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Die Mobilisierung des Reservemannans im keimenden Dattelsamen LUCAS I~EUSCH Botanisehes I n s t i t u t der UniversitEt Fribourg, Schweiz Eingegangen am 11. Oktober 1967

Mobilisation o] Reserve Mannan in Germinating Date Seeds Summary. Morphological and biochemical studies of the decomposition of endosperm tissue in germinating date seeds have shown t h a t the mobilisation of reserve substances is effeeted with the help of exoenzymes. The depolymerisation of the m a n n a n chain takes place in a "dissolution zone" surrounding the haustorium. This dissolution zone can be further divided into two sub-zones; a primary zone (consisting of several cell layers) where the secondary wall becomes swollen b u t does not lose its form, and a secondary zone (much smaller) where the m a n n a n is broken down to mannose residues. The cellulose of the primary wall resists decomposition and remains as threadlike elements in the secondary zone. F r o m the results of qualitative and quantitative sugar determinations it is evident t h a t mannose is the endproduct of m a n n a n decomposition. The mannose is t h e n absorbed b y the haustorimn. F r o m incubations in vitro of solutions of m a n n a n A with haustoria a n u m b e r of oligosaccharides were isolated. The substances found included fragments of pure m a n n a n chains containing 1--5 mannose residues. I n much smaller amounts oligosaceharides containing glucose and mannose residues were found. I t is of interest to note t h a t myoinositol was also detected. The failure to detect phosphorylase activity a n d the absence of phosphorylated intermediary products in the dissolution zone suggest t h a t a hydrolytic process must be involved in the decomposition of the mannans. After absorption b y the seedling, marmose is converted into sucrose, b u t the mechanism of this synthesis was not clearly determined. No sugar nucleotides were detected in the dissolution zone. I n in vitro experiments with enzymes extracted from the haustorium (to observe possible sugar nucleotide formation) only UTP, and not GTP, was found to react with mannose. A possible reaction scheme for the conversion of m a n n a n to sucrose is proposed, and the form in which sugar is t r a n s p o r t e d from the endosperm to the seedling is discussed.

A. E i n l e i t u n g Das am weitesten verbreitete und wh'tschaftlich wichtigste Reservep o l y s a c c h a r i d i n S a m e n i s t o h n e Z w e i f e l d i e St/~rke, d e r e n M o b i l i s i e r u n g b e i d e r K e i m u n g e i n g e h e n d u n t e r s u c h t w o r d e n ist. D e m g e g e n f i b e r i s t d e m A b b a u d e s R e s e r v e m a n n a n s v i e l e r P a ] m e n s a m e n bis h e u t e n o e h keine groBe Aufmerksamkeit geschenkt worden. Dieses Mannan ist ein Zellwandstoff, dessen ehemisehe Struktur vor allem bei der SteinnuB 22

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L. KEuseH:

