Z. Lebensm. Unters.-Forsch. 159, 47~51 (1975) © by J. F. Bergmann, Mfinchen 1975
Quantitative Bestimmung von zugesetztem Vitamin C in Mineralsalzmischungen Wolfgang Mfiller-Mulot, Ursula de Yries, Claude F. Bourgeois u n d Pierre R. Mainguy Analytisches Laboratorium der tIoffmann-La Roche AG, Grenzaeh.Wyhlen/Baden (BRD)* und Laboratoire de Biochimie et Tectmologie Alimentaire F. Hoffmann-La Roche et Cie, Fontenaysous-Bois (France) Eingegangen am 3. M~irz 1975 Quantitative Determination of Supplemental Vitamin C in Mineral Salt Mixtures Summary. Supplemental vitamin C in mineral salt mixtures is extracted without destruction by diluted ethanol under the reducing and stabilizing protection of 2,3-dimercaptopropanel-(1) (BAL). Mter removal of heavy metal ions in form of mercaptides and by means of cation exchange BAL is extracted and vitamin C (ascorbic plus dehydroascorbic acid) titrated with diehlorophenolindophenol. Recovery 98--100°/o . Zusammen/assung. Zugesetztes Vitamin C in Mineralsalzmischungen wird unter dem reduzierend--stabilisierenden Schutz yon 2,3-Dimercaptopropanol-(1) (BAL) mittels verdiinntem Xthanol zerst6rungsfrei extrahiert. Naeh Entfernen der Sehwermetallionea als Mercaptide und dureh Kationenaustansch wird nach BAL-Extraktion Vitamin C (Aseorbins~ure plus Dehydroaseorbins~ure) mit Diehlo~ohenolindophenol titriert. Die Wiederfindungsrate betr~gt ~S--lOO%.
I. Einleitung Die Tatsache, dab a u f d e m Futtermittelsektor Mineralsalzmischungen, dig mit Vitamin C angereiehert sind, im H a n d e l erscheinen, veranlaSte uns, naeh einer zuverl/issigen quantitativen B e s t i m m u n g s m e t h o d e flit Ascorbinsi~ure ( A S C ) + Dehydroascorbins/~ure (DASC) in solchen Mischungen zu suehen. Es ist leicht zu verstehen, da6 eine quantitative Erfassung des Vitamin C in Substraten mit sehr h o h e m Gehalt an Sehwermetallsalzen eine eigens zu 15sende analy~ische Aufgabe darstellt. Befindet sieh doch das Vitamin C eingebettet in eine Mischung y o n Substanzen, die bekannterweise katalytiseh seine Zerst6rung herbeifiihren. Es galt also, die B e s t i m m u n g s m e t h o d e so zu w/~hlen, da$ der Vitamin C-abbauende Effekt im Augenblick des LSsens des Salzes, im Laufe des Extrahierens der ASC u n d DASC u n d w/ihrend der Weiterbehandiung des E x t r a k t e s ausgeschaltet wird u n d b M b t . N u t so l~Bt sigh der wahre Vitamin C-Gehalt in der troekenen ±M_ineralsalzmisehung jeweils ermitteln. Die Anwendung von drei uns bislang bekannten Vitamin C-Bestimmungsmethoden [1--3], die als gute N~herungsmethoden zur Bestimmung yon Vitamin C in Spurenelement-haltigen Substraten dienen, blieb im Falle der ~ineralsalzmisehungen unbefriedigend. Der Vitamin C-Abbau erfolgt hier so rasch, dab auch ein schiitzendes iYlessen der Abbaukinetik, wie es das Prinzip der Niiherungsmethode ist [1, 2], unmSglieh ist. Nach einer Grundlagenstudie von Bourgeois u. Y[ainguy [4] fiber das Stabilisieren yon ASC in komplexen, Metallsalz-haltigen Modell6sungen stellt 2,3-Dimercaptopropanol-(1), auch BAL (British Anti-Lewisite) genannt, einen total wirksamen und zeitlich unabhi~ngigen Stabilisierungsschutz ffir gelSsto ASC dar. BAL wurde, zufallsbedingt, erstmals 1969 yon Gero u. Candido [5] in die Vitamin C-Analytik zum quantitativen Reduzieren yon DASC zu ASC eingeffihx% Wir haben nun dieses DASC reduzierende und ASC stabilisierende Schutzsystem auf die Vitamin C-Bestimmung in Mineralsalzmischungen fibertragen und es dabei milieubedingt angepa$t. Zur restlosen Entfernung von Schwermetallionen, die nicht als unlSsliche Mercaptide abgetrennt werden, ist noch eine Behandlung mit Kationenaustauscher efforderlich, um StSrungen der ASC-Titration mit Dichlorphenolindophenol (DPI) zu vermeiden. Zugesetztes Vitamin C (ab 500 mg/kg) wurde zu 98--100°/o wiedergefunden. * Frau M. Tancer und Frau E. Luk~ov~ haben wit flit geschickte experimentelle Mitarbeit zu danken.
48 Iqach der hier wiedergegebenen, im Detail kommentierten Arbeitsvorsehrift wurden 10 Mineralsalzmisehungen des Handels nach Anreichern mit 500 mg ASC/kg fiber 9 Monate hinweg auf ihren Vitamin C-Gehalt hin kontrolliert. Die ASC-Verluste betrugen auch nach der Kontrollzeit nicht mehr als 10% .
