Zeitschrift for

LebensmittelUntersuchung und -Forschung

Z. Lebensm. Unters.-Forsch. 163, 123--125 (1977)

© J. F. Bergmann-Verlag 1977

Uber den enzymatischen Abbau von Tripolyphosphat und Diphosphat in zerkleinertem Fleisch IIL Vorkommen yon Diphosphatasen im Muskelgewebe* Rune Neraal und Reiner H a m m Institut fiir Chemie und Physik der Bundesanstalt ftir Fteischforschung, Blaich 4, D-8650 Kulmbach

On the Enzymatic Breakdown of Tripolyphosphate and Diphosphate in Minced Meat. III. Occurence of Diphosphatases in Muscular Tissue Summary. After a review on the present knowledge of the occurence of diphosphatases in muscular tissue own data of the diphosphatase acitivity in the bovine longissimus muscle of nine animals are reported. Remarkable differences between animals were observed, the diphosphatase activity being much lower than the tripolyphosphatase activity. Zusammenfassung. Nach einem 13berblick tiber die das Vorkommen von Diphosphatasen im Muskel betreffenden Arbeiten wird fiber eigene Messungen der Diphosphatase-Aktivit~it im Longissimus-dorsi-Muskel von neun Rindern berichtet. Erhebliche AktividitsUnterschiede von Tier zu Tier wurden beobachtet, wobei die Diphosphatase-Aktivit~it wesentlich niedriger als die Tripolyphosphatase-Aktivit~it war.

Bisherige Kenntnisse iiber Diphosphatasen im Muskel 1. Einleitun 9. Energiereiches Diphosphat (DP) entsteht als Zwi-

schenprodukt bei einer Reihe von Stoffwechselprozessen. Die M/Sglichkeit, DP 1 hydrolysieren zu k6nnen, scheint eine physiologische Notwendigkeit zu sein. Die Aktivierung von Aminos~iuren und einigen organischen S~iuren [1], die Synthese von NAD, NADP, FAD, DNA, RNA, Proteinen, Lipiden, Phospholipiden und Coenzym A sind alles Prozesse, bei welchen DP entsteht [2]. Diese Reaktionen schreiten bei sofortiger Hydrolyse des entstandenen DP rasch fort und werden irreversibel. DP hat eine grol3e Affinit~it zu zweiwertigen Kationen. Enzyme, die von solchen Ionen aktiviert oder gehc~mmt werden, kgnnen durch die Anwesenheit von DP stark beeinfl,ul3t werden. DPasen sind daher wichtige regulierende Enzyme [3]. * Diese Arbeit ist Teil der Dissertation yon R.Neraal (Universit~it Giel3en, 1975) 1 Abkiirzungen: DP = Diphosphat; DPase = Diphosphatase; TP = Tripolyphosphat; TPase = Tripolyphosphatase; EDTA = AthyIendiamintetraacetat

Enzyme mit Diphosphatase (DPase)-Aktivifiit sind in vielen verschiedenen Organismen und Gewebetypen gefunden worden; so z.B. in Mikroorganismen, Hefen, Hamsterz~ihnen, Nieren, Leber, Gehirn, Erythrozyten und Muskeln. Die Enzyme sind in verschiedenen Zellbestandteilen wie Zellkernen, Mitochondrien, Mikrosomen und - - nicht strukturgebunden - - im Sarkoplasma lokalisiert. 2. Funktionelle M e r k m a l e der DPasen. Die Kinetik der DPasen ist

von vielen Autoren eingehend studiert worden. Die Rolle des Mg 2 +-Ions ist yon besonderer Bedeutung, da die Anwesenheit dieses Ions eine absolute Voraussetzung fiir die Aktivit~it der DPasen ist. Kunitz [4] land fiir isolierte DPase aus Hefezellen (pH-Optimum 7,0), dab der Bedarf an Mg 2+ mit sinkendem pH zunimmt. Bei optimaler Mg 2 +-Konzentration besteht eine Reaktionskinetik nullter Ordnung. Bei nicht ausreichenden Mengen an Mg 2+ nahm die Geschwindigkeit mit abnehmender DP-Konzentration zu. Ridlirlgton [5] nahm nach kinetischen Studien der Hefe-DPase drei Funktionen fiir das Mg2 +-Ion an: 1. eine strukturelle Rolle als Teil des Metalloenzyms; 2. eine aktivierende Rolle bei der reversiblen Bindung yon DP an das Metalloenzym; 3. eine Substratrolle bei der Bildung yon MgDP, das als physiologisches Substrat dient. Diese drei Annahmen scheinen fiir alle DPasen giiltig zu sein, auch wenn z. B. Substrataffinit/it und pH-Optimum verschieden sein k6nnen. Von vielen Autoren wurde freies DP (nicht mit MgZ+komplex gebunden) als Inhibitor angesehen [4, 6--9]. Rapoport et al. [10] sind jedoch der Meinung, dab ein lJberschu6 an freiem DP durch eine Komplexbildung mit dem vorhandenen Mg 2+ das Enzym hemme. Hierdurch wi.irde ngmlich das fiir die Aktivatorbindungsstelle n6tige Mg 2+ entfernt und die Aktivitiit blockiert. Sie stellten folgendes kinetische Schema auf (E = Enzym): M g . E ~ M 9 • E . M g D P ~ Produkte