(Phytelephas macrocarpa RVlZ. u. PAy.) und beim Dattelsamen (Phoenix daetyli/era L.) untersucht worden ist~ woes mengenm~l~ig etwa 90% der Wandsubstanz ausmacht. I)~I~OSHEIM u. SEIFEXT (1922) fanden, da[~ sich ein Tell des Steinnul~mannans in 5%iger Natronlauge nicht 15ste. Auf Grund dieser Beobachtung definierte LODTKE (1927) zwei Mannantypen, A und B, die sich in ihrer AlkalilSslichkeit unterscheiden. MEIE~s (1958) Bestimmung des Polymerisationsgrades ergab 17--21 HexoseEinheiten bei Mannan A und ca. 80 bei Mannan B. Das Hydrolysat yon Mannan A aus der Steinnu6 enthielt 99,6 o/o Mannose und 0,4 % Galaktose/Glucos% jenes yon Mannan B 93,4% Mannose, 1,8% Galaktose, 2~4% Glucose und 2,4% Arabinose. Mengenmi~6ig verhielten sich die beiden Typen A und B ungefghr wie 2:1. Nach ASPINALL u. Mitarb. (1953, 1958) enthalten Mannan A und B je zwei Molekfilarten, eine mit einem Mannopyranoserest als nichtreduzierender Endgruppe und die an@re mit einem Galaktopyranoserest. Neben fi-1,4- und kleinen Mengen ~-l,4-Bindungen zwischen den Mannopyranoseresten finden sich auch 1,6-Bindungen (6,8% in Mannan A und 14,3% in Mannan B). MEIE~s (1956, 1958) mikroskopische und submikroskopische Untersuchungen der Endospermzellwi~nde bei Steinnul~- und Dattelsamen ergaben folgendes Bild: Auf die dfinne, vermutlich cellulosische Primi~rwand ist eine stark verdickte Sekundi~rwand aufgelagert, in der die Mikrofibrillen yon Mannan B senkrecht zur L~ngsachse der Zelle (bei Phoenix) angeordnet sind. Mannan A ist kristallin und feinkSrnig in das mikrofibrill~re Gerfist des r6ntgenamorphen Mannans B eingelagert. Mit dem Abbau des Mannans haben sich seit der klassischen ,Keimungsgeschichte der Dattel" yon SAc~s (1862) verschiedene Autoren befaBt, aber wenig Iqeues hinzugeffigt 1. SAC~S beschreibt den Vorgang exakt und findet, da~ der Keimling sich ,,~hnlich wie die Schmarotzerpflanzen" erni~bre. Eine dfinne Grenzschicht zwischen Endosperm und Haustorium (Saugorgan) wird, ungeachtet der Zellgrenzen, aufgeweicht. Er denkt bereits an einen fermentativen Abbau. REISS (1889) konst~tiert ein schichtenweises ,,Abschmelzen", bei dem nur die Mittellamellen verschont bleiben. Nach Gxu]~ss (1894) werden die Enzyme yon der Haustoriumepidermis gebildet und sezerniert, und in seiner Arbeit yon 1902 bemerkt er, dab Rohrzucker aus dem Endosperm die erste Nahrung des Embryos darstelle. In einem spi~teren Stadium werde die ,Galaktomannan"-l:'~eserve des Endosperms in Mannose und Galaktose zerlegt und nach dem Eintritt in das Haustorium in l%ohrzucker umgewandelt. KLAGES u. MAUI~E~BRECttEI~ (1938) stellten mit Malzextrakt-Enzymen Mannobiose dar aus Steinnul~- und Salepmannan, die beide wohl gleich gebaut sind wie das Reservekoh]enhydrat des Dattelsamens. F~E:Z (1954) 1 Die viel gr66ere Steinnu] hat m.W. in unseren Breiten niemand zur Keimung bringen kSnnen.

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gab auf G r u n d seiner histochemischen Lokalisation der s a u r e n Phosp h a t a s e Hinweise auf d e n A b b a u des E n d o s p e r m s yon Phoenix dactyli[erct. I n der vorliegenden A r b e i t wurde der morphologisehe u n d ehemisehe Verlauf der M a n n a n m o b i l i s i e r u n g s t u d i e r t u n d u n t e r s u c h t , ob dabei M a n n a n A u n d B gleiehzeitig a b g e b a u t w/irden, i n weleher F o r m das K o h l e n h y d r a t in den K e i m l i n g eintrete, u n d was sein weiterer Weg im Stoffweehselgesehehen der j u n g e n Pflanze sei.

B. Material und lllethoden 1. Allgemeine Vorbemerkungen a) Die Zuekerl6sungen wurden bei 35~ die Nueleotidl6sungen bei 25~ im Vakuumrotationsverdampfer konzentriert oder zur Trockenheit eingedampft. b) Die Hydrolyse der wasserunl6sliehen Kohlenhydrate erfolgte dureh Behandlung mit 72%iger SchwefelsEure (1 Std bei 30~ und ansehlieSend mit 4%iger Sehwefels/iure (1 Std bei 122~ Wasserl6sliehe Kohlenhydrate wurden direkt in 4%iger SchwefelsEure hydrolysiert (1 Std bei 122~ Die Hydrolyse der Saccharose effolgte mit 4%iger Schwefelsgure w~hrend 1 Std bei 100~ Naeh dem Abkfihlen der Hydrolysate wurde mit ges/~ttigtem Bariumhydroxyd und Phenolphthalein als Indicator neutralisiert, der Sulfatniedersehlag abzentrifugiert und der Uberstand im Rotationsverdampfer konzentriert. e) Fiir die absteigende Papierehromatographie fund das Papier Sehleicher und Sehnet12043 a oder 2043 b Verwendung, ffir pr/~parative TrennungenWhatman 3 MM. Als Laufmittel dienten: A. _4thylaeetat/Pyridin/Wasser B. Athylaeetat/Pyridin/Wasser C. Athylaeetat/Pyridin/Wasser D. Athylaeetat/Essigsgure/Wasser E. Wassergesgttigtes Phenol F. Propanol/Ammoniak/Wasser G. Athanol/M-AmmoniumacetatpH 3,8

