Klinische Wochenschrift

Klin. Wschr. 55, 877-880 (1977)

© by Springer-Verlag 1977

Zur Bindung von Steroidhormonen an Serumproteine Ulrich Westphal* Department of Biochemistry, University of Louisville School of Medicine, Louisville, Kentucky, USA

Vor mehr als 60 Jahren stellte der 25jfihrige Ernst Oppenheimer im Pharmakologischen Institut der Universitfit Freiburg i.Br. Versuche an, die zum ersten Male die reversible Bindung yon Steroiden an Eiweil3stoffe aufzeigten [1]. In Untersuchungen fiber die Eigenschaften herzwirksamer Digitalisk6rper beobachtete er am isolierten Froschherzprfiparat eine Abnahme der Toxizitfit, wenn er den Digitalisl6sungen Serum zusetzte. Oppenheimer interpretierte dies Resultat als eine ,,Adsorption" der toxischen Steroidsubstanzen an die Serumkolloide, die eine Herabsetzung der Giftigkeit bewirkte, da das gebundene Steroid inaktiv war. Er erkannte weiterhin, dab die Assoziation yon Digitalissteroiden und Serumprotein reversibel war, sodal3 der Wirkstoff dissoziieren und yon den Herzzellen als Erfolgsorgan aufgenommen werden konnte. Er konzipierte den Vorgang als ein Bindungsgleichgewicht (,,Adsorptionsgleichgewicht") physikalisch-chemischer Natur, in dem der Digitalisstoff zwischen den Serumkolloiden (als ,,Giftvehikel") und den Herzzellen verteilt war. Diese bemerkenswerten fundamentalen Ergebnisse waren ihrer Zeit voraus; sie fanden keinen Widerhall in der wissenschaftlichen Welt und wurden bald vergessen. Erst Ende der zwanziger Jahre wurde das Problem wieder aufgegriffen, als H. Bennhold die systematische Bearbeitung der Bindung verschiedenartiger niedrigmolekularer Stoffe an die Eiweil3k6rper des Blutserums begann, wobei er die Transportfunktion (,,Vehikelfunktion °') in den Vordergrund stellte [2]. Das Verdienst des ersten Nachweises einer Proteinbindung der Steroidhormone gebfihrt B. Brunetli [3], der in Dialyseversuchen die Bindung von Ostron an Plasmaproteine beobachtete. Wiederum verging eine Reihe von Jahren bis F. Bischoff und seine Mitarbeiter [4] und sp/iter die Arbeitsgruppe * Herrn Dr. phil. Drs. reed. h.c. Heinz G6tze zum 65. Geburtstag gewidmet

von L.T. Samuels [5] ihre Untersuchungen der Proteinbindung der Steroidhormone verSffentlichten ; als Methoden dienten L6slichkeitsbestimmung, Analyse der L6sungsmittelverteilung und Gleichgewichtsdialyse. In all diesen fr/ihen Arbeiten ist das Bestreben erkennbar, die Eiweil3bindung der Steroidhormone in Beziehung zu setzen zu dem Schicksal dieser Wirkstoffe im lebenden Organismus, ihrem Transportverhalten, ihrer Verteilung, und ihrer metabolischen Umwandlung und Ausscheidung. In den Jahrzehnten, die seit den grundlegenden Ergebnissen vergangen sind, hat die Erforschung der reversiblen Bindung der Steroidhormone an Proteine eine starke Ausweitung erfahren [6]. Weitaus die meisten Ergebnisse sind mit den Eiweil3k6rpern des Blutserums von Mensch und anderen Species erhalten worden; die Rezeptorproteine der Erfolgsorgane, von fundamentaler Bedeutung ftir den Wirkungsmechanismus der Hormone, sind bisher nicht in gentigender Menge und dem erforderlichen Reinheitsgrad ffir grfindliche physikalisch-chemische Charakterisierung zug/inglich geworden. Die vorliegende Arbeit soll neben einigen allgemeinen Bemerkungen fiber die Steroid-bindenden Serumproteine einige neuere Beobachtungen tiber die Kinetik der Steroid-ProteinWechselwirkung darstellen, die in unserem Laboratorium gemacht wurden. In Tabelle 1 sind die ffir die Steroidbindung wichtigsten Serumproteine des Menschen und ein wegen seiner besonderen Eigenschaften viel untersuchtes Meerschweinchenprotein zusammengestellt. Mit der Ausnahme des Albumins (HSA) sind diese Eiweit3k6rper Glykoproteine, mit Kohlenhydratgehalten bis zu mehr als 70%. Eine Inversionsbeziehung besteht zwischen der Konzentration der Proteine im Serum und ihrer Affinit~it ffir bestimmte Steroidhormone. So ist beispielsweise die Assoziationskonstante des CBG ftir Progesteron bei 37 ° etwa 500mal gr6f3er als die des HSA, die molare Konzentration des Albumins ist je-

