599
茶 お よび カテ キ ンの百 日咳菌 に対 す る防 御 作用 1)
Key
昭和 大 学 医学 部 細 菌学 教 室,2)三 井農 林 株 式 会社 食 品 総 合研 究 所 堀 内
善 信1)戸
田 眞 佐 子1)大
原
征 彦2)島
村
words:
tea,
久 保 幸 枝1).
忠 勝1)
(平成3年12月9日
受 付)
(平成3年12月17日
受理)
Catechin,
Bordetella
要
pertussis,
LPF,
cell adhesion
旨
茶 お よ び カ テ キ ン の 百 日咳 に 対 す る感 染 防 御 の 可 能 性 を,百
日咳 菌 に 対 す る殺 菌 活 性,菌
へ の 付 着 に 対 す る抑 制 作 用 お よ び 百 日咳 毒 素 の リン パ 球 増 多(Lymphocytosis 対 す る 不 活 化 作 用 を 指 標 と して 検 討 し た.殺 茶 お よ び コ ー ヒ ー は,そ
菌 活 性 に つ い て は,い
れ ぞ れ 常 用 飲 用 濃 度(5%)で,百
ア ー ル 茶 も比 較 的 弱 い な が ら殺 菌 活 性 を 示 した.(-)エ フ ラ ビ ン ジ ガ レ ー ト(TF3) HeLa細
日咳 菌 に 対 し て 強 い 殺 菌 活 性 を 示 し た.プ お よび テア
間 以 内 に百 日咳 菌 を 完 全 に 殺 菌 した.
れ に 対 し,緑 茶 お よ び 紅 茶 は,培 養 細 胞 へ の 菌 の 付 着 を 強 く抑 制 した.
性 不 活 化 作 用 は,細 胞 へ の 百 日咳 菌 の 付 着 抑 制 とは 逆 で,1%で
さず,ま た 紅 茶 で もわ ず か な 不 活 化 作 用 しか 示 さ な か った.一 方,EGCgお 不 活 化 作 用 を 示 し,な か で もTF3の に は百 日咳 防 御 に 関 し て,興
序
活性に
ず れ も濃 度 依 存 的 で あ り,緑 茶,紅
胞 へ の 百 日咳 菌 の 付 着 能 に対 す る 抑 制 作 用 を 検 討 し た と こ ろ,EGCgやTF3
は 全 く抑 制 を 示 さ な か っ た.こ 百 日咳 毒 素 のLP活
の培養 細胞 LP)
ピ ガ ロ カ テ キ ン ガ レ ー ト(EGCg)
の 殺 菌 活 性 は 強 く,1mg/miで24時
胞 お よ びCHO細
promoting,
緑 茶 が 全 く作 用 を示
よ びTF3は100μg/mlで
不 活 化 作 用 は 顕 著 で あ っ た.以 上 の 結 果 か ら茶,EGCgお
強い よ びTF3
味 あ る活 性 の あ る こ とが 示 され た.
児 の 主 要 な感 染 症 の地 位 を 占め て い る の が 現 状 で
文
くか ら重 篤 な乳 幼 児 呼 吸 器 感 染 症
あ る1).こ れ らの 国 の 多 くは,副 反 応 低 減 の た め の
の 一 つ と して,広 く注 目を 集 め て き た1).強 い伝 染
菌 体 成 分 ワ クチ ン導 入 も さ る こ とな が ら,そ れ 以
性 や 感 染 初 期 に お け る診 断 の難 し さか ら,1960年
前 に,他
百 日咳 は,古
に も接 種 率 お よ び接 種 効 果 の 向上 な どの
代 に効 果 的 な ワク チ ンが 実 用 化 され る ま で,そ の
た め に解 決 す べ き多 くの 問 題 を抱 えて い る もの と
実 効 的 な 疾 病 制 御 は 困 難 で あ った.そ
考 え られ る.
の後 も,ワ
ク チ ンの 副 反 応 に よ る接 種 率 の低 下 に伴 っ て 罹 患
と こ ろ で,近 年,茶
お よ び カ テ キ ン の抗 菌 ・殺
率 が 一 時 的 に 上 昇 す る 等 の 問 題 が み られ た2)3).
菌 活 性 や 生 理 活 性 に 関 して,興
1981年 に 日本 で,菌 体 成 分 ワ ク チ ン が 実 用 化 さ
れ,下 痢 原 性 消 化 器 感 染 症 原 因-菌6)∼11),皮 膚 糸状
れ4),こ う した 問 題 の 解 決 に対 す る期 待 が 高 ま っ
菌12),MRSA
た.そ
な ウ イ ル ス 性 疾 患 に お い て も防 御 効 果 を示 す 可 能
れ に伴 い,ワ
クチンの改良 に向けた研究が
世 界 的 に 活 発 化 した5)に も関 わ らず,そ の 後,未 だ 新 た な 菌 体 成 分 ワ ク チ ン の本 格 的 実 用 化 の 例 は み られ て い な い.百
日咳 は,今 な お 多 くの 国 で 乳 幼
別刷 請 求 先:(〒142)東
平 成4年5月20日
島村
13),さらに は イ ン フル エ ン ザ14)のよ う
性 を示 唆 す る知 見 が報 告 され た. そ こで,わ れ わ れ は こ の度,ワ
ク チ ン に よ る制
御 に加 え,日 常 飲 用 に 供 さ れ て い る茶 類 の 百 日咳 制 御 へ の 応 用 の可 能 性 を 検 討 す るた め の 第 一 段 階
京 都 品 川 区旗 の 台1.5-8
昭和 大 学 医学 部 細 菌学 教 室
味 あ る研 究 が な さ
忠勝
とし て,百
日咳 菌 に 対 す る殺 菌 活 性,培
養細胞 へ
堀 内 善信 他
600
の菌 付 着 抑 制 能 お よ び百 日咳 毒 素 活 性 の 不 活 化 作
既 報7)の 方 法 で 抽 出 し て サ ン プ ル と し た.カ
用 に つ い て 検 討 し た.そ
ン は 精 製EGCg(緑
の 結 果 若 干 の 興 味 あ る知
見 を 得 た の で 報 告 す る.
茶 よ り 精 製17))を 20(w/v)%,コ
材 料 と方 法 1) 使 用 菌 株
Casamino
acid
USA)
7.0に 溶 解 し た.こ
pH
(CA,
Technical
grade,
れ を20%牛
本 生 物 材 料 セ ン タ ー)加Bordet G)培
地(Difco.
USA)で37℃,48時
2.5×1010CFU/mlと 濁,バ
&
イ ア ル に 分 注 し て-80℃
(B・
血 清 に懸
月 以 上 に わ た っ て安
実 験 の 際 に は,そ
れぞれ新 しいバ
イ ア ル を 融 解 し て 用 い た. 2)
HeLa細
(CHO)
Hamster
Ovary
229細 胞 は,千 葉 県 血 清 研 究 所 の 鈴 木 博 士 た,CHO細
細 胞 株 を 用 い た.培
養 は,10%牛
Essential
Medium
胞 は当教室保存
(MEM-FCS
緑 茶(煎 茶,宇 国 茶)お
toxin;
日 咳 菌1相
(S
&
S)培
Sepharose
Cl-6B
Sweden)
PT)
東 浜 株 をSteiner
地 で37℃,5日
た 上 清 か ら,Sekuraら18)の
間静置培養 し
Fine
Chemicals,
に よ る ゲ ル 炉 過 に よ り さ ら に 精 製 し た. リ ア ク リル ア ミ ドゲ ル 電 気 泳
雑 の 有 無 の 検 査 の 結 果,高
1
5)
Structual
formulae
Epigallocatechin
a)
ァー
&
gallate
(EGCg),
S培
地 で25倍
た 緑 茶,紅
ン 酸 緩 衝 液(glycerol-
濃度 し
ア ー ル 茶 の保 存 抽 出液 を
れ ぞ れ20,
希 釈 溶 液 を 調 製 し た.さ
gallate b)
東 浜 株 を,2倍
に 希 釈 し て10gCFU/mlと
茶,プ
滅 菌 蒸 留 水 で 希 釈,そ v)%の
of Epigallocathechin
7の50(v/
で 保 存 し た.
