Plan~a (:Berl.) 93, 152--159 (1970) 9 by Springer-Verlag 1970

Die Photomodulation der Akkumulationsrate von Ascorbins/iure beim Senfkeimling (Sinapis alba L.) durch Phytochrom ILSE Bi~sxo~sI~ u n d PETER SCttOPFER Biologisehes Institut I I der Universitat Freiburg i. Br. Eingegangen am 23. Mai 1970 P h o t o m o d u l a t i o n b y P h y t o e h r o m e of t h e l~ate of A c c u m u l a t i o n of Aseorbie A c i d in M u s t a r d Seedlings (Sinapis alba L.) Summary. Ascorbie acid accumulation in the mustard seedling is controlled by Pit (active phytoehrome). Kinetic studies demonstrate that Pfr exerts a rapid and fully reversible control over the steady state rate of ascorbie acid accumulation. Following the terminology of Weisz (1967) for this type of metabolic control the term "photomodulation by Ptr" is used. - - The control by /}r is independent of RNA synthesis. Therefore regulation of gene activity is probably not involved in photomodula~ion of the rate of ascorbic acid accumulation. - - There is only a limited period within which P# can control aseorbie acid accumulation. This period is fixed by the time pattern of "primary" differentiation in the seedling. There is no interaction between pho~omodulation by P~r and control by "primary" differentiation of ascorbic acid accumulation. Einleitung Die A k k u m u l a t i o n y o n Aseorbhas~ure (AS) w/thrend der Keimlingse n t w i e k t u n g y o n Sinapis alba L. s t e h t u n t e r d e m s t e u e r n d e u EinfluB des a k t i v e n P h y t o e h r o m s (P#) (Sehopfer, 1966, 1967b). Die m o l e k u l a r e n Vorg/inge, welehe dieser R e g u l a t i o n z u g r u n d e liegen, sind noeh n i e h t i m einzelnen b e k a n n t . Vor allem ist noeh u n k l a r , in welehem A u s m a g die S y n t h e s e bzw. der A b b a u y o n A S reguliert w e r d e n k6nnen. Man m u g sieh d a h e r i m A u g e n b l i c k d a r a u f besehr/inken, die V e r s des g e s a m t e n A S - p o o l s (unter Vernaehl~ssigung d e r K o m p a r t i m e n t i e r u n g ) u n t e r d e m EinfluB des P h y t o c h r o m s y s t e m s zu verfolgen. W i t b e t r a e h t e n die ffir die A k k u m u l a t i o n v o n A S v e r a n t w o r t l i e h e Stoffwechselbahn f o r m a l als ein i m FlieBgleiehgewieht befindliehes S y s t e m , dessen D u r e h fluBgesehwindigkeit in F o r m der A k k u m u l a t i o n s r a t e y o n A S gemessen w e r d e n k a n n . Die i m folgenden besehriebenen E x p e r i m e n t e zeigen, d a b diese D u r e h f l u g g e s e h w i n d i g k e i t d u r e h P/r raseh u n d r o l l reversibel reguliert w e r d e n k a n n .

Photomodulation der Akkumulation yon Ascorbins~ure

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A u B e r d e m soll in dieser A r b e i t a n h a n d y o n g e n a u e n K i n e t i k e n ein B e i t r a g z u m P r o b l e m der W e c h s e l ~ r k u n g zwischen P h y t o e h r o m u n d den endogenen - - i n bezug auf die W i r k u n g y o n P/~ ,,prim~ren" - Differenziernngsfaktoren der Pflanze bei der P h o t o m o r p h o g e n e s e geliefert werden. Bei der E n t w i c k l u n g einer K e i m p f l a n z e b e s t i m m t das jeweilige Muster der ,,prim/iren" Differenzierung ( K o m p e t e n z m u s t e r ) darfiber, wie u n d w a n n die einzelnen Zellen bzw. Gewebe auf die B i l d u n g y o n P/r reagieren. Dieses Muster ist n i c h t statisch, sondern d y n a m i s c h , d a s heil3t, ver/~nderlich m i t der Zeit (Oelze-Karow n n d Mohr, 1970). Die F a k t o r e n der ,,prim/tren" Differenzierung sind i m einzelnen h e u t e noch n i c h t m o l e k u l a r b e s c h r e i b b a r ; ihre E x i s t e n z ist jedoch eine zwingende K o n s e q u e n z der m u l t i p l e n W i r k s a m k e i t des P h y t o c h r o m s y s t e m s (Wagner u n d Mohr, 1966). Material und Methoden