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U. Westphal: Zur Bindungvon Steroidhormonenan Sermnproteine

Tabelle 1. Steroid-bindendeProteine im Humanserum Proteina

Molekulargewicht

Kohlen- Konz. Ste- Assoziationshydrat (gM) roidu konstante (%) gM 1

HSA AAG CBG

69 000 4I 000 52 000

0 42 26

TeBG

94 000

32

PBGc

88 000

71

550 18 0,7

P P P C 0,04 T 0

I3

P

4°

37°

0,36 1,5 700 520 i100 600

0,18 0,6 90 24 350 220

2200

350

HSA, menschliches Serumalbumin; AAG, cq-saures Glykoprotein oder Orosomucoid; CBG, Corticosteroid-bindendesGlobulin; TeBG, Testosteron-0stradiol-bindendes Globulin; PBG, Progesteron-bindendes Globulin b Bindungan P, Progesteron; C, Cortisol; T, Testosteron; O, 0stradiol Aus Serum des trfichtigenMeerschweinchens

doch ungeffihr 800mal h6her als die des CBG. Dies ist der Grund, warum der Prozentsatz albumingebundener Steroidhormone betrfichtlich sein kann [7], eine Tatsache die oft unbeachtet bteibt. Die Steroidhormone sind biologisch inaktiv solange sie an EiweiB gebunden sin& Sie werden unmittelbar aktiv, wenn sie durch Dissoziation freigesetzt werden. Auf diese Weise ist es dem Organismus m6glich, eine relativ groBe Menge an Steroidhormon in inaktiver Form im Blutstrom kreisen zu lassen und den Wirkstoff jederzeit durch Dissoziation am Erfolgsorgan verffigbar zu machen. Die allgemeinen Eigenschaften der SteroidProtein-Komplexe in ihrer Bedeutung fiir hormonate Wirkung sind an anderer Stelle ausfiihrlich diskutiert worden [8]. Wenig Beachtung hat bisher eine Funktion der Steroid-bindenden Serumproteine gefunden, die der Erleichterung des Durchgangs des neu synthetisierten Hormons durch Zellwand oder Blutkapillare dient. Diese Funktion wurde vor mehreren Jahren postutiert [9] auf Grund yon Modellversuchen der Dialyse von Corticosteroiden in Gegenwart und Abwesenheit yon bindenden Proteinen in der AuBenfliissigkeit [10]. Neuere Versuche haben die Existenz einer solchen Funktion best~itigt [11]: Perfusion yon Kaninchenhoden in vitro zeigte, dab der Testosterongehalt im ven6sen AusfluB etwa viermal so hoch war wenn der eiweiBfreien Perfusionsfliissigkeit 3% Rinderserumalbumin zugesetzt wurde. Dieses Ergebnis wurde in dem Sinne gedeutet, dab das bindende Protein die Passage des Steroidhormons durch die Kapillarwand erleichtert.

