Planta (Berl.) 77, 239--249 (1967)

Phytochrom-induzierte Enzymbildung (Phenylalanindesaminase), ein schnell ablaufender ProzeB I~GE R~SSLAND u n d t t A ~ s M o m ~ Botanisches Institut der Universitiit Freiburg i. Br. Eingegangen am 21. August 1967

Phytochrome-Mediated Enzyme Formation (Phenylalanine Deaminase) as a Rapid Process Summary. In previous papers we have reported (Memo and DURST, 1966a, b) that synthesis of phenylalanine deaminase (EC 4.3.1.5), an important enzyme of phenolic metabolism, can be stimulated by the physiologically active phytochrome ( = P730) in the mustard seedling. The data of the present paper suggest that induction of this enzyme is a rapid process if the gene in question is easily accessible for the activating action of PTa0. The seedlings were irradiated with continuous standard far-red light. Longtime irradiation with far-red will maintain a low but virtually constant level of PTa0 in the seedling over an extended period of time. At the moment when the far-red light is turned off the action of P~8o will virtually cease. - - Fig. 3 and Fig. 4, lower part, show the kinetics of enzyme induction by I)780 in an etiolated seedling. The initial (or primary) lag-phase after the onset of far-red is 1.5 hours. If, however, a seedling which has been pre-irradiated with 12 hours of far-red is kept in darkness for 6 hours and is then re-irradiated with far-red no lag-phase for the action of the second irradiation can be found. Enzyme activity increases immediately after the onset of far-red. Since the action of the second irradiation as measured by increase of enzyme activity can be inhibited by relatively low doses of Puromycin and Cycloheximide (table) we conclude that the re-appearance of PTa0 leads to de novo synthesis of enzyme protein. - - Application of Actinomycin D (10 y.g/ml) only partially inhibits the action of the second irradiation as measured by increase of enzyme activity. This finding was to be expected. In preceding papers (e.g. M o ~ and BIE~GnR, 1967) it has been concluded that genes which have once been activated by PTa0 remain less sensitive towards Aetinomycin D even when PTa0 has disappeared. Taking into account all available data the conclusion seems to be justified that the induction of enzyme synthesis by PTa0 (i.e. differential gene activation followed by enzyme synthesis) is a rapid process if the genes are accessible for the action of PTa0. The relatively long initial lag-phase (1.5 hours) is needed to make the "potentially active genes (P780)" accessible for the action of PTa0. The problem of how the initial lag-phase can be understood has been dealt with more in detail in a previous paper on phytochrome-mediated anthoeyanin synthesis (LAncE, ]3IEI~GER and MOER, 1967). Einleitung I n f r i i h e r e n A r b e i t e n (z.B. MOH~, 1966) h a b e n w i t die A n s i c h t begrfindet, d a b die d u t c h PT3o, das p h y s i o l o g i s c h a k t i v e P h y t o c h r o m , 17b Planta (Berl.), Bd. 77

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I. RISSLANDund H. MoHa:

