BIOCHIMIE, 1977, 59, 329-336.

Purification de l'hdmolysine thiol-ddpendante extracellulaire de Bacillus alvei. Joseph E. ALOUF (*) ~, Martine KIRI~DJIAN et C h r i s t i a n e GEOFFROY. Service des Aua~robies, Institut Pasteur, 25, rue da Docteur R o u x , 75724 Paris Cedex 15. (7-2-1977) Summary. - - Alveolysin a sulfhydryl-dependent cytolytie extracellular protein released by Bacillns alvei has been purified by salting-out by ammonium sulfate, gel filtration, isoelectric focusing on pH gradient and chromatography on DEAE-cellulose. The purified protein after reduction by thiols (active hemolytic form) proved homogeneous by disc polyacrylamide gel electrophoresis and by gel immunodiffusion. The molecular ~veight was 60,900 daltons. Two molecular forms of pI 5.1 and 7.0 were detected by gel isoelectrofocusing. The toxin ~¢~as lethal to the mouse. Lyric activity ~vas inhibited by cholesterol and antistreptolysin O antisera. Immunological cross-reaction was observed bet~veen alveolysin and streptolysin O.

]NTRODUCTION. Les s u r n a g e a n t s de culture de Bacillus alvei, bact6rie des ruches d'abeilles, c o n t i c n n e n t u n e h 6 m o l y s i n e dont l'activit6 lytique d6croit progress i v e m e n t p a r exposition ~ l'air. Cette activit~ est restaur6e et souvent fortement augment6e p a r a d d i t i o n de r~ducteurs comme les thiols. ]~lle est ~galement i n h i b 6 e p a r le cholest6rol et neutralis6e p a r u n i m m u n s ~ r u m a n t i s t r e p t o l y s i n e O [1].

caract6ristiques mol~culaires, structurales et imm u n o c h i m i q u e s de ces prot6ines cytolytiques et du m~canisme de leur action d i s r u p t i v e sur les m e m b r a n e s . Nous d~crivons ici ]a p u r i f i c a t i o n et quelques propri6t6s de cette toxine.

MATERIEL E T M,ETHOD~S. 1 --

P R O D U C T I O N DE LA p R E P A R A T I O N HEMOLYTIQUE BRUTE.

Ces trois propri~%s caract~risent le groupe des toxines prot6iques cytolytiques dites oxyg6nolabiles ou s u l f h y d r y l - d 6 p e n d a n t e s [2J dont la streptolysine O (SLO) s6cr~t6e p a r le streptocoque est le chef de file. Quatorze toxines de ce groupe toutes i m m u n o l o g i q u e m e n t apparent6es, 61abor6es p a r diverses esp~ces b a c t 6 r i e n n e s h Gram-positif (dont certaines pathog6nes p o u r l'homme) sont c o n n u e s h l ' h e u r e actuelle [3]. Les toxines SH-d~p e n d a n t e s purifiSes h ce jour sont la SLO, la p n e u molysine, la toxine p e r f r i n g e n s 0, la t h u r i n g i o l y sine et la c6r6olysine de Bacillus cereus [4, 5]. Le r~cepteur m e m b r a n a i r e de ces loxines serait ]e cholesterol constitutif des m e m b r a n e s cytoplasmiques et des organites intra-cel,Iulaires des cellules eucaryotes [2, 4]. La p u r i f i c a t i o n de I ' h 6 m o l y s i n e de B. alvei appe16e alv~olysine [3] nous a sembl6 int~ressante dans u n e perspective d'6tude compar6e ult~rieure des (*) Adresse actuelle: D6partement d'Immunologie, Service des Antig6ncs Bact~riens, Institut Pasteur, 28, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15. C~ A qui route correspondance doit 8tre adress~e.

La toxine b r u t e est c o n s t i t u t e p a r le s u r n a g e a n t de culture de 15 heures de la souche de B. alvei ATCC 6.344 cultiv6e h 30°C dans des flacons de 5 litres r e n f e r m a n t 4 litres d ' u n m i l i e u ayant la c o m p o s i t i o n suivante : prot~ose p e p t o n e n ° 3 (Difco) : 20 g ; extrait de levure (Difco) : 5 g ; Na2HP04, 12 H20 : 8,3 g ; KH 2 PO 4 : 0,7 g ; e a u distill6e q.s.p. : 1 litre. Le m i l i e u est ajust6 h pH 7,8 avec de la soude, st6rilis6 h 115°C p e n d a n t 20 m n puts compl~t6 par a d d i t i o n de solution de glucose (2,5 p. cent final). 2

--

T I T R A G E DU P O U V O I R HEMOLYTIQUE.

Le titre h6molytique de I'a,lv6olysine, pr~alablem e n t r6activ6e p a r a d d i t i o n de 50 ~tM de cyst6ine, a 6t6 d6termin6 selon la t e c h n i q u e d6crite pr~al a b l e m e n t [6] en r e m p l a ~ a n t les h6maties de l a p i n p a r u n e s u s p e n s i o n d'h6maties de m o u t o n h 5 p. cent. L'unit6 h6molytique (UH) est la quantit6 de toxine capable de lyser 50 p. cent de cette suspension en 45 m n h 37°C dans les c o n d i t i o n s pr6cis~es ailleurs [6]. 25

J. E. Alouf, M. Kiredjian et C. Geoffroy.

330

L'activit6 sp6cifique a 6t6 exprim6e p a r le rapport : h o m b r e d ' U t I p a r m l / d e n s i t 6 optique 280 rim. 3 --

PRF, PARATION DE S T R E P T O L Y S I N E O .

