Arch. orthop. Unfall-Chir. 90, 315--323 (1977)

Archiv for orthopadische und UnfalI-Chirurgie © d.F. Ber9mann-Verla 9 1977

Oberfl ichenbetrachtung des Gelenkknorpels nach Einwirkung yon Hyaluronidase E. Hancke I u n d I.-E. Richter 2 Pathologisches Institut der Kliniken der Landeshauptstadt Wiesbaden (Direktor: Prof. Dr. W. Remmele), Schwalbacher Str. 62, D-6200 Wiesbaden 2Institut ftir allgemeine und experimentelle Pathologie der Bundeswehr (Leiter: Prof. Dr. H. G. Fassbender), D-6500 Mainz, Bundesrepublik Deutschland

Observations of the Surface of the Articular Cartilage after Treatment with Hyaluronidase Summary. 1. The articular surfaces of the femoral head of rats have been studied by scanning electron microscopy after in vitro treatment with hyaluronidase. 2. The cartilage surface has been digested mildly by the buffer medium (control). 3. The matrix of the cartilage has selectively been removed by the hyaluronidase. 4. Chondrocytes have been seen on the surface after treatment with hyaluronidase for a longer period. 5. We discuss the result of enzymatic digestion. Zusammenfassung. 1. Die Gelenkflfichen von Rattenhtiftk6pfen wurden nach In-vitro-Behandlung mit Hyaluronidase im Rasterelektronenmikroskop untersucht. 2. Bereits die hyaluronidasefreie Citratpufferl6sung (Kontrolle) greift die Knorpeloberflache geringfiigig an. 3. Die Hyaluronidase 16st die ungeformte Knorpelsubstanz in den oberfl/~chlichen Schichten selektiv heraus. 4. Nach 1/ingerer Behandlung mit Hyaluronidase liegen Knorpelzellen frei. 5. Das unterschiedliche Ausmag der Enzymwirkung wird diskutiert.

Rasterelektronenmikroskopische Untersuchungen an normalen (Gardner und Woodward, 1969; Clarke, 1971 a, b; Richter, 1971, 1977; Puhl, 1974; Puhl und Remus, 1974; Redler, 1974) und arthrotisch ver/inderten Gelenkoberfl~ichen (Inoue und Mitarb., 1969; Cotta und Puhl, 1970, 1973; Ohnsorge und Mitarb., 1970; Richter, 1972, 1974; Dustmann und Mitarb., 1971; Puhl, 1971a, b, 1974; Redler, 1974; Refior, 1974) haben wichtige Hinweise zur Pathogenese des KnorSonderdruckanfragen an: Dr. E. Hancke, Kronprinzenstr. 41, D-5300 Bonn-Bad Godesberg

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pelabbaus geliefert. Enzymatische Vorg/inge scheinen dabei eine wesentliche Rolle zu spielen (Greiling und Mitarb., 1964; Evanson, 1970; Puhl, 1971 a, b; Puhl und Mitarb., 1971; Eberhard und Mitarb., 1972; Lust und Mitarb., 1972; Kaneko und Greiling, 1973; M o m b u r g und Mitarb., 1976; Richter, 1977). Es handelt sich hierbei vor allem um lysosomale Enzyme, wie z. B. die fl-Glucuronidase und die fl-N-Acetylglucosaminidase (Eberhard und Mitarb., 1972; Momburg und Mitarb., 1976). Die Enzyme stammen wohl in erster Linie aus den polymorphkernigen Granulozyten der Synovialfltissigkeit (Puhl, 1971 a, b; Eberhard und Mitarb., 1972; M o m b u r g und Mitarb., 1976). Diese Enzyme bauen offenbar die Proteoglykane, die die R~iume zwischen den Kollagenfasern ausftillen, ab. Dadurch vermindert sich die Knorpelgrundsubstanz, und die Kollagenfasern werden demaskiert. Der Knorpel verliert an Elastizit~it und Gleitf/ihigkeit, die erh6hten Reibungskr/ifte erodieren die Oberfl~iche (Howell und Mitarb., 1974). Bei der Arthrosis deformans geht der Knorpelabbau wahrscheinlich von den lysosomalen Enzymen der Chondrozyten aus (Eberhard und Mitarb., 1972; Kaneko und Greiling, 1973). Ein wesentlicher Baustein in der baumartigen Struktur der Proteoglykane ist die Hyalurons/iure (Howell, 1975). Sie kann mit Hilfe der Hyaluronidase in ihre Bestandteile Glucurons~iure und N-Acetylglucosamin gespalten werden (Karlson, 1974; Stuhlsatz und Mitarb., 1976). Diese Hyaluronidasewirkung wurde bei der Untersuchung der Feinstruktur der Gelenkoberfl~ichen benutzt (Gardner und Woodward, 1969; Richter, 1971). D a jedoch erst mit der Einftihrung der Kritischen-Punkt-Trocknung eine schonende Pr/iparation der Objekte, auch des Htiftknorpels (Richter, 1977), m6glich war, schien es ratsam, die friiheren Untersuchungen am Rasterelektronenmikroskop (Richter, 1971) unter modifizierten Bedingungen zu wiederholen.

