BIOCHIMIE, 1975, 57, 603-608.
Purification et dtude chimique d'une glycoprotdine de Collocalia. Nicole HOUDRET, Michel LHERMITTE, P i e r r e DEGAND et P h i l i p p e ROUSSEL , Unitd de R e c h e r c h e s sur la B i o c h i m i e des Protdines (U 16) de I'INSERM, Place de Verdun, 59045 Lille Cedex. (24-5-1974). Summarz!. - A glycoprotein was purified from the aqueous extract of (> H o w e et al, [11 ont obtenu une p r 6 p a r a t i o n glycop r o t 6 i q u e qui s'est r6v616e O r e h la fois un i n h i b i t e n t de l ' h ~ m a g g l u t i n a t i o n v i r a l e et un substrat p o u r la n e u r a m i n i d a s e du v i r u s .de l'!nfluenza A~, Kathan et Weeks ont 6tabli la c o m p o s i t i o n chimique d'une fraction g l y c o p r o t 6 i q u e analogue, pr6par6e p a r e x t r a c t i o n aqueuse [2~. Biddle et B.elyavin ont montr6 que la p r 6 p a r a tion, obtenue p a r e x t r a c t i o n aqueuse, 6tait h6t6rog6u e en u l t r a c e n t r i f u g a t i o n et c o m p o r t a i t trois constituants, mats lenrs essais de p u r i f i c a t i o n p a r p r 6 e i p i t a t i o n p a r le sulfate d ' a m m o n i u m , p a r f r a c t i o n n e m e n t 6thanolique ou bien p a r c h r o m a t o g r a p h i e sur c o l o n n e de p h o s p h a t e de c a l c i u m n'ont pas dt~ e n t i 6 r e m e n t f r u c t u e u x [3]. Nous avons e.ssay~ de p u r i f i e r la f r a c t i o n glycop r o t 6 i q u e m a j e u r e de l ' e x t r a i t a q u e u x de Collocalia en utilisant l'61ectrophor6se p r 6 p a r a t i v e en film liquide.
MATERJEL E T METHODt~S. MATI~lqIEL. Les e nids d ' h i r o n d e l l e s >> en p r o v e n a n c e de Hong-Kong sont f o u r n i s p a r : P r o d u i t s O r i e n t a u x (Rue Monsieur le P r i n c e , Paris, ¥°). Les n e u r a m i n i d a s e s de Clostridium perfringet~s (souche 33-4 A) et de Diplococcus p n e u m o n i a e (type I) ont ~t6 pr6par6es selon le p r o t o c o l e dbcrit p a r H o u d r e t et al. [43. Elles pr6sentent respectiA qui route correspondanee dolt ~tre adress~e.
vement une activit6 sp6cifique de 146 unit6s et de 1 200 unit6s p a r m g de prot6ines, L ' a c i d e N-ac6tyl-4-O-ac6tylneuraminique nous a ~t6 a i m a b l e m e n t donn6 p a r le D o c t e u r S c h a u e r (*). MI~THODES. 1 --- E x t r a c t i o n aqueuse des glycoprotdines de Collocalia. - - Les glycoprot6ines de Collocalia sont extraites de (< nids d ' h i r o n d e l l e s >) selon la m 6 t h o d e dbcrite p a r H o w e et al. [1] : 65 g de (< nids d ' h i r o n d e l l e s )> r6duits en p o u d r e dans un m o r t i e r sont mis en suspension dans l ' e a u h la c o n c e n t r a t i o n finale de 3 p. 100. La suspension est plac6e 5 60"C p e n d a n t 3 heures, puts elle est raise sons agilation p e n d a n t u n e nuit h 4°C. Apr~s c e n t r i f u g a t i o n , le s u r n a g e a n t est dialys6 c o n t r e de l'eau distill~e p e n d a n t 3 jours 'A 4°C. Le culot est soumis h deux nouvelles extractions. Les surnageants sont rassembl~s, dialys6s c o n t r e de l'eau distill6e et lyophilis~s. On obtient 2 g de glycoprot6ines de Co!localia. 2 - - Eleclrophor~se en [ihn liquide. - - La pr6p a r a t i o n est alors soumise h un f r a c t i o n n e m e n t p a r ~lectrophor6se p r e p a r a t i v e h haut voltage en film l i q u i d e dans l ' a p p a r e i l Elphor-Vap h 4°C. On utilise un t a m p o n Tris 0,8 M - a c i d e c i t r i q u e 0,00.8 M de pH 8,6 p o u r la c h a m b r e d'~leetrophorbse. Une diffdrence de p o t e n t i e l de 1900 V avec une intensit6 de 160 lnA assure un f r a c t i o n n e m e n t satisfaisant, L'~chantillon, c o n t e n a n t 60 mg de (') (Ruhr - - Universit~t, Boehum, Institiit fiir physiologische Chemie, Lehrstuh 463 Bochum-Querenburg, Buseheystr., Postfaeh 2148 - - Germany).
