Lehrstuhl für Pharmazeutische Biologie der Universitat Tübingen
PRODUKTION VON INDOLALKALOIDEN IN CALLUSKULTUREN VON CATHARANTHUS ROSEUS
Production of lndole Alkaloids in Tissue Cultures of Catharanthus roseus Von G. DOLLER, A. W. ALFERMANN und E. REINHARD Y
Zusammenfassung In fiinf verschiedenen Callusstammen von C a t h a r a n t h u s r O s e u s konnte das Indolalkaloid Serpentin und teilweise auch Raubasin nachgewiesen werden. Der Serpentingehalt ist in den verschiedenen Zellstammen unter gleichen Kulturbedingungen sehr stark unterschiedlich, somit offensichtlich durch genetische Faktoren determiniert. ln einem daraufhin untersuchten Callusstamm kann die Hohe des Serpentingehaltes bezogen auf das Trockengewicht von 0,01 bis 0,5O!o regtlliert werden und erreicht damit Werte, wie sie in der fiir die tecbnische Serpentingewinnung verwendeten Wurzeldroge vorkommen. Abstract Five different tissue cultures of Catharanthus roseus were investigated for the indole alkaloids serpentine and ajmalicine. In al1 ce11 lines serpentine could be detected, whereas ajmalicine was only present sometimes at low concentrations. The serpentine content of the different ce11 lines differed under the same cultural conditions, thus indicating that it was regulated by genetic factors. In one ceIl line the serpentine content could be regulated by cultural conditions from 0,01 to O,SO/oon a dry weight basis. This means that serpentine occurs in tissue cultures in amounts comparable with those found in roots of Catharanthus which serve as source for the technical production of serpentine.
Einleitung Es wurden schon zahlreiche Versuche unternommen, mit Hilfe von pflanzlichen Zellkulturen pharmazeutisch oder technisch wichtige~lnhaltsstoffezu produzieren.
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Herrn Prof. Dr. E. Scbratz zum 75. Geburtstag gewidmet
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In den meisten Fallen enthalten pflanzliche Zellkulturen die gewünschten Inhaltsstoffe der Stammpflanze jedoch gar nicht oder nur in solch geringen Konzentrationen, daB sich eine technische Ausbeutung nicht lohnt. Die Gründe hierfür Sind (1973) ausführlich dis.kutiert worden. vielfaltig und von TEUSCHER Catharanthus roseus G. DON enthalt eine Reihe von Alkaloiden, die einerseits für die Behandlung bestimmter maligner Tumoren verwendet werden - wie das Vincaleucoblastin oder das Vincristin - oder die, wie das Serpentin bzw. sein Hydrierungsprodukt, das Raubasin, Bedeutung für die Therapie des Bluthochdruckes erlangt haben. ~alluskulturenvon Catharanthus roseus sind schon seit langem bekannt, auch stoBt Kultivierung in Fermentern auf keine prinzipiellen Schwierigkeiten. Ebenfalls konnte nachgewiesen werden, daB Zellkulturen von Catharanthus zumindest einen Teil der typischen Indolalkaloide der Stammpflanze zu bilden vermogen (Zusammenfassung bei CAREW,1975). Vor allem ist die Biosynthese der Indolalkaloide in ihren Grundzügen bekannt und erst kürzlich gelang auch ihre Synthese in einem zellfreien System ( S C Ound ~ LEE, 1975). Bisher wurden jedoch noch keine Angaben über den ~ e h a l tan einzelnen Alkaloiden in Zellkulturen von Catharanthus gemacht. Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher verschiedene Callusstamme von Catharanthus roseus insbesondere auf ihren Gehalt an Serpentin und Raubasin untersucht. Es konnte gezeigt werden, dai3 die Hohe der Akkumulation dieser Alkaloide in den verschiedenen Zellstammen unter gleichen Kulturbedingungen unterschiedlich ist, also offensichtlich durch genetische Faktoren determiniert wird; andererseits ist der Sepentingehalt in einem daraufhin untersuchten Zellstamm auch durch die Zusammensetzung des Kulturmediums sowie AuBenfaktoren (LichtIDunkel) regulierbar. Die Fahigkeit zur Alkaloidbildung ist in diesem Stamme auch noch 10 Jahre nach seiner Isolierung erhalten geblieben; er erreicht eine Serpentinkonzentration, wie sie von der für die technische Serpentingewinnung venvendeten Wurzeldroge bekannt ist.