Methodik Es wurden zehn Htiftk6pfe von sieben Ratten m/innlichen und weiblichen Geschlechts im Alter yon drei bis vier Monaten mit einem Gewicht von 280 bis 405 g verwendet. Die Ratten wurden kurzfristig mit Ather bet~iubt und dutch Nackenschlag get6tet. Nach schonender Pr~iparation der Htiftk6pfe und Anschlingen eines Fadens am Schenkelhals wurden der Femur abgetrennt, die Htiftk6pfe in die Gl~isermit den vorbereiteten L6sungen gehgngt und, damit sich die L6sungen in stgndigem Umlaufbefanden, die Gl~iserim Wasserbad bei 37°C mit einer Frequenz von 60/rain geschtittelt. Vier Hiiftk6pfe wurden der Einwirkung einer gering konzentrierten Hyaluronidasel6sung (Fa. Serva, Heidelberg) von 3,2mg/100ml Citratpuffer und drei weitere einer 1000fach starkeren L6sung (3,2g/100 ml) entsprechend den Enzymkonzentrationen von Richter (1971) ausgesetzt. Der Citratpuffer hielt den pH-Wert konstant zwischen 4,0 und 6,0, dem Bereich mit der optimalen Enzymaktivitgt (Bergmeyer, 1974). Zur Kontrolle wurden drei weitere HiJftk6pfe nur mit Citratpuffer behandelt. Die Htiftk6pfe verblieben sechs Stunden bis drei Tage in den L6sungen, wurden danach in phosphatgepuffertem Glutaraldehyd fixiert, in der aufsteigenden Azetonreihe entwgssert und nach der Kritischen-Punkt-Methode (Anderson, 1951) getrocknet. Eine leitende Oberflgche wurde durch Aufdampfen einer Goldschicht im Hochvakuum erzielt. Die Untersuchung der Oberfl~iche fand in einem Rasterelektronenmikroskop ,,Stereoscan Mark II A" der Fa. Cambridge Ltd. (England) statt.

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Abb. 1. Hfiftkopf Ratte nach Behandlung mit Citratpuffer (Kontrolle). a Nach 18 Stunden. Vergr613erung: 1650 : 1. b Nach 3 Tagen. Vergr6Berung: 1680 : 1

Ergebnisse N a c h d e m die H i i f t k 6 p f e sechs bis a c h t z e h n S t u n d e n in C i t r a t p u f f e r o h n e Z u s a t z von H y a l u r o n i d a s e verweilt hatten, finder m a n eine K n o r p e l o b e r f l g c h e , die aus

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Abb. 2. Hi~ftkopf Ratte nach Behandlung mit Hyaluronidase. a Nach 6 Stunden, Vergr61~erung: 8240 : 1. b Nach 18 Stunden. Vergr6Berung: 8680 : 1 kugeligen Gebilden von 0,3 bis 1,4 gm Durchmesser besteht. Die Kugeln sind z. T. perlschnurartig aneinandergereiht (Abb. 1 a). Sie liegen oberfl~ichlich frei. In der Tiefe sieht man zwischen den Kugeln eine homogene Zwischensubstanz. Nach einer Inkubationszeit von 3 Tagen in Citratpuffer sind die Vertiefungen zwischen den Kugeln noch st~irker ausgeprggt (Abb. 1 b).

Oberfl~tchenbetrachtung des Gelenkknorpels

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Abb. 3. Hiiftkopf Ratte nach Behandlung mit Hyaluronidase nach 3 Tagen. a Vergr6gerung: 930 : 1. b Vergr6Berung: 1960 : I Sechs Stunden nach Behandlung der Hfiftk6pfe mit der gering konzentrierten Hyaluronidasel6sung findet man an der Knorpeloberflfiche Inseln eines glatten ~lberzugs, der geringgradig gewellt ist. An den Stellen, an denen der Oberfl/ichentiberzug fehlt, treten 0,2 bis 0,6 ]am dicke, faserartige Strukturen zutage. Sie sind netzartig angeordnet und fast ausnahmslos parallel zur Oberfl/iche ausgerichtet.

