristics
of
and results
of PCR
patients
with
PAZ102-H(5'-
G T G T A C G T T G C A A A G T A C T C-3')を,同
様 に
作 製 し た. Therma1プ
ロ フ ィ ー ル は サ イ トメ ガ ロ ウ イ ル
ス の 場 合,(1)danature94℃
min,(2)anniring50℃
min,(3)extension72℃min,35サ
イ ク ル と し た.
カ リ ニ ー に 関 し て は,(1)94℃1.5min,(2)53℃1 min,(3)72℃1.5min,3.5サ PCR産
イ ク ル と し た.
物 の 検 出 は,ア
よ る 分 離 後,臭
化 エ チ ジ ウ ム 染 色 に よ り行 っ た 。 成
Table1に す.サ
ガ ロー ス ゲル 電 気 泳 動 に
績
そ れ ぞ れ の 症 例 のPCR結
果 を 示
イ トメ ガ ロ ウ イ ル ス に 関 し て は8例
例 に 陽 性 所 見 が 得 ら れ た が,症
例4の
中,2
み 喀痰 よ り
陽 性 所 見 が 得 ら れ た.カ
リ ニ ー に 関 し て は8例
3例 が 陽 性 で あ っ た.そ
の3例
は い ず れ も喀 痰 よ
り陽 性 所 見 が 得 ら れ,血
液,尿
に関 しては陰性で
あ っ た.症 PCRに
例4の
臨 床 経 過 表 をTable2に
示 す.
て陽 性 結 果 が 得 られ た 直 後 よ りガ ン シ ク
ロ ビ ル 投 与 を 開 始 し た 。 治 療 開 始 後6日 PCR陰 た.症
中
性 と な り,2週 例14の
臨 床 経 過 をTable3に
陽 性 所 見 が 得 られ た 日 よ りST合
示 す.PCRで
Table
平 成4年11月20日
目には
間 後 には肺 炎像 も消失 し
2
Clinical
剤 の 点滴 治 療 を
開 始 し,治 療 開 始 よ り10日 目 に はPCR所
course
of patient
No. 4
見 が陰
1552
本田 Table
Fig. 1
Preparing
samples
3
Clinical
for PCR.
順一 他
course
of patient
Fig. 2
No. 14
Photomicrograph
(patient
No.14)
of
TBLB
specimen
stained
with
grocott
stain . (x
考
察
400)
性 化 した.1ヵ
月 後 に は肺 炎 像 も完 全 に 消 失 した .
この 症 例 は 経 気 管 支 肺 生 検 を 施 行 し,組 織 学 的 に も カ リ ニ ー原 虫 を 証 明 す る こ と が 可 能 で あ った (Fig.1).症
例10,症 例11に お い て もPcRの
を も と にST合
結果
剤 に よ る カ リニ ー肺 炎 の 治 療 を 早
期 に 開 始 す る こ とが 可 能 で あ った .症 例10は,原
Saikiら2)が
開 発 したPCR法
は分子 生化学 分野
で 画 期 的 な 方 法 と な っ た.PCR法 野 に 応 用5)∼7)され て い る が,今 見 感 染 症,特
は い ろ い ろ な分 回 わ れ わ れ は,日 和
に サ イ トメ ガ ロ ウイ ル ス肺 炎 と カ リ
ニ ー肺 炎 の 遺 伝 子 診 断 に 用 い た イ ル ス は 成 人 の80∼90%が
.サ
イ トメ ガ ロ ウ
感 染 陽 性 者 で あ る8).
病 の悪 化 と とも に再 び肺 炎 を併 発 し死 亡 した が,
し か し,骨
この と きの 肺 炎 の原 因 は 解 剖 の結 果 ,ム
に 陥 っ た 患 者 に 日 和 見 感 染 症 を 起 こ し ,特
炎 で あ っ た.