Cette p r 6 p a r a t i o n qui c o r r e s p o n d h la f r a c t i o n F~ de p u r i f i c a t i o n de la toxine c o n t e n a n t cette dern i t r e et la NAD glycohydrolase [7] a 6t6 uti]is6e p o u r l ' a n a l y s e i m m u n o c h i m i q u e en m i l i e u g61ifi~. 4

--

PI~PARATION

D'IMMUNSERUMS

ANTI - ALVEO-

LYSINE.

Quatre lapins albinos de 2,5 kg (Elevage de F i n s titut Pasteur) ont 6t6 i m m u n i s 6 s avec le s u r n a geant de c u l t u r e p r 6 a l a b l e m e n t d6toxifi6 p a r addition de f o r m a l d 6 h y d e ( c o n c e n t r a t i o n finale de 0,25 p. cent) et s6jour h l'6tuve h 37 ° p e n d a n t 18 heures. L ' a n a t o x i n e diMys6e c o n t r e le t a m p o n a 6t6 adsorb6e sur phosphate de c a l c i u m selon u n e t e c h n i q u e d6crite p r 6 c 6 d e m m e n t [8] et inject6e h r a i s o n de 1 ml p a r vote i n t r a m u s c u l a i r e t o u s ] e s 7 jours p e n d a n t 3 semaines. Apr~s u n repos de 2 roots, les a n i m a u x ont regu h n o u v e a u 1 ml de toxine native brute h 1.000 UH/ ml, m61ang6e h u n volume 6gal d ' a d j u v a n t de F r e u n d complet. Trois i n j e c t i o n s p a r vote i n t r a m u s c u l a i r e h 15 jours d ' i n t e r v a l l e ont 6t6 pratiqu6es. La saign6e des l a p i n s a 6t6 effectu6e ]e 8~ jour apr~s la derni~re injection. Les s6rums recueillis ont 6t6 conserv6s st6riles h + 4 °. Le titre m o y e n a 6t6 de 1.000 unit6s de c o m b i n a i s o n / m l , selon la t e c h n i q u e utilis6e p o u r le titrage de l ' a n t i streptolysine O [8]. 5 - - ELECTROPHORESE SUR GEL DE POLYACRYLAMIDE. Le proc6d6 utilis6 est celui d ' O r n s t e i n [9] et Davis [10! p o u r u n e c o n c e n t r a t i o n en a c r y l a m i d e de 7,5 p. cent avec u n T a m p o n T r i s - g l y c i n e pH 8,5 (Tris : 10-2 M, glycine 0,1 M). ,La m i g r a t i o n est r6alis6e h l'aide d ' u n appareil ISC0 (Lincoln, USA) modble 419, sous 3 mA p a r tube en pr6sence de bleu de b r o m o p h 6 n o l comme traceur. Les gels sont r6v616s avec u n e solution de Bleu Coomassie G 250 (Serva) dans l ' a c i d e p e r c h l o r i q u e selon R e i s n e r et coll. [11]. Les gels destin6s au rep6rage de l'activit6 h6molytique sont d6coup6s en disques de 2 m m d'6paisseur et 61u6s p a r u n e solution de NaC1 h 0.9 p. cent. La d6tection de l'activit6 lytique est effectu6e sur les 61uats. 6 --

ELECTROPHORESE sun

GEL DE t)OLYACRYLAMIDE

EN PRESENCE DE OOD1~C~YL SUL~'ATE DE SODIUM.

La m6thode utilis6e est celle de W e b e r et Osb o r n e [12] p o u r u n e c o n c e n t r a t i o n en a c r y l a m i d e

BIOCHIMIE, 1977, 59, n ° 3.

de 7,5 p. cent. Les 6 c h a n t i l l o n s en t a m p o n phosphate 0,15 M sont d6natur6s avant 61ectrophorbse, p a r chauffage p e n d a n t 5 m n dans u n h a t h - m a r i e b o u i l l a n t , en pr6sence de 0,1 M de dithiothr6itol (Sigma) et de 2 p. cent de dod6cyl sulfate de s o d i u m (Serva). La coloration des gels a 6t6 effeetu6e p a r le Bleu Coomassie (0,25 p. cent en solution darts u n m61ange de 20 p. cent d'alcool isop r o p y l i q u e et de 10 p. cent d'acide ac6tique dans l'eau distill6e). La s 6 r u m a l b u m i n e bovine, l'ovalbunfine, le c h y m o t r y p s i n o g ~ n e , la prot6ine de soja i n h i b i t r i c e de la t r y p s i n e et le lysozyme (coffret ¢ Serva >>) ont 6t6 utilis6s comme m a r q u e u r s de masses mol6culaires connues. 7

F O C A L I S A T I O N I S O E L E C T R I Q U E EN GEL DE POLYACRYLAMIDE.