604
N. Hottdret,
M. Lhermitte,
glycoprot6ine de C o l l o c a l i a ~ la c o n c e n t r a t i o n de 10 m g / m l , est inject6 h n n e vitesse de 2 m l / h e u r e . On recueille 48 fractions dont on mesure l'abs o r p t i o n h 278 n m ainsi que la t e n e u r en oses combin6s grace h la m O h o d e automatique h ]'orcinol sulfurique [5] et la t e n e u r en acides u r o n i q u e s grhce 5 la m6thode au carbazol [6]. 3 - - E h ~ d e d l e c t r o p h o r d t i q u e e n agarose. - - Les fractions obtenues sont 6tudi6es p a r 61ectrophor6se en agarose en t a m p o n vdronal-H,Cl de p H 8,2 et de force i o n i q u e 0,1. Les lames sont color6es p a r l ' A m i d o s c h a r w z , p a r Ie r6actif de Schiff apr6s oxydation p e r i o d i q u e et p a r le bleu de t o l u i d i n e [7]. 4U H r a c e n t r i f n g a t i o n . - - La constante de s 6 d i m e n t a t i o n a 6t6 d6termin6e p a r la m6thode Schlieren h I'aide d ' u n e ulfracenfpifugeuse Spinco mod6le E dans u n t a m p o n ac6tate de sodium 0,02 M de pH 7,0 c o n t e n a n t du chlorure de sodium 0,1 M. 5 - - C o m p o s i t i o n e n a c i d e s a m i n e s . - - La glycoprot6ine de C o l l o e a l i a est soumise h u n e h y d r o lyse en tube scell6 sous vide p a r l'acide chlorhydrique 5,6 N ~ 110°C, p e n d a n t 8, 24, 48 et 72 heures. Apr6s 61imination de l ' a c i d e c h l o r h y d r i q u e p a r l y o p h i l i s a t i o n , la composition en acides amin6s est d6termin6e selon la m6thode de Degand e l al. [8]. 6 - - C o m p o s i t i o n e n oses. - - L'aeide sialique est dos& par la m6thode colorim6trique h l'acide 2 - t h i o b a r b i t u r i q u e de W a r r e n [9] et les groupements ac6tyl-ester p a r la r6action ~ l ' h y d r o x y l a m i n e d'Hestrin [10].
La c o m p o s i t i o n en glucides est d6termin6e apr6s m6thanolyse de la glycoprot6ine p a r le m6thanol.HC1 0,5 N p e n d a n t 16 heures h 65°C p a r c h r o m a t o g r a p h i e des d6riv6s tr,im6thylsilyl6s selon u n e 16g6re modification [11] du protocoIe d6crit p a r R e i n h o l d [12]. 7D o s a g e d e s g r o u p e m e n t s s u l f a t e . - - Le dosage des groupements sulfate lib4r6s p a r h y d r o lyse p a r l'acidc c h l o r b y d r i q u e N p e n d a n t 5 heures •~ l l 0 ° C , en tube scell6 sous vide, est r6alis6 scion la t e c h n i q u e pr6conisde p a r Dod@on et Price
D3]. 8 --- I d e n t i f i c a t i o n
des
acides
sialiques.