Von den Steroid-bindenden Glykoproteinen des Serums hat das Orosomucoid, AAG, eine besondere Rolle gespielt. Es kann ohne viel Mfihe in relativ grol3er Menge rein erhalten werden und stellt eine wertvotle Modellsubstanz dar, mit der die chemische Natur der Steroidbindungsstelle [12] und andere Probleme der Assoziation zwischen Steroiden und Proteinen untersucht werden k6nnen [13]. Die tibrigen in Tabelle 1 angefiihrten Glykoproteine sind anffinglich mit konventionellen Methoden, meist chromatographischer Natur, dargestellt worden. Mit der Entwicklung der Affinit/itschromatographie wurde eine Methode geschaffen, die in relativ wenigen Stufen eine spezifische Reindarstellung dieser stark bindenden Glykoproteine erm6glicht [14, 15]. Die Bestimmung der Affinitfitskonstanten, K,, der Steroid-Protein-Komplexe (Tabelle 1) wird meistens mit der Gleichgewichtsdialyse durchgeffihrt, die zuverl/issige und theoretisch wohl begrfindete Werte liefert. Diese Methode ist aber zeitraubend, ben6tigt radiomarkierte Steroide, und setzt die zum Teil empfindlichen Stoffe lange Zeit der Bestimmungstemperatur aus. Eine willkommene Vereinfachung brachte S.D. Stroupe's Beobachtung, dab die starke Fluoreszenz des PBG durch Bindung von einem Mol Progesteron zu mehr als 80% gel6scht wird [16]. Durch titrimetrische Bestimmung des Endpunktes der Fluoreszenzl6schung 1/il3t sich in einfacher Weise die Konzentration der Bindungsstellen und die Affinit/itskonstante bestinamen (s. Abb. 3 in [16]). Die Fluoreszenzl6schung beruht auf einer Absorption der Emissionsenergie durch die chromophore A43-Ketogruppe des gebundenen Steroidhormons. Da die Bindung reversibel ist, kann das A4-3-Ketosteroid durch ein anderes bindendes Steroid verdr~ingt werden. Wenn dies verdr~ingende Steroid keine entsprechende Licht-absorbierende Gruppe in seinem Molekill besitzt, wird die Fluoreszenzl6schung rtickg/ingig gemacht, und die ursprtingliche starke Fluoreszenz des bindenden Proteins praktisch v611ig wiederhergestellt (s. Abb. 7 in [16]). Da die Geschwindigkeit dieser Wiederherstellung der Fluoreszenz durch die Dissoziation des Steroid-Protein-Komplexes gegeben ist, tfd3t sich mit dieser Methode die Dissoziationsgeschwindigkeit ( k - i ) des Komplexes bestimmen [17]. Die Abnahme der Fluoreszenz bei der Bindung des Steroids an das Protein gibt in entsprechender Weise ein direktes Mag fiir die Assoziationsgeschwindigkeit (kl) des Komplexes. Stopped-flow Methodik ist erforderlich, um die hohen Geschwindigkeiten zu registrieren und auszuwerten. Tabelle 2 zeigt die kinetischen Daten fiir den PBG-Progesteron-Komplex bei verschiedenen Temperaturen, einschliel31ich der kinetischen Affinit/itskonstanten k l / k - 1 , und zum Vergleich die Affinitfitskonstanten, Ka, die durch Gleich-

U. Westphal: Zur Bindung yon Steroidhormonen an Serumproteine Tabelle2. Assoziationskonstanten des PBG-Progesteron plexes von kinetischen u n d Gleichgewichtsdaten [17]

Kom-

Temp.

kI

k_l

k,/k_l

K~ ~

(°C)

M - 1 s - l x l O -v

s-I

M - ~ x 10 -9

M - l x l O -9

4 14 23 37 45

2,2 4,3 7,4 16,2 24,6

0,0095 u 0,031 0,083 0,39 1,05

2,4 1,4 0,89 0,41 0,23

2,2 1,4 1,0 0,35 0,22

Gleichgewichtsdialyse b Unabh/ingige B e s t i m m u n g durch Radiosteroidverdr~ingung mit Hitfe der Gelfiltration ergab 0,011 s -