Les solutions d ' a m p h o l y t e s (Ampholines) ont 6t6 f o u r n i e s p a r LKB (Stockholm). La t e c h n i q u e de S w a n s o n et Sanders [13] modifi6e comme suit dans notre l a b o r a t o i r e (D. Prigent) a 6t6 utilis6e. On pr6pare le m61ange s u i v a n t p o u r u n tube de gel final de 2 cm3 e n v i r o n : solution d ' a c r y l a m i d e 30 p. cent : 500 !xl, A m p h o l i n e s pH 5-8 : 75 ~1, A m p h o l i n e s pH 3,5-10 : 25 ~l, solution de saccharose (Merck) h 50 p. cent : 40 ~1, 6 c h a n t i l l o n de p r e p a r a t i o n de toxine : 50 ~1 et eau distill6e q.s.p. 2, ml. Avant t r a n s f e r t du m61ange dans les tubes p o u r prise en gel on ajoute 50 td de solution de persulfate d ' a m m o n i u m ~ 1~2 m g / m l et 11~1de t6tram6thyl6thyl~nediamine. La p o l y m ~ r i s a t i o n s'effectue en 10 m i n u t e s h la l u m i b r e naturelle. Les tubes sont dispos6s darts l ' a p p a r e i l utilis6 p o u r l'61ectrophorbse en gel de p o l y a c r y l a m i d e . Les extr6mit6s sup6rieures des tubes sont raises en contact avec u n e solution de NaOH, pH 12 (cathode). Les extr6mit6s inf6rieures b a i g n e n t dans u n e solution de H2SO4, pH 2,5 (anode). Une t e n s i o n de 250 volts est appliqu6e p e n d a n t 5 h h la t e m p 6 r a t u r e de 4 °. Les gels sont lib6r6s des tubes. Ceux devant Ore color6s sont plac6s dans u n b a i n d'acide ac6tique h 10 p. cent pendant 24 heures ariD de fixer les prot6ines et d'61im i n e r les A m p h o l i n e s qui a b s o r b e n t le colorant. Les gels sont ensuite color6s au Bleu Coomassie comme i n d i q u 6 plus haut. Les gels n o n soumis h la coloration sont sectionn6s en rondelles de 2 m l n d'6paisseur d~s Farr6t de l'61ectrofocalisation. L'.61ution des rondelles est effectn~e darts 0,5 ml de solution de NaC1 0,1,5 M. Le pH et l'activit6 lytique sont d6termin6s s n r ces 61uats.

Purification de l'alvdolysine. 8 --

luble. Ce d e r n i e r est e x t r a i t ~ d e u x r e p r i s e s p a r 5 ml de t a m p o n . Les s u s p e n s i o n s s o n t centrifug6es. Les s u r n a g e a n t s sont r6unis puis c o n c e n t r 6 s sous

ANALYSE IMMUNOCHIMIQ.UE EN MILIEU GELIFIE.

C e t t e t e c h n i q u e a 6t6 e f f e c t u 6 e s u r l a m e s d e m i c r o s c o p e (76 X 2+6 m m ) r e c o u v e r t e s d ' u n e e o u c h e d e 5 m l d e g61ose D i f c o h 1,5 p . c e n t e n t a m p o n 1. L ' i m m u n o d i f f u s i o n s'effectue en c h a m b r e h u m i d e h 20 ° ( d i a m O r e d e s r 6 s e r v o i r s 4 r a m ) . 9 --

331

L. . . . •

oo

A

DOSAGE DES PROT~INES. .15

L a d 6 t e r m i n a t i o n d e s p r o t 6 i n e s d u n s les p r 6 p a r a t i o n s d e t o x i n e p u r i f i 6 e a 6t6 r 6 a l i s 6 e p a r la m6t h o d e d e L o w r y et coll. [14]. L a s 6 r u m a l b u m i n e b o v i n e ( A r m o u r ; G r a n d e B r e t a g n e ) a 6t6 u t i l i s 6 e c o m m e prot6,ine 6 t a l o n .

I S.

_qo

p~

i

/'

10

/

+

+~""

.... - !

RESULTATS. 1 --

PURIFICATION DU MATERIEL BRUT.

p a r relargage et ultrafiltration :

1.1 - - C o n c e n t r a t i o n

d'ammonium

en sulfate

L a p u r i f i c a t i o n a 6t6 e f f e c t u 6 e s u r u n l i t r e d e s u r n a g e a n t d e c u l t u r e t i t r a n t 3000 U H / m l (tab l e a u I). T o u t e s les o p 6 r a t i o n s o n t 6t6 r 6 a l i s 6 e s + 4 ° sauf i n d i c a t i o n c o n t r a i r e . Le s u r n a g e a n t a 6t6 s o u m i s fi tin r e l a r g a g e p a r d u s u l f a t e d ' a m m o n i u m fi 50 p. c e n t d e s a t u r a t i o n . A p r b s r e p o s d ' u n e n u i t le p r 6 c i p i t 6 c o l l e c t 6 a p r ~ s c e n t r i f u g a t i o n a 6t6 s o l u b i l i s 6 d u n s 20 m l d e t a m p o n p h o s p h a t e - N a C . 1 0,15 M p H 6,8 ( t a m p o n 1), d i a l y s 6 c o n t r e c e t a m p o n p u i s c e n t r i f u g 6 afin d ' 6 1 i m i n e r le r 6 s i d u i n s o -

3'5

fro

7"0' F , a c t , o . s

9'0

FIG. 1. - - Filtration sur Sdphadex G 100 de la frac-

tion F1 issue du relargage par 'le sulfate nium.

Colonne : 100 X 2,5 cm. Eluant : t a m p o n 1 (phosphate de Na-NaC1) 0,15 M pH 6,8. D6bit : 20 m l / h . Volume des fractions reeueillies : 4 mL ..... densit6 optique h 280 rim. aetivit6 h6molytique apr6s r6duetion.

TABLEAU I.

Purification

Fraction

de l'alv~olysine.

Activit6 totale Volume (ml) UH × t0 .~

(')

Activit6 sp6cifique Coefficient Uft -× 10 ~ de purification DO

Rendement p. cent

(+.)

Surnageant . . . . . . . . . . . R e l a r g a g e p a r SO~ (NH4).2 (F1) . . . . . . . ? Filtration sur gel (F2) Eleetrofocalisation (F3) Filtration sur get (F4) Chromatographie sur D E A E cellulose (F5) . . . . . . . . . . . . . . .