--
a) I s o I e m e n t d e l ' a c i d e s i a l i q u e : la glycoprot6ine de C o l l o c a l i a en solution dans u n t a m p o n ac6tate de s o d i u m 0,1 M de p H 5,5 h la c o n c e n t r a t i o n de 5 m g / m l est hydrolys6e p e n d a n t 24 heures ~ 37°C p a r la n e u r a m i n i d a s e de C l o s t r i d i u m p e r f r i n g e n s (souche 33-4 A) avec u n r a p p o r t e n z y m e / s u b s t r a t de 7 unit6s d ' e n z y m e p o u r 1 0 0 ~ g d'ac~de sialique BIOCHIMIE, 1975, 57, n ° 5.
P. Degand
et P. Roussel.
coinbin6 [4]. D ' a n t r e part, la g l y c o p r o t 6 i n e de C o l l o c a l i a est hydrolys6e p e n d a n t u n e h e u r e "h 70°C p a r l'acide formique & pH 2,0 scion les conditions d6crites p a r Casal - Stenzel el al. [141. Puts les hydrolysats sont soumis h une chromatographic de tamisage mol6culaire sur u n e c o l o n n e (160 × 2 cm) de Sephadex G 1:5 dans l'eau distil16e ; la glycoprot6ine d6sialyl6e est exclue du gel et l'acide sialique, localis6 p a r la m6thode an r6.sorcinol c h l o r h y d r i q u e de S v e n n e r h o l m [15] est 61u6 plus tardivement. L ' a e i d e sialique est ensuite purifi6 p a r passage sur une colonne (28 X 1 cm) de r6sine Bio-Rad AG 2 × 8 ( 100200). L'61ution est r6alis6e p a r u n gradient lin6aire en acide f o r m i q u e de 0 ~ 2 N obtenu h l'aide de 100 ml d'acide formique 2 N et de 100 ml d'eau distil]6e plac6e dans la c h a m b r e de m61ange. b) C h r o m a t o g r a p h i c s u r p a p i e r : l'acide sialique purifi6 est identifi6 p a r c h r o m a t o g r a p h i c sur p a p i e r W h a t m a n n ° 1 dans le syst6me s o N a n t de S v e n n e r h o h n [16] : n - b u t a n o l - p r o p a n o l - acide c h l o r b y d r i q u e 0,1 N (1/2/1). Aprbs u n d6veloppem e n t de 18 heures, la r6v6]ation est rbalis6e p a r p u l v 6 r i s a t i o n d ' o r c i n o l trichlorac&tique [17]. c) C h r o m a t o g r a p h i c s u r c o u c h e m i n c e : l'acide sialique purifi6 est identifi6 6galement p a r chrom a t o g r a p h i c s u r plaques de gel de silice DC (Merck) dans le syst~me solvant de Granzer [18] : p r o p a n o l - e a u (7/3). Apr6s u n d6veloppement d ' u n e heure, la r6v61ation est r6alis6e p a r p u l v 6 r i s a t i o n d ' a n i s a l d e h y d e [19]. d) C h r o m a t o g r a l ) h i e e n p h a s e g a z e u s e : L'acide sialique de la glycoprot6ine de C o l l o e a l i a est idenrift6 aprbs silylation selon ]e protocole de CasalStenzel el at. [14]. RESUL,TATS. Purification
de
la g l y c o p r o t ~ i n e
majeure
de
Collocalia. - - La glycoprot6ine de C o l l o c a l i a extraite de > p e r m e t d ' o b t e n i r n o t a m m e n t une f r a c t i o n g l y e o p r o t 6 i q u e qui est homog6ne en 61ectrophor6se en agarose h p H 8,2 apr6s r6v61ation p a r l ' A m i d o s c h w a r z , le r6actif de Schiff apr6s o x y d a t i o n p e r i o d i q u e ou le bleu de to!uidine. En u l f r a e e n t r i f u g a t i o n , eette fraefion se pr~sente sous la f o r m e d'un p i e 16.g6rem e n t 6ta16 dont la eonstante de s 6 d i m e n t a t i o n S~o W est de 3,0. Cette v a l e u r ne c o r r e s p o n d aucun des trois eonstituants trouv6s p a r Biddle et Belyavin [3! dans l ' e x t r a i t aqueux de