Material und Methoden Für die Untersuchungen wurden die folgenden Callusstamme verwendet: Callusstamm 1 - Dieser Callusstarnm wurde uns unter der Bezeichnung ,,Vinca Prag, D 103" freundlicherweise von Herrn Prof. RICHTER,Hannover, überlassen. Callusstamm II - 1973 von einer Keimpflanze angelegt. Callusstamm III - 1974 von der Wurzel einer Keimpflanze isoliert, wozu das Saatgut aus Mocambique stammte. Callusstamm IV - Vom Keimblatt der gleichen Pflanze wie Callus III. Calliisstamm V - SproRcallus, 1966 angelegt. Diese Callusstamme wurden bisher auf dem Basalmedilim nach WHITE(1943) mit einem Zusatz von 7% Cocosmilch (Medium 1) in vierwochigen Passagen gehalten. Die Kultur erfolgte in
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Indolalkaloide in Catharanthus
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Doller, Alfermann und Reinhard
Planta medica Vol. 30 1976
Lux Klirnaschranken bei 27+/l.SO C bei einer Beleuchtungsstarke von 2000+/-200 (Osram-L-Fluora Leuchtstoffrohren),; .die Gewebeeinwaage zu Versuchsbeginn beuug jeweils 1 g Frischgewicht. Fernerhin wurden die Basalmedien nach HELLER (1953) - Medium II - sowie nach MURASHICEund -SKOOG(1962) - Medium III - in weiter unten angegebener Variation verwendet. Nach Gefriertrocknung des Gewebes wurden die Alkaloide mit Methanol extrahiert. Serpentin und Raubasin konnten durch Cochrornatographie mit authentischen Substanzen au£ Kieselgelfertigplatten Mer& mit folgenden FlielSrnitteln nachgewiesen werden: 12 3 4 5
Aceton, Methanol, Eisessig (70:25:5)
Eine quantitative Bestimmung des Serpentins erfolgte nach DC-Trennung mit FlieBrnittel 4 durch Vergleich der Fluoreszenzintensitat der MeBlosung mit der von Eichlosungen aus Serpentinhydrogentartrat unter Verwendung des Zeiss-Chrornatograrnmspektralphotometers PMQ II. AIS Anregungslicht diente die Hg-Lampe in Verbindung mit dern Sperrfilter 313 nrn, gemessen wurde bei einer Wellenlange von 450 nm. Die MeBwerte sind Mittelwerte aus drei verschiedenen Extraktionen mit jeweils vier MeBwerten. Raubasin wurde - wenn überhaupt - nur in so genngen Konzentrationen gefunden, daB auf eine quantitative Bestirnrnung veyzichtet wurde.
Ergebnisse und ~ i s k u s s i o n
Aus Tabelle 1 ist zu ersehen, daB der maximale Serpentingehalt in den untersuchten Callusstammen von Catharanthus roseus unter gleichen Kulturbedingungen sehr unterschiedlich ist. Den hochsten Gehalt weisen auf Medium 1 die Stamme II und V mit 0.14 bzw. 0.16°/o auf. Stamm II wurde erst 1973, Stamm V jedoch schon 1966 angelegt. Es ist von Interesse, daB dieser Zellstamm seine Fahigkeit zur Serpentinbildung über solch einen langen Zeitraum beibehalten hat. Die nachstehenden Versuche wurden daher mit diesem Stamm durchgeführt.
Tabelle 1 Serpentingehalt verschiedener Callusstamme von Catharanthus roseus bei Kultur irn Dauerlicht (27O C) auf Medium 1 Callusstarnm (010
1 II III IV
v
~erpentin~ehalt des Trockengew.)
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- n-Butanol, Methanol, Eisessig (4:l:l) - Aceton, Methanol, Diathylamin (70:20:10) - Benzol, Aceton, Diathylamin (70:20:10) - Xylol, Methylathylketon (2:l) + 2010 Diathylarnin.