上 記 凍 結 保 存 百 日 咳 菌1相
を 用 い,
に よ る
度精製 標 品 で
殺菌活 性
のS
茶(Lipton(R)),プ
よ び コ ー ヒ ー(UCC(R))
a)(—)
中 に-20℃
た.ま
治 山 田),紅
Fig.
v) % glycerol加M/100リ PBS)
&
方 法 に 準 じ て 精 製 し,
(Pharmacia
得 ら れ たPTは,ポ
10)中,
茶 お よびカテキ ン
ル 茶(中
Schlte
胎 児血 清 加 ・
37℃ で 炭 酸 ガ ス 培 養 法 に よ り行 っ た. 3)
液
時 希釈 して用 い
あ る こ と が 確 認 さ れ た.こ のPTは,pH
よ り分 与 を 受 け た.ま
Minimum
百 日咳 毒 素(pertussis
FHA夾
細胞
HeLa
出
動 法 に よ る 純 度 検 定 お よ びELISA法
胞 お よ びChinese
茶 は
は 各 々PBSで2mg/ml溶
に 凍 結 保 存 し,用
PTは,百
に 凍 結 保 存 し た15).
こ の 保 存 菌 液 の 生 菌 数 は6ヵ 定 し て お り,各
4)
間 培 養 し た 後,
な る よ う に40%牛
照).各
た.
Difco, 血 液(日
Gengou
よ びTF3
を 作 成,-20℃
東 浜 株 を 少 量 の1%
用 い た(Fig.1参
ー ヒ ー は25(w/v)%のPBS抽
液,EGCgお
凍 結 乾 燥 百 日 咳 菌I相
テキ
茶 よ り精 製16))お よ びTF3(紅
Teaflavin
and Teaflavin digallate
10, 4.0,
1.0 (w/
ら に,EGCgお
よ
digallate.
(TF3)
b)
感 染 症 学 雑誌
第66巻
第5号
601
茶,カ テキ ンの抗 百 日咳作 用 びTF3の
各 溶 液 も 同 様 に 希 釈,2.0,
ml,お
よ び2.0,
製 し た.こ を,組
1.0,
0.2mg/mlの
れ ら 各 希 釈50μlと,上
養0,
1,
3,
希 釈 溶 液 を調
(96穴)の
潤 箱 中,37℃
各 ウェ
々の
つ を 採 取 し,Miles
19)の方 法 に よ りB・G培
&
地 で生菌 数 を カ ウ
ン ト し た. 6)
地 で37℃,24時
東 浜 株 を1%
CAに
菌 液100μlず
に対 す る殺 菌 活 性 茶,コ
ー ヒ ー,EGCgお
よ びTF3の,百
緑 茶,紅 茶,プ
コ ー ヒ ー,200μg/mlのEGCgお ぞ れ 等 量 混 和 し,37℃
の
それ
で15分 間 処 理 し た.こ
示 す よ うに非 常 に強 い 殺 菌 活 性 菌 液 に お い て,
も,48時
間 目ま で に 完 全 に
殺 菌 さ れ た.そ れ 以 下 の 濃 度 で は,48時 の 完 全 な殺 菌 に は至 ら なか っ た が,茶
れ ら
Fig.
2
Bactericidal
against
B.
cultured
処 理 菌 液 お よ び 対 照 無 処 理 菌 液 を15,000回
転 で5
に 希 釈 し た.
前 に 培 養 液 を 除 去 し,PBSで
2×104/wellのHeLa細
洗 浄 した
胞 お よ びCHO細
間 以内で の濃 度 に 依
胞 の各
in
containing tea
or
activity
pertussis. a a)
d)
counted
at
geometric
0,
at
tea, 37•Ž.
1, 3, 24
mean
of
and at
tea
108/ml
100,ul/well green
coffee
of
5•~
of b)
S
48 least
&
black
Viable
and
coffee
bacteria
tea,
cell hr.
were
S
medium c)
pu-erh
numbers
were
point
shows
Each 3
repeated
●;
0.5%,
experi-
ments.
4ウ
ェル に,こ
の 処 理 希 釈 菌 液 各20μlを 添 加 し,
37℃ で45分 間 接 触 さ せ た.つ
づ い て これ ら各 ウ ェ
ル に180μlの1%
CAを
菌 を 回 収 し,さ
添 加 し て 上 清 の 浮 遊 百 日咳
ら に 温 和 なTrypsin処
胞 付 着 百 日咳 菌 を 回 収 し た.回
○;
10%,
△;
5%,
□;
2%,
a)
Green
tea
b) Black
理 に よ り細
菌 活性の場
れ ら の菌 液 を 無 細 胞
ウ ェ ル に 添 加 し て 同 様 に 測 定 し た と こ ろ,用
いた
条 件 下 で は 殺 菌 活 性 に よ る著 しい 生 菌 数 の 減 少 や,ウ 7)
ェ ル へ の 非 特 異 的 な 吸 着 は み ら れ な か っ た. 百 日 咳 毒 素LP活
2%の TF3を
緑 茶,紅
茶,お
性 に 対 す る不 活 化 作 用 よ び200μg/mlのEGCg,
そ れ ぞ れ,10μg/mlお
c)
よ び2μg/mlのPT
と 等 量 混 和 し た.5μg/mlと1μg/mlのPT溶
液,
生 理 食 塩 液 の 各 対 照 お よ び 上 記 検 体 ・PT混
液 の
各 々0.5mlを,1群5匹
4週
齢)の
腹 腔 内 に 投 与,3日
の マ ウ ス(ddY,
♀,
後 に メ ラ ンジ ュ ー ル を
用 い て 各 マ ウ ス の 尾 静 脈 か ら 採 血 した.採
取 した
血 液 を 型 通 り に チ ュ ル ク 液 に 浮 遊 し,ノ
イ バ ウ
ア ー の 血 球 計 算 盤 を 用 い て,鏡
検 下,リ
お よ び 白 血 球 数 を 併 せ て カ ウ ン ト し た. 平 成4年5月20日
ンパ 球 数
▲;
trol
収 した 上 清浮 遊 お
よ び 細 胞 付 着 百 日 咳 菌 の 生 菌 数 を,殺 合 と 同 様 に カ ウ ン トし た.こ
間
まで 継 続 的 な菌 の増 殖 が み られ た.こ れ に 対 し, 緑 茶 はFig.2aに
ァ ー ル 茶,
よ びTF3と
分 間 遠 心 洗 浄 し た 後,1%CAで100倍
日咳 菌
2に 示 す よ うに茶 抽 出液 無 添 加 対 照 で は,48時
が 認 め られ ず,5%で
濃 度 を 分 光 光 度 計(日
際 濁 度 単 位 に 調 整 し た.こ
つ を,2%の
百 日咳 菌
10%の 濃 度 で は,培 養1時 間 目で 既 に生 菌 の 検 出
間 培 養 し た 百 日 咳 菌1相
浮 遊,菌
立,U-1100)で0.1国
そ し て,直
よ びTF3の
を 示 し,出 発 時5×108CFU/mlの
培 養 細 胞 へ の菌 付 着 抑 制 作 用
B・G培
績
1) 茶,コ ー ヒ ー,EGCgお
の 増 殖 像 に 対 す る影 響 を 検 討 した.そ の 結 果,Fig.
で 培 養 し た.培
24時 間 お よ び48時 間 目 に,各
ウ ェ ル か ら培 養 物20μlず Misra
成
0.1mg/
記 希 釈 菌 液50μl
織 培 養 用 平 底Microplate
ル 中 で 等 量 混 和,湿
0.4,
Pu-erh
tea
d) Coffee
tea
Con-
堀内 善信 他
602
存 して 生 菌 数 の 減 少 が認 め られ た. 紅 茶 の 場 合,Fig.2bに
うに,1mg/mlで,EGCgで
示 す よ うに10%で
時 間 目で 生 菌 の検 出 が認 め られ ず,そ
は,24
め な か った.そ
れ 以 下 の濃
度 で も,茶 の濃 度 に依 存 して48時 間 ま で 継 続 的 な
れ 以 下 の 濃 度 で も,茶 同様,そ
れ
ぞ れ 濃 度 依 存 的 な殺 菌 効 果 が み られ た.
生 菌 数 の 減 少 が み られ た.
2) 培 養 細 胞 へ の 菌 付 着 抑 制 活 性
プ ァ ー ル茶 の 場 合,Fig.2cに
み られ る よ うに,
48時 間 以 内 で の 完 全 な殺 菌 に は10%の た.そ
は24時 間 で,ま たTF3
で は48時 間 で 完 全 な殺 菌 に至 り,生 菌 の検 出 を 認
れ 以 下 の濃 度 で は,2%ま
次 に菌 定 着 に対 す る阻 止 の 可 能 性 を探 るた め,
濃 度を要 し
で は,48時
培 養HeLa細
間ま
胞 お よ びCHO細
胞 へ の 百 日咳 菌 の
付 着 に 及 ぼ す 緑 茶,紅 茶,EGCgお
よ びTF3の
で濃 度 に依 存 した 継 続 的 な 生 菌 数 の減 少 が 認 め ら
制 能 に つ い て 検 討 した.こ
れ た が,0.5%で
ンで 処 理 した 菌 液 の100倍 希 釈(103CFU/ml)に
は 十 分 な殺 菌 活 性 ば み られ な か っ
た.