II. Arbeitsweise Prinzlp Zugesetztes Vitamin C wird mit Hilfe yon 50°/oigem Athanol in Gegenwart yon 2,3-Dimercaptopropanol-(1) (=BAL) aus dem Probegut extrahiert. Der Extrakt wird filtriert, mit Bernsteins~urel5sung versetzt, erneut filtriert und mit Dowex-Kationenaustauscher behandelt. AnsehlieBend wird BAL mittels Methylenchlorid- und J~ther-W~sche aus der LSsung entfernt; diese wird mit Dichlorphenolindophenol (DPI)-LSsung in fiblicher Weise titriert. Die Methode erfafit Ascorbinsi~ure (ASC) und Dehydroascorbins~ure (DASC) gemeinsam. Reagentien 1. Wasser, b i d e s t . - 2. _~thanol, abs., zur Analyse (z. B. M e r c k ) . - 3. 2,3-Dimereaptoprop.anol-(1) = BAL (British Anti-Lewisite) ( M e r c k ) . - 4. Extraktionsmittel: Athanol 500/0, aus Athanol, abs., zur Analyse und Wasser bidest. 1-4-1, versetzt mit 1% B A L . 5. 2 n Natronlauge ca.: 80 g I~atriumhydroxid Pl~itzchen zur Analyse, zum 1 gelSst. - - 6. 2 n Salzs~ure ca. : 160 ml HC1 37°/o zur Analyse, verdfinnt zum 1 . - 7. Bernsteins~urelSsung 20/0: Bernsteins~ure krist, rein, Erg. B.6, zum..1 gelSst, dann mit C02 ca. 3--4 min d u r c h g a s t . 8. Methylenchlorid, wasserges~ttigt.- 9. Ather, peroxydfrei, wasserges~ttigt.- 10. Kationenaustauscher: Dowex WXS, 50--100 mesh, stark sauer Reinheitsgrad praet. (Serva oder Fluka). Vor Benutzung nach Arbeitsvorschrift zu aktivieren. - - 11. C02, Bombenware. - - 12. Diehlorphenolindophenol (DPI)-LSsung: 35 mg 2,6-Dichlorphenolindophenol-I~atriumsalz (Merck) bei Raumtemp. zum l, 15sen, filtrierenZusatz yon ca. 12 mg Natriumhydrogencarbonat. Die LSsung ist ca. 10-~ t o o l . - 13. Ascorbins~ure (ASC), krist, rein 100°/o. - - 1 4 . ASC-Standard-LSsung 100 ppm: 10,0 mg ASC krist, rein 100% 15sen in Bernsteins~urelSsung 2% ad 100 ml. 1 Tag unter Lichtabschlu] bei Raumtemp. h a l t b a r . - 15. Universalindikator-Papier, z.B. Merck, pH 1--10. - - 16. Spezialindikator-Papier, z. B. Merck, pH 5,4--7,0. Arbeitsvorschri]t 1. Extraktion der ASC. Eine ca. 2500--5000 meg ASC enthaltende, genau eingewogene Probe der Mineralsalzmisehung im 100-ml-Schlifferlenmeyerkolben mit 50 ml Extraktionsmittel versetzen (III, 1,2). Mit ca. 2n-l~atronlauge* auf pH 6,0--7,0 einstellen (gemessen mit Spezialindikator-Papier Merck, pH-Bereich 5,4--7,0) (III, 3), mit COg begasen und im verschlossenen Erlenmeyerkolben 20 rain mit dem Magnetrfihrer rfihren (III, 4). Die Rfihrgesehwindigkeit so einstellen, dab die gesamte Einwaage-Masse in Bewegung ist und sieh nicht am Boden absetzen kann. W~hrend des Extrahierens fallen die Schwermetall-Mercaptide in Form eines schwarzen Schlammes aus. l~aeh beendeter Extraktion den gesamten Kolbeninhalt ohne Nachspfilen und unter Verwerfen eines Vorlaufes durch ein Faltenfilter geben (Ira Abzug arbeiten! Geruehsbel/~stigung durch BAL). Ein aliquoter Teil yon 10,0--20,0 ml des so filtrierten Extraktes ~zwischen 500--2000 tzg ASC enthaltend) im Mel]kSlbchen mit Bernsteins~ure 2°/0 ad. 50 ml verdfinnen. Gut durehmischen und die gesamte L5sung fiber ein Schwarzbandfilter filtrieren, den Vorlauf verwerfen. Der so gewonnene ASC-Extrakt ist klar, bisweilen gelblich gefarbt und besitzt einen pH-Wert yon ca. 2,5 (III, 5). 2. Ent]ernen yon Metallionen. Die im ASC-Extrakt stets noeh vorhandenen Sehwermetallionen mit Kationenaustauscher entfernen (III, 6). Dabei ist wie folgt zu verfahren: a) Vorbereiten der Si~ule. Glasrohr, ~ ca. 1 era, L~nge ca. 2 0 - 2 5 cm, mit Hahnauslauf; der Reihe nach fiillen mit Glaswatte, Filterpapierpl~ttchen ~ 1 cm und Dowex-Kationenaustauseher, ans Orginal-Handelspaekung entnommen; Ffillh5he 10 cm. b) Aktivieren des Dowex-Kationenaustausehers. Waschen und dabei luftfrei machen der Ffillung mit Wasser bidest.; aufgeben yon 30 ml 2n-:Natronlauge und langsam durchtropfen lassen; alkalifrei wasehen mit Wasser bidest., Dauer je nach Dowex-Sorte 10--30 rain; Alkalifreiheit prfifen mit Merck-Universalindikator-Papier (nieht mit Phenolphthalein); aufgeben yon 30 ml 2n-Salzs~ure und langsam durchtropfen lassen; neutral waschen mit Wasser bidest. Dauer ca. 10--15 rain; S~urefreiheit prfifen mit Merck-Universalindikator-Papier (neutral identisch mit Chlorfreiheit). Austauscher unter Wasser belassen; 1 Tag haltbar ohne Aktivit~tsverlust. Benutzten Austauscher jeweils neu aktivieren; max. 4mal verwendbar. c) Behandtung des ASC-Extraktes mit aktiviertem Dowex-Kationenaustauscher. I n der Si~ule aktivierten Dowex-Kationenaustauseher fiber Kol3f in einen 100-ml-Schlifferlenmeyerkolben entleeren, l~un 10,0 ml ASC-Extrakt (s. 1.), ca. 100--400 l~g ASC enthaltend, hinzu pipettieren; naeh Zugabe eines Magnetrfihrsti~bchens und C02-Begasung verschlieBen und 15 rain rfihren. Den Kolbeninhalt hernach fiber ein mit Bernsteins~urelSsung 2% vorgewasehenes Schwarzbandfilter geben und das Filtrat sogleich in einem 100 ml-Squibb-Seheidetriehter auf* wenige Tropfen