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Medium 1 enthalt Cocosmilch, daher wurde zunachst nach synthetischeq Medien gesucht, au£ denen Catharanthus Calluskulturen gut wachsen und auch einen moglichst hohen Serpentingehalt aufweisen. Vorversuche zeigten, daB sich hierfür sowohl das Basalmedium nach HELLER(1953) - Medium II - wie auch das nach MURASHICE und SKOOG(1962) - Medium III - eignen. Es ist bekannt, daB die Bildung von Sekundarstoffen in Zellkulturen durch die Art und die Konzentration von Wuchsstoffen regulierbar ist (v. BROCKE1972, TABATA et al. 1972, NAGEL1974, ALFERMANN et al. 1975, ZENKet al. 1975). Tabelle II zeigt, daB bei Verwendung von Medium II bis auf eine Ausnahme keine deutlichen Unterschiede im Serpentingehalt auftreten, wenn das Medium IAA an Scelle von NAA enthalt. Einen groBeren EinfluB au£ die Serpentinakkumulation hat das Verhaltnis von AuxidKinetin, die Anwesenheit w n Caseinhydrolysat (Difco) und die Beleuchtung (Tabelle III). T a b e l l e II Serpentingehalt von Callusstamm V bei Kultur im Licht (27O C) auf Medium II mit verschiedenen Kombinationen der Wuchsstoffe Kinetin, Indolylessigsaure (IAA) und Naphthylessigsaure (NAA) Wuchsstoffkornbination
Serpentingehalt (010 des Trockengew.)
KinetidNAA (1:4) KinetinIlAA (1:4) KinetinINAA (1:100) KinetidIAA (1:lOO) KinetidNAA (20:l) KinetinIIAA (20: 1)
0.36 0.35 0.31 0.50 0.31 0.37
Tabelle III Serpentirigehalt von Callusstarnm V bei Kultur auf Medium III mit unterschiedlichen Kombinationen KinetinIIAA ohne bzw. mit 1 g/L Caseinhydrolysat im Licht (2000 Lux) bzw. im Dunkeln bei 27' C Wuchsstoff kombination KinetinIIAA
Serpentingehalt (Olo des Trockengew.) ohne Casein ohne Casein mit Casein ohne Casein ohne Casein
Licht Dunkel Licht Licht Licht
0.46 0.09 0.04 0.09 0.06
TEUSCHER (1973) betont, daB der meist geringe Gehalt an Sekundarstoffen in pflanzlichen Zellkulturen durch eine nicht ausreichende Versorgung mit Bio-
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Doller, Alferrnann undReinhard
Planta rnedica Vol. 30 1976
synthesevorstufen bedingt sein konnte. Tryptophan, Tryptamin und Geraniol, die Biosynthesevorstufen der Indolalkaloide darstellen (GROCER 1969, CORDELL 1974), wurden daher Medium III in verschiedenen Konzentrationen zugesetzt. Aus Tabelle IV geht hervor, daB: hohere Konzentrationen dieser Verbindungen - verbunden mit einer Wachsturnshemrnung - die Serpentinakkumulation hemmen. Dies -dernonstriert insbesondere der Serpentingehalt berechnet auf das gesamte sich in einem Erlenmeyerkolben befindliche Gewebe. Eine gewisse Ausnahrne stellt Tryptamin dar, das relativ wenig toxisch ist.
Zugesetzte Vorstufe (rng/L)
(010
Serpentingehalt . des Trockengew.)
