Übersicht
Möglichkeiten der molekularen Diagnostik von Nierenzelltumoren Possibilities of Molecular Diagnosis of Renal Cell Carcinoma
Autor
K. Junker
Institut
Klinik für Urologie und Kinderurologie, Universitätsklinikum des Saarlandes
Schlüsselwörter ▶ Nierentumoren ● ▶ molekulare Diagnostik ● ▶ Prognoseparameter ●
Zusammenfassung
Abstract
▼
▼
Die primär histologisch definierten Subtypen (klarzellig, papillär, chromophob, Onkozytom) der Nierenzelltumoren müssen aufgrund ihrer spezifischen differenten molekularen Veränderungen sowie der unterschiedlichen Prognose als eigenständige Tumorentitäten betrachtet werden. Immunhistochemische und genetische Analysen können zur Diagnosestellung in unklaren Fällen eingesetzt werden und gewinnen mehr und mehr Bedeutung für die individuelle Therapieentscheidung. Eine weitere Differenzierung der Prognose innerhalb der Subtypen scheint zukünftig durch molekulare Signaturen des Primärtumors möglich, die eine individuelle Vorhersage der Aggressivität und insbesondere des Metastasierungspotenzials erlauben werden. Prädiktive molekulare Marker aus dem Blut sowie aus Tumorgewebeproben werden zu einer individuellen Vorhersage des Therapieansprechens beitragen. Um die vielversprechenden Ansätze beim Nierenzellkarzinom auch in die klinische Praxis umzusetzen, sind Validierungsstudien notwendig, die nach klaren Kriterien, ähnlich wie sie für Therapiestudien definiert sind, durchgeführt werden.
Histologically defined subtypes of renal cell tumors (clear cell, papillary, chromophobe, oncocytoma) have to be accepted as distinct tumor entities based on specific and distinct molecular alterations and different prognosis. Immunochemistry and genetic analysis can be used for diagnosis in uncertain cases and are more and more important for individual therapy selection. Differentiation of prognosis in each subtype seems possible by using molecular signatures of primary tumors allowing individual assessment of aggressiveness and metastatic potential. Molecular markers from blood as well as from tumor tissues can predict therapy response in the future. In order to transfer these promising data into clinical practice it is mandatory to develop validation studies which have to be performed based on defined criteria similar to those for therapeutic clinical trials.
Nierenzellkarzinome (NZK) haben einen Anteil von 3 % an allen malignen Erkrankungen im Erwachsenenalter. Es ist heute klar belegt, dass die primär histologisch definierten Subtypen (klarzellig, papillär, chromophob, Onkozytom) aufgrund ihrer spezifischen differenten molekularen Veränderungen sowie der unterschiedlichen Prognose als eigenständige Tumorentitäten betrachtet werden müssen.
Diagnostik und Klassifizierung der Nierenzelltumoren
Key words ▶ kidney cancer ● ▶ molecular diagnostics ● ▶ prognostic parameters ●
Erstpublikation DOI http://dx.doi.org/ 10.1055/s-0034-1369137 TumorDiagn u Ther 2014; 35: 194–196 © Georg Thieme Verlag KG Stuttgart · New York ISSN 0722-219X Bibliografie DOI http://dx.doi.org/ 10.1055/s-0034-1389946 Akt Urol 2014; 45: 370–373 © Georg Thieme Verlag KG Stuttgart · New York ISSN 0001-7868 Korrespondenzadresse Prof. Dr. Kerstin Junker Klinik für Urologie und Kinderurologie Universitätsklinikum des Saarlandes Kirrbergerstraße 1 66424 Homburg Tel.: + 49/6841/161 4734 Fax: + 49/6841/162 4756 [email protected]
Junker K. Möglichkeiten der molekularen Diagnostik … Akt Urol 2014; 45: 370–373
▼ Ist die Klassifikation anhand des histomorphologischen Bildes nicht sicher möglich, können immunhistochemische und genetische Analysen eingesetzt werden, die mehr und mehr auch für Biopsien an Bedeutung für die individuelle Therapieentscheidung gewinnen. In verschiedenen Studien konnten spezifische genetische Veränderungen für die häufigsten Subtypen der Nierenzelltumoren definiert werden, die zur Klassifizierung genutzt werden kön-