49 fangen mit 50 ml wasserges/ittigten Methylenchlorid. Zum quantitativen Herauswaschen der ASC K61bchen und Austauschermasse mit 6 × 5 ml Bernsteinsi~urel6sung 2% 1)ortionsweise naehspfilen; obere Phase ca. 40 ml Metallionen-freier, BAL-haltiger und zumeist farbloser ASC-Extrakt. 3. Extraktion des g A L . Den so gereinigten ASC-Extrakt insgesamt 3real mit je 50 ml wassergesi~ttigtem Methylenchlorid jeweils 1 rain lang schfitteln. Das Methylenchlorid verwerfen. Eine 4. Extraktion erfolgt in gleieher Weise mit 50 ml wasserges~ttigtem Ather (III, 7). Die wi~Brige Phase gut absitzen lassen und darm in einem 100-ml-Erlenmeyerkolben auffangen. Eventuell an der Phasengrenze Wasser/_~ther noeh vorhandene Mereaptid-Partikelehen diirfen unter keihen Umst/inden mit in den Erlenmeyerkolben gelangen. Kein Nachwasehen der J~therphase oder des Scheidetrichters! Letzte L6sungsmittelreste dureh l~'i~ftiges Einleiten yon C02 verblasen (Geruehsprobe) (III, 8); das Einleitungsrohr mit max. 2 ml 2°/oiger Bernsteinsi~urel6sung naehspiilen. g. Titration der ASC. Die Metallionen- und BAL-freie, farblos bis sehwach gelbstichige LSsung (Probel6sung) mi~ ca. 10-4 m-DPI-LSsung unter Verwendung einer Halbmikrobfirette in bekarmter Weise titrieren. Enthiilt die Probel6sung mehr als ca. 200 t~g ASC, so ist sie z. B. ad 50 ml mit 2°/oiger Bernsteinsi~elSsung zu verdfinnen. Es werden dann Miquote Teile titriert. Eine definierte ptt-Einstellung mit Iqatriumacetat eriibrigt sieh beim Titrieren in bernsteinsaurer LSsung. Der Endpunkt smite 5--10 rain konstant bleiben. Blindwerte fiir ASC-ireie Probel6sungen liegen im allgemeinen in der Gr61]enordnung fiir Leerwerte der reinen Bernsteins/~urelSsung 20/o. 5. Eichen der DPI.L6sung. Fiir alas Eichen der DPI-L6sung (Standardbestimmung) 2,0 ml ASC-Standard-L6sung (200 meg ASC) mit ca. 28 ml 2°/oiger Bernsteinsiiurel6sung versetzen und bis zum bleibenden Umsehlag nach Rosa titrieren. In gleieher Weise ist der Leerwert fiir 30 ml 2°/oiger Bernsteins~urel6sung zu bestimmen. 6. Berechnung. Formel: (Vpr.-- Blpr.) (ml) • [Zgstd. • Verdiinnung • 1000 ( V s t d . - Lstd.) (ml) • 1000" Einwaage(g) = mg ASC]kg. L e g e n d e : VStd, = DPI-Verbrauch fiir 2 ml ASC-Standard-LSsung in m l . - LStd. ~ Leerwert ffir Standardbestimmung = z.B. 0,3 ml. - - Vpr. = DPI-Verbrauch ~fir Probel6sung in m l . - Blpr. = Blindwert fiir Probel6sung = z.B. 0,3ml.--~gStd. : ~xgASC in 2,0 ml ASC-Standard-LSsung ( = 200 i~g). 7. Analysenbeispiel. Mineralfutter mit einem Sollgehalt yon 500 nag ASC/kg (III, 9) Einwaage 5 g. - - Verdiinnung Ew./50/20/50/lO. - - VStd. = 12,28 ml. - - Vpr. = 11,94 ml. ASC gefunden: (11,94 - - 0,3). 2 0 0 . 5 0 - 50- 1000 (12,28-- 0,3) • 1000.10- 2 0 . 5 = 485,8 mg/kg.
Zeitaufwand fiir 1 Doppelbestimmung (2 Einwaagen) : 4 Std (1 Person).
III. Diskussion 1. Einwaage und Extraktionsmittel Die handelsfiblichen ASC-I)osierlmgen liegen zwischen 500 u n d 5000 m g ASC/kg Mineralsalzmischung, in Sonderf~llen bei 100 m g ASC/kg. Die E i n w a a g e soll m a x i mal 5 g betragen. Als L5sungs- bzw. E x t r a k t i o n s m i t t e l w i r d 50%iges A t h a n o l v e r w e n d e t , weil a) die Salze d e r Mineralsalzmischung d a r i n w e i t g e h e n d unge]Sst bleiben, b) zugesetzte umhfillte ASC in W a s s e r k a u m 15slich ist. D a s fibliche C o a t i n g - M a t e r i a l ffir ASC 15st sich bei a u s r e i c h e n d l a n g e r l~fihrzeit in 50~/oigem A t h a n o l vSllig auf, so d a b ASC in LSsung gehen k a n n . 2. Er[orderliche Menge B A L E i n Z u s a t z y o n 1 % B A L z u m E x t r a k t i o n s m i t t e l erwies sich bei d e n bisher g e t e s t e t e n handelsfiblichen M i n e r a l s a l z m i s c h u n g e n Ms a u s r e i c h e n d e r Sehutz fiir zugesetzte ASC. Die E i n w a a g e n lagen n i c h t fiber 5 g. 3. p H - W e r t bei der ASC-Extraktio~t Z u m Stabilisieren d e r aus d e m P r o b e g u t e x t r a h i e r t e n ASC k a n n d e r p i t - W e f t u n t e r 6 liegen. Ffir die R e d u k t i o n d e r D A S C bei R a u m t e m p . genfigt jedoch ein pI-I-Wert y o n 5 - 6 n i c h t ; die R e a k t i o n s z e i t erhTht sich, so dM] zur vollst&ndigen R e d u k t i o n 4 z. Lebensmitt.-Untersuch.,Band 159
50 l~nger als 1 Std geriihrt werden miiBte. Hingegen wird DASC im pH-Bereich yon 6,0-7,0 rasch reduziert, so dab auch anf Erwiirmnng verzichtet werden kann. Uberraschenderweise sind Stabilisierung resp. Reduktion anch noch im alkalischen Bereich bis pH 8 gew~hrleistet; gearbeitet wird jedoch im Start-pH-Bereich 6,0-7,0. Im Laufe der 20-miniitigen Extraktion der ASC sinken die Anfangs-pH-Werte um ca. 2, da Anionen infolge Mercaptidbildung freigesetzt werden. Eine elektrometrische pH-Messnng ist nicht zu empfehlen, da BAL mit dem Diaphragma der MeBelektrode unter Mercaptidbildung reagiert und die Elektrode unbranchbar macht. 4. ExtraIctionsdauer Eine Riihrzeit yon 20 rain reicht aus, um a) ASC, sowohl krist, als auch nmhfillt, in LSsung zu bringen, b) DASC durch BAL zu rednzieren, c) einen Grol~teil der Mctalle als Mercaptide zu f&llen. Verliingerte Rfihrzeiten sind unschadlich, verkfirzte jedoch bedingen Minderbefunde. 5. Bern~teinsSure als Verdi~nnungs- und AnsSuerungsreagens Bernsteinsi~ure erwies sich als geeignetstes Reagens zum Stabilisiercn, Ans~uern nnd Verdiinuen der Analysenprobe. Sie weist gegeniiber Metaphosphors~ure und Oxals£ure Vorteile auf: a) Der pit-Weft der reinen 2~/oigen Bernsteins~urelSsung liegt bei 2,4, so dab sich eine zus~tzliche pH-Einstellung vor der Titration mit DPI erfibrigt.