mg Serpentin pro Erlenmeyerkolben
--
Kontrolle 50 - Tryptophan 100 - Tryptophan 5 0 - Tryptanin 100 - Tryptanin 10 - Geraniol 5 0 - Geraniol 100 - Geraniol 150 - Geraniol 200 - Geraniol
Dieser Befund steht im Gegensatz zu Untersuchungen von VELIKYund BARBER (1975), die bei suspensionskul&ren von Phaseolus vulgaris durch Zusatz von 1 g/L Tryptophan die Konzentration von Harrnan und Norharrnan irn Medium u m das 30fache steigern konnten. Ebenso erhielten GARNIERund MOREL(1972) bei Catharanthus roseus den hochsten Gehalt an Gesamtalkaloiden auf einem Medium, das Tryptophan enthielt. CZYGAN(1975) berichtet jedoch, daB nur unter suboptirnalen Bedingungen ein Tryptophanzusatz den Gehalt an dimeren Indolalkaloiden in Calluskulturen von Catharanthus steigert. Dies konnte eventue11 im Falle von GARNIERund MOREL zutreffen, denn ihre Werte für den Gesarntalkaloidgehalt liegen noch deutlich unter unseren für den Serpentingehalt. O b die zugesetzten Biosynthesevorstufen überhaupt in das gebildete Serpentin eingebaut werden, wurde von uns nicht untersucht. In diesern Zusarnrnenhang ist interessant, daB VELIKYund BARBER(1975) angeben, daB nur etwa Solo des zugesetzten Tryptophans in die Alkaloide von Phaseolus eingebaut werden. NETTLESHIP und SLAYTOR(1974) fanden darüber hinaus, daB bei Peganum harrnala Calluskulturen Tryptophan ebenfalls nur in .auBerst geringem MaBe in die Alka-
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Tabelle IV Serpentingehalt von Callusstamm V auf Medium III mit KinetinIIAA (10:l) im Licht bei 27O C bei Zusatz verschiedener Biosynthesevorstufen
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loide eingebaut wird. Sie nehmen an, daB hierfür eine Kompartimentierung in der Zelle verantwortlicli ist. Andererseits kann der Zeitpunkt der Vorstufenzugabe von groger Bedeutung für eine Beeinflussung der Alkaloidsynthese sein, wie die Untersuchungen von F ~ o s et s al. (1974) mit Claviceps zeigen. Die vorliegenden Versuche zeigen, daB die Akkumulation von Serpentin in verschiedenen -Calluskulturen von Catharanthus roseus unter gleichen Kulturbedingungen deutlich unterschiedlich, und somit wohl durch genetische Faktoren ,determiniert ist. Die Hohe des Alkaloidgehaltes kann durch das Medium sowie Beleuchtung von 0.01 bis 0.50010 bezogen auf das Trockengewicht reguliert werden. Hiermit werden Serpentingehalte erreicht, die in der gleichen GroBenordnung liegen, wie man sie durchschnittlich in der für die technische Serpentingewinnung verwendeten Wurzeldroge von Catharanthus findet. Alkaloidgehalte in gleicher Hohe in einer Calluskultur wie in der Pflanze sind bisher unseres Wissens nur et al., 1975) bekannt. Es bleibt weiter zu für Macleaya microcarpa (KOBL~TZ prüfen, o b durch weitere Variation der Kulturbedingungen und unter Verwendung von Zellkulturen aus anderen Ausgangspflanzen der Serpentin- bzw. Raubasingehalt in Suspensionskultur noch gesteigert werden kann. Anhaltspunkte hierfür sind vorhanden. Mit Unterstützung des Bundesministeriums für Forschung und Technologie.
Literaturverzeihnis