コー ル肺
髄 移 植 や,悪
性腫 瘍 の た め に 免 疫 不 全
性 肺 炎 は 予 後 不 良 で あ る9).又,サ 感染症学雑誌
に間 質
イ トメ ガ ロ ウイ 第66巻
第11号
PCR法
に よ る 日和 見 感染 症 の 早期 診 断
ル ス肺 炎 の確 定 は 非 常 に 困難 で あ っ た.し か し, 今 回 わ れ わ れ はPCR法
を用 い て8例
イ トメ ガPウ イ ル スDNAを
中2例
にサ
証 明す る こ とが で き
た.ま た,喀 痰 よ りDNAが
証 明 され た 患 者 は,サ
1553
の 組 織 学 的 証 明 に 限 ら れ て い た .こ の た め カ リ ニ ー肺 炎 を 生 前 に診 断 で き る確 率 は非 常 に 低 か っ た.し か し,今 回PCR法 例 中3例
を用 い る こ とに よ り,8
に喀 痰 よ りカ リニ ー原 虫DNAを
早期 に
イ トメ ガ ロ ウ イ ル ス に よ る間 質 性肺 炎 と診 断 し,
証 明 す る こ とが 出 来 た.ま た,ST合
ガ ン シ ク ロ ビル の早 期 投 与 を行 い,肺 炎 を治 癒 さ
に よ りカ リニ ー肺 炎 を 改 善,治 癒 させ る こ とが 可
せ る こ とが 可 能 で あ った.も
能 で あ った.カ
りDNAが
証 明 され た た め,ガ
を 行 わ ず,細
ン シ ク ロ ビル 投 与
菌 と真 菌 の 治 療 を 施 行 した とこ ろ,
肺 炎 は 改 善 し た.サ PCR法
う1例 は 血 液 の み よ
イ トメ ガ ロ ウ イ ル ス 肺 炎 の
に よ る診 断 は これ ま で 多 の 報 告 が あ る.
剤 の点 滴 治 療
リニ ー に関 して は サ イ トメ ガ ロ ウ
イ ル ス とは 異 な り,血 液,尿 な どのPCR結
果など
を 考 慮 す る必 要 は な い と思 わ れ る.今 回 の わ れ わ れ の結 果 で も,す べ て の 症 例 で,血 液,尿 のPCR は 陰 性 で あ った.カ
リニ ー肺 炎 が 極 度 に 進 行 す れ
Eiseleら10)は 骨 髄 移 植 後 の18例 を検 討 し,血 液 よ
ば 血 中 に も原 虫 が 出現 す る こ と も考 え られ るが,
りのPCRの
早 期 診 断 を 目的 とす れ ば,喀 痰 やTBLB,BALな
結 果 は,ガ
ン シ ク ロ ビル 治 療 の 良 い
指 標 と な る と報 告 し て い る.ま
たIshigakiら11)
どの 肺 組 織 由来 の 材 料 を用 い たPCR法
は,血 液 悪 性 疾 患 患 者 の サ イ トメ ガ ロ ウイ ル ス肺
思 わ れ た.事 実,カ
炎 を 検 討 し,血
PCR陽
DNA量
清 中 の サ イ トメ ガ ロ ウ イ ル ス
と肺 炎 の 病 状 経 過 に 関 連 が あ る と して い
リニ ー肺 炎 に関 して,今 回 の
性 率 は37.5%(3例/8例)と
あ った.カ
で十 分 と
か な り高 率 で
リ ニ ー肺 炎 は 現 在 問 題 と な って い る
る.今 回 の わ れ わ れ の結 果 で は症 例 数 が 少 な い の
AIDSな
で 明 確 な事 は 言 え な い が,血
率l5)に発 病 して く る.今 回 の症 例 は 血 液 悪 性 疾 患
ロ ウ イル スDNAの
中 よ りの サ イ トメ ガ
検 出 は サ イ トメ ガ ロ ウ イル ス
肺 炎 の 証 明 に は な らな か った.PCRの 題 が あ る だ ろ うが,や
感 度 に も問
は りサ イ トメ ガ ロ ウ イ ル ス
肺 炎 の 確 定 診 断 は 局 所 材 料(喀
痰,経
気管支肺生
検,気 管 支 肺 胞 洗 浄 液)な どか らのDNAの
証 明が
ど の 非 常 に 免 疫 力 が 低 下 した 場 合 に 高
患 者 で あ り,免 疫 力 の低 下 が考 え られ る も の の, 極 端 な低 下 は認 め られ て い な か った.カ
リニ ー 肺
炎 の発 症 機 序 に言 及 す る こ とは,今 回 の 症 例 だ け で は無 理 で あ るが,カ
リニ ー肺 炎 は 決 して 特 殊 な
肺 炎 で は な い こ とを理 解 す る必 要 が あ る と思 わ れ
必 要 で あ る と思 わ れ る.ま た 最 近 ウイ ル ス の 活 性
た.少
しで も免 疫 力 の低 下 の 可 能 性 が あ る場 合 に
化 をmRNAを
は,カ
リニ ー肺 炎 を考 慮 に 入 れ る こ とが 必 要 で あ
捕 捉 す る こ とで 直 接 証 明 す る
ReverseTranscription-PCR法
も 開 発12)∼14)さ れ
応 用 され て い る.以 上 の よ うにPCR法 高 い こ とで,極
の感 度 が
め て 早 期 に サ イ トメ ガ ロ ウ イル ス
ろ う. 今 回 はPCR法
を ル ー チ ン検 査 とす る こ とを 目
的 と し て,試 料 のDNA抽
出を 簡 便 化 し,フ ェ ノ ー
の 活 性 化 を 証 明 で き る よ うに な って き た.又,我 々
ル 抽 出 な どの操 作 を 行 わ な か った.本 法 を 用 い る
の と ころ で は,サ
以 前 は フ ェ ノー ル 抽 出,エ
イ トメ ガ ロ ウ イル ス抗 体 陽 性 者
タ ノ ール 沈 澱 な どを 行
で ス テ ロイ ドの 長 期 治 療 を受 け て い る患 者 の血 液
い,本 法 と比 較 して い た.そ
を 用 い て サ イ トメ ガ ロ ウ イ ル ス のPCR法
抽 出 法 陽 性 例 と今 回 の 方 法 に よ る陽 性 例 は す べ て 一 致 した .ま た,フ ェノ ー ル抽 出 法 で 陽 性 の 場 合
して い る が,患 者 の 約70%で
を施 行
陽 性 所 見 が得 られ る.