Tabelle 3. Assoziations- u n d Dissoziationsgeschwindigkeitskonstanten yon P B G - K o m p l e x e n mit Steroiden bei 20 ° [17] Steroid

kl

k_ 1

kl/k

M - I s -1

s -~

M -1

x l 0 -v Progesteron Deoxycorticosteron Corticosteron Cortisol Testosteron Testosteronacetate Medrogeston f

8,8 8,3 5~ 5° 7,8 9,3 8,5

xl0 0,060 0,12 1,4 90 ~ 0,43 0,15 0,024

14,5 6,7 0,4 ° -,~ 1,8 6,1 35,3

1

Ko M

s

i

xl0-S 20"' b 10a 0,2 a 0,02 ~ 2,9 a 9,2 d 45,5 d

Stroupe et aI. [16] ~' Extrapolation der Gleichgewichtsdiatysewerte in Tabelle 2 ergibt K a = l l × l0 s M -1 bei 20 ° ° Dieser Wert ist weniger genau als die K o n s t a n t e n ffir die andeten Steroide da die Reaktion unter den Versuchsbedingungen nicht beendet war a Bestimmt durch FtuoreszenzlSschung bei 23 °. Unver6ffentlichte Ergebnisse mit A.T. Blanford and W.L. W i t t m a n Die Cortisoldissoziation war im Gegensatz zu den anderen Steroiden zweiphasisch; eine langsamere Reaktion (1---2 s -1) trug etwa die Hfilfte zur Fluoreszenzerh6hung bei r 6, 16c~-Dimethyl-4,6-pregnadien-3,20-dion

gewichtsdialyse erhalten wurden [17]. Die gute 15bereinstimmung dieser nach verschiedenen Prinzipien erhattenen Konstanten zeigt die Gfittigkeit der Methodik. Ein Vergleich der kinetischen Daten bei den verschiedenen Temperaturen 1/il3t erkennen, dab die Abnahme der Affinit/it bei h6herer Temperatur durch eine relativ gr613ere Zunahme der Dissoziationsgeschwindigkeit bedingt ist; w/ihrend kl zwischen 4 ° und 45 ° etwa um das 10-fache ansteigt, ist k-1 bei 45 ° ungeffihr 100mal gr613er als bei 4% Der dominierende EinfluB der Dissoziationsgeschwindigkeit zeigt sich auch beim Vergleich der PBG-Komplexe mit verschiedenartigen Steroiden (Tabelle 3). Die kl-Werte sind alle v o n d e r gleichen Gr6Benordhung, aber die Dissoziationsgeschwindigkeiten sind bis zum 1000fachen verschieden [17]. Die k_ l-Werte