ALFERMANN, A. W., D. MERZ und E. REINHARD:I'ianta medica Suppi. 197.5,70-78 BROCKE,W . VON: Ruta graueolens L., zur Kenntnis, Analytik und Bildungsphysiologie der Curnarine in Gewebekulturen. Diss., Tübingen 1972 CAREW,D. P. in: The Catharanthus Alakaloids. Botany, Chemistry, Pharrnacology, and Clinical eds., M. DEKKER, Inc., New York 193-208 (1975) Use. W. 1. TAYLORand N. R. FARNSWORTH, G. A.: Lloydia 37,219-298 (1974) CORDELL, CZYGAN, F.-C.: Planta rnedica Suppl. 1975,169-185 in: Metabolism and Regulation of Secondary F~ossH , . G., J. E. ROBBERSund P. F. HEINSTEIN eds., Acadernic Press, New York, 141-178 Plant Products. V. C. RUNECKLES and E. E. CONN, (1974) J. und C.MOREL:Physiol. Vég. 10,617-625 (1972) GARNIER, CROGER,D. und K. STOLLE:Ar&. Pharm. 298, 246-256 (1965) eds., Deutscher GROCER,D., in: Biosynthese der Alkaloide. K. MOTHESund H. R. SCH~TTE, Verlag der Wissenschaften, Berlin. 459485 und 699-703 (1969) R.: Ann. Sci. Nat. Bot. Biol. Vég. 14,l-223 (1953) HELLER, KOBLITZ,H., U. SCHUMANN,H. BOHMund J. FRANKE:Experientia 31, 768-769 (1975) T. und F. SKOOG:Physiol. Plant. 15, 473-497 (1962) MURASHIGE, NACEL,M.: Das atherische 0 1 der Calluskulturen von Ruta graveolens L., Diss. Tübingen 1974 NEITLESHIP,L. und M. SLAYTOR: Phytochem. 13,735-742 (1974) LEE: J. Amer. Chern. Soc. 97, 6906-6908 (1975) SCOTT,A. 1. und SIU-LEUNG
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Indolalkaloide in Catharanthus
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Doller, Alfermann und 'Reinhard
Planta medica Vol. 30 1976
N. HITAOKA,Y:MAMMOTOund N. KONOSHIMA: Phytochern. 10, TABATA,M., H. YAMAMOTO, 723-729 (1971) E.: Phannazie 28,6-18 (1973) TEUSCHER, 1. A. und K. M. BARBER: Lloydia 38,125-130 (1975) VELIKY, WHITE,P. R.: A Handbook of Plant Tissue Culture, Lancaster (1943) und U. SCHULTE:Planta rnedica, Suppl. 1975, 79-101 ZENK,M. H.,H. EL-SHAGI
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Anschrift der Verfasser: Dipl. Biol. Gabriele Doller, Dr. A. W . Alfermann und Prof. Dr. E. Reinhard, Lehrstuhl für Pharmazeutische Biologie der Universitut, Auf der Morgenstelle 8,D-74 Tübingen
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Production of lndole Alkaloids in Tissue Cultures of Catharanthus roseus Von G. DOLLER, A. W. ALFERMANN und E. REINHARD Y
Zusammenfassung In fiinf verschiedenen Callusstammen von C a t h a r a n t h u s r O s e u s konnte das Indolalkaloid Serpentin und teilweise auch Raubasin nachgewiesen werden. Der Serpentingehalt ist in den verschiedenen Zellstammen unter gleichen Kulturbedingungen sehr stark unterschiedlich, somit offensichtlich durch genetische Faktoren determiniert. ln einem daraufhin untersuchten Callusstamm kann die Hohe des Serpentingehaltes bezogen auf das Trockengewicht von 0,01 bis 0,5O!o regtlliert werden und erreicht damit Werte, wie sie in der fiir die tecbnische Serpentingewinnung verwendeten Wurzeldroge vorkommen. Abstract Five different tissue cultures of Catharanthus roseus were investigated for the indole alkaloids serpentine and ajmalicine. In al1 ce11 lines serpentine could be detected, whereas ajmalicine was only present sometimes at low concentrations. The serpentine content of the different ce11 lines differed under the same cultural conditions, thus indicating that it was regulated by genetic factors. In one ceIl line the serpentine content could be regulated by cultural conditions from 0,01 to O,SO/oon a dry weight basis. This means that serpentine occurs in tissue cultures in amounts comparable with those found in roots of Catharanthus which serve as source for the technical production of serpentine.
Einleitung Es wurden schon zahlreiche Versuche unternommen, mit Hilfe von pflanzlichen Zellkulturen pharmazeutisch oder technisch wichtige~lnhaltsstoffezu produzieren.