an Keimpfianzen ausgel6sten ,,positiven" Photomorphosen auf eine differentielle Genaktivierung dureh P7~o zurfickzuffihren seien. Positive Photomorphosen sind solche phytochromabh~ngigen Veranderungen einer Keimpflanze, die durch eine Ausl6sung oder Steigerung yon Biosynthesen oder WachstumsvorgKngen ausgezeichnet sind. Charakteristisch ist die relativ lange lag-Phase nach Erstbelichtung. Bei der Anthocyansynthese des Senfkeimlings, die als Prototyp einer positiven ,Photomorphose" (=photoresponse) aufgefaSt werden kann, dauert es z.B. 3 Std, bis auf die erstmalige Bildung yon P7a0 hin Anthocyan meSbar wird. Diesen Zeitraum nennen wir ,,primate" lag-Phase (Lx~Gv,, B I E ~ r und MoH~, 1967). In mehreren Arbeiten, die sich kritisch mit dem Konzept der dffferentiellen Genaktivierung durch Pv30 befassen, ist das Argument verwendet worden, da$ photoresponses mit kurzer lag-Phase nicht mit der Vorstellung, P730 verursache bei positiven Photomorphosen eine Genaktivierung, in Einklang zu bringen seien ("The rapidity of the response indicates that gene activation as currently suggested for phytoehrome action by M o ~ and his coworkers is not involved", FONDEWLL~, BORTItW~CKand H~ND~ICKS, 1966). Auch HILLMAX(1967) ist tier Auffassung, alas die Genaktivierung durch P730 ein Ereignis sei, das sieh erst relativ sp/tt nach der Bildung yon P730 abspiele ("Hence, while it is reasonable to suppose that a chain of events set in motion by phytochrome can result in gene activation one hardly thereby identifies the nature of the initial reaction"). In der vorliegenden Arbeit werden wit zeigen, da$ die Genaktivierung dutch P730 rasch erfolgt, falls die betreffenden Gene ffir P73o (oder ffir die von P730ausgehende ,,Signalkette", vgl. M o ~ , 1966) leicht zug/inglich sin& Wit verwenden als experimentelles System die im Senfkeimling (Sinapis alba L.) fiber P780ausgel6ste Synthese des Enzyms PhenylalanindesaminaseL In vorangegangenen Mitteilungen haben wit gezeigt (Du~s~ und M o ~ , 1966a, b), da$ die Aktivit/~t dieses Enzyms im Senfkeimling dutch P780 stark erhSht werden kann. Die prim/ire lag-Phase betr/~gt etwa 1,5 Std. Inhibitorexperimente deuten darauf bin, da$ die ansteigende Enzymaktivit~t auf einer de novo Synthese des Enzyms beruht. Da wir bei tier fiber PTa0 ausge16sten Anthocyansynthese gefunden haben (LA~G~, BI~NGw~und MoH~, 1967), da$ bei einer Zweitbelichtung (Programm: Erstbeliehtung - - 1/~ngere Dunkelperiode - - Zweitbelichtung) die lag-Phase fehlt, so lag es nahe, die fiber P7~0induzierte Enzymsynthese unter einem entsprechenden Bestrahlungprogramm zu unter1 Abki~rzungen: Phenylalanindesaminase: Phenylalaninammonialyase(EC 4. 3.1.5) = PADAse; Dunkelrot = DR, ActinomycinD = Act. D; Puromycin = Pu; Cycloheximid= Cyc.

Phytochrom-induzierte Enzymbildung

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suchen. Es stellte sich dabei heraus, dag die Z u n a h m e der E n z y m a k t i vits tats~chlich sofor~ nach Einsetzen der Zweitbelichtung erfolgt. Eine ,,sekund~Lre" lag-Phase is$ nich~ nuchweisbar. D a auch im Fall der Zweitbehchtung die P A D A s e - A k t i v i t s sehr wahrschein]ich auf eine de novo Syn~hese y o n R N S lind E n z y m p r o t e i n zurfiekzuffihren ist, glauben wir den Beweis erbraeht zu haben, dab P~a0 sehr rasch die Aktivierung y o n Genen bewirken kann, falls diese Gene ftir P~30 (oder fiir die ,,Signalkette") leicht zug~Lnghch sind. Die lange primiire lagPhase nach Einsetzen der Erstbelichtung ben6tigt das P730 offenbar dazu, die potentiell aktiven Gene (vgl. Mom~, 1966) ffir das P780 zugs zu m a c h e n (vgl. Diskussion bei LA~G~, BI~G~,I~ u n d M o r a l 1967). Die Bes~rahlung erfolgte auch in den vorliegenden Experimenten mit Dauer-Dunkelrot 1. Das verwendete Standard-Dl% stellt in dem Senf. keimling eine relativ niedrige, langfristig station~re X o n z e n t r a t i o n des wirksamen P~80 ein (HA~T~A~X, 1966; Mo~n, 1966; CnARXSO~ und I-IILLMAN, 1967). Material und Methoden

1. Material ]:)as Samenmaterial yon Sinapis alba L. (Botanischer Garten Freiburg i. Br, Ernte 1965) stammt aus der 4. Nachzucht einer seit 1957 yon Mom~ u. Mitarb. verwendeten Population. Die Samen wurden nach den im Institut fiblichen Gesichtspunkten selektioniert, um mSglichst homogenes AusgangsmateriM zu erhalten.