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nen. So sind die klarzelligen NZK in fast 100 % durch einen Verlust auf dem Chromosom 3 charakterisiert, während die papillären NZK Zugewinne der Chromosomen 7 und 17 aufweisen. Chromophobe NZK sind durch kombinierte Verluste der Chromosomen 1, 2, 6, 10, 13, 17 und 21 gekennzeichnet, die gutartigen Onkozytome durch den Verlust von Chromosom 1 oder in seltenen Fällen durch eine Translokation unter Beteiligung des Chromosoms 11. Es ist heute leicht möglich, diese Veränderungen sicher durch die Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung (FISH) an isolierten Zellkernen aus kryokonserviertem Gewebe oder an Schnittpräparaten von paraffin-eingebetteten Gewebeblöcken durchzuführen ▶ Abb. 1). Wir haben hierzu in unserer Arbeitsgruppe ein Test(● system entwickelt [1]. Die FISH stellt eine robuste Methode dar, die in der molekularen Pathologie zu den Standardtechniken zählt. Wir konnten darüber hinaus zeigen, dass die FISH zur Erhöhung der diagnostischen Sicherheit an der Biopsie des Nierentumors führt [2]. Von zunehmendem Interesse sind auch epigenetische Veränderungen, zu denen die DNA-Methylierung, Histonmodifikationen sowie die miRNAs zählen. Diese kurzen, nichtkodierenden RNAs regulieren die Genexpression durch Bindung an mRNAs posttranskriptional. Auch miRNAs könnten in Zukunft zur Diagnosesicherung genutzt werden. So zeigten Youssef et al., dass eine akkurate Klassifizierung der Subtypen des NZK mithilfe von spezifischen miRNA-Signaturen möglich ist [3]. Papilläre NZK werden inzwischen noch einmal in Typ 1 und 2 unterteilt, basierend auf einem unterschiedlichen histomorphologischen Bild und unterschiedlichen molekularen Veränderungen. Allerdings fehlen derzeit noch validierte gesicherte Marker für eine zuverlässige Subklassifizierung. Zukünftig sind sicher auch Marker aus Blut oder Urin gefragt, die eine frühzeitige, einfache Diagnostik, aber auch eine entsprechende sensitive Nachsorge nach primärer Therapie ermöglichen. In den letzten Jahren wurden Proteine bzw. Proteinsignaturen im Blut identifiziert, die den Nachweis von vor allem klarzelligen NZK erlauben sollen. Serumamyloidalpha (SAA-1), ein Akutphaseprotein, wurde hier von Tolson et al. in einer Proteinsignatur identifiziert und auch von unserer Gruppe bestätigt [4]. Aber auch freie DNA oder miRNAs können als Marker dienen. Von zunehmendem Interesse sind die sog. Exosomen – Mikrovesikel, die von Tumorzellen in die Zirkulation abgegeben werden und tumorspezifisch bestimmte RNAs und miRNAs enthalten, die entsprechend quantifiziert werden können.
Prognosebewertung
▼ Die weitere Differenzierung der Subtypen macht es möglich, aggressive, metastasierende Tumoren zu identifizieren. In den letzten Jahren wurde eine ganze Reihe von molekularen Markern beschrieben, die eine signifikante Korrelation mit der Metastasierung oder dem Überleben für die klarzelligen NZK zeigen, z. T. konnten diese Marker auch als unabhängige Prognoseparameter bestätigt werden. Zugewinne und Verluste in spezifischen chromosomalen Regionen wurden zunächst durch konventionelle Techniken – wie die vergleichende genomische Hybridisierung – identifiziert. Arraybasierte hochauflösende Analysen sowie die FISH konnten diese Ergebnisse bestätigen und die Regionen auf den Chromosomen 9 p, 10, 14 q, 18 (Verluste) sowie 1 q, 7 q, 8 q, 12 q und 20 q (Zugewinne) weiter eingrenzen [5–7]. In unserer eigenen Arbeitsgruppe ist es uns gelungen, 4 genomische Regionen zu definieren, deren Verluste/Zugewinne in Kombination signifikant und unabhängig voneinander mit der Metastasierung und dem Überleben assoziiert sind. Mehrere Arbeitsgruppen haben miRNAs identifiziert, deren Expression im Primärtumor klar mit der Metastasierung und dem Überleben der Patienten assoziiert sind [8–11]. MiRNAs stehen aktuell im Fokus der Tumorforschung, da sie die Expression mehrerer Gene gleichzeitig steuern und somit effektiv auch in Signalwege der Metastasierung eingreifen können. Darüber hinaus können sie in Zukunft auch als Biomarker in Blut oder Urin geeignet sein, da sie eine hohe Stabilität aufweisen, wie erste Ergebnisse auch für die Nierenzellkarzinome belegen [12–14]. Die bisher vorgestellten Daten haben in erster Linie einzelne Marker oder einzelne molekulare Ebenen analysiert. Da es sich bei der Metastasierung als prognosebestimmenden Faktor um einen komplexen Prozess handelt, erscheint es sinnvoller, molekulare Signaturen auf mehreren Ebenen mit den verfügbaren Hochdurchsatzverfahren zu definieren. Durch das Cancer Genome Atlas Projekt (The Cancer Genome Atlas: TCGA) wurden insgesamt knapp 400 klarzellige NZK parallel auf den Ebenen der DNA, RNA, miRNA, DNA-Methylierung und der Proteine in Korrelation zum klinischen Verlauf analysiert [15]. Dabei