b) Die Reaktion yon Schwermetallionen mit DPI (Reduktion) ist in bernsteinsaurer LSsung welt harmloser als in oxalsaurem oder metaphosphorsaurem Milieu. Im Analysengang werden zudem die Schwermetallionen noch mittels Kationenaustauscher vorher entfernt (III, 6). c) Beim Verdiinnen des filtrierten Extraktes mit Bernsteins~urelSsung flocken Mercaptide, welche vorher das Filter kolloid passiert haben, aus nnd lassen sich durch erneutes Filtrieren abtrennen. Anderseits gehen aber durch dieses Ans£uern gewisse Mercaptide unter Zersetzung wieder in LSsung (Anteil gering). Bei Verwendung yon 0xal- und Metaphosphors~ure hingegen 15sen sich die meisten Mercaptide wieder auf. d) BernsteinsiiurelSsung kann ohne Bedenken einige Tage lang verwendet wetden. Man sollte sie nur jeden Tag neu mit CO2 durchgasen. 6. Dowex-Kationenaustauscher Handelsfibliche Kationenaustauscher miissen vor Verwendung stets, wie beschrieben, aktiviert werden. Die Metalhonen-entfernung wird vor der BAL-Extraktion durchgefiihrt, um die LSsung noch nnter Reduktionsschutz zu belassen. Durch eine vorzeitige BAL-Entfernung in Gegenwart yon Metallionen wird sogleich ein rasant verlaufender Abbau der ASC in Gang gesetzt; es ist deshalb stets in der beschriebenen Reihenfolge zu verfahren. Als Ionenaustauscher bew~hrte sich Kationenaustauscher Dowex 50 WX8, 50-100 mesh am besten; eine pro anal.-Qualit~t war nicht erforderlich. GrobkSrnigere Qualiti~ten (z. B. 20-50 mesh) sind ungeeignet (zeitaufwendiges Aktivieren; geringere Austauschleistung bei vorgegebener gleicher Zeit). Die Gegenwart yon BAL ist ohne Einflul~ auf die Funktion des Dowex-Kationenaustauschers, tier die restlichen, freien, nicht mehr als Mercaptide vorliegenden Schwermetallionen - z. B. Fe, Cu, Mn, Zn, Co - aus der LSsung entfernt. Der SchwermetaUionenaustausch als Zeitreaktion erfolgt zweckmii6igerweise durch Zugabe des Austauschers zum ASC-Extrakt; eine Austauschzeit yon 15 rain unter Rfihren ist ausreichend.
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7. Extraktion von B A L Eine 4malige E x t r a k t i o n ist erforderlich, u m BAL vollstdndig aus dem Eluat zu entfernen. Bei nur 3maliger Extraktion verbleiben immer noeh geringe BALSpuren in L6sung, und bedingen eine ziehende Titration. BAL kann nut aus saurer LSsmlg vollst~ndig extrahiert werden. Aus neutraler oder schwach alkalischer L6sung 1/il~t sich BAL nur unvollkommen entfernen, da es teilweise resp. ganz als wasserl6sliches Alkalisalz vorliegt. Der p H - W e r t yon 2,4 in der bernsteins~uren L6sung reicht jedoch fiir eine ersch6pfende Extraktlon aus. Aus Grfinden der Arbeitserleichtertmg wird an Stelle yon J~ther fiir die ersten 3 Extraktionen Methylenchlorid verwendet (untere Phase). Itierdurch ist es mSglich, die ganze Extraktion in nut einem Scheidetrichter durchzuf/ihren. Unter den beschriebenen Extraktionsbedingungen betr/igt der unvermeidliche Verlust an ASC (4 W~schen !) 2 - 3 % ; er wird im allgemeinen durch das Miterfassen letzter Metallionenspuren bei der ASC-Titration ausgeglichen und daher rechnerisch nicht beriicksichtigt. 8. Verwendung von CO 2 Ein Verblasen der letzten Methylenchlorid- und ~therspuren mittels CO 2 vor dem Titrieren erwies sich als vorteilhaft, da diese L6sungsmitteh'este ziehende Titrationen verursachen k6nnen.
9. ProbenhomogenitSt und Analyse Den korngr613enm~13ig oft ziemlieh inhomogenen Mineralsalzmischungen Rechhung tragend sollten je Muster mindestens 4 Parallelanalysen durchgeffihrt werden. Literatur
1. 2. 3. 4. 5.