11 E.

11 ~

E . MgDP

K ~SS~Irl n ~ ~ . ~ I ~b e rE [ 7 ] ~ n t e r s ~ c h t e~ ei~e D P a s e a ~s R a t t e ~ eb ~r l

Zellkernen, deren hohe Aktivit~it sie auf eine hohe SubstrataffinitM zurtickfiihrten. Sie nahmen an, da6 die Bindung von Mg2DP oder Ca 2+ an die Aktivatorbindungsstelle das Enzym hemmt, dab die Bindung yon NAD oder DP an die Hydrolysebindungsstelle die Aktivit~it blockiert und dab ATP durch die Komplexbildung mit Mg 2+ als Inhibitor fungiert. Der Schlul3 liege jedoch nahe, dab freies DP auch hier durch eine derartige Komplexbildung hemmend wirkt. 3. Diphosphatasen des Muskels. Nakamura et al. [9] waren die er-

sten, die eine sorgfgltige Untersuchung der DPasen im Muskel durchf~hrten. Von Kaninchenmuskulatur isolierten sie zwei vet-

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R.Neraal und R.Hamm: Abbau von Tripolyphosphat und Diphosphat. III.

schiedene DPasen. Die eine hatte ein pH-Optimum von 5,2 (,,saure DPase") und war hautpsiichlich in der submikroskopischen Partikelfraktion, abet auch in der mikrosomalen und mitochondrialen Fraktion lokalisiert. Die andere DPase, deren pH-Optimum bei 7,0 lag (,,neutrale DPase"), war wasserl6slieh. Dieses Enzym war fiir den gr613eren Teil der Aktivitiit verantwortlich. Die beiden Enzyme wurden von Ca 2+, EDTA, freiem DP, Na +, K + und einem grogen l~berschul3 an Mg 2+ gehemmt; die erforderlichen Mengen waren jedoch unterschiedlich. W~ihrend die neutrale DPase nur in Gegenwart yon Mg a+-Ionen stabil war und durch Mg 2+-Konzentrationen bis zur zehnfachen Menge der DP-Konzentration aktiviert wurde, zeigte die saure DPase keinen Bedarf an Mg 2 +. Die Autoren schlossen daraus, dal3 die Mg 2 +-Ionen w~ihrend der Isolierung an das Enzym gebunden bleiben. Sie versuchten nicht, eine Interpretation des Mechanismus der Hemmung zu geben, aber die Daten lassen sich durchaus mit der Theorie yon Rapoport et al. [101 vereinbaren. Nach ihr mtiBten freies DP und EDTA durch Komplexbildung mit Mg 2+ eine Hemmung hervorrufen - - Mg 2÷ durch die Bildung yon MgxDPv-Komplexen (x > 1) und Ca 2+ durch die Blokkierung der Aktivatorbindungsstelle. Die Hemmung durch Na + und K + ist wahrscheinlich kompetitiver Art, und die erforderlichen Mengen sind verh~iltnism~ifAiggrol3. Nicht auszuschliefAen ist, dab in den Zellkernen des Muskels eine nicht wasserl6sliche DPase zu finden ist, wie sie yon Kesselring u. Siebert [7] aus Leberzellkernen der Ratte isoliert werden konnte. McArdle [2~ stellte fest, dab die DPase-Aktivit~it in der roten Rattenmuskulatur h/Sher ist als in der weigen. 4. Inaktivierung der DPasen. pH-Labilit~it ist fiir verschiedene DP asen nachgewiesen worden. Ein Verlust der Aktivit~it in saurem Milieu bei der Rattenleber-Mikrosomen-DPasewurde zungchst als das Resultat einer Lipidperoxidation angenommen [11]. Rafter u. Witherspoon [121 fanden aber, dab die bei pH 5,1 eingetretene Inaktivierung in neutralem Milieu wieder reversibel wurde. Obwohl Lipidperoxidation das Enzym inaktivieren kann, konnte far die Sfiureinaktivierung damit jede nicht-reversible Reaktion, wie Proteolyse oder thermische Labilit~it bei niedrigen pH-Werten, ausgesehlossen werden. Je niedriger der pH-Wert lag, um so schneller und weitgehender wurde das Enzym inaktiviert. Zwei Reagentien, Na-Citrat und NH4-Molybdat , welche die katalytische Aktivit~it hemmen, verz6gerten auch die Inaktivierungsgesehwindigkeit, beeinflul3ten jedoch nicht das AusmaB der Inaktivierung. Der Effekt diJrfte zum Tell auf einer Komplexbindung mit Mg; + beruhen. Nakamura et al. [-9~fanden ffir die saure und auch fiir die neutrale DPase im Muskel ein Stabilit~itsoptimum bei ca. pH 6,2 (1° C). Was die Stabilit~it bei den entsprechenden Aktivit~tsoptima (pH 5,2 bzw. 7,0) betrifft, so zeigte sich far beide Enzyme eine mit der Temperatur (30--50 ° C) zunehmende Inaktivierung, die im Falle der neutralen DPase durch MgCI 2 verz/Sgert wurde. Eine eventuelle Reversibilit~it wurde nicht gepriift. 5. Diphosphatase-Aktivit& yon Rind- und Schweinefleisch. Nach Abschlul3 unserer Arbeiten fiber den enzymatischen Abbau yon DP und Tripolyphosphat (TP) in zerkleinertem Fleisch, fiber deren Resultate bereits 1972/1973 berichtet worden war [13, 141, erschienen weitere Beitr~ige zum Studium der DPase-Aktivit~it in Fleisch. Mihalyi-Kengyel u. K/Srmendy [15] studierten die Hydrolyse yon zugesetztem DP w~ihrend der Lagerung von zerkleinertem Schweinemuskel (+4 ° C) nach Eintritt des Rigor morris. 2% NaC1 iibte auf die DPase-Aktivit~it eine hemmende Wirkung aus. Toluol bewirkte eine Beschleunigung des DP-Abbaues; dies wurde mit einer Plasmolyse, d.h. mit einer Freisetzung von DPase-Isozym aus der Gewebestruktur erkl~irt. Ohne Toluol wurde eine w~ihrend des DP-Abbaues zunehmende Abbaugeschwindigkeit beobachtet. - - Der Abbau von zugesetztem DP erfolgt nach Van Hoof [16~ in w~issrigem, blassem Schweinefleisch (PSE-Fleisch) langsamer als in Fleisch normaler Qualitiit. Die DPase-Aktivit~it war in den Muskeln beider Quali-