konnten zuvor bekannte genomische Zugewinne und Verluste sowie Mutationen (z. B. VHL-Gen) bestätigt werden. Darüber hinaus wurden durch die komplexe parallele Analyse mehrerer molekularer Ebenen neue potenzielle diagnostische und vor allem prognostische Marker identifiziert. Darüber hinaus können so komplexe Signalwege aufgezeigt werden, die essenziell wichtige Schritte der Tumorgenese regulieren. So wurden, neben dem bekannten VHL-Gen, 3 weitere Gene (PBRM1, BAP1, SETD2) auf dem kurzen Arm von Chromosom 3 beschrieben, die zwischen 10 % und 34 % Mutationen aufweisen. Alle 3 Gene regulieren Prozesse der Chromatinmodifikation und damit die Expression anderer Gene. Im überwiegenden Teil der klarzelligen NZK schließen sich Mutationen in diesen Genen gegenseitig aus, was auf verschiedene Mechanismen der molekularen Tumorprogression hinweist [16]. Zusammen mit anderen publizierten Daten zu diesen 3 Genen könnten sich hier neue molekulare Prognoseparameter ergeben [17, 18]. Entscheidend für die Überführung in die klinische Praxis sind die Validierung in unabhängigen Kollektiven sowie die Prüfung des zusätzlichen Nutzens der potenziellen Marker im Vergleich zu bestehenden etablierten klinischen und histopathologischen
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Abb. 1 FluroeszenzIn-Situ-Hybridisierung (FISH) an Zellkernen eines chromophoben Nierenzellkarzinoms: Verlust der Chromosomen 1 (1blaues Signal), 2 (1 rotes Signal) und 6 (1 grünes Signal).
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Parametern. Bislang zeigten einzelne Marker wie EPCAM und molekulare Signaturen eine Verbesserung der Prognosebewertung [19–21].
IL-8 beschrieben, der mit dem PFS korrelierte [28]. In einer weiteren Studie an einem anderen Studienkollektiv konnte das jedoch nicht bestätigt werden (Xu et al., ASCO 2013). Für die Validierung der dargestellten SNPs sind größere Studien notwendig.
Marker zur Prädiktion des Ansprechens auf systemische Therapie
Prädiktive Marker aus dem Blut
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Seit einigen Jahren stehen für Patienten mit metastasiertem NZK Therapeutika zur Verfügung, die zielgerichtet in Signalwege der Tumorzellen und der Endothelzellen eingreifen. Diese sind auf den VHL/HIF/VEGF- sowie den mTOR-Signalweg ausgerichtet und regulieren unter anderem die Angiogenese. Entsprechend den Leitlinien der EAU existieren Empfehlungen für den Einsatz der unterschiedlichen Tyrosinkinaseinhibitoren (TKI) und mTOR-Inhibitoren in der Erst- und Zweitlinientherapie. Die Daten aus den klinischen Studien sind jedoch nicht ausreichend, um eine individuelle Selektion des Therapeutikums mit dem besten Ansprechen für den einzelnen Patienten zu ermöglichen. Es gibt nun verschiedene Ebenen, die hier auf der Suche nach prädiktiven Biomarkern analysiert werden können.
Die dritte Ebene prädiktiver Marker sind blutbasierte Marker. Sie stellen sicher die klinisch interessanteste Quelle dar, da sie einfach zugänglich sind und auch mehrere Bestimmungen z. B. im Verlauf möglich sind. Erste Daten belegen hier, dass Chemokine und angiogenetische Faktoren potenziell sehr gut geeignet sein könnten. So haben Zurita et al. eine Signatur von 6 Serummarkern beschrieben, die eine Subgruppe von Patienten mit einem Benefit der Kombination von Sorafinib mit IFN profitieren. Ähnliche Daten wurden im vergangenen Jahr von Nixon et al. für die ALLIANCE Studie sowie von Pal et al. für eine Studie mit Pazopanib in der Zweitlinie auf dem ASCO dargestellt. Auch miRNAs könnten zukünftig aus dem Blut zur Prädiktion bestimmt werden, wie in einer ersten Analyse gezeigt werden konnte [29]. Neben der Quantifizierung bekannter Chemokine und angiogenetischer Faktoren ist es aber auch möglich, neue Proteine/Peptide und Signaturen durch Verfahren der Massenspektrometrie oder der 2D-Gelelektrophorese zu identifizieren, wie unsere eigenen aktuell laufenden Arbeiten belegen. Reproduzierbare Daten sind allerdings nur dann zu erwarten, wenn Biomarker standardisiert abgenommen und entsprechende klinische Daten auch standardisiert dokumentiert werden. Das ist nur in klinischen Studien möglich. Deshalb muss für die Zukunft gefordert werden, dass in Studien zur systemischen Therapie zwingend Biomarkerprogramme integriert werden, wie in einigen Studien (MARC-2, BERAT, SWITCH-2, FLIPPER) schon