1 00O

30

lO0

1,4

6,6

206 584 1185

44 147 417 846

75 60 38 -22

5,7

2264

1617

19

10 10 12

20 18 11,3

4

62

(*) et (**) UH : unit6s h6molytiques ; D.O. : densitd optique h 280 nm. Sur la base d ' u n poids mol6culaire de 60 000 pour la f r a c t i o n purifide F5 et d'une activit6 sp6cHique de 350 000 U H / m g de protdine d apr6s le dosage de la toxine par la m6thode de Lowry, on caleule q u ' u n mg de toxine purifi6e correspond h 1,58 unit6s de D.O. Une UH correspond h 2,8 ng de prot6ines soit 2,8 X 1010 mol6eules. C o m m e cette quantit6 lyse par d6finition 50 per cent des cellules de la s u s p e n s i o n d'6rythroeytes de m o u t o n normalis6e h 5 X 10s cellules/ml, ces donn6es p e r m e t t e n t de calculer q u ' e n v i r o n 100 mol6cules de toxine suffisent pour lyser u n 6rythrocyte.

BIOCHIM1E, 1977, 59, n ° 3.

d'ammo-

J. E. A l o u f , M. K i r e d j i a n et C. G e o f f r o y .

332

p r e s s i o n d'azote jusqu'5 un v o l u m e de 10 m l (fraction F 1), dams un a p p a r e i l d ' u l t r a f i l t r a t i o n (Amicon, L e x i n g t o n , U.S.A.) 6quip6 d ' u n e m e m b r a n e Diaflo type PM-10. Cette o p 6 r a t i o n ( r e n d e m e n t 75 p. cent) r6alise u n e p u r i f i c a t i o n a p p r 6 c i a b l e du mat6riel b r u t avec 61imination d ' u n e g r a n d e p a r t i e des p i g m e n t s et des mol6cules de taille i n f 6 r i e u r e 10.0.00 daltons. 1.2 ~

Filtration sur gel de S~phadex G-IO0 :

La f r a c t i o n F~ est d6pos6e sur une c o l o n n e de S6phadex G-100 (100 × 2,5 cm) 6quilibr6e en tamp o n 1. L'61ution est effectu6e p a r v o l e d e s c e n d a n t e p a r le m6me t a m p o n (fig. 1). Le profiI d'61ution des f r a c t i o n s h 280 nm m o n t r e un 6talernent sans pics d6finis, en r a i s o n du mat6riel v i s q u e u x a b o n d a n t clans la f r a c t i o n 1. Toutefois un p i c d'activit6 lytique est retrouv6 dams un v o l u m e r e l a t i v e m e n t restreint, qui est collect6 puis c o n c e n t r 6 p a r ultrafiltration c o m m e ci-dessus ( f r a c t i o n F 2 : 10 ml).

t e c h n i q u e d&crite dams le m a n u e l du c o n s t r u c t e u r . La f r a c t i o n F_, est ajout6e fi la solution de s a c c h a rose la m o i n s dense. Le g r a d i e n t de densit6 a 6t6 r6alis6 au m o y e n du m61angeur L.K.B. L'61ectrode du c o m p a r t i m e n t c e n t r a l (anode) r e n f e r m a i t u n e solution ~ 1 p. cent d ' a c i d e s u l f u r i q u e clans u n e solution fi 60 p. cent de saccharose. La c a t h o d e 6tait constitu6e p a r une solution de 0,2 ml d'6thy16nediamine dams 10 m l d'eau distill6e d6pos6e la p a t t i e sup~rieure du gradient. La t e n s i o n 6tablie en d6but d ' e x p ~ r i e n c e (300 volts) clans la c o l o n n e thermostat6e h 4°.C a 6t6 p r o g r e s s i v e m e n t 61ev6e h 500 volts. La dur6e totale de l ' o p 6 r a t i o n a ~t6 de 30 heures. Le p H des f r a c t i o n s r e c u e i l l i e s a 6t6 mesur6 /~ 4°C avec un p H m6tre au 1/100" (Heito, Paris). I

D.O.

UHI•3m

/\

....

1.3 - - Focalisation iso~lectrique en gradient de pH : Cette 6tape a 6t6 r6alis6e sur c o l o n n e 8100-1 (L.K.B. P r o d u k t e r A.B., Stockholm) de 110 ml dans UHImlx 103

DO

pH

35 *150

lo_

50

70

F

t o s

90

Fro. 3. -F i l t r a t i o n sar Sdphadex G 100 de la fraction Fs issue de l'~lectrofocalisation.

M~me ldgende que fig. 1. 8. .1oo

s_

.so

4

L'activit6 l y t i q u e (fig. 2) a 6t6 retrouv6e sous forlne d'un p i c dont le s o m m e t c o r r e s p o n d /~ un pH de 5. Les f r a c t i o n s actives 16g6rement troubles, sont r6unies (F 3 : 12 ml) et le p H e s t ensuite ajust6 h 6,5 p a r a d d i t i o n d ' u n e solution d ' h y d r o x y d e de s o d i u m dilu6e. Cette o p 6 r a t i o n p r o v o q u e u n e clarification totale de la fraction. 1.4 - - Deuxibme filtration sur gel de S @ h a d e x G-IO0 :

3"0

5'0

7b

Fractions

Fro. 2 . Focalisation isodlectrique en gradient de pH de ta fraction F2 issue de la filtration sur gel. Les conditions exp6rimentales sont d6crites dans le texte. Volume des fractions: 1,5 ml. ..... densit6 optique h 280 nm. - activit6 h6molytique apr6s r6duction. • ••

pH h 0°C.

un g r a d i e n t c o n t i n u de s a c c h a r o s e c o n t e n a n t 1 p. cent d ' u n m61ange d ' A m p h o l i n e s L.K.B., de pH 5-8 (0,5 ml), 3,5-5 (1,5 ml) et 3,5-10 (0,5 ml) selon la

BIOCHIMIE, 1977, 59, n ° 3.