2:1:2 8:2:1 10:4:3 3:1:3

v/v (obere Phase) v/v v/v v/v (obere Phase)

6:3:1 v/v 7:3 v/v

Zum Nachweis yon Zuekern auf den Chromatogrammen wurden alkalisches Silbernitrat (TREvELYAN et al., 1950) oder p-Anisidin-HC1 und f/ir Ketosen das Harnstoffreagens, beide naeh ttousH et al. (1950), verwendet, ffir Zuekerphosphate und Nucleotide das Reagens yon HASPS und ISgERWOOD (1949) oder yon GORDO~ et al. (1964). Znr Nucleotidlokalisierung wurde auch die UV-Lampe beniitzt. d) Die Papierelektrophorese wurde mit 0,2 M Ammoniumformiatpuffer (pH 3,7) bei einer Spannung yon 30 V/era w/ihrend 1~2 Std durehgefiihrt. e) Verwendete Abkiirzungen: UTP = Uridintriphosphat, UDP = Uridindiphosphat, UDP-G = Uridindiphosphat-Glueose; GTP = Guanosintriphosphat, GDP = Guanosindiphosphat, GDP-M ~ Guanosindiphosphat-Mannose; G-1-P Glucose-l-Phosphat, M-1-P = Mannose-l-Phosphat, M-1,6-P = Mannose-l,6-Diphosphat; Fru = Fructose, Gal = Galaktose, Glu Glucose, Arab ~ Arabinose, Rha = Rhamnose, Xyl = Xylose; M2, M3, M4, M5 = Mannobiose (=fl-l,4-DMannopyranosyl-D-mannose), -triose, -tetraose, -pentaose (alle vier homoIog); Sa = Saeeharose.

2. K e i m u n g der Samen Zur Untersuehung kamen die Kerne von k~uflichen, gezuckerten oder ungezuckerten Datteln, meistens Phoenix dactyli]era cv. Deglet Nour. Die abnormal 22*

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L. Knusc~:

ausgebildeten Samen wurden ausgeschieden. Lagerung Ms Frucht oder als Samen fiber 1 Jahr hatte keinen merklichen Einflug auf die Keimfghigkeit. Als giinstig fiir die Keimung erwiesen sieh folgende Bedingungen: Die Samen wurden 30 min mit 10%igem Javellewasser behandelt, griindlieh mit Leitungswasser gespiilt, fiber Naeht in Wasser gequollen und dann in feuehtem S~gemehl bei 32--33 ~ zur Keimung angesetzt. Am 6. oder 7. Tag wurden die Keimlinge in gut durehlfiftete, feuchte Erde (mit Torfmull und Sand vermischt) gebraeht und mit einer Sehieht von ca. 1 em zugedeekt. Sie wuchsen bei der gleiehen Temperatur im Dunkeln bis zur Verwendung.

3. Extralction des Versuehsmaterials Vor der Extraktion wurden die Samen in versehiedenen Entwicklungsstadien zwischen Samenruhe und vollst~ndigem Abbau des Endosperms in einze]ne Teile zerlegt. Bei ruhenden Samen konnte der Embryo n~eh Entfernung der Samenschale aus dem Endosperm herausgehoben werden. Die angekeimten Samen wurden zerlegt in Wurzel, Sprog mit Niederb]att, Scheide mit Verbindungsstiiek, Haustorium, Aufl6sungssehicht und Restendosperm. Die AuflSsungsschieht wurde mit dem Skalpell yon der Innenfl~ehe des Restendosperms mSglichst vollst~ndig abgesehabt, ebenso wie die fibrigen Fraktionen grob zerkleinert und wi~hrend 10--30 min in 80%igem ~thanol gekoeht. AnsehlieBend wurde d~s Material im abgekfihlten LSsungsmittel mit einem Turmix behandelt, dureh eine G3 Glasfritte filtriert und der l~tickstand mit kaltem Athanol gleicher Konzentration gewasehen. Die mit J~ther digerierten Rfiekst~nde kamen zur Troeknung in den Vakuumexsice~tor. Die Extrakte wurden zur Trockenheit eingedunstet. Auf die erste Alkoholextraktion folgte in gewissen F~llen eine zweite mit 0,2 M Ameisensi~ure in 20%igem w~grigem A_thanol (nach BInLESKr und YounG, 1963) zur vollsti~ndigen Extraktion der Zuckerphosphate und Nueleotide aus den Filtrierriiekst~nden.