realisiert. Darüber hinaus werden aktuell 2 große europäische Projekte (EUROTARGET, PREDICT), teils mit Beteiligung deutscher Kliniken, zur komplexen Identifizierung prädiktiver Marker beim NZK durchgeführt. Alle hier dargestellten Daten beziehen sich auf die klarzelligen NZK, zu den anderen Subtypen liegen hier wenig bis keine Daten vor. Zusammenfassend kann eingeschätzt werden, dass eine ganze Reihe vielversprechender Marker zur Diagnostik, Prognosebewertung und Prädiktion identifiziert worden sind. Um sie tatsächlich auch in die klinische Praxis zu überführen, sind Validierungsstudien in unabhängigen Kollektiven notwendig. Hierzu müssen klare Kriterien für klinische Studien, ähnlich wie sie für Therapiestudien bestehen, entwickelt werden. Prädiktive Marker aus dem Blut
Prädiktive Marker im Tumorgewebe
▼ Naheliegend erscheint hier zunächst, Moleküle des angezielten Signalweges hinsichtlich Mutation/Expression zu untersuchen. Die publizierten Ergebnisse im Rahmen der TKI-Therapie, bspw. zu VHL, VEGF(R) oder CAIX sind widersprüchlich bzw. konnten keine signifikante Korrelation zum Ansprechen zeigen. Etwas anders ist die Situation für die mTOR-Inhibitoren. Hier konnte in 2 kleinen Kollektiven gezeigt werden, dass die erhöhte Expression von Komponenten des mTOR-Signalweges (pAkt, S6K, p4EBP1), die für eine Aktivierung dieses Signalweges spricht, mit dem Ansprechen korreliert [22, 23]. In Zukunft müssen weitere Untersuchungen am Primärtumor bzw. den Metastasen prädiktive Marker identifizieren, die zunächst nicht direkt in die angezielten Signalwege einzuordnen sind. Auch hier werden miRNAs zunehmend an Bedeutung gewinnen. Für andere Tumorentitäten konnte gezeigt werden, dass miRNAs wesentlich an der Therapieresistenz beteiligt sind und somit stellen sie auch potenzielle prädiktive Marker dar. Kürzlich konnten Prior et al. miRNAs identifizieren, deren Expression im Tumorgewebe mit dem Ansprechen auf eine Sunitinib-Therapie korreliert [24]. Für die mTOR-Inhibitoren könnten miRNAs von Bedeutung sein, die die Komponenten des mTOR-Signalweges regulieren [25].
SNPs als prädiktive Marker
Interessenkonflikt: Nein
▼ Eine weitere wichtige Gruppe prädiktiver Marker stellen die Single Nucleotid Polymorphism (SNP) dar. Hier sind vor allem SNP in Genen von Bedeutung, die ▶ Aufnahme oder Exkretion ▶ den Metabolismus oder ▶ die Targets der Substanz beeinflussen. Durch verschiedene Gruppen konnte ein signifikanter Zusammenhang zwischen bestimmten SNPs und dem Ansprechen unter Sunitinib und Pazopanib z. B. für ABCB1, CYP3A5, NR113 (Aufnahme, Metabolismus) sowie VEGFA, VEGFR belegt werden [26–28]. Für Pazopanib wurde ein weiterer Polymorphismus in Junker K. Möglichkeiten der molekularen Diagnostik … Akt Urol 2014; 45: 370–373
Literatur 1 Sanjmyatav J, Hauke S, Gajda M et al. Establishment of a multicolour fluorescence in situ hybridisation-based assay for subtyping of renal cell tumours. Europ Urol 2013; 64: 689–691 2 Chyhrai A, Sanjmyatav J, Gajda M et al. Multi-colour FISH on preoperative renal tumour biopsies to confirm the diagnosis of uncertain renal masses. World J Urol 2010; 28: 269–274 3 Youssef YM, White NM, Grigull J et al. Accurate molecular classification of kidney cancer subtypes using microRNA signature. Europ Urol 2011; 59: 721–730 4 Tolson J, Bogumil R, Brunst E et al. Serum protein profiling by SELDI mass spectrometry: detection of multiple variants of serum amyloid alpha in renal cancer patients. Lab Invest 2004; 84: 845–856
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19 Klatte T, Seligson DB, LaRochelle J et al. Molecular signatures of localized clear cell renal cell carcinoma to predict disease-free survival after nephrectomy. Cancer Epidemiol 2009; 18: 894–900 20 Eichelberg C, Chun FK, Bedke J et al. Epithelial cell adhesion molecule is an independent prognostic marker in clear cell renal carcinoma. Int J Cancer 2013; 132: 2948–2955 21 Parker AS, Leibovich BC, Lohse CM et al. Development and evaluation of BioScore: a biomarker panel to enhance prognostic algorithms for clear cell renal cell carcinoma. Cancer 2009; 115: 2092–2103 22 Ch D, Signoretti S, Dabora S et al. Potential histologic and molecular predictors of response to temsirolimus in patients with advanced renal cell carcinoma. Clin Gen Cancer 2007; 5: 379–385 23 Nishikawa M, Miyake