2. Reagentien Borat-Puffer (Na2B~O~ . 10 g20 p.a. 0,05 molar mit H~BOa p.a. 0,2 molar und NaC1 p.a. 0,05 molar, alle Reagentien yon Merck, Darmstadt, auf pH 8,8 eingestellt). - - n-Phenylalanin pur., (Fluka AG, Buchs, Schweiz). - - Actinomycin D~ (ein Geschenk yon Merck, Sharp u. Dohme, Rahway, N. J., U.S.A.). - - Puromycin~, geliefert als Puromycindihydrochlorid (Nutritional Biochemicals Corporation, Cleveland, Ohio, U.S.A.). - - Actidion purum = CycloheximidI (Fluka AG, Buehs, Schweiz).

3. Bestrahlungsanlage Es wurde das yon IIA~TXA~ gebaute Standardfeld des Institutes flit DI~ verwendet (vgl. Mom~, 1966). Die Intensit~t betrggt an den fiir die vorliegende Arbeit verwendeten Positionen 3400 erg/em ~. see :t: 5 %.

4. Allgemeiner Versuchsansatz a) Keimbedingungen und Bestrahlungsprogramm. Die im Institut fiblichen Standardbedingungen zur Anzucht yon Keimlingen (auf Chromatographiepapier mit aqua dest., 25,0:~0,3 ~ C; vgl. Mom~, 1966) wurden strikt eingehalten. Die Samen wurden vor der Aussaat dreimal mit aqua des%. gewaschen. 36 Std nach Aussaat begann jewefls die Erstbelichtung. ]3ei Zweitbelichtung wurde folgendes Programm verwendet: 12 Std Erstbelichtung - - 6 Std Dunke] --Zweitbelichtung.

I. RISSLAND und H. Momz:

242

b) Die Experimente mit Act. D, Pu und Cyc. Nach 12 Std Erstbelichtung warden die Keimlinge ffir 5 Std verdunkelt. Ansehliel]end erfolgte eine lstiindige submerse Inkubatioa mit aqua dest. bzw. mit den Antibiotika-LSsungen im Dunkeln. Danach wurden die Keimlinge im schwachen griinen Sieherheitslicht wieder auf d~s arspriingliche Keimpapier fibertragen. Unmittelbar danach setzte die Zweitbelichtung ein. (])as Inkubationsveff~hren ist bei LARGE, BIE~GER und MOOR, 1967, eingehend besehrieben). Die Auswertung (,,Endwert") effolgte nach 3 Std Zweitbelichtung mit DR. Ffir den zum Vergleich dienenden ,,Anf~ngswert" warden die Keimlinge nach der lstiindigen Inkubation im Dunkeln ausgewertet. Act. D, Pu und Cyc haben keineu EinfluI~ auf den Enzymtest. 30c

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Zeit nQch S u b s t r Q t z u g a b e

Abb. l. Die Kinetik der Bildung von trans-Zimts~ure in der Testcuvette. Die Messung der Konzentr~tion an trans-Zimts/~ure erfolgte durch die Bestimmung der Extinkfion bei 290 nm in der mit dem Substrat (Phenylalanin) ges~ttigten Cuvette. Behandlung der Keimlinge: (. . . . . ) 54 Std Dunkel; (. .) 36 Std Dunkel ~- 18 Std Dunkelrot

c) Gewinnung des Enzymextralctes. Um den gravierenden Effekt yon Verwundungen ~uf die PADAse Aktivit~t isolierter Org~ne (vgl. ElqGELSlgA, 1967) auszusehlieBen, verwendeten wir die Ges~mtkeimlinge ffir die Herstellung des Enzymextraktes. Von den 50 Keimlingen aus 2 Keimdosen warden die 46 gr58ten (Merkmal: Hypokotyll~nge) zur weiteren Aufarbeitung verwendet. Diese warden yon den Testen befreit und in einem MeBzylinder mit 0,1 molarem Boratpuffer (vgl. ZVCKER, 1965) auf das Gesamtvolumen yon 10 ml gebracht; davon wurden rund 3 ml entnommen (zum sp~teren Nachspfi]en). Darm warden die Keimlinge mit dem Rest des :Puffers in eine gek/ihlte Reibsehale (0 ~ C) fibergefiihrt und mit 1,5 g Quarzsand (p. a.) 10 min l~ng zerkleinert. Das Homogenat wurde quantitativ in einen vorgekfihlten Zentrifugenbecher fibergefiihrt. Die zuvor abgezweigten 3 ml Pufferl5sung dienten hierbei zur Reinigung yon MSrser und Pistill. Es wurde bei 34000 g und - - I ~ 20 rain zentrifugiert. Dann wardea 5 ml des Uberstandes unter der Fettschieht abpipettiert, mit 1 g feingekSrnter Aktivkohle versetzt und noehmals 10 min bei 34000 g und --1 ~ C zentrifugiert. Bei diesem Vorgang warden die im nahen UV ( ~ 280 nm) absorbierenden Substanzen weitgehend aus dem