t~tsgruppen geringer als die TPase-Aktivit~it. - - Uber den Abbau yon zugesetztem DP in einem handelsfiblichen Brtihwurstbr~it berichteten jiingst Gerhardt u. Rein [12]. Ein mit der angewendeten halbquantitativen Methode nachweisbarer DP-Abbau durch fleischeigene Enzyme bis unter die Nachweisgrenze erfolgte nur bei Zusatz von 0,3 g/kg (nicht bei 0,5 g/kg) und zwar erst innerhalb 24 Std (2--4 ° C). Der Abbau von DP durch zugesetzte ,,arffremde" Enzyme, n~imlich durch alkalische Phosphatase, saure Phosphatase und Pyrophosphatase war ebenfalls nur gering.

Individuelle Unterschiede der Diphosphatase-Aktivitfit yon Rindermuskel Ehe wir uns mit dem Einflul3 verschiedener, bei der Fleischverarbeitung in Betracht kommender Faktoren auf die Geschwindigkeit des enzymatischen Abbaues von zugesetztem DP in zerkleinertem Rindfleisch befal3ten, war zun~ichst festzustellen, wieweit sich die DPase-Aktivitfit des gleichen Muskels yon Tier zu Tier unterscheidet. Wegen der starken pH-Anderungen, die zwischen dem Zeitpunkt der Schlachtung des Tieres und der vollst~indigen Entwicklung des Rigor morris im Muskelgewebe eintreten, wurde die DPaseAktivitgt erst nach Eintritt des Rigor bestimmt.

Material und Methoden Material: Longissimus dorsi-Muskel des Rindes nach Eintritt des Rigor mortis (mindestens drei Tage nach dem Schlachten). Nach Entfernen des anh~ingenden Fett- und Bindegewebes das Fleisch im Fleischwolf (3 mm-Scheibe) zerkleinern, 0,5% Tetranatrium-Diphosphat (Na~P2OT) der Fa. Benckiser-Knapsack GmbH zusetzen. Das Pr~parat enthielt Spuren an Monophosphat. Ferner wurden 2% NaC1 (pro anal.) und 50% entionisiertes Wasser zugesetzt. NaC1 wurde zugeffigt, da in der Praxis DP stets in Kombination mit NaCI verwendet wird. - - Methode zur Bestimmung der DPaseAktivit~it, vgl. I. Mitteilung dieser Reihe [18]. Bestimmung des Proteingehaltes mit der KjeldahI-Methode, pH-Wert elektrometrisch mit der Glaselektrode.