れ らの 茶 お よび カ テ キ
い て細 胞 付 着 能 を調 べ た と ころ,Table
コ ー ヒー で は ,緑 茶10%で は み られ な か った が,10%お
見 られ た 急 速 な殺 菌
Table
よ び5%で
胞 お よびCHO細
目 まで に完 全 な 殺 菌 が認 め られ,さ
は24時 間
らに,2%の
抑 つ
1お よ び
2に 示 した よ うに,緑 茶 と紅 茶 は,HeLa細 胞 の いず れ に 対 す る 菌 付 着 を も
強 く抑 制 した.一 方,EGCgお
よびTF3の
低 濃 度 で も48時 間 目ま で に 完 全 な殺 菌 が 認 め られ
用 い た条 件 下 で は,HeLa,
た(Fig.2d),す
へ の菌 付 着 に対 して も,顕 著 な 抑 制 を示 さ な か っ
なわ ち,コ ー ヒ ーの 場 合,殺 菌 有
CHOの
場 合,
いず れ の 細 胞
効 濃 度 や 殺 菌 速 度 か らみ て,こ れ ま で 示 した 他 の
た.さ らに104CFU/mlの
茶 とは,殺
つ い て も検 討 した と こ ろ,細 胞 付 着 お よび 上 清 浮
菌 活 性 の機 作 が 異 な る可 能 性 が 考 え ら
れ た.
処 理 菌 液 を用 い た 場 合 に
遊 の 各 菌 数 は,用 い た 菌 濃 度 に 依 存 して そ れ ぞ れ
茶 成 分 の うちEGCgお
よびTF3が,既
菌 性 下 痢 症 起 因 菌 の場 合 と同 様,百 て も殺 菌 活 性 を 示 す か 否 か を,茶 検 討 した.そ の 結 果,Fig.3aお
Fig.
3
or
b)
shows
の場 合 と 同様 な結 果 で あ った.
と同 様 の方 法 で
3) 百 日咳 毒 素LP活
よび3bに 示 した よ
were TF3.
約10倍 に 増 加 した が,付 着 抑 制 に つ い て は103/ml
日咳 菌 に対 し
Bactericidal
bacteria
報8)の細
activity cultured
Viable
geometric
cell mean
a)
○;
1mg/ml
EGCg,
b)
○;
1mg/ml
TF3,
a) EGCg
of in
△; △;
and
a 100ƒÊl/well
numbers of
EGCg
百 日咳 毒 素 は,百
at
were least 200μg/ml
500μg/ml
TF3 of
S
counted
S at
3 repeated
B.
medium 0,
1, 3, 24
日咳 発 症 の 上 で 重 要 な役 割 を
pertussis.
5•~
108/ml
containing
a)
EGCg
Each
point
and
48
hr.
experiments.
EGCg, TF3,
against &
性 に対 す る不 活 化 作 用
□; □;
50μg/ml
100μg/ml
EGCg, TF3,
●;
●;
Control.
Control.
b) TF3
感染 症 学 雑 誌
第66巻
第5号
茶,カ テ キ ンの抗 百 日咳 作用 Table
1
EGCg
Inhibitory and TF3
tussis to HeLa
1):
Geometric
2):
Significantly
1%CA tions 37•Ž
of
1%
black
for
B. pertussis
were
100ƒÊg/ml and
min. and as
2
Inhibitory
EGCg and TF3
1): Geometric from
tea,
supernatant expressed
Table
per-
of green tea, black tea, of Bordetella
viable
adherent
with
100 229
number
of
to
the
cells
green
TF3
times.
HeLa
mean
1%
100ƒÊg/ml
The
cells
was
of two
at
in
four
the
結 果,Table
and wells.
3に 示 した よ うに5μg/mlのPTに
対 して,1%緑 びTF3は
担 うも の と考 え られ て い る.そ て,緑 茶,紅 茶,EGCgお
茶,紅
茶 は全 く不 活 化 作 用 を 示 さ
つ い て,百
日咳 毒 素 に 対 す る不 活 化 能 の 検 討 を 行 った.そ
3
Inhibitory
1):
Geometric
5ƒÊg/ml the
expressed
平 成4年5月20日
mean
of five
PT, 1ƒÊg/ml
concentrations
injected
with as
action
of
promoting
PT
0.5ml geometric
mice
in the
of each mean
tea,
(control) table.
mixture counts
不 活 化 作 用 を 示 した.一
black
of pertussis
2):
or saline
shown
green
activity
Five and
95% was
mixed
bled
of leuco-lymphocytes
EGCg
and
TF3
on
the
leuco-
interval with old
3 days
green female later. per
tea, ddY The
,al
black mice
tea, were
residual
of the
blood
EGCg
or TF3
intraperitoneally LP
匹敵す る
方,EGCgは5μg/mlの
toxin
confidential
of 4 weeks were
tea,
こ ろ が,
用 い た 場 合,緑 茶 は や は り不 活
化 作 用 を 示 さ な か った が,紅 茶 はTF3に
の
よ
と も に 顕 著 な 不 活 化 作 用 を 示 し,特 に
強 い 不 活 化 作 用 が 認 め られ た.と
1μg/mlのPTを
性を指標 とし
よ びTF3に
lymphocytosis
TF3に
こで,代 表 的 な百
日咳 毒 素 活 性 の 一 つ で あ るLP活
as
1. except for using CHO cells.
dilu-
counted
or
in Table
or
in wells
bacteria
mean
な か った.こ れ に 対 して,100μg/mlのEGCgお
Table
per-
2): Significantly different from control (p= 0.05) The experiment was carried out in the same manner
(p=0.05)
treated
diluted
with
a geometric
control
EGCg,
were
The
action
on adherence
tussis to CHO cells
co-incubated 45
tea,
of Bordetella
cells
different
(control) were
of green tea, black
mean
106CFU/ml tea,
action
on adherence
603
activities
samples.
were
at
堀 内 善信 他
604
PTの
場 合 と異 な り僅 か な不 活 化 作 用 し か 示 さ な
か った.
し か し,殊 に 紅 茶 とEGCgの が,PTの
考 近 年,健
濃 度 に よ っ て は 逆 転 を み せ た こ とか ら,
これ らのLP活
察
康 に 対 す る 関 心 の 高 ま りと と も に,食
不 活化 作 用 の 強 さ
性 不 活 化 の機 序 に多 様 性 の あ る こ
とが推 察 され る.ま た,緑 茶,紅 茶 ま た はEGCgの
品 の 生 体 調 節 機 能 に着 目 した 研 究 が 多 くみ られ る
腹 腔 内 投 与 に よ って,マ
よ うに な っ た.我 々6)7)は,50種 以 上 の 食 品 を ス ク
白血 球 の 増 多 が観 察 され た.こ の こ とは,緑 茶 お
リー ニ ン グ した 結 果,茶
よ び紅 茶 の 多 様 な 成 分 やEGCgが,末
や コ ー ヒー が,多
くの細
ウス 末 梢 リンパ 球 お よび
梢 リン パ球
菌 性 下 痢 起 因 菌 に対 して 抗 菌 作 用 を有 す る こ とを
や 白血 球 に対 して 生 理 活 性 を 有 す る こ とを 示 す も
報 告 した.ま
の と考 え られ る.こ の 活 性 と,緑 茶 お よ び紅 茶 が
MRSA13)に
た,茶 や カテ キ ン が 皮 膚 糸 状 菌12)や 対 し て も 殺 菌 作 用 を 有 す る こ とを 報
十 分 量 のEGCgやTF3を
有 して い る に も か か わ
らず,5μg/mlのPTに
告 した. 今 回,茶
お よ び コー ヒ ーが,さ
らに,呼
吸器 感
染 症 起 因 菌 の 一 つ で あ る百 日咳 菌 に 対 し て も殺 菌 活 性 を 有 す る こ とを見 い だ した.ま
た,そ
の殺 菌
対 し てLP活
性不 活 化 作
用 を示 さ な か った こ と との 関 連 は不 明 で あ る. 以 上,茶 類,EGCgお に対 して,殺
よ びTF3が
菌,菌 定 着 阻 止,あ
百 日咳 菌 感 染 るいは毒素不 活
活 性 は濃 度 依 存 的 で あ り,コ ー ヒ ーの そ れ は殺 菌
化 を通 じ て防 御 的 に働 き得 る可 能 性 が 示 され た.