Purification et dtude chimique d'une glycoprotdine de Collocalia. Nicole HOUDRET, Michel LHERMITTE, P i e r r e DEGAND et P h i l i p p e ROUSSEL , Unitd de R e c h e r c h e s sur la B i o c h i m i e des Protdines (U 16) de I'INSERM, Place de Verdun, 59045 Lille Cedex. (24-5-1974). Summarz!. - A glycoprotein was purified from the aqueous extract of (> H o w e et al, [11 ont obtenu une p r 6 p a r a t i o n glycop r o t 6 i q u e qui s'est r6v616e O r e h la fois un i n h i b i t e n t de l ' h ~ m a g g l u t i n a t i o n v i r a l e et un substrat p o u r la n e u r a m i n i d a s e du v i r u s .de l'!nfluenza A~, Kathan et Weeks ont 6tabli la c o m p o s i t i o n chimique d'une fraction g l y c o p r o t 6 i q u e analogue, pr6par6e p a r e x t r a c t i o n aqueuse [2~. Biddle et B.elyavin ont montr6 que la p r 6 p a r a tion, obtenue p a r e x t r a c t i o n aqueuse, 6tait h6t6rog6u e en u l t r a c e n t r i f u g a t i o n et c o m p o r t a i t trois constituants, mats lenrs essais de p u r i f i c a t i o n p a r p r 6 e i p i t a t i o n p a r le sulfate d ' a m m o n i u m , p a r f r a c t i o n n e m e n t 6thanolique ou bien p a r c h r o m a t o g r a p h i e sur c o l o n n e de p h o s p h a t e de c a l c i u m n'ont pas dt~ e n t i 6 r e m e n t f r u c t u e u x [3]. Nous avons e.ssay~ de p u r i f i e r la f r a c t i o n glycop r o t 6 i q u e m a j e u r e de l ' e x t r a i t a q u e u x de Collocalia en utilisant l'61ectrophor6se p r 6 p a r a t i v e en film liquide.
MATERJEL E T METHODt~S. MATI~lqIEL. Les e nids d ' h i r o n d e l l e s >> en p r o v e n a n c e de Hong-Kong sont f o u r n i s p a r : P r o d u i t s O r i e n t a u x (Rue Monsieur le P r i n c e , Paris, ¥°). Les n e u r a m i n i d a s e s de Clostridium perfringet~s (souche 33-4 A) et de Diplococcus p n e u m o n i a e (type I) ont ~t6 pr6par6es selon le p r o t o c o l e dbcrit p a r H o u d r e t et al. [43. Elles pr6sentent respectiA qui route correspondanee dolt ~tre adress~e.
vement une activit6 sp6cifique de 146 unit6s et de 1 200 unit6s p a r m g de prot6ines, L ' a c i d e N-ac6tyl-4-O-ac6tylneuraminique nous a ~t6 a i m a b l e m e n t donn6 p a r le D o c t e u r S c h a u e r (*). MI~THODES. 1 --- E x t r a c t i o n aqueuse des glycoprotdines de Collocalia. - - Les glycoprot6ines de Collocalia sont extraites de (< nids d ' h i r o n d e l l e s >) selon la m 6 t h o d e dbcrite p a r H o w e et al. [1] : 65 g de (< nids d ' h i r o n d e l l e s )> r6duits en p o u d r e dans un m o r t i e r sont mis en suspension dans l ' e a u h la c o n c e n t r a t i o n finale de 3 p. 100. La suspension est plac6e 5 60"C p e n d a n t 3 heures, puts elle est raise sons agilation p e n d a n t u n e nuit h 4°C. Apr~s c e n t r i f u g a t i o n , le s u r n a g e a n t est dialys6 c o n t r e de l'eau distill~e p e n d a n t 3 jours 'A 4°C. Le culot est soumis h deux nouvelles extractions. Les surnageants sont rassembl~s, dialys6s c o n t r e de l'eau distill6e et lyophilis~s. On obtient 2 g de glycoprot6ines de Co!localia. 2 - - Eleclrophor~se en [ihn liquide. - - La pr6p a r a t i o n est alors soumise h un f r a c t i o n n e m e n t p a r ~lectrophor6se p r e p a r a t i v e h haut voltage en film l i q u i d e dans l ' a p p a r e i l Elphor-Vap h 4°C. On utilise un t a m p o n Tris 0,8 M - a c i d e c i t r i q u e 0,00.8 M de pH 8,6 p o u r la c h a m b r e d'~leetrophorbse. Une diffdrence de p o t e n t i e l de 1900 V avec une intensit6 de 160 lnA assure un f r a c t i o n n e m e n t satisfaisant, L'~chantillon, c o n t e n a n t 60 mg de (') (Ruhr - - Universit~t, Boehum, Institiit fiir physiologische Chemie, Lehrstuh 463 Bochum-Querenburg, Buseheystr., Postfaeh 2148 - - Germany).