Ergebnisse Wie aus Tab. 1 und Abb. 1 hervorgeht, variierten die DPase-Aktivit~ten bei 9 untersuchten Tieren zwischen 0,12 und 0,63 ~tmol/min/g Protein. Die for den Abbau yon 0,5% DP bei Zimmertemperatur erforderliche Zeit lag zwischen 2 und 12 Std, w~ihrend ffir den TPAbbau bei denselben Muskeln die entsprechende Dauer nur 9 bis 19 rain betrug [191. Diese ffir Rindermuskel festgestellte Tatsache, dab n~imlich die DPaseAktivit~it, des Gewebes wesentlich niedriger ist als die Tabeile 1. Diphosphatase-Aktivitfit yon zerkleinertem M. longissimus dorsi des Rindes. - - Zus~tze: 0,5% DP; 2% NaC1; 50% Wasser. Aktivit~it bei 22 ° C in ~tmol DP/min - g Protein Tier

Tage p.m.

pH

Aktivit~it

1 2 3 4 5 6 7 8 9

3 ll 7 4 7 4 8 4 6

6,4 6,1 6,1 6,0 5,9 5,9 5,9 5,9 5,8

0,63 0,15 0,12 0,14 0,46 0,22 0,18 0,12 0,12

R. Neraal und R. Hamm: Abbau von Tripolyphosphat und Diphosphat. III.

80 ~ ' o ~ . .C ~6

~- 40

O1

-6 E

2

× t

I

2

4

Std nach DP-Zusatz Abb. 1. Schneller und langsamer Abbau yon Diphosphat bei Zim-

mertemperatur (0,5% DP; 2% NaC1; 50% HzO )im zerkleinerten M. longissimus dorsi von zwei Rindern

Tripolyphosphatase-Aktivitiit, gilt auch fiir den Skeletmuskel des Schweins [15, 16]. Im Gegensatz zur TPase-Aktivit~it war eine klare Beziehung zwischen pH-Wert des Fleisches und DPase-Aktivit/it nicht zu erkennen. Literatur i. Schlegel, H.G.: Allgemeine Mikrobiologie. Stuttgart: Thieme 1969 2. McArdle, B.: Muscle Disease Proc. Internat. Congr. S. 205. Amsterdam 1969 (Erschienen 1970)

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3. Horn, H, B6rnig, H., Thiele, G.: Eur. J. Biochem. 2, 243 (1967) 4. Kunitz, M. : J. gen. Physiol. 35, 423 (1952) 5. Ridlington, J. W. : Dissertation. Diss. Abstr. Internat., Section B: Sciences and Engineering (Ann. Arbor. Mich.) 32, 3172 (1971) 6. Baykov, A.A., Braga, E.A., Avaeva, S. M. : EEBS-Letters 21, 80 (1972) 7. Kesselring, K., Siebert, G.: Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem. 348, 585 (1972) 8. Moe, O.A.: Dissertation. Diss. Abstr. Internat., Section B: Sciences and Engineering (Ann. Arbor, Mich.) 32, 3167 (1971) 9. Nakamura, S., Yamaguchi, M., Morita, J., Yasui, T.: Japan. Bull. Meat, Meat Prods. 5, 19 (1969) 10. Rapaport, T.A., H6hne, W.E., Reich, J.G., Heitmann, P., Rapaport, S.M.: Eur. J. Biochem. 26, 237 (1972) 11. Goshal, A. K., Decknagel, R. O. : Life Sci. 4, 2195 (1965) 12. Rafter, G.W., Witherspoon, B.H.: Life Sci. 11,995 (1972) 13. Hamm,R., Neraal, R., Sauer, H,: Jahresbericht der Bundesanstalt ftir Fleischforschung, Kulmbach, 1972, [ 69, 1 70 14. Neraal, R., Hamm, R.: Proceed. 19th European Meat Research Worker's Meeting, Bd. IV, S. 1419. Paris 1973 15. Mihalyi-Kengyel, V., K6rmendy, L.: Acta Alimentaria 2, 69 (1973) 16. VanHoof, J.: Proceed. 21th European Meat Research Worker's Meeting, S. 35. Bern 1975 17. Gerhardt, U., Rein, H. W. : Fleischwirtschaft 55, 1396 (1975) 18. Neraal, R., Hamm,R.:Z. Lebensm. Unters.-Forsch. I.Mitt. 163, 14 (1977) 19. Neraal, R., Hamm,R. : Z. Lebensm. Unters.-Forsch. II. Mitt. 163, 18 (1977)

Eingegangen am 19. Mai 1976