時 間 や 有 効 濃 度 か らみ て,茶
今 後 さ ら に,百
とは作 用 機 作 が異 な
日咳 毒 素 の 他 の 活 性 に 対 す る不 活
る こ とを うか が わ せ た.ま た,茶 成 分 の うち,主
化 の 可 能 性 や,飲
な 有 効 成 分 と考 え られ たEGCgお
検 討 な ど,実 用 化 に 向 け た 研 究 を行 うこ とは,日
よびTF38)は,
用,噴
霧 吸 入 とい った 投 与 法 の
百 日咳 菌 に対 し て もや は り強 い殺 菌 活 性 を示 す こ
常 飲 用 し て い る茶 の 安 全 性 の 実 績 か らみ て も意 義
とを 確 認 した.
あ る もの と考 え られ る. 文 献 Prevention with use of vaccines
と こ ろ で,我 々14)は,茶が イ ン フル エ ン ザ ウイ ル ス の培 養 細 胞 へ の 感 染 を 阻 止 す る こ と を 報 告 し た.ま た,Relmanら20)は
1) Wright, P. F.: -Pertussis
百 日咳 菌 の様 々 な病 原 因
子 欠 損 変 異 株 の 定 着 能 を,CHO細
of the problem
胞 お よび家 兎
Infect.
気 管 上 皮 細 胞 を 用 い て 解 析 し,用 い た 継 代 細 胞 と
2) Kanai,
CHO細
こで,わ れ わ れ はHeLa細
胞 を 用 い て 緑 茶,紅 茶,EGCgお
よ びTF3
の 細 胞 へ の 百 日咳 菌 付 着 抑 制 能 を検 討 した.そ
の
結 果,緑 茶 お よ び紅 茶 が,常 用 飲 用 濃 度 の5分 の 1の=濃 度 で も,強 い菌 付 着 抑 制 作 用 を 示 す こ とが 明 ら か に な った.一 方,EGCgお
よ びTF3は,殺
菌 活 性 の場 合 と異 な り,用 いた 条 件 下 で は ほ とん ど菌 付 着 抑 制 作 用 を示 さず,殺 菌 活 性 と菌 付 着 抑 制 作 用 で は,互
い に 関 与 す る茶 成 分 の 有 効 量 も し
くは 種 類 に違 い の あ る こ とが 示 唆 され た. 次 に,百
日咳 が 毒 素 性 疾 患 の一 つ で あ る と考 え
られ て い る こ と か ら,茶,EGCgお
よびTF3に
る百 日咳 毒 素 不 活 化 の可 能 性 を 探 った.ま 活 性 に対 す る作 用 を観 察 した 結 果,茶 ろEGCgやTF3に
よ
-143
and prospects Japan's
for control.
Rev.
1991.
evidence
and vaccination
in
pertussis
in the past thirty
Jpn. J. Med. Sci. Biol., 33: 107
, 1980.
3) Fine, P. E.M. & Clarkson, J. A.: The recurrence of whooping cough: Possible implications for assessment of vaccine efficacy. Lancet, 20: 666-669, 1982. 4) Sato, Y., Kimura, M. & Fukumi, H.: Development of a pertussis component vaccine in Japan. Lancet, 1: 122-126, 1984. 5) Robinson, A., Irons, L.I. & Ashworth, L.A. E.: Pertussis vaccine: Present status and future prospects. Vaccine, 3: 11-22, 1985. 6) Toda, M., Okubo, S., Hiyoshi, R. & Shimamura, T.: The bactericidal activity of tea and coffee. Lett. Appl. Microbiol., 8: 123-125, 1989. 7)
ずLP
戸 田 眞 佐 子,
大 久 保 幸 枝,
大 西 玲 子,
島 村 忠 勝:
日 本 茶 の 抗 菌 作 用 お よ び 殺 菌 作 用 に つ い て. 菌 誌,
よ りは む し
強 い 不 活 化 作 用 が 認 め られ た.
K.:
years—Review.
胞 お よび
Countries: Definition
Dis., 13: S528-534,
epidemiology
初 代 気 管 細 胞 間 で 基 本 的 に 差 異 の な い 結 果 を報 告 して い る.そ
in Developing
8)
44:
669-672,
戸 田 眞 佐 子,
日細
1989.
大 久 保 幸 枝,
生貝
感 染症 学 雑 誌
初,
島 村 忠 勝:
第66巻
第5号
茶,カ テ キ ンの 抗百 日咳 作用
茶 カテ キ ン類 お よ びそ の構 造 類 似物 質 の 抗 菌作 用
infection
な ら び に 抗 毒 素 作 用.
-40
日 細 菌 誌,
45:
561-566,
1990. 9)
征 彦,
石上
正:
Bordetella
茶 ポ リフ ェ ノール 類 の食 中 日食 工 誌,
16) 征 彦,
渡 辺 真 由 美:
茶 ポ リフ ェ ノール 類 の ボ
ツ リ ヌ ス 菌 に 対 す る 抗 菌 作 用. -955 , 1989.
大 久 保 幸 枝,
戸 田 眞 佐 子,
日食 工 誌, 36: 951
征 彦,
用.
日細 菌 誌,
戸 田 眞 佐 子, Methicillin
46:
509-514,
大 久 保 幸 枝, resistant
征 彦,
Staphylococcus
島 村 忠 勝: に対
す る カ テ キ ン の 抗 菌 ・殺 菌 作 用. 日細 菌 誌, 46: 839 -845 , 1991.
14) Nakayama, Shimamura,
M., T.:
Toda,
M.,
Inhibition
Protective
Okubo,
of influenza
Activity
S.
&
virus
of Tea
and
11: 38
15: 17-26, 征 彦:
The detoxification
of
glutaraldehyde.
J.
1987.
茶 葉 カテ キ ン類 の抗 酸 化 作
日 本 農 芸 化 学 会 誌,
59:
129-134,
征 彦,
松 崎 妙 子,
鈴 木 建 夫:
茶成分のアンジ
61:
803-808,
日本 農 芸
1987.
18) Sekura, R. D., Fish, F., Manclark, C.R., Meade, B. & Yan, L.Z.: Pertussis Toxin-Affinity purification of a new ADP-ribosyltransferase. J. Biol. Chem., 258: 14647-14651, 1983. 19) Miles, A.A. & Misra, S. S.: The estimation of the bactericidal power of blood. J. Hyg., 38: 732-748, 1938. 20) Relman, D.A., Domenighini, M., Tuomanen, E. & Rappouli, R.: Filamentous hemagglutinin of Bordetella pertussis: Nucleotide sequence and crucial role in adherence. Proc. Natl. Acad. Sci., 86: 2637-2641, 1989.
島 村 忠 勝:
aureus
原
化 学 会 誌,
1991. 原
with
オ テ ン シ ン I変 換 酵 素 阻 害 能 に つ い て.
白癬 菌 に 対 す る 茶 お よ び カ テ キ ン の 抗 菌 ・殺 菌 作
13)
Microbiol.,
1985. 17)
原
原
用 に つ い て.
11) Toda, M., Okubo, S., Ikigai, H., Suzuki, T., Suzuki, Y. & Shimamura, T.: The protective activity of tea against infection by Vibrio cholerae 01. J. Appl. Bacteriol., 70: 109-112, 1991. 12)
松 崎 妙 子,
Y.:
pertussis
Biol. Stand.,
36: 996-999,
1989. 原
by tea. Lett. Appl.
, 1990.
15) Iida, T. & Horiuchi,
原
毒 菌 に 対 す る 抗 菌 活 性.
10)
605
Catechins
against
Bordetella
pertussis
Yoshinobu HORIUCHI1), Masako TODA1), Sachie OKUBO1), Yukihiko HARA2) & Tadakatsu SHIMAMURA1) 1)Department
of Microbiology
and Immunology
2)Food Research
, Showa University School of Medicine Laboratories , Mitsui Norin Co.
We examined the bactericidal activity of tea and catechins against Bordetella pertussis. Green tea, black tea and coffee showed marked bactericidal activity at their concentrationsin beverages, while pu-erh tea killed the bacteria in a moderate way. (-) Epigallocatechin gallate (EGCg) and theaflavin digallate (TF3) showed also marked bactericidal activity. Green tea and black tea also effectively blocked the adhesion of B. pertussis to HeLa and CHO cells, whereas ECGg and TF3could not. EGCg and TF3 markedly inactivated leuco-lymphocytosis promoting activity of pertussistoxin. Black tea showed slight but significant inactivation of the activity, whereas green tea showed no inactivation. These results suggest that green tea, black tea, EGCg and TF3 might act as prophylactic agents against pertussis infection.