Phytochrom-induzierte Enzymbfldung

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Extrakt entfernt. Die Enzymaktivitat wurde dureh diesen Arbeitsgang nicht verandert. Der gereinigte Extrakt wurde direkt fiir die Bestimmung der Enzymaktivitat verwendet. Die Aktivitatsbestimmung erfolgte grundsatzlich unmittelbar nach der Herstellung des Extraktes. Es sei aber festgestellt, dal~ der aus dem Senfkeimling gewonnene gereinigte Enzymextrakt langfristig (ca. 2 Std) stabil ist, so dal~ sich fiir unsere Experimente die Herstellung eines Azetonpulvers (vgl. ZUCKER, 1965) eriibrigte. d) Enzymtest. PADAse katalysiert die Desaminierung yon L-Phenylalanin zu trans-Zimtsaure. Die Reaktion ist irreversibel. Die Bestimmung der PADAseAktivitat erfolgte im AnschluB an ZUCKEI~ (1965) nach der optischen Methode

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Menge an eingesetztem Enzymextrakt

Abb. 2. Die Abhangigkeit der l%eaktionsgeschwindigkeit yon der zugese~zten Menge an Enzymextrakt (bezogen auf das gleiche Reaktionsvolumen). Behandlung der Keimlinge: (. . . . . ) 54 Std Dunkel; (. .) 36 Std D u n k e l + 1 8 Std Dunkelrot yon KOUKOL und CONN (1961). Gemessen wurde die Zunahme der Extinktion bei l ~ 290 n m im Zeiss-Spektralphotometer PMQ I I (Cuvettenhalter auf 25~ temperiert). Bei der zur Messung verwendeten Wellenl~inge absorbiert Phenylalanin praktisch nicht mehr. Die Extinktionszunahme bei 290 nm beruht aussch]ie2lich auf der Bildung yon trans-Zimtss Ffir den Testansatz warden folgende Substanzen nacheinander in eine 1 emQuarzcuvette einpipettiert: 1,9 ml Boratpuffer, pH 8,8 (200 ~ Mol), 0,5 ml Enzymextrakt und 0,6 ml L-Phenylalanin (60 ~ Mol). Naeh Substratzugabe wurde der Cuvetteninhalt gut durchgemischt und die Extinktionsanderungen bei 290 n m gegen eine Leerprobe (ohne Phenylalanin) gemessen. Die Extinktionszunahme wurde 2 Std lang verfolgt (Ablesung alle 10 rain, Abb. 1). Dieser Zeitraum diente zur Aktivits Die Enzymaktivits geben wir in der vorliegenden Arbeit an als ~Mol trans-Zimtss m i n . Keimling Die Reaktionsgesehwindigkeit (A E/At) war unter unseren Testbedingungen fiber einen Zeitraum yon mindestens 2 Std konstant (Abb. 1). AuBerdem ist die l%eaktionsgesehwindigkeit in dem uns interessierenden Bereich proportional zu der Menge an eingesetztem Enzymextrakt (Abb. 2).

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I. I~ISSLANDund H. Mo~:

Fiir jeden Kurvenpunk~ wurden 4 unabh~ingige Einzelbestimmungen durchgeffihrt. Die Streuung der Einzelmegwerte um den Mittelwert erwies sieh als sehr gering.

Experimentelle Daten 1. Die prim~re lag-Phase. Wie die Abb. 3 zeigt, steigt die PADAseAktivitiit nach Einsetzen der Erstbelichtung nieht sofort, sondern ersg naeh einer prim~ren lag-Phase yon 1,5 Std, an. Der Anstieg ist zumindest fiber 12 Std hinweg linear. Wit vermuten, dag w/~hrend dieses Zeitraums diejenigen Prozesse, die einen Abbau des Enzyms verursachen 1.00

b

[Phytochrome-mediated enzyme formation (Phenylalanine deaminase) as a rapid process].

In previous papers we have reported (MOHR and DURST, 1966a, b) that synthesis of phenylalanine deaminase (EC 4.3.1.5), an important enzyme of phenolic...
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