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Herrn Prof. Dr. E. Scbratz zum 75. Geburtstag gewidmet
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In den meisten Fallen enthalten pflanzliche Zellkulturen die gewünschten Inhaltsstoffe der Stammpflanze jedoch gar nicht oder nur in solch geringen Konzentrationen, daB sich eine technische Ausbeutung nicht lohnt. Die Gründe hierfür Sind (1973) ausführlich dis.kutiert worden. vielfaltig und von TEUSCHER Catharanthus roseus G. DON enthalt eine Reihe von Alkaloiden, die einerseits für die Behandlung bestimmter maligner Tumoren verwendet werden - wie das Vincaleucoblastin oder das Vincristin - oder die, wie das Serpentin bzw. sein Hydrierungsprodukt, das Raubasin, Bedeutung für die Therapie des Bluthochdruckes erlangt haben. ~alluskulturenvon Catharanthus roseus sind schon seit langem bekannt, auch stoBt Kultivierung in Fermentern auf keine prinzipiellen Schwierigkeiten. Ebenfalls konnte nachgewiesen werden, daB Zellkulturen von Catharanthus zumindest einen Teil der typischen Indolalkaloide der Stammpflanze zu bilden vermogen (Zusammenfassung bei CAREW,1975). Vor allem ist die Biosynthese der Indolalkaloide in ihren Grundzügen bekannt und erst kürzlich gelang auch ihre Synthese in einem zellfreien System ( S C Ound ~ LEE, 1975). Bisher wurden jedoch noch keine Angaben über den ~ e h a l tan einzelnen Alkaloiden in Zellkulturen von Catharanthus gemacht. Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher verschiedene Callusstamme von Catharanthus roseus insbesondere auf ihren Gehalt an Serpentin und Raubasin untersucht. Es konnte gezeigt werden, dai3 die Hohe der Akkumulation dieser Alkaloide in den verschiedenen Zellstammen unter gleichen Kulturbedingungen unterschiedlich ist, also offensichtlich durch genetische Faktoren determiniert wird; andererseits ist der Sepentingehalt in einem daraufhin untersuchten Zellstamm auch durch die Zusammensetzung des Kulturmediums sowie AuBenfaktoren (LichtIDunkel) regulierbar. Die Fahigkeit zur Alkaloidbildung ist in diesem Stamme auch noch 10 Jahre nach seiner Isolierung erhalten geblieben; er erreicht eine Serpentinkonzentration, wie sie von der für die technische Serpentingewinnung venvendeten Wurzeldroge bekannt ist.
Material und Methoden Für die Untersuchungen wurden die folgenden Callusstamme verwendet: Callusstamm 1 - Dieser Callusstarnm wurde uns unter der Bezeichnung ,,Vinca Prag, D 103" freundlicherweise von Herrn Prof. RICHTER,Hannover, überlassen. Callusstamm II - 1973 von einer Keimpflanze angelegt. Callusstamm III - 1974 von der Wurzel einer Keimpflanze isoliert, wozu das Saatgut aus Mocambique stammte. Callusstamm IV - Vom Keimblatt der gleichen Pflanze wie Callus III. Calliisstamm V - SproRcallus, 1966 angelegt. Diese Callusstamme wurden bisher auf dem Basalmedilim nach WHITE(1943) mit einem Zusatz von 7% Cocosmilch (Medium 1) in vierwochigen Passagen gehalten. Die Kultur erfolgte in
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Lux Klirnaschranken bei 27+/l.SO C bei einer Beleuchtungsstarke von 2000+/-200 (Osram-L-Fluora Leuchtstoffrohren),; .die Gewebeeinwaage zu Versuchsbeginn beuug jeweils 1 g Frischgewicht. Fernerhin wurden die Basalmedien nach HELLER (1953) - Medium II - sowie nach MURASHICEund -SKOOG(1962) - Medium III - in weiter unten angegebener Variation verwendet. Nach Gefriertrocknung des Gewebes wurden die Alkaloide mit Methanol extrahiert. Serpentin und Raubasin konnten durch Cochrornatographie mit authentischen Substanzen au£ Kieselgelfertigplatten Mer& mit folgenden FlielSrnitteln nachgewiesen werden: 12 3 4 5
Aceton, Methanol, Eisessig (70:25:5)
Eine quantitative Bestimmung des Serpentins erfolgte nach DC-Trennung mit FlieBrnittel 4 durch Vergleich der Fluoreszenzintensitat der MeBlosung mit der von Eichlosungen aus Serpentinhydrogentartrat unter Verwendung des Zeiss-Chrornatograrnmspektralphotometers PMQ II. AIS Anregungslicht diente die Hg-Lampe in Verbindung mit dern Sperrfilter 313 nrn, gemessen wurde bei einer Wellenlange von 450 nm. Die MeBwerte sind Mittelwerte aus drei verschiedenen Extraktionen mit jeweils vier MeBwerten. Raubasin wurde - wenn überhaupt - nur in so genngen Konzentrationen gefunden, daB auf eine quantitative Bestirnrnung veyzichtet wurde.