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An der Oberfl/iche liegen sie frei. In der Tiefe erkennt man zwischen den Faserbtindeln eine homogene Substanz. An jenen Stellen, an denen einzelne, sehr oberfl/ichlich liegende, kaliberstarke Faserbtindel unter den Inseln des glatten Oberfl/ichentiberzugs verschwinden, deuten Erhebungen innerhalb des Uberzugs den weiteren Verlauf der Fasern an (Abb. 2 a). Nach einer Einwirkungszeit der Hyaluronidase yon 18 Stunden sind die Reste des Gelenktiberzugs vollends geschwunden. Jetzt werden auch tieferliegende Fibrillen sichtbar. Die ungeformte Knorpelmatrix zwischen den Faserbtindeln fehlt nahezu v611ig (Abb. 2b). Drei Tage nach Enzymbehandlung lassen sich kreisf6rmige bzw. oval/ire, parallel zur Oberfl/iche ausgerichtete Gebilde mit einem linsenf6rmigen, zentralen Anteil yon 9--15 gm Durchmesser erkennen. Dieser liegt in einer Substanzaussparung und ist darin mit strangf6rmigen Ausl~iufern verankert. Ein Teil dieser oval/iren Gebilde liegt paarweise beieinander (Abb. 3). Die tibrige Oberfl/iche wird von zahlreichen 0,2 bis 0,8 gm grogen, kugeligen Gebilden besetzt, die z.T. auch zu gr6fSeren Haufen zusammengeballt sind. Zwischen den Kugeln erkennt man eine ungeformte Substanz. Faserartige Strukturen sind nicht zu erkennen. Bei einem weiteren, ebenfalls 3 Tage der Hyaluronidase ausgesetzten Hiiftkopf konnten die oval/iren Gebilde nicht beobachtet werden. An der Oberfl~iche der Htiftk6pfe, die sich bis 24 Stunden in einer 1000fach starkeren Hyaluronidasel6sung befanden (3,2g/100ml), liegen 0,1 bis 0,5gm dicke, faserartige Strukturen sehr dicht nebeneinander. Sie erscheinen glatter strukturiert als die vorher beobachteten Fasern, liegen abet nut teilweise frei. Zwischen den Easern ist deutlich eine homogene Substanz zu erkennen. Mit dem blol3en Auge und bei Lupenvergr6gerung erschienen die Oberfl/ichen aller Htiftk6pfe glatt, gleichgtiltig, ob sie der Einwirkung des Enzyms oder der Kontroll6sung ausgesetzt waren.

Diskussion

In den oberfl/ichlichen Anteilen des normalen Gelenkknorpels lassen sich zur Tiefe hin folgende Schichten unterscheiden (Wiltberger und Lust, 1975): Eine feine Geweblage, die die Oberfl~iche bedeckt und die der Lamina splendens in der Lichtmikroskopie entspricht; eine Schicht aus schmalen, eng in Btindeln zusammengefagten, parallel zur Oberfl/iche ausgerichteten Kollagenfasern; eine Sclrichtmit nicht mehr in Btindeln liegenden, zumeist parallel zur Oberfl~iche ausgerichteten K011agenfasern und mit ovalen Knorpelzellen; eine Schicht mit grgfStenteils dicken, ungebtindelten Kollagenfasern ohne bevorzugte Verlaufsrichtung und mit runden Knorpelzellen. In unseren Versuchen wurde die feine oberfl/ichenbedeckende Geweblage des Hiiftknorpels bereits durch die Inkubation der Htiftk6pfe in der Kontroll6sung aus Citratpuffer angegriffen. Freiliegende Faserstrukturen werden aber erst nach der Behandlung mit Hyaluronidase sichtbar. Offenbar 16st das Enzym die ungeformte Zwischensubstanz aus den oberfl/ichlichen Schichten selektiv heraus, so dab die netzartig angeordneten und nahezu parallel zur Oberfl/iche ausgerich-