604
N. Hottdret,
M. Lhermitte,
glycoprot6ine de C o l l o c a l i a ~ la c o n c e n t r a t i o n de 10 m g / m l , est inject6 h n n e vitesse de 2 m l / h e u r e . On recueille 48 fractions dont on mesure l'abs o r p t i o n h 278 n m ainsi que la t e n e u r en oses combin6s grace h la m O h o d e automatique h ]'orcinol sulfurique [5] et la t e n e u r en acides u r o n i q u e s grhce 5 la m6thode au carbazol [6]. 3 - - E h ~ d e d l e c t r o p h o r d t i q u e e n agarose. - - Les fractions obtenues sont 6tudi6es p a r 61ectrophor6se en agarose en t a m p o n vdronal-H,Cl de p H 8,2 et de force i o n i q u e 0,1. Les lames sont color6es p a r l ' A m i d o s c h a r w z , p a r Ie r6actif de Schiff apr6s oxydation p e r i o d i q u e et p a r le bleu de t o l u i d i n e [7]. 4U H r a c e n t r i f n g a t i o n . - - La constante de s 6 d i m e n t a t i o n a 6t6 d6termin6e p a r la m6thode Schlieren h I'aide d ' u n e ulfracenfpifugeuse Spinco mod6le E dans u n t a m p o n ac6tate de sodium 0,02 M de pH 7,0 c o n t e n a n t du chlorure de sodium 0,1 M. 5 - - C o m p o s i t i o n e n a c i d e s a m i n e s . - - La glycoprot6ine de C o l l o e a l i a est soumise h u n e h y d r o lyse en tube scell6 sous vide p a r l'acide chlorhydrique 5,6 N ~ 110°C, p e n d a n t 8, 24, 48 et 72 heures. Apr6s 61imination de l ' a c i d e c h l o r h y d r i q u e p a r l y o p h i l i s a t i o n , la composition en acides amin6s est d6termin6e selon la m6thode de Degand e l al. [8]. 6 - - C o m p o s i t i o n e n oses. - - L'aeide sialique est dos& par la m6thode colorim6trique h l'acide 2 - t h i o b a r b i t u r i q u e de W a r r e n [9] et les groupements ac6tyl-ester p a r la r6action ~ l ' h y d r o x y l a m i n e d'Hestrin [10].
La c o m p o s i t i o n en glucides est d6termin6e apr6s m6thanolyse de la glycoprot6ine p a r le m6thanol.HC1 0,5 N p e n d a n t 16 heures h 65°C p a r c h r o m a t o g r a p h i e des d6riv6s tr,im6thylsilyl6s selon u n e 16g6re modification [11] du protocoIe d6crit p a r R e i n h o l d [12]. 7D o s a g e d e s g r o u p e m e n t s s u l f a t e . - - Le dosage des groupements sulfate lib4r6s p a r h y d r o lyse p a r l'acidc c h l o r b y d r i q u e N p e n d a n t 5 heures •~ l l 0 ° C , en tube scell6 sous vide, est r6alis6 scion la t e c h n i q u e pr6conisde p a r Dod@on et Price
D3]. 8 --- I d e n t i f i c a t i o n
des
acides
sialiques.