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folgen hierbei der Polarit/itsregel indem sie bei den Steroiden mit der gr6Bten Zahl polarer Gruppen am gr6gten sind, sodaB die Bindungsaffinit/it am geringsten ist. Welche physiologische Bedeutung k6nnen wir den Assoziations- und Dissoziationsgeschwindigkeiten der Steroidhormon-Protein-Komplexe beimessen? Die Geschwindigkeit der Dissoziation bestimmt offenbar die Verf/.igbarkeit des freien Hormons am Erfolgsorgan. Demgegenfiber erffillt die Bindung der Steroidhormone an die intrazellulfiren Rezeptorproteine eine andere Funktion: das Hormon bleibt an den Rezeptor gebunden wfihrend Konformations/inderungen und Transport in den Zellkern stattfinden k6nnen. Es ist daher yon Interesse, in welchem Mage Geschwindigkeit der Assoziation und der Dissoziation an der Stabilitfit der verschiedenen Typen der Steroid-Protein-Komplexe beteiligt sind. Tabelle 4 zeigt die Geschwindigkeitskonstanten f/Jr Steroidkomplexe mit drei hochaktiven Serumproteinen und mit verschiedenen Zytosolrezeptoren yon Huhn und Ratte. Der Unterschied ist auffaltend: alle Serumproteine haben etwa 6-400real h6here Dissoziationsgeschwindigkeiten als die Rezeptorproteine. Diese Verschiedenheiten in der Kinetik stehen in {)bereinstimmung mit der physiologischen Funktion. Der Progesteron-PBG-Komplex des trS.chtigen Meerschweinchens, zum Beispiel, hat bei 37 ° eine Halbwertszeit der Assoziation yon 0,36 ms, und der Dissoziation yon 1,8 s [17]. Die entsprechenden Werte ffir den Cortisol-CBG-Komplex sind 44 ms und 1,1 s. Wenn man die Rezeptorproteine zum Vergleich heranzieht so sieht man, dab die Dissoziationsgeschwindigkeiten ihrer Steroidkomplexe viel geringer als die der Serumproteine sind: ihre Halbwertszeit bei 0-4 ° ist gr6Benordnungsm/iBig 10 Std; die Halbwertszeit der Dissoziation des Dexamethasonkomplexes mit dem Rattenleberrezeptor bei 37 ° ist etwa 13 min. Die relativ langsame Dissoziation der. Cytosol-Rezeptor-Komplexe ist in 15bereinstimmung mit ihrer postulierten Rolle im Wirkungsmechanismus der Steroidhormone. Das Hormon bleibt eine genfigend lange Zeit am Rezeptorprotein gebunden, sodal3 die Folgereaktionen statthaben k6nnen, die zur eigentlichen Hormonwirkung fiihren. Im Gegensatz dazu ist die Aufgabe der Transportproteine im Serum eine andere: schnelle Dissoziation des Komplexes am Erfolgsorgan ist erforderlich, um das ungebundene Steroidhormon unverzfiglich zur Verffigung zu haben. Zur gleichen Zeit mug die Assoziationsgeschwindigkeit und die resultierende BindungsaffinitS.t grog sein zur Versicherung, dab der Hauptanteit des zirkulierenden Hormons in gebundener Form vorhanden ist, zum Schutz des Organismus gegen fibermfiBige Hormonwirkung, und gleichermagen des Steroidhormons

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U. Westphat: Zur Bindung von Steroidhormonen an Serumproteine

Tabelle 4. Assoziations- und Dissoziationsgeschwindigkeitskonstanten ftir Steroid-bindende Proteine bei 0-4 ° Protein

Steroid ~

lq

k_ 1

M-ts-lxl0 PBG, Meerschweinchen CBG, Mensch CBG, Mensch CBG, Mensch CBG, Ratte TeBG, Mensch TeBG, Mensch TeBG, Kaninchen Huhnoviduct Rezeptor A Huhnoviduct RezepWr B Huhnoviduct Rezeptor, gereinigt Rattenleber Rezeptor Rattenuterus

P C C C C T DHT DHT P P P D O

4 s-~×10 s

2200 20 -28 63 1,4 -

950 41 230 280 50 90 15 220 1,9 2,4 1,6 2,0 3,9 b

kl/k- 1

Literatur

M 1×10-8 24 4,9 150 260 7,3 -

(Tabelle 2) [18] [19] [20] [2I] [22] [22] [23] [24] [24] [25] [21] [26]

P, Progesteron; C, Cortisol; T, Testosteron; DHT, Dihydrotestosteron; D, Dexamethason; (), Ostradiol b

25 °

gegen chemischen und enzymatischen Angriff, ebenso wie gegen unspezifische Aufnahme durch Gewebestrukturen. In dieser Weise erftillen die Steroid-bindenden Proteine verschiedenartige Aufgaben der Konservierung im physiologischen Geschehen.

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Professor Dr. Ulrich Westphal Department of Biochemistry University of Louisville School of Medicine Louisville, Kentucky/USA