La f r a c t i o n F 3 est soumise fi une filtration sur gel dams les c o n d i t i o n s d~crites p o u r F r Cette op~r a t i o n a p o u r but d ' ~ l i m i n e r les a m p h o l y t e s et le saccharose. Elle r6alise ~galement un d o u b l e m e n t de l'activit6 sp6cifique p a r 61imination d ' u n e fraction i m p o r t a n t e de prot6ines i n a c t i v e s (fig. 3), ainsi que de pigments. Les f r a c t i o n s lytiques (57 fi 72) sont rassembl6es, et c o n c e n t r 6 e s (fraction F 4 de 4 ml) sur m e m b r a n e Amicon. La p r 6 p a r a t i o n & ce stade reste 16g6rement teint6e en jaune et montre e n c o r e une c e r t a i n e h6t6rog6n6it6 en gel de p o l y a c r y l a m i d e (fig. 5).

Purification 1.5 - -

Chromatographic sur DEAE-cellulose :

L a f r a c t i o n F4 est c h r o m a t o g r a p h i 6 e s u r u n e c o l o n n e d e D E A E - c e l l u l o s e (30 X 0,8 c m ) 6 q u i l i b r 6 e e n t a m p o n p h o s p h a t e d e p o t a s s i u m 0,02 M

UHlml •lo3

DO. I

.~o

~

m-~

0,~-

333

de l ' a l v d o l y s i n e .

La majeure partie de l'activit6 lytique apparait d~s l ' 6 t a b l i s s e m e n t d u g r a d i e n t . L e s 61uats a c t i f s ( f r a c t i o n s 3:0 h 57) s o n t r a s s e m b l 6 s et c o n c e n t r 6 s par ultrafiltration comme pr6c6demment. La fraction obtenue (F 5 : 4 ml)s'6tant av6r6e hoinog~ne p a r les c r i t ~ r e s i m m u n o l o g i q u e s et 6 1 e c t r o p h o r 6 t i ques d6crits plus loin, la purification de l'alv6ol y s i n e est c o n s i d 6 r 6 e c o m m e a c h e v 6 e h ce s t a d e . Le rendement final en toxine (sur la base des UH) est d e 19 p. c e n t . L ' e s t i m a t i o n d e l a t e n e u r e n p r o t ~ i n e d e la f r a c t i o n F5 p a r la m ~ t h o d e de L o w r y et coll. [14! d o n n e u n e v a l e u r d e 400 ~ g / m l . L ' a c t i v i t 6 s p 6 c i f i q u e d e l a p r 6 p a r a t i o n c a l c u l 6 e s u r c e t t e b a s e est d e 35,6.000 U H / m g d e p r o t 6 i n e . 2 --

CARACTERISTIQUES DE LA TOXINE PURIFIEE.

F o r m e s o x y d ~ e s et r~duites de l'alv~olysine : La purification entraine une oxydation partielle d e l ' a l v 6 o l y s i n e . A l o r s q u e d a n s le m a t 6 r i e l b r u t d e d 6 p a r t l ' a e t i v i t ~ h 6 m o l y t i q u e est l a m ~ m e a v a n t ou apr~s addition de r6ducteurs, celle de la fract i o n F 5 est a u g m e n t 6 e de 4 fois, a p r ~ s i n c u b a t i o n d e q u e l q u e s m i n u t e s a v e c le d i t h i o t h r e i t o l , la cyst 6 i n e o u la 2 - m e r c a p t o 6 t h a n o l h l a c o n c e n t r a t i o n d e 0,03 M. L a p r 6 p a r a t i o n d e t o x i n e p u r i f i 6 e d a n s la c o n d i t i o n c i - d e s s u s a p p a r a i t d o n e e n p r e m i e r e approximation, comme un m61ange de molecules d o n t 25 p. c e n t est r e s t 6 s o u s f o r m e r 6 d u i t e et 75 p. c e n t est s o u s f o r m e o x y d ~ e . 2.1 - -

3'0

7*

Ft actions

FIr. 4. - - Chromatographic sur DEAE-cellulose de la fraction F, issue de la deuxi~me filtration sur gel Colonne : 30 × 0,8 em. E l u a n t : t a m p o n p h o s p h a t e de p o t a s s i u m 0,02~ M pH 7,5, puts g r a d i e n t eonstitu6 p a r 100 m l de ee t a m pon et 100 m l de solution h 0,5 M en NaC1. D6bit : 20 m l / h . Volume des fractions : 4 ml. ..... densit6 optique h 280 rim. ---aetivit~ h ~ m o l y t i q u e apr~s r6duetion. • • • 1 / ~ (conductivit6 du g r a d i e n t en m Siemens).

p H 7,5. L ' 6 1 u t i o n a 6.t6 e f f e c t u 6 e d ' a b o r d p a r c e tampon, puts par la raise en place d'un gradient l i n 6 a i r e de c o n c e n t r a t i o n s a l i n e h p H c o n s t a n t p a r a d d i t i o n d e c h l o r u r e d e s o d i u m h ce t a m p o n (fig. 4).