Mfiller-~ulot, W.: Zit. bei E. De Ritter. J. Assoc. Offic. Agr. Chemists 48, 985--991 (1965) Mitteilung H. Struchen: Hoffmalm-La Roche, Basel 24. 1. 1972 (nicht verSffentlicht) Navarini, L, Zucker, H.: Landwirtsch. Forsch. Sonderheft 28/II. 153--158 (1973) Bourgeois, C., Mainguy, P.: Analusis 2, 556--561 (1973) Gero, E., Candido, A.: J. Intern. Vitaminol. 39, 252--258 (1969) Dr. Wolfgang Miiller-Mulot Hoffmam~-La Roche AG Analytisches Laboratorium D-7889 Grenzach-Wyhlen Bundesrepublik Deutschland
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Quantitative Bestimmung von zugesetztem Vitamin C in Mineralsalzmischungen Wolfgang Mfiller-Mulot, Ursula de Yries, Claude F. Bourgeois u n d Pierre R. Mainguy Analytisches Laboratorium der tIoffmann-La Roche AG, Grenzaeh.Wyhlen/Baden (BRD)* und Laboratoire de Biochimie et Tectmologie Alimentaire F. Hoffmann-La Roche et Cie, Fontenaysous-Bois (France) Eingegangen am 3. M~irz 1975 Quantitative Determination of Supplemental Vitamin C in Mineral Salt Mixtures Summary. Supplemental vitamin C in mineral salt mixtures is extracted without destruction by diluted ethanol under the reducing and stabilizing protection of 2,3-dimercaptopropanel-(1) (BAL). Mter removal of heavy metal ions in form of mercaptides and by means of cation exchange BAL is extracted and vitamin C (ascorbic plus dehydroascorbic acid) titrated with diehlorophenolindophenol. Recovery 98--100°/o . Zusammen/assung. Zugesetztes Vitamin C in Mineralsalzmischungen wird unter dem reduzierend--stabilisierenden Schutz yon 2,3-Dimercaptopropanol-(1) (BAL) mittels verdiinntem Xthanol zerst6rungsfrei extrahiert. Naeh Entfernen der Sehwermetallionea als Mercaptide und dureh Kationenaustansch wird nach BAL-Extraktion Vitamin C (Aseorbins~ure plus Dehydroaseorbins~ure) mit Diehlo~ohenolindophenol titriert. Die Wiederfindungsrate betr~gt ~S--lOO%.
I. Einleitung Die Tatsache, dab a u f d e m Futtermittelsektor Mineralsalzmischungen, dig mit Vitamin C angereiehert sind, im H a n d e l erscheinen, veranlaSte uns, naeh einer zuverl/issigen quantitativen B e s t i m m u n g s m e t h o d e flit Ascorbinsi~ure ( A S C ) + Dehydroascorbins/~ure (DASC) in solchen Mischungen zu suehen. Es ist leicht zu verstehen, da6 eine quantitative Erfassung des Vitamin C in Substraten mit sehr h o h e m Gehalt an Sehwermetallsalzen eine eigens zu 15sende analy~ische Aufgabe darstellt. Befindet sieh doch das Vitamin C eingebettet in eine Mischung y o n Substanzen, die bekannterweise katalytiseh seine Zerst6rung herbeifiihren. Es galt also, die B e s t i m m u n g s m e t h o d e so zu w/~hlen, da$ der Vitamin C-abbauende Effekt im Augenblick des LSsens des Salzes, im Laufe des Extrahierens der ASC u n d DASC u n d w/ihrend der Weiterbehandiung des E x t r a k t e s ausgeschaltet wird u n d b M b t . N u t so l~Bt sigh der wahre Vitamin C-Gehalt in der troekenen ±M_ineralsalzmisehung jeweils ermitteln. Die Anwendung von drei uns bislang bekannten Vitamin C-Bestimmungsmethoden [1--3], die als gute N~herungsmethoden zur Bestimmung yon Vitamin C in Spurenelement-haltigen Substraten dienen, blieb im Falle der ~ineralsalzmisehungen unbefriedigend. Der Vitamin C-Abbau erfolgt hier so rasch, dab auch ein schiitzendes iYlessen der Abbaukinetik, wie es das Prinzip der Niiherungsmethode ist [1, 2], unmSglieh ist. Nach einer Grundlagenstudie von Bourgeois u. Y[ainguy [4] fiber das Stabilisieren yon ASC in komplexen, Metallsalz-haltigen Modell6sungen stellt 2,3-Dimercaptopropanol-(1), auch BAL (British Anti-Lewisite) genannt, einen total wirksamen und zeitlich unabhi~ngigen Stabilisierungsschutz ffir gelSsto ASC dar. BAL wurde, zufallsbedingt, erstmals 1969 yon Gero u. Candido [5] in die Vitamin C-Analytik zum quantitativen Reduzieren yon DASC zu ASC eingeffihx% Wir haben nun dieses DASC reduzierende und ASC stabilisierende Schutzsystem auf die Vitamin C-Bestimmung in Mineralsalzmischungen fibertragen und es dabei milieubedingt angepa$t. Zur restlosen Entfernung von Schwermetallionen, die nicht als unlSsliche Mercaptide abgetrennt werden, ist noch eine Behandlung mit Kationenaustauscher efforderlich, um StSrungen der ASC-Titration mit Dichlorphenolindophenol (DPI) zu vermeiden. Zugesetztes Vitamin C (ab 500 mg/kg) wurde zu 98--100°/o wiedergefunden. * Frau M. Tancer und Frau E. Luk~ov~ haben wit flit geschickte experimentelle Mitarbeit zu danken.
48 Iqach der hier wiedergegebenen, im Detail kommentierten Arbeitsvorsehrift wurden 10 Mineralsalzmisehungen des Handels nach Anreichern mit 500 mg ASC/kg fiber 9 Monate hinweg auf ihren Vitamin C-Gehalt hin kontrolliert. Die ASC-Verluste betrugen auch nach der Kontrollzeit nicht mehr als 10% .