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teten Faserbfindel demaskiert werden. Die Kaliberst~irke von 0,2 bis 0,6gm spricht dagegen, dab es sich um einzelne Kollagenfasern handelt. Diese wohl in Btindeln zusammengefaBten Kollagenfasern direkt unter der Knorpeloberfl~iche haben durch ihren Verband anscheinend noch gentigend Stabilit~it, um auch nach dem Schwund tier Knorpelgrundsubstanz in ihrer urspriinglichen Lage verharren zu k6nnen. Ein gleichartiger Aufbau dieser oberflfichlichen, unter der Lamina splendens liegenden Knorpelschicht wurde auch yon anderen Autoren beschrieben (Gardner und Woodward, 1969; Mohr und Mitarb., 1975; Wiltberger und Lust, 1975; Richter, 1977). Einzelne dicke Faserbtindel, die sehr oberfl/ichlich verlaufen, scheinen die sanften Wellungen des Knorpeliiberzugs, die sog. terti~ire Struktur (Puhl und Remus, 1974), zu bedingen. Verschwinden Faserbtindel unter den Inseln der noch erhaltenen Lamina splendens, dann deuten die Erhebungen des Oberfl~ichentiberzugs den weiteren Faserverlauf an (Abb. 2a). Die ovalen bzw. runden Formationen der terti~iren Struktur lassen sich allerdings durch diese Kollagenfaserbt~ndel allein nicht erkl/~ren. Knorpelzellen, die hierftir verantwortlich gemacht werden (Gardner und Woodward, •969; Cotta und Puhl; 1970; Puhl und Mitarb., 1971; Puhl und Remus, 1974), konnten in Ubereinstimmung mit anderen Autoren (Gardner und Woodward, 1969; Wiltberger und Lust, 1975) direkt unter der Lamina splendens nicht beobachtet werden. Erst nach 1/ingerdauernder Behandlung mit Hyaluronidase werden Strukturen sichtbar, die den beschriebenen ovalen, abgeflachten und zum Teil paarweise beieinanderliegenden Knorpelzellen entsprechen (Lust und Sherman, 1973; Muirden und Mitarb., 1974; Wiltberger und Lust, 1975). Sie sind parallel zur Oberfl~iche ausgerichtet, von einem Hof umgeben und darin mit strangf6rmigen Ausl~iufern verankert. Faserstrukturen kOnnen zwischen den Knorpelzellen nicht beobachtet werden. Hier finden sich zahlreiche kugelige Gebilde. Offenbar verlieren die schmalen, nicht in Bi~ndeln zusammengefaBten Kollagenfasern der Schicht, in der sich die ovalen Knorpelzellen befinden, durch das Herausl6sen der Proteoglykane ihren Halt und verschwinden. Die freiliegenden Makromolektile tier ungeformten Matrix rollen sich offensichtlich zu den kugeligen Gebilden an tier Oberfl~iche zusammen (Abb. 3). Nach Einwirkung der hochkonzentrierten Hyaluronidasel6sung sind wieder Kollagenfasern sichtbar, die abet dichter gepackt und insgesamt glatter konturiert sind. Die Zwischensubstanz ist nicht so stark herausgel6st. Es l/iBt sich nicht entscheiden, um welche Knorpelschicht es sich hierbei handelt. Da keine Knorpelzellen zu sehen sind, mfiBte man annehmen, dab diese Faserstrukturen aus der Schicht direkt unter der Oberfl~iche stammen. Andererseits sind die Fasern abet dtinner und glatter als die in der oberfl/~chlichen Schicht beobachteten Biindel, so dab der Eindruck entsteht, als ob es sich um einzelne Kollagenfasern mit einem ziemlich groBen Durchmesser handelte, wie sie in tiefeten Knorpelschichten vorkommen (Wiltberger und Lust, 1974). Diese Untersuchungen konnten die von Richter (1971) beobachtete Wirkung der Hyaluronidase im damaligen AusmaB nicht best~itigen. Es ist durchaus denkbar, dab das Enzym die einzelnen Ht~ftk6pfe individuell verschieden angreift, aufgrund einer unterschiedlichen Widerstandskraft der Htiftk6pfe. Vielleicht kommt die Wirkung erst bei einem bereits in vivo in gewissem MaBe vorgesch~idigten Knorpel zur vollen Auspr/igung, wie yon Gardner und Woodward (•969)

322 beschrieben. Es ist j e d o c h a u c h Herstellung der Hyaluronidase w o r t l i c h ist. D a n n wgren a b e r ver~inderungen m6glicherweise ftihren.

E. Hancke und I.-E. Richter n i c h t auszuschliegen, d a b eine .gmderung in der ftir die h i e r erzielte, geringere W i r k u n g v e r a n t die v o n Richter (1971) b e s c h r i e b e n e n K n o r p e l a u f ,,Verunreinigungen" des E n z y m s zurtickzu-

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