2.2 - -

H o m o g d n ~ i t ~ en gel de p o l y a c r y l a m i d e

:

L ' 6 1 e c t r o p h o r ~ s e e n gel d e p o l y a c r y l a m i d e effect u 6 e s u r les d i f f 6 r e n t e s f r a c t i o n s o b t e n u e s a u c o u r s d e la p u r i f i c a t i o n (fig. 5) m e t e n 6 v i d e n e e la d i s -

Electrophor~se sur gel de polyFIG. 5. acrylamide de diff~rentes fractions des dtapes de la purification de l'alo~olysine. Les q u a t r e p r e m i e r s tubes c o r r e s p o n d e n t aux f r a c t i o n s F1, F~, F~ et Fs. Le einqui6me tube correspond h la f r a c t i o n F5 pr6alablem e n t r6duite p a r le d i t h i o t h r e i t o l . Le sixi6me t u b e correspond h l'61ectrophor~se en gel de polyaerylamide-SDS de Fs. Les conditions e x p 6 r i m e n t a l e s sont d6erites dans le texte. Les volumes des d e h a n t i l l o n s d6pos6s sont de 50 I~1 des f r a c t i o n s n o n dilu6es figurant sur le t a b l e a u I. -

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-

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J. E. A foul, M. K i r e d j i a n el C. G e o f f r o y .

p a r i t i o n p r o g r e s s i v e des n o m b r e u s e s prot6ines pr~sentes dans le m a t e r i e l de d~part. La f r a c t i o n F~ non trait~e p a r les r b d u c t e u r s pr~sente une h6t~rog~n6it~ attest~e p a r la pr6sence de trois bandes contigu~s d'intensit~ diff6rente (R m r e s p e c t i f s : 0,32 ; 0,3.4 ; 0,36). Cette h6t~rog6n6it~ n'est plus r e t r o u v ~ e p o u r le mSme ~ehantillon de t o x i n e p r ~ a l a b l e m e n t r~duit p a r le dithiothr6itol. On observe dans ce cas une b a n d e u n i q u e (R m : 0,33). La r e c h e r c h e de l'activit~ l y t i q u e p a r d6eoupage de gels non c o l o r , s e o m m e d~erit dans Mat6riels et M6thodes a 6t6 effectube en parMlble. Dans le cas de la t o x i n e p r 6 a l a b l e m e n t r~duite, l'aetivit6 lytique est retrouv~e u n i q u e m e n t h l'emp l a c e m e n t de la b a n d e color6e c o r r e s p o n d a n t e . P o u r ]a t o x i n e non r6duite, on r e t r o u v e une aetivii6 l y t i q u e spontan6e au n i v e a u de la b a n d e de R m 0,32, et une activit~ r~vblable apr~s r&duetion de l'~luat et c o r r e s p o n d a n t aux deux autres bandes de Rm 0,34 et 0,36. Les trois b a n d e s observ6es sereblent donc c o r r e s p o n d r e ~ des m o l e c u l e s d'alv~o]ysine. L'61ectrophor~se de la t o x i n e (fraction Fs) d~naturbe et r6duite en gel de p o l y a c r y l a m i d e - d o d ~ cylsulfate de s o d i u m r~v~le 6galement une b a n d e unique. La masse m o l 6 c u l a i r e mesur~.e dans ees

c o n d i t i o n s a 6t~ trouv~e de l ' o r d r e de 6.0,000 h 65.00'0 p o u r des gels de 7,5 et 10 p. cent de concent r a t i o n en p o l y a e r y l a m i d e . Une v a l e u r du m b m e o r d r e a ~t~ trouv6e p a r filtration sur gel de S6phadex G 100 6talonn~ avec des m a r q u e u r s prot6iques de poids mol~culaires connus. 2.3 - - Point isodlectrique : La f o c a l i s a t i o n iso~lectrique en gel de polya c r y l a m i d e - A m p h o l i n e s de la f r a c t i o n F 5 pr&alab l e m e n t r~duite a p e r m i s de d6teeter une activit6 h ~ m o l y t i q u e m a j e u r e dans la zone de p H 5,1 et une aetivit6 m i n e u r e h pH 7,0. 2.4 - - Homog~nditd i m m u n o c h i m i q u e : L ' a n a l y s e i m m u n o c h i m i q u e en m i l i e u g~lifi6 de F~ avee ou sans a d d i t i o n de r 6 d u c t e u r r~v~le un seul arc de p r 6 c i p i t a t i o n p a r diffusion e o n t r e les i m m u n s ~ r u m s de lapin anti-toxine brute (fig. 6 A). 2.5 - - R~activit~ crois~e avec la streplolgsine O. La figure 6 B m 0 n t r e la parent6 i m m u n o l o g i q u e entre l'alv~olysine et la s t r e p t o l y s i n e O p a r i m m u n o - p r 6 c i p i t a t i o n c o n t r e un m~lange d ' i m m u n s~rums 6quin antistr'eptolysine O, d~crits pr~c~d e m m e n t [8~. La parent6 i m m u n o l o g i q u e s ' o b s e r v e ~galement p a r la n e u t r a l i s a t i o n de l'aetivit~ lyti-

A B Fro. 6. - - Analyse immunochimique en milieu gdlifid. A - - R6servoirs eentraux (S) : m61ange des immuns6rums de lapins antialv6olysine ; puis (1), (2), (3) et (4) eontiennent respeetivement 15 ~1 des fractions F1 F4 F5 sans r6duetion et F5 aprbs r6duetion par le dithiothr6itol. B - R6servoir S : mdlange des immuns6rums ~quins antiprot~ines streptoeoeeiques extraeellulaires, puits (1) : 20 !~1 de F~, puits (2) : 20 i~l de streptolysine O purifi6e titrant 500 unit6s de eombinaison Lh/ml. L'are eorerspondant h la streptolysine O est celui montrant une r6activit6 erois6e avee Fare de l'alv6olysine.