II. Arbeitsweise Prinzlp Zugesetztes Vitamin C wird mit Hilfe yon 50°/oigem Athanol in Gegenwart yon 2,3-Dimercaptopropanol-(1) (=BAL) aus dem Probegut extrahiert. Der Extrakt wird filtriert, mit Bernsteins~urel5sung versetzt, erneut filtriert und mit Dowex-Kationenaustauscher behandelt. AnsehlieBend wird BAL mittels Methylenchlorid- und J~ther-W~sche aus der LSsung entfernt; diese wird mit Dichlorphenolindophenol (DPI)-LSsung in fiblicher Weise titriert. Die Methode erfafit Ascorbinsi~ure (ASC) und Dehydroascorbins~ure (DASC) gemeinsam. Reagentien 1. Wasser, b i d e s t . - 2. _~thanol, abs., zur Analyse (z. B. M e r c k ) . - 3. 2,3-Dimereaptoprop.anol-(1) = BAL (British Anti-Lewisite) ( M e r c k ) . - 4. Extraktionsmittel: Athanol 500/0, aus Athanol, abs., zur Analyse und Wasser bidest. 1-4-1, versetzt mit 1% B A L . 5. 2 n Natronlauge ca.: 80 g I~atriumhydroxid Pl~itzchen zur Analyse, zum 1 gelSst. - - 6. 2 n Salzs~ure ca. : 160 ml HC1 37°/o zur Analyse, verdfinnt zum 1 . - 7. Bernsteins~urelSsung 20/0: Bernsteins~ure krist, rein, Erg. B.6, zum..1 gelSst, dann mit C02 ca. 3--4 min d u r c h g a s t . 8. Methylenchlorid, wasserges~ttigt.- 9. Ather, peroxydfrei, wasserges~ttigt.- 10. Kationenaustauscher: Dowex WXS, 50--100 mesh, stark sauer Reinheitsgrad praet. (Serva oder Fluka). Vor Benutzung nach Arbeitsvorschrift zu aktivieren. - - 11. C02, Bombenware. - - 12. Diehlorphenolindophenol (DPI)-LSsung: 35 mg 2,6-Dichlorphenolindophenol-I~atriumsalz (Merck) bei Raumtemp. zum l, 15sen, filtrierenZusatz yon ca. 12 mg Natriumhydrogencarbonat. Die LSsung ist ca. 10-~ t o o l . - 13. Ascorbins~ure (ASC), krist, rein 100°/o. - - 1 4 . ASC-Standard-LSsung 100 ppm: 10,0 mg ASC krist, rein 100% 15sen in Bernsteins~urelSsung 2% ad 100 ml. 1 Tag unter Lichtabschlu] bei Raumtemp. h a l t b a r . - 15. Universalindikator-Papier, z.B. Merck, pH 1--10. - - 16. Spezialindikator-Papier, z. B. Merck, pH 5,4--7,0. Arbeitsvorschri]t 1. Extraktion der ASC. Eine ca. 2500--5000 meg ASC enthaltende, genau eingewogene Probe der Mineralsalzmisehung im 100-ml-Schlifferlenmeyerkolben mit 50 ml Extraktionsmittel versetzen (III, 1,2). Mit ca. 2n-l~atronlauge* auf pH 6,0--7,0 einstellen (gemessen mit Spezialindikator-Papier Merck, pH-Bereich 5,4--7,0) (III, 3), mit COg begasen und im verschlossenen Erlenmeyerkolben 20 rain mit dem Magnetrfihrer rfihren (III, 4). Die Rfihrgesehwindigkeit so einstellen, dab die gesamte Einwaage-Masse in Bewegung ist und sieh nicht am Boden absetzen kann. W~hrend des Extrahierens fallen die Schwermetall-Mercaptide in Form eines schwarzen Schlammes aus. l~aeh beendeter Extraktion den gesamten Kolbeninhalt ohne Nachspfilen und unter Verwerfen eines Vorlaufes durch ein Faltenfilter geben (Ira Abzug arbeiten! Geruehsbel/~stigung durch BAL). Ein aliquoter Teil yon 10,0--20,0 ml des so filtrierten Extraktes ~zwischen 500--2000 tzg ASC enthaltend) im Mel]kSlbchen mit Bernsteins~ure 2°/0 ad. 50 ml verdfinnen. Gut durehmischen und die gesamte L5sung fiber ein Schwarzbandfilter filtrieren, den Vorlauf verwerfen. Der so gewonnene ASC-Extrakt ist klar, bisweilen gelblich gefarbt und besitzt einen pH-Wert yon ca. 2,5 (III, 5). 2. Ent]ernen yon Metallionen. Die im ASC-Extrakt stets noeh vorhandenen Sehwermetallionen mit Kationenaustauscher entfernen (III, 6). Dabei ist wie folgt zu verfahren: a) Vorbereiten der Si~ule. Glasrohr, ~ ca. 1 era, L~nge ca. 2 0 - 2 5 cm, mit Hahnauslauf; der Reihe nach fiillen mit Glaswatte, Filterpapierpl~ttchen ~ 1 cm und Dowex-Kationenaustauseher, ans Orginal-Handelspaekung entnommen; Ffillh5he 10 cm. b) Aktivieren des Dowex-Kationenaustausehers. Waschen und dabei luftfrei machen der Ffillung mit Wasser bidest.; aufgeben yon 30 ml 2n-:Natronlauge und langsam durchtropfen lassen; alkalifrei wasehen mit Wasser bidest., Dauer je nach Dowex-Sorte 10--30 rain; Alkalifreiheit prfifen mit Merck-Universalindikator-Papier (nieht mit Phenolphthalein); aufgeben yon 30 ml 2n-Salzs~ure und langsam durchtropfen lassen; neutral waschen mit Wasser bidest. Dauer ca. 10--15 rain; S~urefreiheit prfifen mit Merck-Universalindikator-Papier (neutral identisch mit Chlorfreiheit). Austauscher unter Wasser belassen; 1 Tag haltbar ohne Aktivit~tsverlust. Benutzten Austauscher jeweils neu aktivieren; max. 4mal verwendbar. c) Behandtung des ASC-Extraktes mit aktiviertem Dowex-Kationenaustauscher. I n der Si~ule aktivierten Dowex-Kationenaustauseher fiber Kol3f in einen 100-ml-Schlifferlenmeyerkolben entleeren, l~un 10,0 ml ASC-Extrakt (s. 1.), ca. 100--400 l~g ASC enthaltend, hinzu pipettieren; naeh Zugabe eines Magnetrfihrsti~bchens und C02-Begasung verschlieBen und 15 rain rfihren. Den Kolbeninhalt hernach fiber ein mit Bernsteins~urelSsung 2% vorgewasehenes Schwarzbandfilter geben und das Filtrat sogleich in einem 100 ml-Squibb-Seheidetriehter auf* wenige Tropfen