a) Material. ])as 1967 geerntete Samenmaterial yon Sinapsis alba L. wurde yon der Firma Schoell (Stuttgart) bezogen. Ffir die Experimente wurde eine hinsichtlich des ttypokotyll~ngenwachstums relativ homogene, selektionierte Fraktion mit einem Samendurchmesser yon 2,0--2,5 mm verwendet. Die Anzucht der Keimlinge erfolgte auf Chromatographiepapier mit dest. Wasser bei 25,0 ~: 0,2 ~ C (vgl. Mohr, 1966). b) Bestrahlung. Die Keimlinge warden mit einem Standard-Dunkelrotfeld (350 ~W cm-2~ 10%; vg]. Weidner u. Mitarb., 1965) bei 25,0~ 0,4~ C bestrahlt. Diese Lichtquelle stellt das Photogleichgewicht des Phytochromsystems in weniger als 5 rain auf ca. 2,5% P~r ein (Oelze-Karow u. Mitarb., 1970). c) Applilcation yon Actinomycin D. Je 25 Keimlinge warden in 10 ml Actinomyein D-LSsung (10 ~g m1-1, Serw-Entwicklungslabor, Heidelberg) fiir 1 Std im Dunkeln submers inkubiert. AnschlieBend wurden die Keimlinge wieder auf Keimpapier (mit Actinomycin D-LSsung getr~nkt) gehalten. Als Kontrolle wurden entsprechende Ansgtze mit dest. Wasser durchgefiihrt. d) Auswertung. Jeweils 20 Keimlinge wurden bei -- 75 ~ C in I-Iomogenisierungsmedium eingefroren. Ascorbinsi~ure und Anthocyan wurden nach der bei Schopfer (1966) ausffihrlich beschriebenen lgethode extrahiert und bestimmt. - - Jeder Kurvenpunkt repr~sentiert das arithmetische Mittel yon 8--16 unabhgngigen Proben. In den AbbiIdungen und in der Tabelle ist der einfache, mittlere Fehler des Mittelwerts eingetragen. Ergebnisse und Diskussion

a) Die Ascorbinsdure-A/clcumulation im Dunlcelrot-Dauerlicht ( D R ) . Das p r i m ~ r e Differenzierungsmuster fiir die A S - A k k u m u l a t i o n k a n n d u r c h Messung y o n D a u e r - D R - K i n e t i k e n , welche zu verschiedenen Zeitp u n k t e n der K e i m l i n g s e n t w i c k l u n g einsetzen, a b g e t a s t e t w e r d e n (Abb. 1). D a b e i zeigt sich, d a b P# in d e m Z e i t r a u m 2 4 - - 8 4 S t d n a c h der A u s s ~ a t in ~hnlicher Weise ~uf die A S - A k k u m u l a t i o n einwirkt. E s b e s t e h t j e d o c h in folgender t t i n s i c h t eine Abhi~ngigkeit der Pfr-Wirkung y o r e A l t e r der K e i m l i n g e : 1. Bis ca. 30 S t d nach der A u s s a a t k a n n der K e i m l i n g bezfiglich der A S - A k k u m u l a t i o n noch n i e h t auf die B i l d u n g y o n P# ]1 a

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I. Bienger und P. Schopfer:

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Abb. 1. Die Kinetik der Akkumul~tion yon Ascorbins~ure im Dunkeln (-- 9 und bei Dauer-Dunkelrot-Bestrahlung (--o--). Der Bestr~hlungsbeginn liegt bei 24, 36, 48, 60, 72 Std nach der Aussaat

reagieren. Dies macht sich in einer deutlichen VerzSgerung der durch D R bewirkten Steigerung im AS-Gehalt bemerkbar (Abb. 1, 24 Std D-->DR). Die Empfindlichkeit ffir Pit setzt erst zwischen 30 und 36 Std nach der Aussaat roll ein. Entsprechende Befunde wurden yon Wagner und Mohr (1966) bei der phytochrominduzierten Anthocyansynthese gemacht. - - 2. Das Maximum der Akkumulation wird nnabh~ngig vom Bestrahlungsbeginn ca. 66--72 Std nach der Aussaat erreicht. 72 Std nach der Aussaat ist auch die F~higkeit der Dunkelkeimlinge, auf die Bildung yon P# mit linearer Akkumulation yon AS zu reagieren, nur noch gering ausgepr~gt. - - 3. Die lag-Phase zwischen dem Einsetzen der Bestrahlung und der ErhShung der Akkumula~ionsrate ist bei friihem Bestrahlungsbeginn (36 Std nach der Aussaat) kfirzer (ca. 1,5 Std) als bei spi~ter einsetzender Bestrahlung (ca. 3 Std). Naeh ~berwindung der ]ag-Phase wird die erh6hte Akkumulationsrate ohne meBbare Ubergangsphase eingeste]lt. Die Akkumulationsrate im linearen Tell aller DRK u r v e n ist konstant, sie ist unabh~ngig yore Alter der Keimlinge. Wit deuten diese DR-Kinetiken folgendermal~en: I m Falle der ASAkkumulation ffihrt die Einstellung einer weitgehend konstanten Konzentration an P# (ca. 2,5 % des Gesamtphytoehroms) zu einer konstanten, gegeniiber dem Dunkelniveau stark erh6hten Akkumulationsrate, welche