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a) I s o I e m e n t d e l ' a c i d e s i a l i q u e : la glycoprot6ine de C o l l o c a l i a en solution dans u n t a m p o n ac6tate de s o d i u m 0,1 M de p H 5,5 h la c o n c e n t r a t i o n de 5 m g / m l est hydrolys6e p e n d a n t 24 heures ~ 37°C p a r la n e u r a m i n i d a s e de C l o s t r i d i u m p e r f r i n g e n s (souche 33-4 A) avec u n r a p p o r t e n z y m e / s u b s t r a t de 7 unit6s d ' e n z y m e p o u r 1 0 0 ~ g d'ac~de sialique BIOCHIMIE, 1975, 57, n ° 5.
P. Degand
et P. Roussel.
coinbin6 [4]. D ' a n t r e part, la g l y c o p r o t 6 i n e de C o l l o c a l i a est hydrolys6e p e n d a n t u n e h e u r e "h 70°C p a r l'acide formique & pH 2,0 scion les conditions d6crites p a r Casal - Stenzel el al. [141. Puts les hydrolysats sont soumis h une chromatographic de tamisage mol6culaire sur u n e c o l o n n e (160 × 2 cm) de Sephadex G 1:5 dans l'eau distil16e ; la glycoprot6ine d6sialyl6e est exclue du gel et l'acide sialique, localis6 p a r la m6thode an r6.sorcinol c h l o r h y d r i q u e de S v e n n e r h o l m [15] est 61u6 plus tardivement. L ' a e i d e sialique est ensuite purifi6 p a r passage sur une colonne (28 X 1 cm) de r6sine Bio-Rad AG 2 × 8 ( 100200). L'61ution est r6alis6e p a r u n gradient lin6aire en acide f o r m i q u e de 0 ~ 2 N obtenu h l'aide de 100 ml d'acide formique 2 N et de 100 ml d'eau distil]6e plac6e dans la c h a m b r e de m61ange. b) C h r o m a t o g r a p h i c s u r p a p i e r : l'acide sialique purifi6 est identifi6 p a r c h r o m a t o g r a p h i c sur p a p i e r W h a t m a n n ° 1 dans le syst6me s o N a n t de S v e n n e r h o h n [16] : n - b u t a n o l - p r o p a n o l - acide c h l o r b y d r i q u e 0,1 N (1/2/1). Aprbs u n d6veloppem e n t de 18 heures, la r6v6]ation est rbalis6e p a r p u l v 6 r i s a t i o n d ' o r c i n o l trichlorac&tique [17]. c) C h r o m a t o g r a p h i c s u r c o u c h e m i n c e : l'acide sialique purifi6 est identifi6 6galement p a r chrom a t o g r a p h i c s u r plaques de gel de silice DC (Merck) dans le syst~me solvant de Granzer [18] : p r o p a n o l - e a u (7/3). Apr6s u n d6veloppement d ' u n e heure, la r6v61ation est r6alis6e p a r p u l v 6 r i s a t i o n d ' a n i s a l d e h y d e [19]. d) C h r o m a t o g r a l ) h i e e n p h a s e g a z e u s e : L'acide sialique de la glycoprot6ine de C o l l o e a l i a est idenrift6 aprbs silylation selon ]e protocole de CasalStenzel el at. [14]. RESUL,TATS. Purification
de
la g l y c o p r o t ~ i n e
majeure
de
Collocalia. - - La glycoprot6ine de C o l l o c a l i a extraite de > p e r m e t d ' o b t e n i r n o t a m m e n t une f r a c t i o n g l y e o p r o t 6 i q u e qui est homog6ne en 61ectrophor6se en agarose h p H 8,2 apr6s r6v61ation p a r l ' A m i d o s c h w a r z , le r6actif de Schiff apr6s o x y d a t i o n p e r i o d i q u e ou le bleu de to!uidine. En u l f r a e e n t r i f u g a t i o n , eette fraefion se pr~sente sous la f o r m e d'un p i e 16.g6rem e n t 6ta16 dont la eonstante de s 6 d i m e n t a t i o n S~o W est de 3,0. Cette v a l e u r ne c o r r e s p o n d aucun des trois eonstituants trouv6s p a r Biddle et Belyavin [3! dans l ' e x t r a i t aqueux de