49 fangen mit 50 ml wasserges/ittigten Methylenchlorid. Zum quantitativen Herauswaschen der ASC K61bchen und Austauschermasse mit 6 × 5 ml Bernsteinsi~urel6sung 2% 1)ortionsweise naehspfilen; obere Phase ca. 40 ml Metallionen-freier, BAL-haltiger und zumeist farbloser ASC-Extrakt. 3. Extraktion des g A L . Den so gereinigten ASC-Extrakt insgesamt 3real mit je 50 ml wassergesi~ttigtem Methylenchlorid jeweils 1 rain lang schfitteln. Das Methylenchlorid verwerfen. Eine 4. Extraktion erfolgt in gleieher Weise mit 50 ml wasserges~ttigtem Ather (III, 7). Die wi~Brige Phase gut absitzen lassen und darm in einem 100-ml-Erlenmeyerkolben auffangen. Eventuell an der Phasengrenze Wasser/_~ther noeh vorhandene Mereaptid-Partikelehen diirfen unter keihen Umst/inden mit in den Erlenmeyerkolben gelangen. Kein Nachwasehen der J~therphase oder des Scheidetrichters! Letzte L6sungsmittelreste dureh l~'i~ftiges Einleiten yon C02 verblasen (Geruehsprobe) (III, 8); das Einleitungsrohr mit max. 2 ml 2°/oiger Bernsteinsi~urel6sung naehspiilen. g. Titration der ASC. Die Metallionen- und BAL-freie, farblos bis sehwach gelbstichige LSsung (Probel6sung) mi~ ca. 10-4 m-DPI-LSsung unter Verwendung einer Halbmikrobfirette in bekarmter Weise titrieren. Enthiilt die Probel6sung mehr als ca. 200 t~g ASC, so ist sie z. B. ad 50 ml mit 2°/oiger Bernsteinsi~elSsung zu verdfinnen. Es werden dann Miquote Teile titriert. Eine definierte ptt-Einstellung mit Iqatriumacetat eriibrigt sieh beim Titrieren in bernsteinsaurer LSsung. Der Endpunkt smite 5--10 rain konstant bleiben. Blindwerte fiir ASC-ireie Probel6sungen liegen im allgemeinen in der Gr61]enordnung fiir Leerwerte der reinen Bernsteins/~urelSsung 20/o. 5. Eichen der DPI.L6sung. Fiir alas Eichen der DPI-L6sung (Standardbestimmung) 2,0 ml ASC-Standard-L6sung (200 meg ASC) mit ca. 28 ml 2°/oiger Bernsteinsiiurel6sung versetzen und bis zum bleibenden Umsehlag nach Rosa titrieren. In gleieher Weise ist der Leerwert fiir 30 ml 2°/oiger Bernsteins~urel6sung zu bestimmen. 6. Berechnung. Formel: (Vpr.-- Blpr.) (ml) • [Zgstd. • Verdiinnung • 1000 ( V s t d . - Lstd.) (ml) • 1000" Einwaage(g) = mg ASC]kg. L e g e n d e : VStd, = DPI-Verbrauch fiir 2 ml ASC-Standard-LSsung in m l . - LStd. ~ Leerwert ffir Standardbestimmung = z.B. 0,3 ml. - - Vpr. = DPI-Verbrauch ~fir Probel6sung in m l . - Blpr. = Blindwert fiir Probel6sung = z.B. 0,3ml.--~gStd. : ~xgASC in 2,0 ml ASC-Standard-LSsung ( = 200 i~g). 7. Analysenbeispiel. Mineralfutter mit einem Sollgehalt yon 500 nag ASC/kg (III, 9) Einwaage 5 g. - - Verdiinnung Ew./50/20/50/lO. - - VStd. = 12,28 ml. - - Vpr. = 11,94 ml. ASC gefunden: (11,94 - - 0,3). 2 0 0 . 5 0 - 50- 1000 (12,28-- 0,3) • 1000.10- 2 0 . 5 = 485,8 mg/kg.
Zeitaufwand fiir 1 Doppelbestimmung (2 Einwaagen) : 4 Std (1 Person).
III. Diskussion 1. Einwaage und Extraktionsmittel Die handelsfiblichen ASC-I)osierlmgen liegen zwischen 500 u n d 5000 m g ASC/kg Mineralsalzmischung, in Sonderf~llen bei 100 m g ASC/kg. Die E i n w a a g e soll m a x i mal 5 g betragen. Als L5sungs- bzw. E x t r a k t i o n s m i t t e l w i r d 50%iges A t h a n o l v e r w e n d e t , weil a) die Salze d e r Mineralsalzmischung d a r i n w e i t g e h e n d unge]Sst bleiben, b) zugesetzte umhfillte ASC in W a s s e r k a u m 15slich ist. D a s fibliche C o a t i n g - M a t e r i a l ffir ASC 15st sich bei a u s r e i c h e n d l a n g e r l~fihrzeit in 50~/oigem A t h a n o l vSllig auf, so d a b ASC in LSsung gehen k a n n . 2. Er[orderliche Menge B A L E i n Z u s a t z y o n 1 % B A L z u m E x t r a k t i o n s m i t t e l erwies sich bei d e n bisher g e t e s t e t e n handelsfiblichen M i n e r a l s a l z m i s c h u n g e n Ms a u s r e i c h e n d e r Sehutz fiir zugesetzte ASC. Die E i n w a a g e n lagen n i c h t fiber 5 g. 3. p H - W e r t bei der ASC-Extraktio~t Z u m Stabilisieren d e r aus d e m P r o b e g u t e x t r a h i e r t e n ASC k a n n d e r p i t - W e f t u n t e r 6 liegen. Ffir die R e d u k t i o n d e r D A S C bei R a u m t e m p . genfigt jedoch ein pI-I-Wert y o n 5 - 6 n i c h t ; die R e a k t i o n s z e i t erhTht sich, so dM] zur vollst&ndigen R e d u k t i o n 4 z. Lebensmitt.-Untersuch.,Band 159
50 l~nger als 1 Std geriihrt werden miiBte. Hingegen wird DASC im pH-Bereich yon 6,0-7,0 rasch reduziert, so dab auch anf Erwiirmnng verzichtet werden kann. Uberraschenderweise sind Stabilisierung resp. Reduktion anch noch im alkalischen Bereich bis pH 8 gew~hrleistet; gearbeitet wird jedoch im Start-pH-Bereich 6,0-7,0. Im Laufe der 20-miniitigen Extraktion der ASC sinken die Anfangs-pH-Werte um ca. 2, da Anionen infolge Mercaptidbildung freigesetzt werden. Eine elektrometrische pH-Messnng ist nicht zu empfehlen, da BAL mit dem Diaphragma der MeBelektrode unter Mercaptidbildung reagiert und die Elektrode unbranchbar macht. 4. ExtraIctionsdauer Eine Riihrzeit yon 20 rain reicht aus, um a) ASC, sowohl krist, als auch nmhfillt, in LSsung zu bringen, b) DASC durch BAL zu rednzieren, c) einen Grol~teil der Mctalle als Mercaptide zu f&llen. Verliingerte Rfihrzeiten sind unschadlich, verkfirzte jedoch bedingen Minderbefunde. 5. Bern~teinsSure als Verdi~nnungs- und AnsSuerungsreagens Bernsteinsi~ure erwies sich als geeignetstes Reagens zum Stabilisiercn, Ans~uern nnd Verdiinuen der Analysenprobe. Sie weist gegeniiber Metaphosphors~ure und Oxals£ure Vorteile auf: a) Der pit-Weft der reinen 2~/oigen Bernsteins~urelSsung liegt bei 2,4, so dab sich eine zus~tzliche pH-Einstellung vor der Titration mit DPI erfibrigt.