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Photomodul~tion der Akkumulation von Ascorbins~ure

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nach Ablauf einer 1,5--3stfindigen lag-Phase eingestellt wird. Die Wirkung des DI~ wird jedoch zeitlich eingegrenzt durch eine ,,prim/ire" Differenzierung, welche von den Keimlingen durchlaufen wird und, unabh~ngig yon P/r, die Empfindlichkeit des Systems fiir DR festgelegt. Diese Empfindlichkeit folgt einer Optimumkurve mit einem Plateau zwischen ca. 33 und 60 Std nach der Aussaat. Es kann derzeit nicht gesagt werden, ob Ver~nderungen der Phytochromkonzentration bei der ,,prim~ren" Differenzierung eine Rolle spielen, oder ob es sich hier ausschliel31ich nm Ver~nderungen der ,,Empfindlichkeit" der AS-Akkumulation ffir Pjr handelt. Die AS-Akkumulation in den Dunkelkeimlingen zeigt im Prinzip das gleiche zeitliche Muster wie im Dauer-DR.

b) Umsetzexperimente. Wird die Bestrahlung zu Beginn (Abb. 2) oder in der Mitre (Abb. 3) des linearen Kinetikabschnitts unterbrochen, so stellt sich nach hSchstens 1 Std wieder die fiir die Dunkelkeimlinge charakteristische Akkumulationsrate ein. Man mul3 daraus schliel3en, dab das zu diesem Zeitpunkt noch vorhandene P]r keine Wirkung mehr auf die AS-Akkumulation ausiibt (die Pfr-Konzentration wird unter den hier gegebenen Bedingungen durch irreversible Destruktion [Halhwertszeit ca. 45rain; Marm6, 1969) yon ca. 2,5% auf ca. 1% des Gesamtphytochroms erniedrigt]. Andererseits wh-d das Hypokotylli~ngenwachstum des Senfkeimlings durch 1% P# (ira Dunkeln) noch nahezu vollst/~ndig gehemmt (Schopfer, unverSffentlicht). Dieser Vergleich zeigt, dab verschiedene P/r-abh~ngige physiologische Reaktionen einen unterschiedlichen Bedarf an P/r aufweisen. Werden die mit DR vorbestrahlten Keimlinge nach einigen Stunden im Dunkeln erneut ins DR gebracht, so setzt sofort eine verst~rkte Akkumulation yon AS ein, deren Rate sich ohne mel3bare Ubergangsphase der ffir diesen Zeitabschnitt charakteristischen Dl%-Rate angleicht. In Ubereinstimmung mit allen bisher daraufhin untersuchten Photomorphosen des Senfkeimlings (z. B. Lange u. Mitarb., 1967; Rissland und Mohr, 1967; Mohr u. Mitarb., 1968) tritt bei der Zweitbestrahlung keine mel~bare lagPhase auf. Auch bei der AS-Akkumulation mul3 man daher den Schlul~ ziehen, dal3 P# sehr rasch, d.h. ohne mel3bare lag-Phase, seine physiologische Wirksamkeit entfalten kann. - - Die Daten der Abb. 2 und 3 weisen darauf hin, daI3 P# und die Faktoren der ,,prim~ren" Differenzierung sich gegenseitig in ihrer Wirkung nicht beeinflussen. Dieses Resultat steht im Einklang mit allen bisher vorliegenden Daten zur Photomorphogenese des Senfkeimlings. c) Die Wir]cungsweise yon P/r bei der Ascorbinsgure-AlJcumulation. Alle bisher dargestellten I)aten zeigen, da[~ P# bei der AS-Akkumulation des Senfkeimlings die Akkumulationsrate im Rahmen eines vorgegebenen Di•erenzierungsmusters rasch und reversibel regulieren kann. Der]lb

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