しか し,殆 どの 場 合,病
的 な意 味 は な い と考 え ら
れ る.こ の よ うにPCR法
の高感 度ゆ えの 問題 も
あ る.今 後,多
くの症 例 の 多 種 類 の 材 料 を 用 い て
検 討 す る必 要 が あ る と思 わ れ た. ま で非 常 に困 難 で あ った.す
来 の カ リニ ー肺 炎 の 確 定 診 断 法 は,カ 平 成4年11月20日
に,本 法 で 陽 性 とな る場 合 もあ った.フ 抽 出 法 は 操 作 が繁 雑 と な りDNAの
ェノール
ェ ノ ール
ロス が 多 い こ
とが考 え られ た. 本 法 の 施 行 に よ り検 体 の 処 理 が極 め て 簡 便 化 さ
サ イ トメ ガ ロ ウ イ ル ス と同 様 カ リニ ー肺 炎 の診 断 は,今
の 結 果,フ
な わ ち,従 リニ ー原 虫
れ,短
時 間 に行 わ れ る よ うに な った た め,ル
ーチ
ン検 査 化 す る こ とが で きた. PCR法
は,そ の 性 質 上 偽 陽 性,偽 陰 性 な どの 問
1554
本田
題 が 残 っ て い るが,日 和 見 感 染 症,特 ガ ロ ウ イル ス肺 炎,カ
に サ イ トメ
リニ ー肺 炎 の 早 期 治療 を 目
的 と した 早 期 診 断 を考 えた 場 合,極
め て有 用 で あ
り,積 極 的 に 施 行 され るべ き検 査 法 で あ る と考 え られ た. 本論文の要 旨は,第66回 日本感染症学会総会において発 表 した. 文 1)
Reed,
E. C.,
leby,
K. E.
Bowden &
Meyer,
cytomegalovirus and
2)
intravenous in
plants.
Ann.
Saiki,
R. K., Horn,
-1354
Intern.
Med.,
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Scharf,
S ., Faloona,
G. T.,
Erlich,
sickle
restriction cell
H. A.
Lilof
gandiclovir immunog-
bone
and of
with
with
amplification
sequences
P. S.,
Treatment
cytomegalovirus
patients
Enzymatic
nosis
Dandiker,
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lovulin
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感 染 症学 雑誌
第66巻
第11号
PCR法
Rapid Diagnosis
に よ る 日和 見 感 染症 の 早期 診 断
of Cytomegalovirus Pneumonia and Pneumocystis carinii Pneumonia Using Polymerase Chain Reaction DNA Amplification
1555
by
Junichi HONDA, Toshinobu YOKOYAMA, Tomotaka KAWAYAMA, Shiro TOKISAWA, Kaori YASUDA, Ken TANAKA, Hideyo NATORI & Kotaro OIZUMI First Department of Internal Medicine, Kurume University
We attempted to detect cytomegalvorius DNA (CMV-DNA)and Pneumocystiscarinii DNA (cariniiDNA) in urine, blood and sputum samples of 16 leukemia patients with pneumonia, using the polymerase chain reaction (PCR). Synthetic oligonucleotide primer pair were used to amplify DNA from the major immediateearly genes of CMV and genes for the large subunit of mitochondrial ribosomal RNA of P. carinii. Amplified products were detected by gel electrophoresis. In two cases, CMV-DNAwas detected at about the time the pneumonia occurred, and in one of the two cases, CMV-DNAwas detected in the sputum sample. This patient was treated immediately with ganciclovir. After ganciclovir treatment, clinical and biochemical signs of CMV pneumonia disappeared. In three cases, carinii-DNA was detected in their sputum samples. In their blood and urine samples, carinii-DNA were not detected. This three cases were treated with sulfamethoxazoletrimethoprim and successfully treated episodes of P. carinii pneumonia. We conclude that PCR amplification may be a valuable tool for rapid diagnosing CMVpneumonia and P. carinii pneumonia.
平 成4年11月20日