H, Harada K et al. Expression level of phosphorylated-4E-binding protein 1 in radical nephrectomy specimens as a prognostic predictor in patients with metastatic renal cell carcinoma treated with mammalian target of rapamycin inhibitors. Med Oncol 2014; 31: 792 24 Prior C, Perez-Gracia JL, Garcia-Donas J et al. Identification of Tissue microRNAs Predictive of Sunitinib Activity in Patients with Metastatic Renal Cell Carcinoma. PloS one 2014; 9: e86263 25 Alqurashi N, Hashimi SM, Wei MQ. Chemical Inhibitors and microRNAs (miRNA) Targeting the Mammalian Target of Rapamycin (mTOR) Pathway: Potential for Novel Anticancer Therapeutics. Int L Mol Sci 2013; 14: 3874–3900 26 Garcia-Donas J, Esteban E, Leandro-Garcia LJ et al. Single nucleotide polymorphism associations with response and toxic effects in patients with advanced renal-cell carcinoma treated with first-line sunitinib: a multicentre, observational, prospective study. Lancet Oncol 2011; 12: 1143–1150 27 van der Veldt AA, Eechoute K, Gelderblom H et al. Genetic polymorphisms associated with a prolonged progression-free survival in patients with metastatic renal cell cancer treated with sunitinib. Clin Cancer Res 2011; 17: 620–629 28 Xu CF, Bing NX, Ball HA et al. Pazopanib efficacy in renal cell carcinoma: evidence for predictive genetic markers in angiogenesis-related and exposure-related genes. J Clin Oncol 2011; 29: 2557–2564 29 Gamez-Pozo A, Anton-Aparicio LM, Bayona C et al. MicroRNA expression profiling of peripheral blood samples predicts resistance to firstline sunitinib in advanced renal cell carcinoma patients. Neoplasia 2012; 14: 1144–1152
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Autor
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Klinik für Urologie und Kinderurologie, Universitätsklinikum des Saarlandes
Schlüsselwörter ▶ Nierentumoren ● ▶ molekulare Diagnostik ● ▶ Prognoseparameter ●
Zusammenfassung
Abstract
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Die primär histologisch definierten Subtypen (klarzellig, papillär, chromophob, Onkozytom) der Nierenzelltumoren müssen aufgrund ihrer spezifischen differenten molekularen Veränderungen sowie der unterschiedlichen Prognose als eigenständige Tumorentitäten betrachtet werden. Immunhistochemische und genetische Analysen können zur Diagnosestellung in unklaren Fällen eingesetzt werden und gewinnen mehr und mehr Bedeutung für die individuelle Therapieentscheidung. Eine weitere Differenzierung der Prognose innerhalb der Subtypen scheint zukünftig durch molekulare Signaturen des Primärtumors möglich, die eine individuelle Vorhersage der Aggressivität und insbesondere des Metastasierungspotenzials erlauben werden. Prädiktive molekulare Marker aus dem Blut sowie aus Tumorgewebeproben werden zu einer individuellen Vorhersage des Therapieansprechens beitragen. Um die vielversprechenden Ansätze beim Nierenzellkarzinom auch in die klinische Praxis umzusetzen, sind Validierungsstudien notwendig, die nach klaren Kriterien, ähnlich wie sie für Therapiestudien definiert sind, durchgeführt werden.
Histologically defined subtypes of renal cell tumors (clear cell, papillary, chromophobe, oncocytoma) have to be accepted as distinct tumor entities based on specific and distinct molecular alterations and different prognosis. Immunochemistry and genetic analysis can be used for diagnosis in uncertain cases and are more and more important for individual therapy selection. Differentiation of prognosis in each subtype seems possible by using molecular signatures of primary tumors allowing individual assessment of aggressiveness and metastatic potential. Molecular markers from blood as well as from tumor tissues can predict therapy response in the future. In order to transfer these promising data into clinical practice it is mandatory to develop validation studies which have to be performed based on defined criteria similar to those for therapeutic clinical trials.
Nierenzellkarzinome (NZK) haben einen Anteil von 3 % an allen malignen Erkrankungen im Erwachsenenalter. Es ist heute klar belegt, dass die primär histologisch definierten Subtypen (klarzellig, papillär, chromophob, Onkozytom) aufgrund ihrer spezifischen differenten molekularen Veränderungen sowie der unterschiedlichen Prognose als eigenständige Tumorentitäten betrachtet werden müssen.