平成4年5月20日
茶 お よび カテ キ ンの百 日咳菌 に対 す る防 御 作用 1)
Key
昭和 大 学 医学 部 細 菌学 教 室,2)三 井農 林 株 式 会社 食 品 総 合研 究 所 堀 内
善 信1)戸
田 眞 佐 子1)大
原
征 彦2)島
村
words:
tea,
久 保 幸 枝1).
忠 勝1)
(平成3年12月9日
受 付)
(平成3年12月17日
受理)
Catechin,
Bordetella
要
pertussis,
LPF,
cell adhesion
旨
茶 お よ び カ テ キ ン の 百 日咳 に 対 す る感 染 防 御 の 可 能 性 を,百
日咳 菌 に 対 す る殺 菌 活 性,菌
へ の 付 着 に 対 す る抑 制 作 用 お よ び 百 日咳 毒 素 の リン パ 球 増 多(Lymphocytosis 対 す る 不 活 化 作 用 を 指 標 と して 検 討 し た.殺 茶 お よ び コ ー ヒ ー は,そ
菌 活 性 に つ い て は,い
れ ぞ れ 常 用 飲 用 濃 度(5%)で,百
ア ー ル 茶 も比 較 的 弱 い な が ら殺 菌 活 性 を 示 した.(-)エ フ ラ ビ ン ジ ガ レ ー ト(TF3) HeLa細
日咳 菌 に 対 し て 強 い 殺 菌 活 性 を 示 し た.プ お よび テア
間 以 内 に百 日咳 菌 を 完 全 に 殺 菌 した.
れ に 対 し,緑 茶 お よ び 紅 茶 は,培 養 細 胞 へ の 菌 の 付 着 を 強 く抑 制 した.
性 不 活 化 作 用 は,細 胞 へ の 百 日咳 菌 の 付 着 抑 制 とは 逆 で,1%で
さず,ま た 紅 茶 で もわ ず か な 不 活 化 作 用 しか 示 さ な か った.一 方,EGCgお 不 活 化 作 用 を 示 し,な か で もTF3の に は百 日咳 防 御 に 関 し て,興
序
活性に
ず れ も濃 度 依 存 的 で あ り,緑 茶,紅
胞 へ の 百 日咳 菌 の 付 着 能 に対 す る 抑 制 作 用 を 検 討 し た と こ ろ,EGCgやTF3
は 全 く抑 制 を 示 さ な か っ た.こ 百 日咳 毒 素 のLP活
の培養 細胞 LP)
ピ ガ ロ カ テ キ ン ガ レ ー ト(EGCg)
の 殺 菌 活 性 は 強 く,1mg/miで24時
胞 お よ びCHO細
promoting,
緑 茶 が 全 く作 用 を示
よ びTF3は100μg/mlで
不 活 化 作 用 は 顕 著 で あ っ た.以 上 の 結 果 か ら茶,EGCgお
強い よ びTF3
味 あ る活 性 の あ る こ とが 示 され た.
児 の 主 要 な感 染 症 の地 位 を 占め て い る の が 現 状 で
文
くか ら重 篤 な乳 幼 児 呼 吸 器 感 染 症
あ る1).こ れ らの 国 の 多 くは,副 反 応 低 減 の た め の
の 一 つ と して,広 く注 目を 集 め て き た1).強 い伝 染
菌 体 成 分 ワ クチ ン導 入 も さ る こ とな が ら,そ れ 以
性 や 感 染 初 期 に お け る診 断 の難 し さか ら,1960年
前 に,他
百 日咳 は,古
に も接 種 率 お よ び接 種 効 果 の 向上 な どの
代 に効 果 的 な ワク チ ンが 実 用 化 され る ま で,そ の
た め に解 決 す べ き多 くの 問 題 を抱 えて い る もの と
実 効 的 な 疾 病 制 御 は 困 難 で あ った.そ
考 え られ る.
の後 も,ワ
ク チ ンの 副 反 応 に よ る接 種 率 の低 下 に伴 っ て 罹 患
と こ ろ で,近 年,茶
お よ び カ テ キ ン の抗 菌 ・殺
率 が 一 時 的 に 上 昇 す る 等 の 問 題 が み られ た2)3).
菌 活 性 や 生 理 活 性 に 関 して,興
1981年 に 日本 で,菌 体 成 分 ワ ク チ ン が 実 用 化 さ
れ,下 痢 原 性 消 化 器 感 染 症 原 因-菌6)∼11),皮 膚 糸状
れ4),こ う した 問 題 の 解 決 に対 す る期 待 が 高 ま っ
菌12),MRSA
た.そ
な ウ イ ル ス 性 疾 患 に お い て も防 御 効 果 を示 す 可 能
れ に伴 い,ワ
クチンの改良 に向けた研究が
世 界 的 に 活 発 化 した5)に も関 わ らず,そ の 後,未 だ 新 た な 菌 体 成 分 ワ ク チ ン の本 格 的 実 用 化 の 例 は み られ て い な い.百
日咳 は,今 な お 多 くの 国 で 乳 幼
別刷 請 求 先:(〒142)東
平 成4年5月20日
島村
13),さらに は イ ン フル エ ン ザ14)のよ う
性 を示 唆 す る知 見 が報 告 され た. そ こで,わ れ わ れ は こ の度,ワ
ク チ ン に よ る制
御 に加 え,日 常 飲 用 に 供 さ れ て い る茶 類 の 百 日咳 制 御 へ の 応 用 の可 能 性 を 検 討 す るた め の 第 一 段 階
京 都 品 川 区旗 の 台1.5-8
昭和 大 学 医学 部 細 菌学 教 室
味 あ る研 究 が な さ
忠勝
とし て,百
日咳 菌 に 対 す る殺 菌 活 性,培
養細胞 へ
堀 内 善信 他
600
の菌 付 着 抑 制 能 お よ び百 日咳 毒 素 活 性 の 不 活 化 作
既 報7)の 方 法 で 抽 出 し て サ ン プ ル と し た.カ
用 に つ い て 検 討 し た.そ
ン は 精 製EGCg(緑
の 結 果 若 干 の 興 味 あ る知
見 を 得 た の で 報 告 す る.
茶 よ り 精 製17))を 20(w/v)%,コ
材 料 と方 法 1) 使 用 菌 株
Casamino
acid
USA)
7.0に 溶 解 し た.こ
pH
(CA,
Technical
grade,
れ を20%牛
本 生 物 材 料 セ ン タ ー)加Bordet G)培
地(Difco.
USA)で37℃,48時
2.5×1010CFU/mlと 濁,バ
&
イ ア ル に 分 注 し て-80℃
(B・
血 清 に懸
月 以 上 に わ た っ て安
実 験 の 際 に は,そ
れぞれ新 しいバ
イ ア ル を 融 解 し て 用 い た. 2)
HeLa細
(CHO)
Hamster
Ovary
229細 胞 は,千 葉 県 血 清 研 究 所 の 鈴 木 博 士 た,CHO細
細 胞 株 を 用 い た.培
養 は,10%牛
Essential
Medium
胞 は当教室保存
(MEM-FCS
緑 茶(煎 茶,宇 国 茶)お
toxin;
日 咳 菌1相
(S
&
S)培
Sepharose
Cl-6B
Sweden)
PT)
東 浜 株 をSteiner
地 で37℃,5日
た 上 清 か ら,Sekuraら18)の
間静置培養 し
Fine
Chemicals,
に よ る ゲ ル 炉 過 に よ り さ ら に 精 製 し た. リ ア ク リル ア ミ ドゲ ル 電 気 泳
雑 の 有 無 の 検 査 の 結 果,高
1
5)
Structual
formulae
Epigallocatechin
a)
ァー
&
gallate
(EGCg),
S培
地 で25倍
た 緑 茶,紅
ン 酸 緩 衝 液(glycerol-
濃度 し
ア ー ル 茶 の保 存 抽 出液 を
れ ぞ れ20,
希 釈 溶 液 を 調 製 し た.さ
gallate b)
東 浜 株 を,2倍
に 希 釈 し て10gCFU/mlと
茶,プ
滅 菌 蒸 留 水 で 希 釈,そ v)%の
of Epigallocathechin
7の50(v/
で 保 存 し た.