4. Analyse der Mono- und Oligosaecharide in den Extrakten Die qua]itative Priifung der Mono- und Oligosaccharide erfolgte papierchromatographisch unter Verwendung der L6sungsmittel A bis E und der Nachweisreagentien p-Anisidin-HC1 (fiir reduzierende Zucker) und alkMische Silbernitrat]Ssung (ffir reduzierende und nichtreduzierende Zucker). Die Methode yon SaEMAN et al. (1954) kam fiir die quantitative Papierchromatographie der Monosen zur Anwendung. :Die Saccharosebestimmung erfolgte nach Ro~ (1955). Zur Trennung der ~ono- und Oligosaccharide wurde der Alkoholextrakt der Aufl6sungsschicht yon 800 Keimlingen auf eine G-10 Sephadex-S~ule (~ 1 cm, HShe 100 cm) gebracht. Die Eluierung e1~olgte mit Wasser bei einer TropL geschwindigkeit yon 6 ml/Std. Die gesammelten 2 ml-Fraktionen wurden papierehromatographisch untersucht.

5. Analyse der Polysaccharide der Extraktionsri~cksti~nde Das Endosperm bzw. Restendosperm und die einzelnen Teile des Keimlings wurden nach der alkoholischen Extraktion der 15slichen Zucker mit Aceton/Ather gewaschen, g..etrocknet, hydrolysiert und papierchromatographisch untersucht. Das mit A~hanol extrahierte Material der AuflSsungsschieht wurde z.T. ebenso behandelt, z.T. nachtr~glieh noch mit 7%igem KMiumhydroxyd extrahiert zur Entfernung von ~ a n n a n A und ansehliel~end hydrolysiert und ehromatographiert. I n einem separaten Versuch wurde der unlSsliche Antei] der AuflSsungssehieht isoliert, indem die Haustorien 80 Tage nach Beginn der Keimung aus dem rest-

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lichen Endosperm herausprgpariert und fiber Nacht in Wasser yon 4 ~ gehalten wurden. Dadurch 16ste sich die den tIaustorien anhaftende Aufl6sungsschieht (vorwiegend Verflfissigungszone) in Flocken ab, wurde abfiltriert, mit Athanol gewaschen und hydrolysiert.