b) Die Reaktion yon Schwermetallionen mit DPI (Reduktion) ist in bernsteinsaurer LSsung welt harmloser als in oxalsaurem oder metaphosphorsaurem Milieu. Im Analysengang werden zudem die Schwermetallionen noch mittels Kationenaustauscher vorher entfernt (III, 6). c) Beim Verdiinnen des filtrierten Extraktes mit Bernsteins~urelSsung flocken Mercaptide, welche vorher das Filter kolloid passiert haben, aus nnd lassen sich durch erneutes Filtrieren abtrennen. Anderseits gehen aber durch dieses Ans£uern gewisse Mercaptide unter Zersetzung wieder in LSsung (Anteil gering). Bei Verwendung yon 0xal- und Metaphosphors~ure hingegen 15sen sich die meisten Mercaptide wieder auf. d) BernsteinsiiurelSsung kann ohne Bedenken einige Tage lang verwendet wetden. Man sollte sie nur jeden Tag neu mit CO2 durchgasen. 6. Dowex-Kationenaustauscher Handelsfibliche Kationenaustauscher miissen vor Verwendung stets, wie beschrieben, aktiviert werden. Die Metalhonen-entfernung wird vor der BAL-Extraktion durchgefiihrt, um die LSsung noch nnter Reduktionsschutz zu belassen. Durch eine vorzeitige BAL-Entfernung in Gegenwart yon Metallionen wird sogleich ein rasant verlaufender Abbau der ASC in Gang gesetzt; es ist deshalb stets in der beschriebenen Reihenfolge zu verfahren. Als Ionenaustauscher bew~hrte sich Kationenaustauscher Dowex 50 WX8, 50-100 mesh am besten; eine pro anal.-Qualit~t war nicht erforderlich. GrobkSrnigere Qualiti~ten (z. B. 20-50 mesh) sind ungeeignet (zeitaufwendiges Aktivieren; geringere Austauschleistung bei vorgegebener gleicher Zeit). Die Gegenwart yon BAL ist ohne Einflul~ auf die Funktion des Dowex-Kationenaustauschers, tier die restlichen, freien, nicht mehr als Mercaptide vorliegenden Schwermetallionen - z. B. Fe, Cu, Mn, Zn, Co - aus der LSsung entfernt. Der SchwermetaUionenaustausch als Zeitreaktion erfolgt zweckmii6igerweise durch Zugabe des Austauschers zum ASC-Extrakt; eine Austauschzeit yon 15 rain unter Rfihren ist ausreichend.
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7. Extraktion von B A L Eine 4malige E x t r a k t i o n ist erforderlich, u m BAL vollstdndig aus dem Eluat zu entfernen. Bei nur 3maliger Extraktion verbleiben immer noeh geringe BALSpuren in L6sung, und bedingen eine ziehende Titration. BAL kann nut aus saurer LSsmlg vollst~ndig extrahiert werden. Aus neutraler oder schwach alkalischer L6sung 1/il~t sich BAL nur unvollkommen entfernen, da es teilweise resp. ganz als wasserl6sliches Alkalisalz vorliegt. Der p H - W e r t yon 2,4 in der bernsteins~uren L6sung reicht jedoch fiir eine ersch6pfende Extraktlon aus. Aus Grfinden der Arbeitserleichtertmg wird an Stelle yon J~ther fiir die ersten 3 Extraktionen Methylenchlorid verwendet (untere Phase). Itierdurch ist es mSglich, die ganze Extraktion in nut einem Scheidetrichter durchzuf/ihren. Unter den beschriebenen Extraktionsbedingungen betr/igt der unvermeidliche Verlust an ASC (4 W~schen !) 2 - 3 % ; er wird im allgemeinen durch das Miterfassen letzter Metallionenspuren bei der ASC-Titration ausgeglichen und daher rechnerisch nicht beriicksichtigt. 8. Verwendung von CO 2 Ein Verblasen der letzten Methylenchlorid- und ~therspuren mittels CO 2 vor dem Titrieren erwies sich als vorteilhaft, da diese L6sungsmitteh'este ziehende Titrationen verursachen k6nnen.
9. ProbenhomogenitSt und Analyse Den korngr613enm~13ig oft ziemlieh inhomogenen Mineralsalzmischungen Rechhung tragend sollten je Muster mindestens 4 Parallelanalysen durchgeffihrt werden. Literatur
1. 2. 3. 4. 5.
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