上 記 凍 結 保 存 百 日 咳 菌1相
を 用 い,
に よ る
度精製 標 品 で
殺菌活 性
のS
茶(Lipton(R)),プ
よ び コ ー ヒ ー(UCC(R))
a)(—)
中 に-20℃
た.ま
治 山 田),紅
Fig.
v) % glycerol加M/100リ PBS)
&
方 法 に 準 じ て 精 製 し,
(Pharmacia
得 ら れ たPTは,ポ
10)中,
茶 お よびカテキ ン
ル 茶(中
Schlte
胎 児血 清 加 ・
37℃ で 炭 酸 ガ ス 培 養 法 に よ り行 っ た. 3)
液
時 希釈 して用 い
あ る こ と が 確 認 さ れ た.こ のPTは,pH
よ り分 与 を 受 け た.ま
Minimum
百 日咳 毒 素(pertussis
FHA夾
細胞
HeLa
出
動 法 に よ る 純 度 検 定 お よ びELISA法
胞 お よ びChinese
茶 は
は 各 々PBSで2mg/ml溶
に 凍 結 保 存 し,用
PTは,百
に 凍 結 保 存 し た15).
こ の 保 存 菌 液 の 生 菌 数 は6ヵ 定 し て お り,各
4)
間 培 養 し た 後,
な る よ う に40%牛
照).各
た.
Difco, 血 液(日
Gengou
よ びTF3
を 作 成,-20℃
東 浜 株 を 少 量 の1%
用 い た(Fig.1参
ー ヒ ー は25(w/v)%のPBS抽
液,EGCgお
凍 結 乾 燥 百 日 咳 菌I相
テキ
茶 よ り精 製16))お よ びTF3(紅
Teaflavin
and Teaflavin digallate
10, 4.0,
1.0 (w/
ら に,EGCgお
よ
digallate.
(TF3)
b)
感 染 症 学 雑誌
第66巻
第5号
601
茶,カ テキ ンの抗 百 日咳作 用 びTF3の
各 溶 液 も 同 様 に 希 釈,2.0,
ml,お
よ び2.0,
製 し た.こ を,組
1.0,
0.2mg/mlの
れ ら 各 希 釈50μlと,上
養0,
1,
3,
希 釈 溶 液 を調
(96穴)の
潤 箱 中,37℃
各 ウェ
々の
つ を 採 取 し,Miles
19)の方 法 に よ りB・G培
&
地 で生菌 数 を カ ウ
ン ト し た. 6)
地 で37℃,24時
東 浜 株 を1%
CAに
菌 液100μlず
に対 す る殺 菌 活 性 茶,コ
ー ヒ ー,EGCgお
よ びTF3の,百
緑 茶,紅 茶,プ
コ ー ヒ ー,200μg/mlのEGCgお ぞ れ 等 量 混 和 し,37℃
の
それ
で15分 間 処 理 し た.こ
示 す よ うに非 常 に強 い 殺 菌 活 性 菌 液 に お い て,
も,48時
間 目ま で に 完 全 に
殺 菌 さ れ た.そ れ 以 下 の 濃 度 で は,48時 の 完 全 な殺 菌 に は至 ら なか っ た が,茶
れ ら
Fig.
2
Bactericidal
against
B.
cultured
処 理 菌 液 お よ び 対 照 無 処 理 菌 液 を15,000回
転 で5
に 希 釈 し た.
前 に 培 養 液 を 除 去 し,PBSで
2×104/wellのHeLa細
洗 浄 した
胞 お よ びCHO細
間 以内で の濃 度 に 依
胞 の各
in
containing tea
or
activity
pertussis. a a)
d)
counted
at
geometric
0,
at
tea, 37•Ž.
1, 3, 24
mean
of
and at
tea
108/ml
100,ul/well green
coffee
of
5•~
of b)
S
48 least
&
black
Viable
and
coffee
bacteria
tea,
cell hr.
were
S
medium c)
pu-erh
numbers
were
point
shows
Each 3
repeated
●;
0.5%,
experi-
ments.
4ウ
ェル に,こ
の 処 理 希 釈 菌 液 各20μlを 添 加 し,
37℃ で45分 間 接 触 さ せ た.つ
づ い て これ ら各 ウ ェ
ル に180μlの1%
CAを
菌 を 回 収 し,さ
添 加 し て 上 清 の 浮 遊 百 日咳
ら に 温 和 なTrypsin処
胞 付 着 百 日咳 菌 を 回 収 し た.回
○;
10%,
△;
5%,
□;
2%,
a)
Green
tea
b) Black
理 に よ り細
菌 活性の場
れ ら の菌 液 を 無 細 胞
ウ ェ ル に 添 加 し て 同 様 に 測 定 し た と こ ろ,用
いた
条 件 下 で は 殺 菌 活 性 に よ る著 しい 生 菌 数 の 減 少 や,ウ 7)
ェ ル へ の 非 特 異 的 な 吸 着 は み ら れ な か っ た. 百 日 咳 毒 素LP活
2%の TF3を
緑 茶,紅
茶,お
性 に 対 す る不 活 化 作 用 よ び200μg/mlのEGCg,
そ れ ぞ れ,10μg/mlお
c)
よ び2μg/mlのPT
と 等 量 混 和 し た.5μg/mlと1μg/mlのPT溶
液,
生 理 食 塩 液 の 各 対 照 お よ び 上 記 検 体 ・PT混
液 の
各 々0.5mlを,1群5匹
4週
齢)の
腹 腔 内 に 投 与,3日
の マ ウ ス(ddY,
♀,
後 に メ ラ ンジ ュ ー ル を
用 い て 各 マ ウ ス の 尾 静 脈 か ら 採 血 した.採
取 した
血 液 を 型 通 り に チ ュ ル ク 液 に 浮 遊 し,ノ
イ バ ウ
ア ー の 血 球 計 算 盤 を 用 い て,鏡
検 下,リ
お よ び 白 血 球 数 を 併 せ て カ ウ ン ト し た. 平 成4年5月20日
ンパ 球 数
▲;
trol
収 した 上 清浮 遊 お
よ び 細 胞 付 着 百 日 咳 菌 の 生 菌 数 を,殺 合 と 同 様 に カ ウ ン トし た.こ
間
まで 継 続 的 な菌 の増 殖 が み られ た.こ れ に 対 し, 緑 茶 はFig.2aに
ァ ー ル 茶,
よ びTF3と
分 間 遠 心 洗 浄 し た 後,1%CAで100倍
日咳 菌
2に 示 す よ うに茶 抽 出液 無 添 加 対 照 で は,48時
が 認 め られ ず,5%で
濃 度 を 分 光 光 度 計(日
際 濁 度 単 位 に 調 整 し た.こ
つ を,2%の
百 日咳 菌
10%の 濃 度 で は,培 養1時 間 目で 既 に生 菌 の 検 出
間 培 養 し た 百 日 咳 菌1相
浮 遊,菌
立,U-1100)で0.1国
そ し て,直
よ びTF3の
を 示 し,出 発 時5×108CFU/mlの
培 養 細 胞 へ の菌 付 着 抑 制 作 用
B・G培
績
1) 茶,コ ー ヒ ー,EGCgお
の 増 殖 像 に 対 す る影 響 を 検 討 した.そ の 結 果,Fig.
で 培 養 し た.培
24時 間 お よ び48時 間 目 に,各
ウ ェ ル か ら培 養 物20μlず Misra
成
0.1mg/
記 希 釈 菌 液50μl
織 培 養 用 平 底Microplate
ル 中 で 等 量 混 和,湿
0.4,
Pu-erh
tea
d) Coffee
tea
Con-
堀内 善信 他
602
存 して 生 菌 数 の 減 少 が認 め られ た. 紅 茶 の 場 合,Fig.2bに
うに,1mg/mlで,EGCgで
示 す よ うに10%で
時 間 目で 生 菌 の検 出 が認 め られ ず,そ
は,24
め な か った.そ
れ 以 下 の濃
度 で も,茶 の濃 度 に依 存 して48時 間 ま で 継 続 的 な
れ 以 下 の 濃 度 で も,茶 同様,そ
れ
ぞ れ 濃 度 依 存 的 な殺 菌 効 果 が み られ た.
生 菌 数 の 減 少 が み られ た.
2) 培 養 細 胞 へ の 菌 付 着 抑 制 活 性
プ ァ ー ル茶 の 場 合,Fig.2cに
み られ る よ うに,
48時 間 以 内 で の 完 全 な殺 菌 に は10%の た.そ
は24時 間 で,ま たTF3
で は48時 間 で 完 全 な殺 菌 に至 り,生 菌 の検 出 を 認
れ 以 下 の濃 度 で は,2%ま
次 に菌 定 着 に対 す る阻 止 の 可 能 性 を探 るた め,
濃 度を要 し
で は,48時
培 養HeLa細
間ま
胞 お よ びCHO細
胞 へ の 百 日咳 菌 の
付 着 に 及 ぼ す 緑 茶,紅 茶,EGCgお
よ びTF3の
で濃 度 に依 存 した 継 続 的 な 生 菌 数 の減 少 が 認 め ら
制 能 に つ い て 検 討 した.こ
れ た が,0.5%で
ンで 処 理 した 菌 液 の100倍 希 釈(103CFU/ml)に
は 十 分 な殺 菌 活 性 ば み られ な か っ
た.