Ergebnisse und ~ i s k u s s i o n
Aus Tabelle 1 ist zu ersehen, daB der maximale Serpentingehalt in den untersuchten Callusstammen von Catharanthus roseus unter gleichen Kulturbedingungen sehr unterschiedlich ist. Den hochsten Gehalt weisen auf Medium 1 die Stamme II und V mit 0.14 bzw. 0.16°/o auf. Stamm II wurde erst 1973, Stamm V jedoch schon 1966 angelegt. Es ist von Interesse, daB dieser Zellstamm seine Fahigkeit zur Serpentinbildung über solch einen langen Zeitraum beibehalten hat. Die nachstehenden Versuche wurden daher mit diesem Stamm durchgeführt.
Tabelle 1 Serpentingehalt verschiedener Callusstamme von Catharanthus roseus bei Kultur irn Dauerlicht (27O C) auf Medium 1 Callusstarnm (010
1 II III IV
v
~erpentin~ehalt des Trockengew.)
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- n-Butanol, Methanol, Eisessig (4:l:l) - Aceton, Methanol, Diathylamin (70:20:10) - Benzol, Aceton, Diathylamin (70:20:10) - Xylol, Methylathylketon (2:l) + 2010 Diathylarnin.
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Medium 1 enthalt Cocosmilch, daher wurde zunachst nach synthetischeq Medien gesucht, au£ denen Catharanthus Calluskulturen gut wachsen und auch einen moglichst hohen Serpentingehalt aufweisen. Vorversuche zeigten, daB sich hierfür sowohl das Basalmedium nach HELLER(1953) - Medium II - wie auch das nach MURASHICE und SKOOG(1962) - Medium III - eignen. Es ist bekannt, daB die Bildung von Sekundarstoffen in Zellkulturen durch die Art und die Konzentration von Wuchsstoffen regulierbar ist (v. BROCKE1972, TABATA et al. 1972, NAGEL1974, ALFERMANN et al. 1975, ZENKet al. 1975). Tabelle II zeigt, daB bei Verwendung von Medium II bis auf eine Ausnahme keine deutlichen Unterschiede im Serpentingehalt auftreten, wenn das Medium IAA an Scelle von NAA enthalt. Einen groBeren EinfluB au£ die Serpentinakkumulation hat das Verhaltnis von AuxidKinetin, die Anwesenheit w n Caseinhydrolysat (Difco) und die Beleuchtung (Tabelle III). T a b e l l e II Serpentingehalt von Callusstamm V bei Kultur im Licht (27O C) auf Medium II mit verschiedenen Kombinationen der Wuchsstoffe Kinetin, Indolylessigsaure (IAA) und Naphthylessigsaure (NAA) Wuchsstoffkornbination
Serpentingehalt (010 des Trockengew.)
KinetidNAA (1:4) KinetinIlAA (1:4) KinetinINAA (1:100) KinetidIAA (1:lOO) KinetidNAA (20:l) KinetinIIAA (20: 1)
0.36 0.35 0.31 0.50 0.31 0.37
Tabelle III Serpentirigehalt von Callusstarnm V bei Kultur auf Medium III mit unterschiedlichen Kombinationen KinetinIIAA ohne bzw. mit 1 g/L Caseinhydrolysat im Licht (2000 Lux) bzw. im Dunkeln bei 27' C Wuchsstoff kombination KinetinIIAA
Serpentingehalt (Olo des Trockengew.) ohne Casein ohne Casein mit Casein ohne Casein ohne Casein
Licht Dunkel Licht Licht Licht
0.46 0.09 0.04 0.09 0.06
TEUSCHER (1973) betont, daB der meist geringe Gehalt an Sekundarstoffen in pflanzlichen Zellkulturen durch eine nicht ausreichende Versorgung mit Bio-
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synthesevorstufen bedingt sein konnte. Tryptophan, Tryptamin und Geraniol, die Biosynthesevorstufen der Indolalkaloide darstellen (GROCER 1969, CORDELL 1974), wurden daher Medium III in verschiedenen Konzentrationen zugesetzt. Aus Tabelle IV geht hervor, daB: hohere Konzentrationen dieser Verbindungen - verbunden mit einer Wachsturnshemrnung - die Serpentinakkumulation hemmen. Dies -dernonstriert insbesondere der Serpentingehalt berechnet auf das gesamte sich in einem Erlenmeyerkolben befindliche Gewebe. Eine gewisse Ausnahrne stellt Tryptamin dar, das relativ wenig toxisch ist.