6. Enzymnachweise a) Der histochemische Naehweis der Phosphatase erfolgte nach der yon FREY (1954) beniitzten Methode, mit dem Unterschied, dab Glycerin-2-PhosphatDinatriumsalz als Substrat verwendet wurde. Die Inkubationszeiten variierten zwischen 15 min und 3 Std. Die Kontrollans~tze enthielten Mle Reagentien auBer dem Substrat. Die Mikrotomschnitte durch frisehes oder gefrorenes Material waren 20 oder 40 ~ dick. Vom Haustorium mugten dickere Handschnitte angefertigt werden. Dieses Organ wurde auch als Ganzes oder halbiert inkubiert und dann an Hand yon Gefrierschnitten anMysiert. Als Einbettungsmedium diente Glyceringelatine. Braunf~rbung bei den Kontrollen wurde auf die Anwesenheit yon freiem Phosphat im Gewebe zurfickgeffihrt, w~hrend die st~rkere Br~unung oder Schw~rzung der Proben dem Phosphat aus dem Substrat, also der Phosphataset~tigkeit, zugeschrieben wurde. t~fir die Bestimmung des pH~Optimums und der Aktivit~t der Phosphatase wurden ]e 20 AuflSsungsschichten und ttaustorien aus 3 Wochen gekeimten Samen bei 4 ~ in Wasser homogenisiert und durch Glasfritten filtriert. ]:)as pit-Optimum wurde in Acetat- oder Veronalpuffer nach BODANSKY (1933) und das freigese~zte anorganische Phosphat nach FISKE und S~BBA~OW (1925) bestimmt. b) Der Phosphorylasenachweis erfolgte nach der yon L~E (1966) ffir die Kartoffelphosphorylase ~ngegebenen Methode. Die AuflSsungsschieht aus 10 Samen je Ansatz wurde bei 4 ~ in 0,05 M Citratpuffer homogenisiert, dann 15 rain bei 1O000 g zentrifugiert, der ~berstand mit vierfachem Volumen ges~ttigter AmmoniumsulfatlSsung versetzt uud bei 20 000 g zentrifugiert. Der in wenig Puffer gel5ste Niederschlag wurde als Enzyml5sung verwendet. Als primer dienten Mannotetraose oder Mannan A, und als Substrat M-1-P oder G-1-P. Zur Hemmung der Phosphatase wurde einem anderen Ans~tz Ammoniummolybdat zugegeben, das die Spaltung yon G-1-P bei millimolarer Konzentration vollst~ndig verhindert ( T v ~ E ~ und T c ~ R , 1960). Das freie Phosphat wurde nach der Methode yon FIst;E und S~B~AROW (1925) bestimmt. c) Zur Prfifung auf GTP:~-D-M~nnose-l-Phosphat-Guanylyltrans[erase und auf verwandte Enzyme kam die Methode yon ZETSCm~ (1965) mit verschiedenen Anderungen zur Anwendung. In einer ersten Versuchsreihe wurden radioaktive Hexosen als Substrat benfitzt. Ein typischer Ansatz enthielt in 5 m] LSsung: 80 ~ Phosphatpuffer pit 7,6, 32 ~M radioaktive Mannose oder Glucose (je 12,5 ~c) 2 4 ~M GTP oder UTP, 80 ~M Natriumfluorid, 10 ~M Magnesiumchlorid. Als Fermentlieferanten wurden je ffinf herauspr~p~rierte intakte Haustorien aus 21 Tage alten Keimlingen oder das Filtrat yon Haustoriumhomogenisaten benfitzt. Zur Aufarbeitung der InkubationslSsungen bzw. der Haustoriumextrakte wurden die Nucleotide (und Oligosaeeh~ride) an Darco G 60 Aktivkohle adsorbiert und nachtr~glich eluiert, wie bei ZETSC~E (1965) beschrieben. Ffir die p~pierchromatogr~phische Untersuehung kamen die Laufmittel G und F zur Anwendung. Znr Anreicherung der Fermente wurden in anderen Experimenten Haustorien bei 4~ fein homogenisiert (Glas/Glas), bei 8000 g die ungel6sten Teilchen w~hrend ~)-Mannosed-C14 und D-Glucose-U-C14, bezogen yon The Radioehemical Centre, Amersham, England, wurden in 50 % igem Ath~nol gel5st, in der gewfinschten Menge abpipettiert, eingedunstet und mit der nStigen in~ktiven Zuckermenge in wgBriger LSsung kombiniert.

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L. KEUSCH:

15 min abzentrifugiert, der t3berstand mit dem vierfachen Volumen gcs~ttigter AmmoniumsulfatlSsung versetzt, wieder zentrifugiert und der Niederschlag in wenig Puffer aufgenommen. Eine weitere Versuchsrcihe enthielt in der Inkubationsl6sung 8 tzM M-I-P start )Sannose bzw. Glucose. Als FermentlSsung diente die Ammoniumsulfatf~llung aus dem Homogenisat von je 6 Haustorien oder AuflSsungssehichten. Ftir die quantitative Bestimmung der Nucleotidc und Nueleotidzucker wurden die entspreehenden Flecken aus den Chromatogrammen ausgescbnitten, mit je 3 ml 0,1 n Salzs~ure eluiert und die Maxima der mit dem UV-Spektrophotometer erhaltenen Absorptionskurven dieser L6sungen mit Standardwerten verglichen.