れ らの 茶 お よび カ テ キ
い て細 胞 付 着 能 を調 べ た と ころ,Table
コ ー ヒー で は ,緑 茶10%で は み られ な か った が,10%お
見 られ た 急 速 な殺 菌
Table
よ び5%で
胞 お よびCHO細
目 まで に完 全 な 殺 菌 が認 め られ,さ
は24時 間
らに,2%の
抑 つ
1お よ び
2に 示 した よ うに,緑 茶 と紅 茶 は,HeLa細 胞 の いず れ に 対 す る 菌 付 着 を も
強 く抑 制 した.一 方,EGCgお
よびTF3の
低 濃 度 で も48時 間 目ま で に 完 全 な殺 菌 が 認 め られ
用 い た条 件 下 で は,HeLa,
た(Fig.2d),す
へ の菌 付 着 に対 して も,顕 著 な 抑 制 を示 さ な か っ
なわ ち,コ ー ヒ ーの 場 合,殺 菌 有
CHOの
場 合,
いず れ の 細 胞
効 濃 度 や 殺 菌 速 度 か らみ て,こ れ ま で 示 した 他 の
た.さ らに104CFU/mlの
茶 とは,殺
つ い て も検 討 した と こ ろ,細 胞 付 着 お よび 上 清 浮
菌 活 性 の機 作 が 異 な る可 能 性 が 考 え ら
れ た.
処 理 菌 液 を用 い た 場 合 に
遊 の 各 菌 数 は,用 い た 菌 濃 度 に 依 存 して そ れ ぞ れ
茶 成 分 の うちEGCgお
よびTF3が,既
菌 性 下 痢 症 起 因 菌 の場 合 と同 様,百 て も殺 菌 活 性 を 示 す か 否 か を,茶 検 討 した.そ の 結 果,Fig.3aお
Fig.
3
or
b)
shows
の場 合 と 同様 な結 果 で あ った.
と同 様 の方 法 で
3) 百 日咳 毒 素LP活
よび3bに 示 した よ
were TF3.
約10倍 に 増 加 した が,付 着 抑 制 に つ い て は103/ml
日咳 菌 に対 し
Bactericidal
bacteria
報8)の細
activity cultured
Viable
geometric
cell mean
a)
○;
1mg/ml
EGCg,
b)
○;
1mg/ml
TF3,
a) EGCg
of in
△; △;
and
a 100ƒÊl/well
numbers of
EGCg
百 日咳 毒 素 は,百
at
were least 200μg/ml
500μg/ml
TF3 of
S
counted
S at
3 repeated
B.
medium 0,
1, 3, 24
日咳 発 症 の 上 で 重 要 な役 割 を
pertussis.
5•~
108/ml
containing
a)
EGCg
Each
point
and
48
hr.
experiments.
EGCg, TF3,
against &
性 に対 す る不 活 化 作 用
□; □;
50μg/ml
100μg/ml
EGCg, TF3,
●;
●;
Control.
Control.
b) TF3
感染 症 学 雑 誌
第66巻
第5号
茶,カ テ キ ンの抗 百 日咳 作用 Table
1
EGCg
Inhibitory and TF3
tussis to HeLa
1):
Geometric
2):
Significantly
1%CA tions 37•Ž
of
1%
black
for
B. pertussis
were
100ƒÊg/ml and
min. and as
2
Inhibitory
EGCg and TF3
1): Geometric from
tea,
supernatant expressed
Table
per-
of green tea, black tea, of Bordetella
viable
adherent
with
100 229
number
of
to
the
cells
green
TF3
times.
HeLa
mean
1%
100ƒÊg/ml
The
cells
was
of two
at
in
four
the
結 果,Table
and wells.
3に 示 した よ うに5μg/mlのPTに
対 して,1%緑 びTF3は
担 うも の と考 え られ て い る.そ て,緑 茶,紅 茶,EGCgお
茶,紅
茶 は全 く不 活 化 作 用 を 示 さ
つ い て,百
日咳 毒 素 に 対 す る不 活 化 能 の 検 討 を 行 った.そ
3
Inhibitory
1):
Geometric
5ƒÊg/ml the
expressed
平 成4年5月20日
mean
of five
PT, 1ƒÊg/ml
concentrations
injected
with as
action
of
promoting
PT
0.5ml geometric
mice
in the
of each mean
tea,
(control) table.
mixture counts
不 活 化 作 用 を 示 した.一
black
of pertussis
2):
or saline
shown
green
activity
Five and
95% was
mixed
bled
of leuco-lymphocytes
EGCg
and
TF3
on
the
leuco-
interval with old
3 days
green female later. per
tea, ddY The
,al
black mice
tea, were
residual
of the
blood
EGCg
or TF3
intraperitoneally LP
匹敵す る
方,EGCgは5μg/mlの
toxin
confidential
of 4 weeks were
tea,
こ ろ が,
用 い た 場 合,緑 茶 は や は り不 活
化 作 用 を 示 さ な か った が,紅 茶 はTF3に
の
よ
と も に 顕 著 な 不 活 化 作 用 を 示 し,特 に
強 い 不 活 化 作 用 が 認 め られ た.と
1μg/mlのPTを
性を指標 とし
よ びTF3に
lymphocytosis
TF3に
こで,代 表 的 な百
日咳 毒 素 活 性 の 一 つ で あ るLP活
as
1. except for using CHO cells.
dilu-
counted
or
in Table
or
in wells
bacteria
mean
な か った.こ れ に 対 して,100μg/mlのEGCgお
Table
per-
2): Significantly different from control (p= 0.05) The experiment was carried out in the same manner
(p=0.05)
treated
diluted
with
a geometric
control
EGCg,
were
The
action
on adherence
tussis to CHO cells
co-incubated 45
tea,
of Bordetella
cells
different
(control) were
of green tea, black
mean
106CFU/ml tea,
action
on adherence
603
activities
samples.
were
at
堀 内 善信 他
604
PTの
場 合 と異 な り僅 か な不 活 化 作 用 し か 示 さ な
か った.
し か し,殊 に 紅 茶 とEGCgの が,PTの
考 近 年,健
濃 度 に よ っ て は 逆 転 を み せ た こ とか ら,
これ らのLP活
察
康 に 対 す る 関 心 の 高 ま りと と も に,食
不 活化 作 用 の 強 さ
性 不 活 化 の機 序 に多 様 性 の あ る こ
とが推 察 され る.ま た,緑 茶,紅 茶 ま た はEGCgの
品 の 生 体 調 節 機 能 に着 目 した 研 究 が 多 くみ られ る
腹 腔 内 投 与 に よ って,マ
よ うに な っ た.我 々6)7)は,50種 以 上 の 食 品 を ス ク
白血 球 の 増 多 が観 察 され た.こ の こ とは,緑 茶 お
リー ニ ン グ した 結 果,茶
よ び紅 茶 の 多 様 な 成 分 やEGCgが,末
や コ ー ヒー が,多
くの細
ウス 末 梢 リンパ 球 お よび
梢 リン パ球
菌 性 下 痢 起 因 菌 に対 して 抗 菌 作 用 を有 す る こ とを
や 白血 球 に対 して 生 理 活 性 を 有 す る こ とを 示 す も
報 告 した.ま
の と考 え られ る.こ の 活 性 と,緑 茶 お よ び紅 茶 が
MRSA13)に
た,茶 や カテ キ ン が 皮 膚 糸 状 菌12)や 対 し て も 殺 菌 作 用 を 有 す る こ とを 報
十 分 量 のEGCgやTF3を
有 して い る に も か か わ
らず,5μg/mlのPTに
告 した. 今 回,茶
お よ び コー ヒ ーが,さ
らに,呼
吸器 感
染 症 起 因 菌 の 一 つ で あ る百 日咳 菌 に 対 し て も殺 菌 活 性 を 有 す る こ とを見 い だ した.ま
た,そ
の殺 菌
対 し てLP活
性不 活 化 作
用 を示 さ な か った こ と との 関 連 は不 明 で あ る. 以 上,茶 類,EGCgお に対 して,殺
よ びTF3が
菌,菌 定 着 阻 止,あ
百 日咳 菌 感 染 るいは毒素不 活
活 性 は濃 度 依 存 的 で あ り,コ ー ヒ ーの そ れ は殺 菌
化 を通 じ て防 御 的 に働 き得 る可 能 性 が 示 され た.