Zugesetzte Vorstufe (rng/L)
(010
Serpentingehalt . des Trockengew.)
mg Serpentin pro Erlenmeyerkolben
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Kontrolle 50 - Tryptophan 100 - Tryptophan 5 0 - Tryptanin 100 - Tryptanin 10 - Geraniol 5 0 - Geraniol 100 - Geraniol 150 - Geraniol 200 - Geraniol
Dieser Befund steht im Gegensatz zu Untersuchungen von VELIKYund BARBER (1975), die bei suspensionskul&ren von Phaseolus vulgaris durch Zusatz von 1 g/L Tryptophan die Konzentration von Harrnan und Norharrnan irn Medium u m das 30fache steigern konnten. Ebenso erhielten GARNIERund MOREL(1972) bei Catharanthus roseus den hochsten Gehalt an Gesamtalkaloiden auf einem Medium, das Tryptophan enthielt. CZYGAN(1975) berichtet jedoch, daB nur unter suboptirnalen Bedingungen ein Tryptophanzusatz den Gehalt an dimeren Indolalkaloiden in Calluskulturen von Catharanthus steigert. Dies konnte eventue11 im Falle von GARNIERund MOREL zutreffen, denn ihre Werte für den Gesarntalkaloidgehalt liegen noch deutlich unter unseren für den Serpentingehalt. O b die zugesetzten Biosynthesevorstufen überhaupt in das gebildete Serpentin eingebaut werden, wurde von uns nicht untersucht. In diesern Zusarnrnenhang ist interessant, daB VELIKYund BARBER(1975) angeben, daB nur etwa Solo des zugesetzten Tryptophans in die Alkaloide von Phaseolus eingebaut werden. NETTLESHIP und SLAYTOR(1974) fanden darüber hinaus, daB bei Peganum harrnala Calluskulturen Tryptophan ebenfalls nur in .auBerst geringem MaBe in die Alka-
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Tabelle IV Serpentingehalt von Callusstamm V auf Medium III mit KinetinIIAA (10:l) im Licht bei 27O C bei Zusatz verschiedener Biosynthesevorstufen
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loide eingebaut wird. Sie nehmen an, daB hierfür eine Kompartimentierung in der Zelle verantwortlicli ist. Andererseits kann der Zeitpunkt der Vorstufenzugabe von groger Bedeutung für eine Beeinflussung der Alkaloidsynthese sein, wie die Untersuchungen von F ~ o s et s al. (1974) mit Claviceps zeigen. Die vorliegenden Versuche zeigen, daB die Akkumulation von Serpentin in verschiedenen -Calluskulturen von Catharanthus roseus unter gleichen Kulturbedingungen deutlich unterschiedlich, und somit wohl durch genetische Faktoren ,determiniert ist. Die Hohe des Alkaloidgehaltes kann durch das Medium sowie Beleuchtung von 0.01 bis 0.50010 bezogen auf das Trockengewicht reguliert werden. Hiermit werden Serpentingehalte erreicht, die in der gleichen GroBenordnung liegen, wie man sie durchschnittlich in der für die technische Serpentingewinnung verwendeten Wurzeldroge von Catharanthus findet. Alkaloidgehalte in gleicher Hohe in einer Calluskultur wie in der Pflanze sind bisher unseres Wissens nur et al., 1975) bekannt. Es bleibt weiter zu für Macleaya microcarpa (KOBL~TZ prüfen, o b durch weitere Variation der Kulturbedingungen und unter Verwendung von Zellkulturen aus anderen Ausgangspflanzen der Serpentin- bzw. Raubasingehalt in Suspensionskultur noch gesteigert werden kann. Anhaltspunkte hierfür sind vorhanden. Mit Unterstützung des Bundesministeriums für Forschung und Technologie.
Literaturverzeihnis
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Anschrift der Verfasser: Dipl. Biol. Gabriele Doller, Dr. A. W . Alfermann und Prof. Dr. E. Reinhard, Lehrstuhl für Pharmazeutische Biologie der Universitut, Auf der Morgenstelle 8,D-74 Tübingen