7. Resorptionsversuche mit radioaktiven Zuckern Ein typischer Resorptionsversuch mit radioaktiver Mannose bzw. Glucose verlief folgendermaI~en: Die Haustorien wurdcn in Verbindung mit den ganzcn 16 Tage alten Keim]ingen aus dem angegriffenen Endosperm herauspr~pariert und die unverletzten Exemp]are 90 rain nnter Rfihren in mehrmals gewechseltem destiliertem Wasser yon anhaftendem AuflSsungsmaterial befreit. Je 10 Stfiek wurden bci Zimmcrtemperatur mit der Wurzel nach oben so in ein kleines Bechcrglas gcstellt, dal~ die LSsung (5 m]) geradc a]le Haustorien bedeckte. Die Inkubationsl6sung enthielt 0,05% Mannose odor Glucose mit 5 ~c Aktivit~t. In bestimmten Zcitabst~nden wurden Proben davon cntnommen und sofort chromatographiert oder aliquotc Teile der L6sung und die entsprechendc Zahl Keimlinge zur Analyse entfernt. Die LSsungen wurden in das vierfache Volumen siedendes _~thanol gegossen, um die Fermentt~tigkeit zu unterbinden, die abgespiiltcn l)fl~nzchen vom Haustorium abgeschnitten und bcidc Teile in 80 %iges siedendes Athanol fallen gelassen. Nach 10 min wurden sie homogenisiert, filtriert und in gewohnter Weise extrahicrt. Die cingeengten Extrakte wurden papierchromatographisch getrcnnt und autoradiographisch auf Zucker, Zuckerphosphate und Nucleotide untersucht und die Rfickstgnde hydrolysiert. Fiir die Autoradiographie wurden RSntgcnfilme Kodirex E1) 5 oder l0 Tage in ciner l)resse den l)apierchromatogrammen unmittelbar aufgelegt. Die entwickelten Filme wurden mit den Chromatogrammen verglichen und die l~adioaktivit~t der einzelnen Flecken nach dcr Intcnsitat dcr Filmschw~rzung abgesch~tzt. In einigen F~llen wurden die l)apierchromatogramme zur Messung der Aktivitgt mit einem Geiger-Mfiller-Z~hler abgetastet und die Impulse pro Minute registriert.

8. Abbau yon Mannan A in vitro Zur Extraktion yon Mannan A aus der Steinnu• wurdc die braune Samenschale abgeschmirgelt, der Keimling entfernt und das Endosperm rein gemahlcn. Das Mchl wurde im Soxhlet-Apparat einigc Studen mit Aceton/~ther 1:1 entfetter. Das luftgetrocknete, weil~e l)ulver wurde 8 Std in 7%igor Kalilauge (10 ml fiir 1 g Mehl) geriihrt, dann auf einer Nutsche abfiltriert. Nach dem Ans~uern des Filtrates mit Essigs~ure auf pH 6 wurde das Mannan A mit dem vierfaehen Volumcn 96%igen _~thanols ausgef/~llt. Die ~'/s wurde im Zentrifugenglas mit Athanol und ~ther gewaschen und ansehlieBend gctroeknet. Da Mannan A in Wasser schwer 15slieh ist, wurde cs zun~chst im basischen Anteil des Puffers suspendiert. 14 m] M/15 Dinatriumhydrogenphosphat wurden mit 4 g Mannan A vcrsetzt, mit Wasser auf 300 ml verdiinnt und fiber 5Iacht bei Zimmertcmperatur gerfihrt. Die Suspension wurde anschliel~end klarzentrifugiert und mit 4/15 Kaliumdihydrogenphosphat auf pH 6,2 eingestellt, wobei eine kaum