Diagnostik und Klassifizierung der Nierenzelltumoren
Key words ▶ kidney cancer ● ▶ molecular diagnostics ● ▶ prognostic parameters ●
Erstpublikation DOI http://dx.doi.org/ 10.1055/s-0034-1369137 TumorDiagn u Ther 2014; 35: 194–196 © Georg Thieme Verlag KG Stuttgart · New York ISSN 0722-219X Bibliografie DOI http://dx.doi.org/ 10.1055/s-0034-1389946 Akt Urol 2014; 45: 370–373 © Georg Thieme Verlag KG Stuttgart · New York ISSN 0001-7868 Korrespondenzadresse Prof. Dr. Kerstin Junker Klinik für Urologie und Kinderurologie Universitätsklinikum des Saarlandes Kirrbergerstraße 1 66424 Homburg Tel.: + 49/6841/161 4734 Fax: + 49/6841/162 4756 [email protected]
Junker K. Möglichkeiten der molekularen Diagnostik … Akt Urol 2014; 45: 370–373
▼ Ist die Klassifikation anhand des histomorphologischen Bildes nicht sicher möglich, können immunhistochemische und genetische Analysen eingesetzt werden, die mehr und mehr auch für Biopsien an Bedeutung für die individuelle Therapieentscheidung gewinnen. In verschiedenen Studien konnten spezifische genetische Veränderungen für die häufigsten Subtypen der Nierenzelltumoren definiert werden, die zur Klassifizierung genutzt werden kön-
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nen. So sind die klarzelligen NZK in fast 100 % durch einen Verlust auf dem Chromosom 3 charakterisiert, während die papillären NZK Zugewinne der Chromosomen 7 und 17 aufweisen. Chromophobe NZK sind durch kombinierte Verluste der Chromosomen 1, 2, 6, 10, 13, 17 und 21 gekennzeichnet, die gutartigen Onkozytome durch den Verlust von Chromosom 1 oder in seltenen Fällen durch eine Translokation unter Beteiligung des Chromosoms 11. Es ist heute leicht möglich, diese Veränderungen sicher durch die Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung (FISH) an isolierten Zellkernen aus kryokonserviertem Gewebe oder an Schnittpräparaten von paraffin-eingebetteten Gewebeblöcken durchzuführen ▶ Abb. 1). Wir haben hierzu in unserer Arbeitsgruppe ein Test(● system entwickelt [1]. Die FISH stellt eine robuste Methode dar, die in der molekularen Pathologie zu den Standardtechniken zählt. Wir konnten darüber hinaus zeigen, dass die FISH zur Erhöhung der diagnostischen Sicherheit an der Biopsie des Nierentumors führt [2]. Von zunehmendem Interesse sind auch epigenetische Veränderungen, zu denen die DNA-Methylierung, Histonmodifikationen sowie die miRNAs zählen. Diese kurzen, nichtkodierenden RNAs regulieren die Genexpression durch Bindung an mRNAs posttranskriptional. Auch miRNAs könnten in Zukunft zur Diagnosesicherung genutzt werden. So zeigten Youssef et al., dass eine akkurate Klassifizierung der Subtypen des NZK mithilfe von spezifischen miRNA-Signaturen möglich ist [3]. Papilläre NZK werden inzwischen noch einmal in Typ 1 und 2 unterteilt, basierend auf einem unterschiedlichen histomorphologischen Bild und unterschiedlichen molekularen Veränderungen. Allerdings fehlen derzeit noch validierte gesicherte Marker für eine zuverlässige Subklassifizierung. Zukünftig sind sicher auch Marker aus Blut oder Urin gefragt, die eine frühzeitige, einfache Diagnostik, aber auch eine entsprechende sensitive Nachsorge nach primärer Therapie ermöglichen. In den letzten Jahren wurden Proteine bzw. Proteinsignaturen im Blut identifiziert, die den Nachweis von vor allem klarzelligen NZK erlauben sollen. Serumamyloidalpha (SAA-1), ein Akutphaseprotein, wurde hier von Tolson et al. in einer Proteinsignatur identifiziert und auch von unserer Gruppe bestätigt [4]. Aber auch freie DNA oder miRNAs können als Marker dienen. Von zunehmendem Interesse sind die sog. Exosomen – Mikrovesikel, die von Tumorzellen in die Zirkulation abgegeben werden und tumorspezifisch bestimmte RNAs und miRNAs enthalten, die entsprechend quantifiziert werden können.