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P u r i f i c a t i o n de l ' a l v d o l y s i n e . que de l'alv6olysine p a r les s6rums a n t i s t r e p t o l y sine O. 2.6 - - I n h i b i t i o n de l'effet lytique par le cholesterol : Cette i n h i b i t i o n a ~t6 d6termin6e p o u r l'alv6ol y s i n e purifi6e p a r i n c u b a t i o n de 100 UH de t o x i n e en p r e s e n c e de c o n c e n t r a t i o n c r o i s s a n t e de susp e n s i o n de cholesterol selon la t e c h n i q u e d6crite a n t 6 r i e u r e m e n t p o u r la s t r e p t o l y s i n e O [15]. La dose i n h i b i t r i c e 50 a 6t6 trouv6e de l ' o r d r e de 8 ng de cholest@ol p a r unit6 h ~ m o l y t i q u e de toxine, soit 440 mol6cules de c h o l e s t e r o l p a r mol6cule de p r o l 6 i n e sur la base d ' u n e masse mol6cul a i r e de 60.000. Cette v a l e u r est du m6me o r d r e que celle trouv6e p o u r la s t r e p t o l y s i n e O [15]. 2.7 --, P o u v o i r l~tal : La dose m i n i m u m 16tale de l'alv6olysine p u r i fi6e et r6duite inject6e p a r voie i n t r a v e i n e u s e h la souris Swiss d ' e n v i r o n 20 g a 6t$ de 300 UH. DISLCU,SSIO~N. L ' a l v ~ o l y s i n e t o x i n e p r o t 6 i q u e h g m o l y t i q u e et antig~nique a p p a r e n t 6 e h la s t r e p t o l y s i n e O et aux douze autres t o x i n e s c y t o l y t i q u e s t h i o l - d 6 p e n d a n tes c h i m i q u e m e n t et i m m u n o l o g i q u e m e n t analogues 61abor6es p a r diverses b a c t 6 r i e s h Gramp o s i t i f [3, 4] a 6t6 purifi6e p o u r la p r e m i e r e fois p a r t i r des s u r n a g e a n t s de c u l t u r e de Bacillus alvei. La p u r i f i c a t i o n de cette p r o t ~ i n e c y t o l y t i q u e c o n t r i b u e ~ l'6tude c o m p a r 6 e de la s t r u c t u r e et des c a r a c t 6 r i s t i q u e s i m m u n o c h i m i q u e s de ce g r o u p e de toxines. Elle est 6galement essentielle p o u r l'6tude du m 6 c a n i s m e p a r lequel s'effectue la r u p ture de l'int6grit~ f o n c t i o n n e l l e et s t r u c t u r a l e des m e m b r a n e s des cellules e u c a r y o t e s au cours de l ' i n t e r a c t i o n avec ces t o x i n e s apr~s fixation sur leur r 6 c e p t e u r (cholest6rol) [4]. Au stade final de la p u r i f i c a t i o n la p r 6 p a r a t i o n d ' a l v 6 o l y s i n e obtenue (fraction F 5) s'est av6r6e homog6ne p a r a n a l y s e i m m u n o c h i m i q u e en m i l i e u g61ifi6. Le titrage de l'activit6 l y t i q u e avant et apr6s a d d i t i o n de r 6 d u c t e u r (dithiothr6itol), montre q u ' e n v i r o n 75 p. cent des mol6cules de t o x i n e clans la f r a c t i o n F 5 sont ~ l'6tat oxyd~ (inactif) et 25 p. cent ~ l'6tat r 6 d u i t (actif). La p r 6 p a r a t i o n r6duite r6v61e une b a n d e u n i q u e l'61ectrophor6se en gel de p o l y a c r y l a m i d e et polyacrylamide-SDS. En l ' a b s e n c e de r 6 d u c t e u r la m6me p r 6 p a r a t i o n m o n t r e t r o i s b a n d e s contigu~s d'intensit6 in6gale, c o r r e s p o n d a n t ~ des mol6cules de toxine, pr6sentant des 6tats d ' o x y d a t i o n diff6rents. Un r6sultat BIOCHIMIE, 1977, 59, n ° 3.