時 間 や 有 効 濃 度 か らみ て,茶
今 後 さ ら に,百
とは作 用 機 作 が異 な
日咳 毒 素 の 他 の 活 性 に 対 す る不 活
る こ とを うか が わ せ た.ま た,茶 成 分 の うち,主
化 の 可 能 性 や,飲
な 有 効 成 分 と考 え られ たEGCgお
検 討 な ど,実 用 化 に 向 け た 研 究 を行 うこ とは,日
よびTF38)は,
用,噴
霧 吸 入 とい った 投 与 法 の
百 日咳 菌 に対 し て もや は り強 い殺 菌 活 性 を示 す こ
常 飲 用 し て い る茶 の 安 全 性 の 実 績 か らみ て も意 義
とを 確 認 した.
あ る もの と考 え られ る. 文 献 Prevention with use of vaccines
と こ ろ で,我 々14)は,茶が イ ン フル エ ン ザ ウイ ル ス の培 養 細 胞 へ の 感 染 を 阻 止 す る こ と を 報 告 し た.ま た,Relmanら20)は
1) Wright, P. F.: -Pertussis
百 日咳 菌 の様 々 な病 原 因
子 欠 損 変 異 株 の 定 着 能 を,CHO細
of the problem
胞 お よび家 兎
Infect.
気 管 上 皮 細 胞 を 用 い て 解 析 し,用 い た 継 代 細 胞 と
2) Kanai,
CHO細
こで,わ れ わ れ はHeLa細
胞 を 用 い て 緑 茶,紅 茶,EGCgお
よ びTF3
の 細 胞 へ の 百 日咳 菌 付 着 抑 制 能 を検 討 した.そ
の
結 果,緑 茶 お よ び紅 茶 が,常 用 飲 用 濃 度 の5分 の 1の=濃 度 で も,強 い菌 付 着 抑 制 作 用 を 示 す こ とが 明 ら か に な った.一 方,EGCgお
よ びTF3は,殺
菌 活 性 の場 合 と異 な り,用 いた 条 件 下 で は ほ とん ど菌 付 着 抑 制 作 用 を示 さず,殺 菌 活 性 と菌 付 着 抑 制 作 用 で は,互
い に 関 与 す る茶 成 分 の 有 効 量 も し
くは 種 類 に違 い の あ る こ とが 示 唆 され た. 次 に,百
日咳 が 毒 素 性 疾 患 の一 つ で あ る と考 え
られ て い る こ と か ら,茶,EGCgお
よびTF3に
る百 日咳 毒 素 不 活 化 の可 能 性 を 探 った.ま 活 性 に対 す る作 用 を観 察 した 結 果,茶 ろEGCgやTF3に
よ
-143
and prospects Japan's
for control.
Rev.
1991.
evidence
and vaccination
in
pertussis
in the past thirty
Jpn. J. Med. Sci. Biol., 33: 107
, 1980.
3) Fine, P. E.M. & Clarkson, J. A.: The recurrence of whooping cough: Possible implications for assessment of vaccine efficacy. Lancet, 20: 666-669, 1982. 4) Sato, Y., Kimura, M. & Fukumi, H.: Development of a pertussis component vaccine in Japan. Lancet, 1: 122-126, 1984. 5) Robinson, A., Irons, L.I. & Ashworth, L.A. E.: Pertussis vaccine: Present status and future prospects. Vaccine, 3: 11-22, 1985. 6) Toda, M., Okubo, S., Hiyoshi, R. & Shimamura, T.: The bactericidal activity of tea and coffee. Lett. Appl. Microbiol., 8: 123-125, 1989. 7)
ずLP
戸 田 眞 佐 子,
大 久 保 幸 枝,
大 西 玲 子,
島 村 忠 勝:
日 本 茶 の 抗 菌 作 用 お よ び 殺 菌 作 用 に つ い て. 菌 誌,
よ りは む し
強 い 不 活 化 作 用 が 認 め られ た.
K.:
years—Review.
胞 お よび
Countries: Definition
Dis., 13: S528-534,
epidemiology
初 代 気 管 細 胞 間 で 基 本 的 に 差 異 の な い 結 果 を報 告 して い る.そ
in Developing
8)
44:
669-672,
戸 田 眞 佐 子,
日細
1989.
大 久 保 幸 枝,
生貝
感 染症 学 雑 誌
初,
島 村 忠 勝:
第66巻
第5号
茶,カ テ キ ンの 抗百 日咳 作用
茶 カテ キ ン類 お よ びそ の構 造 類 似物 質 の 抗 菌作 用
infection
な ら び に 抗 毒 素 作 用.
-40
日 細 菌 誌,
45:
561-566,
1990. 9)
征 彦,
石上
正:
Bordetella
茶 ポ リフ ェ ノール 類 の食 中 日食 工 誌,
16) 征 彦,
渡 辺 真 由 美:
茶 ポ リフ ェ ノール 類 の ボ
ツ リ ヌ ス 菌 に 対 す る 抗 菌 作 用. -955 , 1989.
大 久 保 幸 枝,
戸 田 眞 佐 子,
日食 工 誌, 36: 951
征 彦,
用.
日細 菌 誌,
戸 田 眞 佐 子, Methicillin
46:
509-514,
大 久 保 幸 枝, resistant
征 彦,
Staphylococcus
島 村 忠 勝: に対
す る カ テ キ ン の 抗 菌 ・殺 菌 作 用. 日細 菌 誌, 46: 839 -845 , 1991.
14) Nakayama, Shimamura,
M., T.:
Toda,
M.,
Inhibition
Protective
Okubo,
of influenza
Activity
S.
&
virus
of Tea
and
11: 38
15: 17-26, 征 彦:
The detoxification
of
glutaraldehyde.
J.
1987.
茶 葉 カテ キ ン類 の抗 酸 化 作
日 本 農 芸 化 学 会 誌,
59:
129-134,
征 彦,
松 崎 妙 子,
鈴 木 建 夫:
茶成分のアンジ
61:
803-808,
日本 農 芸
1987.
18) Sekura, R. D., Fish, F., Manclark, C.R., Meade, B. & Yan, L.Z.: Pertussis Toxin-Affinity purification of a new ADP-ribosyltransferase. J. Biol. Chem., 258: 14647-14651, 1983. 19) Miles, A.A. & Misra, S. S.: The estimation of the bactericidal power of blood. J. Hyg., 38: 732-748, 1938. 20) Relman, D.A., Domenighini, M., Tuomanen, E. & Rappouli, R.: Filamentous hemagglutinin of Bordetella pertussis: Nucleotide sequence and crucial role in adherence. Proc. Natl. Acad. Sci., 86: 2637-2641, 1989.
島 村 忠 勝:
aureus
原
化 学 会 誌,
1991. 原
with
オ テ ン シ ン I変 換 酵 素 阻 害 能 に つ い て.
白癬 菌 に 対 す る 茶 お よ び カ テ キ ン の 抗 菌 ・殺 菌 作
13)
Microbiol.,
1985. 17)
原
原
用 に つ い て.
11) Toda, M., Okubo, S., Ikigai, H., Suzuki, T., Suzuki, Y. & Shimamura, T.: The protective activity of tea against infection by Vibrio cholerae 01. J. Appl. Bacteriol., 70: 109-112, 1991. 12)
松 崎 妙 子,
Y.:
pertussis
Biol. Stand.,
36: 996-999,
1989. 原
by tea. Lett. Appl.
, 1990.
15) Iida, T. & Horiuchi,
原
毒 菌 に 対 す る 抗 菌 活 性.
10)
605
Catechins
against
Bordetella
pertussis
Yoshinobu HORIUCHI1), Masako TODA1), Sachie OKUBO1), Yukihiko HARA2) & Tadakatsu SHIMAMURA1) 1)Department
of Microbiology
and Immunology
2)Food Research
, Showa University School of Medicine Laboratories , Mitsui Norin Co.
We examined the bactericidal activity of tea and catechins against Bordetella pertussis. Green tea, black tea and coffee showed marked bactericidal activity at their concentrationsin beverages, while pu-erh tea killed the bacteria in a moderate way. (-) Epigallocatechin gallate (EGCg) and theaflavin digallate (TF3) showed also marked bactericidal activity. Green tea and black tea also effectively blocked the adhesion of B. pertussis to HeLa and CHO cells, whereas ECGg and TF3could not. EGCg and TF3 markedly inactivated leuco-lymphocytosis promoting activity of pertussistoxin. Black tea showed slight but significant inactivation of the activity, whereas green tea showed no inactivation. These results suggest that green tea, black tea, EGCg and TF3 might act as prophylactic agents against pertussis infection.
平成4年5月20日