Prognosebewertung
▼ Die weitere Differenzierung der Subtypen macht es möglich, aggressive, metastasierende Tumoren zu identifizieren. In den letzten Jahren wurde eine ganze Reihe von molekularen Markern beschrieben, die eine signifikante Korrelation mit der Metastasierung oder dem Überleben für die klarzelligen NZK zeigen, z. T. konnten diese Marker auch als unabhängige Prognoseparameter bestätigt werden. Zugewinne und Verluste in spezifischen chromosomalen Regionen wurden zunächst durch konventionelle Techniken – wie die vergleichende genomische Hybridisierung – identifiziert. Arraybasierte hochauflösende Analysen sowie die FISH konnten diese Ergebnisse bestätigen und die Regionen auf den Chromosomen 9 p, 10, 14 q, 18 (Verluste) sowie 1 q, 7 q, 8 q, 12 q und 20 q (Zugewinne) weiter eingrenzen [5–7]. In unserer eigenen Arbeitsgruppe ist es uns gelungen, 4 genomische Regionen zu definieren, deren Verluste/Zugewinne in Kombination signifikant und unabhängig voneinander mit der Metastasierung und dem Überleben assoziiert sind. Mehrere Arbeitsgruppen haben miRNAs identifiziert, deren Expression im Primärtumor klar mit der Metastasierung und dem Überleben der Patienten assoziiert sind [8–11]. MiRNAs stehen aktuell im Fokus der Tumorforschung, da sie die Expression mehrerer Gene gleichzeitig steuern und somit effektiv auch in Signalwege der Metastasierung eingreifen können. Darüber hinaus können sie in Zukunft auch als Biomarker in Blut oder Urin geeignet sein, da sie eine hohe Stabilität aufweisen, wie erste Ergebnisse auch für die Nierenzellkarzinome belegen [12–14]. Die bisher vorgestellten Daten haben in erster Linie einzelne Marker oder einzelne molekulare Ebenen analysiert. Da es sich bei der Metastasierung als prognosebestimmenden Faktor um einen komplexen Prozess handelt, erscheint es sinnvoller, molekulare Signaturen auf mehreren Ebenen mit den verfügbaren Hochdurchsatzverfahren zu definieren. Durch das Cancer Genome Atlas Projekt (The Cancer Genome Atlas: TCGA) wurden insgesamt knapp 400 klarzellige NZK parallel auf den Ebenen der DNA, RNA, miRNA, DNA-Methylierung und der Proteine in Korrelation zum klinischen Verlauf analysiert [15]. Dabei konnten zuvor bekannte genomische Zugewinne und Verluste sowie Mutationen (z. B. VHL-Gen) bestätigt werden. Darüber hinaus wurden durch die komplexe parallele Analyse mehrerer molekularer Ebenen neue potenzielle diagnostische und vor allem prognostische Marker identifiziert. Darüber hinaus können so komplexe Signalwege aufgezeigt werden, die essenziell wichtige Schritte der Tumorgenese regulieren. So wurden, neben dem bekannten VHL-Gen, 3 weitere Gene (PBRM1, BAP1, SETD2) auf dem kurzen Arm von Chromosom 3 beschrieben, die zwischen 10 % und 34 % Mutationen aufweisen. Alle 3 Gene regulieren Prozesse der Chromatinmodifikation und damit die Expression anderer Gene. Im überwiegenden Teil der klarzelligen NZK schließen sich Mutationen in diesen Genen gegenseitig aus, was auf verschiedene Mechanismen der molekularen Tumorprogression hinweist [16]. Zusammen mit anderen publizierten Daten zu diesen 3 Genen könnten sich hier neue molekulare Prognoseparameter ergeben [17, 18]. Entscheidend für die Überführung in die klinische Praxis sind die Validierung in unabhängigen Kollektiven sowie die Prüfung des zusätzlichen Nutzens der potenziellen Marker im Vergleich zu bestehenden etablierten klinischen und histopathologischen
Junker K. Möglichkeiten der molekularen Diagnostik … Akt Urol 2014; 45: 370–373
Heruntergeladen von: WEST VIRGINIA UNIVERSITY. Urheberrechtlich geschützt.
Abb. 1 FluroeszenzIn-Situ-Hybridisierung (FISH) an Zellkernen eines chromophoben Nierenzellkarzinoms: Verlust der Chromosomen 1 (1blaues Signal), 2 (1 rotes Signal) und 6 (1 grünes Signal).
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Parametern. Bislang zeigten einzelne Marker wie EPCAM und molekulare Signaturen eine Verbesserung der Prognosebewertung [19–21].
IL-8 beschrieben, der mit dem PFS korrelierte [28]. In einer weiteren Studie an einem anderen Studienkollektiv konnte das jedoch nicht bestätigt werden (Xu et al., ASCO 2013). Für die Validierung der dargestellten SNPs sind größere Studien notwendig.
Marker zur Prädiktion des Ansprechens auf systemische Therapie
Prädiktive Marker aus dem Blut
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Seit einigen Jahren stehen für Patienten mit metastasiertem NZK Therapeutika zur Verfügung, die zielgerichtet in Signalwege der Tumorzellen und der Endothelzellen eingreifen. Diese sind auf den VHL/HIF/VEGF- sowie den mTOR-Signalweg ausgerichtet und regulieren unter anderem die Angiogenese. Entsprechend den Leitlinien der EAU existieren Empfehlungen für den Einsatz der unterschiedlichen Tyrosinkinaseinhibitoren (TKI) und mTOR-Inhibitoren in der Erst- und Zweitlinientherapie. Die Daten aus den klinischen Studien sind jedoch nicht ausreichend, um eine individuelle Selektion des Therapeutikums mit dem besten Ansprechen für den einzelnen Patienten zu ermöglichen. Es gibt nun verschiedene Ebenen, die hier auf der Suche nach prädiktiven Biomarkern analysiert werden können.