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analogue a 6t6 observ6 p a r Cowell et coll. [51 p o u r la c~r~olysine purifi6e h p a r t i r des s u r n a g e a n t s de culture de Bacillus cereus et p a r nous-m6mes p o u r la s t r e p t o l y s i n e O. It n'est pas exclu que la multiplicit6 des b a n d e s observ6es en l ' a b s e n c e de r6d u c t e u r soit un art6fact r6sultant de l ' o x y d a t i o n h des degr6s d i v e r s des mol6cules de p r o t 6 i n e p a r le p e r s u l f a t e d ' a m m o n i u m utilis6 c o m m e catalyseur p o u r la p o l y m 6 r i s a t i o n du gel. Tel semble 6tre le cas de l'6nolase de levure [16], de la clostridiopeptidase enzyme bact6rienne thiol-d6pendante [171 et de la t o x i n e d i p h t ~ r i q u e p r o t 6 i n e c o n t e n a n t deux l i a i s o n s d i s u l f u r e (P. Boquet, c o m m u n i c a t i o n p e r s o n n e l l e ) . P o u r ces t r o i s prot6ines, l'63imination du p e r s u l f a t e r 6 s i d u e l dans le gel avant l ' a n a lyse 61ectrophor6tique de l ' 6 c h a n t i l l o n non r 6 d u i t ou la p o l y m 6 r i s a t i o n p a r la r i b o f i a v i n e s u p p r i m e l'h6t~rog6n6it6 observ6e dans les c o n d i t i o n s op6r a t o i r e s habituelles. Le p o i d s m o l 6 c u l a i r e de l ' a l v 6 o l y s i n e purifi6e mesur6 p a r la t e c h n i q u e d ' ~ l e c t r o p h o r 6 s e en gel de p o l y a c r y l a m i d e - S D S s'est av6r6 de l ' o r d r e de 60.000. S m y t h [181 a trouv6 p a r la m6me t e c h n i q u e des valeurs de 59'000 h 6~2000 p o u r la t o x i n e perf r i n g e n s 0. Des v a l e u r s du m6me o r d r e o n t 6t6 trouv6.es p a r d ' a u t r e s proc6d6s p o u r la s t r e p t o l y sine O [7, 19] avec toutefois une f o r m e d i m 6 r i q u e p o u r cette d e r n i 6 r e [7]. Cowell et coll. [5] o n t montr6 que la c6r6olysine (5.5000 daltons) 6tait constitu6e d ' u n e c h a l n e u n i q u e de 518 r6sidus a m i n o - a c y l c o n t e n a n t deux r~sidus d e m i - c y s t i n e . Une v a l e u r de 47000 daltons estim6e p a r filtration sur gel a 6t6 signal6e p o u r une p r 6 p a r a t i o n de t h u r i n g i o l y s i n e p u r i f i 6 e p a r r e l a r g a g e salin et 61ectrofocalisation [201. Deux formes d ' a l v 6 o l y s i n e de p o i n t iso61ectrique r e s p e c t i v e m e n t de 5,1 ( c o m p o s a n t m a j e u r ) et 7 ( c o m p o s a n t m i n e u r ) ont 6t$ d6tect6es. Une h6t6rog~n6it6 de charge s i m i l a i r e a 6t6 trouv6e p o u r la s t r e p t o l y s i n e O [7], la t o x i n e p e r f r i n g e n s 0 [18] et la t h u r i n g i o l y s i n e [2,0] avec des p I c o m p r i s entre 6 et 7,2 p o u r les diverses formes observ6es. Le p I p l u s has de l ' a l v 6 o l y s i n e est tr6s p r o c h e de celui observ6 p o u r la p n e u m o l y s i n e qui est de 4,9 p o u r une p r 6 p a r a t i o n b r u t e [2] et de 5 p o u r la t o x i n e h a u t e m e n t purifi6e (Johnson et Alouf, r6sultats publier). De n o m b r e u s e s autres t o x i n e s [4] et p r o t 6 i n e s m o n t r e n t 6galement une h6t6rog6n6it6 de c h a r g e qui a fait l'objet d ' u n e d i s c u s s i o n d6taill6e [7, 18]. II n'est p a s e n c o r e c l a i r si dans le cas de l'alv6ol y s i n e et des t o x i n e s S H - d 6 p e n d a n t e s apparent6es, cette h6t6rog6n6it6 r6sulte d ' a r t 6 f a c t s de purification (toxoidation, d6samidation.., etc) ou est due h des mol6cules (isotoxines) diff6rant p a r leur structure p r i m a i r e .

J.E. Alouf, M. Kiredjian et C. Geoffroy.

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Comme p o u r la p r 6 p a r a t i o n b r u t e [1], l'activit6 de l'alv6olysine purifi6.e est neutralis6e p a r les imlnuns6.rums a n t i s t r e p t o l y s i n e O et i n h i b 6 e p a r le cholest6rol. La f o r u l a t i o n d ' 6 p e r o n au n i v e a u des arcs d ' i m m u n o p r 6 c i p i t a t i o n de la s t r e p t o l y s i n e et de l'alv6olysine met en 6vidence u n e r6activit6 crois6e partielle entre les deux prot6ines.

Remerciements. Ce t r a v a i l a b6n6fici6 de l'aide d u Centre N a t i o n a l de la R e c h e r c h e Scientifique et de la D616gation G6n6rale h la R e c h e r c h e Scientifique et T e c h n i q u e (cont r a t N ° 74 7 0186). RI~SUMI~. L'alv6olysine toxine h6molytique thiol-d6pendante est n n e prot6ine e x t r a c e l l u l a i r e a n t i g 6 n i q u e 61abor6e p a r Bacillus alvei. La t o x i n e a 6t6 purifide p a r r e l a r g a g e p a r le s u l f a t e d ' a m m o n i u m , f i l t r a t i o n s s u r gel, f o c a l i s a t i o n iso61ect r i q u e en g r a d i e n t de pH et c h r o m a t o g r a p h i e s u r DEAE-cellulose. La prot6ine purifide, r6duite p a r les t h i o l s (forme active) est h o m o g 6 n e p a r les t e s t s i m m u n o l o g i q u e s et p a r 61ectrophor6se e n gel de p o l y a c r y l amide. Elle poss~de u n poids m o l 6 c u l a i r e de t ' o r d r e de 60.000 d a l t o n s . Deux f o r m e s m o l d e u i a i r e s de p o i n t isodlectrique 5,1 et 7,0 o n t 6t6 m i s e s en 6videnee. La t o x i n e est 16tale p o u r la s o u r i s et son activit6 l y t i q u e est inhib6e p a r le cholestdrol et p a r les i m m u n s 6 r u m s a n t i s t r e p t o l y s i n e O. U n e r6activit6 i m m u n o l o g i q u e crois6e entre l ' a l v 6 o l y s i n e et la s t r e p t o l y s i n e O est observ6e.

BIOCHIMIE, 1977, 59, n ° 3.

BIBLIOGRAPHIE. 1. B e r n h e i m e r , A. W. & Grushoff, P. (1967) J. Bacteriol., 95, 1541-1543. 2. B e r n h e i m e r , A. W. (1974) Biochim. Biophys. Acta, 344, 27-50. 3. B e r n h e i m e r , A. W. (1976) in