Die dritte Ebene prädiktiver Marker sind blutbasierte Marker. Sie stellen sicher die klinisch interessanteste Quelle dar, da sie einfach zugänglich sind und auch mehrere Bestimmungen z. B. im Verlauf möglich sind. Erste Daten belegen hier, dass Chemokine und angiogenetische Faktoren potenziell sehr gut geeignet sein könnten. So haben Zurita et al. eine Signatur von 6 Serummarkern beschrieben, die eine Subgruppe von Patienten mit einem Benefit der Kombination von Sorafinib mit IFN profitieren. Ähnliche Daten wurden im vergangenen Jahr von Nixon et al. für die ALLIANCE Studie sowie von Pal et al. für eine Studie mit Pazopanib in der Zweitlinie auf dem ASCO dargestellt. Auch miRNAs könnten zukünftig aus dem Blut zur Prädiktion bestimmt werden, wie in einer ersten Analyse gezeigt werden konnte [29]. Neben der Quantifizierung bekannter Chemokine und angiogenetischer Faktoren ist es aber auch möglich, neue Proteine/Peptide und Signaturen durch Verfahren der Massenspektrometrie oder der 2D-Gelelektrophorese zu identifizieren, wie unsere eigenen aktuell laufenden Arbeiten belegen. Reproduzierbare Daten sind allerdings nur dann zu erwarten, wenn Biomarker standardisiert abgenommen und entsprechende klinische Daten auch standardisiert dokumentiert werden. Das ist nur in klinischen Studien möglich. Deshalb muss für die Zukunft gefordert werden, dass in Studien zur systemischen Therapie zwingend Biomarkerprogramme integriert werden, wie in einigen Studien (MARC-2, BERAT, SWITCH-2, FLIPPER) schon realisiert. Darüber hinaus werden aktuell 2 große europäische Projekte (EUROTARGET, PREDICT), teils mit Beteiligung deutscher Kliniken, zur komplexen Identifizierung prädiktiver Marker beim NZK durchgeführt. Alle hier dargestellten Daten beziehen sich auf die klarzelligen NZK, zu den anderen Subtypen liegen hier wenig bis keine Daten vor. Zusammenfassend kann eingeschätzt werden, dass eine ganze Reihe vielversprechender Marker zur Diagnostik, Prognosebewertung und Prädiktion identifiziert worden sind. Um sie tatsächlich auch in die klinische Praxis zu überführen, sind Validierungsstudien in unabhängigen Kollektiven notwendig. Hierzu müssen klare Kriterien für klinische Studien, ähnlich wie sie für Therapiestudien bestehen, entwickelt werden. Prädiktive Marker aus dem Blut
Prädiktive Marker im Tumorgewebe
▼ Naheliegend erscheint hier zunächst, Moleküle des angezielten Signalweges hinsichtlich Mutation/Expression zu untersuchen. Die publizierten Ergebnisse im Rahmen der TKI-Therapie, bspw. zu VHL, VEGF(R) oder CAIX sind widersprüchlich bzw. konnten keine signifikante Korrelation zum Ansprechen zeigen. Etwas anders ist die Situation für die mTOR-Inhibitoren. Hier konnte in 2 kleinen Kollektiven gezeigt werden, dass die erhöhte Expression von Komponenten des mTOR-Signalweges (pAkt, S6K, p4EBP1), die für eine Aktivierung dieses Signalweges spricht, mit dem Ansprechen korreliert [22, 23]. In Zukunft müssen weitere Untersuchungen am Primärtumor bzw. den Metastasen prädiktive Marker identifizieren, die zunächst nicht direkt in die angezielten Signalwege einzuordnen sind. Auch hier werden miRNAs zunehmend an Bedeutung gewinnen. Für andere Tumorentitäten konnte gezeigt werden, dass miRNAs wesentlich an der Therapieresistenz beteiligt sind und somit stellen sie auch potenzielle prädiktive Marker dar. Kürzlich konnten Prior et al. miRNAs identifizieren, deren Expression im Tumorgewebe mit dem Ansprechen auf eine Sunitinib-Therapie korreliert [24]. Für die mTOR-Inhibitoren könnten miRNAs von Bedeutung sein, die die Komponenten des mTOR-Signalweges regulieren [25].
SNPs als prädiktive Marker
Interessenkonflikt: Nein
▼ Eine weitere wichtige Gruppe prädiktiver Marker stellen die Single Nucleotid Polymorphism (SNP) dar. Hier sind vor allem SNP in Genen von Bedeutung, die ▶ Aufnahme oder Exkretion ▶ den Metabolismus oder ▶ die Targets der Substanz beeinflussen. Durch verschiedene Gruppen konnte ein signifikanter Zusammenhang zwischen bestimmten SNPs und dem Ansprechen unter Sunitinib und Pazopanib z. B. für ABCB1, CYP3A5, NR113 (Aufnahme, Metabolismus) sowie VEGFA, VEGFR belegt werden [26–28]. Für Pazopanib wurde ein weiterer Polymorphismus in Junker K. Möglichkeiten der molekularen Diagnostik … Akt Urol 2014; 45: 370–373
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