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naerkliche Trfibung entstand. Dadurch wurde eine ca. 0,2%ige LSsung (500 ml) yon Nannan A in 0,01 M Puffer erhalten. Die Haustorien fiir die Inkubation wurden unverletzt aus dem Endosperm 3 Wochen alter Keinalinge herausprgpariert und 90 rain gewaschen. Dann wurden sie am ,,Stiel'~ (Verbindungsstiick zuna Keimling) abgeschnitten und in die Inkubationsl6sung getaucht. Ein erster Versuch sollte qualitative Hinweise fiber den Abbau yon Mannan A geben. 100 nil 0,01 ~ Phosphatpuffer (pH 6,2) enthielten 270 mg Nannan A, Ammoniummolybdat in millimolarer Konzentration zur Hemmung der Phosphatase und drei Tropfen ToluoI. Die Inkubation dauerte 15 Std unter Riihren bei 34 ~ Durch Zugabe des vierfachen Volumens 96%igen Athanols wurde die Reaktion beendet und das nicht oder unwesentlich abgebaute 1Viannan A ausgefgllt, abzentrifugiert und getrocknet (63 nag bei der Probe, 285 nag bei der Kontrolle, also quantitative F~llung). Die eingeengte Inkubationsl6sung wurde zur Trennung yon Salzen, Hexosen und Oligosacchariden durch eine G-10 Sephadex-Sgule ( ~ 1 cm, I{6he 100 cm) gesehickt. Die Trennung war bei einer Tropfgeschwindigkeit yon 6 ml/Std und Sammlung yon 2 ml-Fraktionen nicht scharf. Darum mul~te anschlieI~end noch auf Papier chromatographiert werden. Fiir die quantitative Bestimmung der Oligosaccharide wurde ein grSl~erer Ansatz gemacht, der in 400 ml 0,01 M Phosphatpuffer (pII 6,2) 0,24% Mannan A und Ammoniummolybdat in millinaolarer Konzentration enthielt. Inkubiert wurde 40 Std bei 28 ~ mit 40 Haustorien Nach der Entfernung des nicht abgebauten Mannans wurde die eingeengte gthanolische L6sung der Kohlenhydrate auf einer Kohle/Celit-S~iule fraktioniert. Eluiert wurde mit l Liter Wasser, dann mit 1,8 Liter 0 15 %igem Athanol (linearer Gradient) und schlieI~lich mit 1,5 Liter 15--30%igem _~thanol. Die Fraktionen zu 10ml wurden papierchromatographisch untersucht. Die oligosaccharidhaltigen Fraktionen wurden gesammelt, eingetrocknet und mit 50%igem Athanol (2 nal) aufgenommen, dann auf Whatman 3 MM-Papier mit dem Laufmittel C ehromatographiert. Die verschiedenen Oligosaccharide wurden mit Wasser eluiert und ihr Mengenverh~iltnis colorimetrisch bestimnat. Wie sich aus Versuehen nait Testsubstanzen (Mannose bis Mannotetraose) ergab, l~13t sich die Methode yon SAE~A.~ et al. (1954) aueh auf Mannose-Oligosaccharide anwenden.

C. Ergebnisse 1. Morphologie der Samenkeimung und der Endospermau/16sung Der r u h e n d e Same (Abb. 1 a) ist auf einer Seite tier gefurcht, auf der a n d e r n ist die L a g e des E m b r y o s d u r c h eine n a b e l a r t i g e Vertiefung in der gew61bten Fl~che a n g e d e u t e t . D e r r u n d e I)eckel der K e i m h 6 h l e b e s t e h t aus wenigen S e h i c h t e n y o n r e l a t i v k u r z e n E n d o s p e r m z e l l e n , die auf d e r Aul3enseite y o n einer dfinnen S a m e n s c h a l e t i b e r d e c k t sind. D e r r u h e n d e E m b r y o wiegt weniger als 1 rag, h a t beilf6rmige G e s t a l t u n d ist m~t d e m u m g e b e n d e n E n d o s p e r m n i e h t verwachsen, k l e b t a b e t oft d a r a n a m G r u n d e der z y l i n d r i s c h e n tt6hle. A n seinem d i s t a l e n E n d e ist eine E i n s t t i l p u n g (die sp/~tere Scheiden6ffnung) zu erkennen, auf deren G r u n d sich der S p r o B v e g e t a t i o n s p u n k t befindet. U n t e r den im m e t h o d i s c h e n Tell beschriebenen K e i m u n g s b e d i n g u n g e n e n t w i c k e l t e n sich fiber 90 % d e r S a m e n ziemlich gleichzeitig. E i n kleiner

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L. KEUSCH:

Prozentsatz keimte erst spgter, und bei ca. 1% konnte ira sonst normalen Endosperm kein E m b r y o gefunden werden. Bei der Quellung rundet der E m b r y o seine Gestalt ab a n d fiillt den ganzen Hohlraum im Endosperm aus, das sieh infolge der Wasseraufnahme k a u m merklieh ausdehnt. Am 5. Tag wird der Deekel abgesprengt, der Keimling wgehst hinaus (Abb. 1 b) und biegt sich senkrecht in den Boden. Starkes Streckungs-

Abb. 1. Entwicklung des Dattelkeimlings in den ersten 3 Wochen: a Trockener Same; ruhender Embryo (~-) herausprgpariert, b 7 Tage alter Keimling; Lgngsund Querschnitt durch Samen; Embryo mit Haustorium herausprgpariert. c 21 Tage alter Keimling; Lgngs- und Querschnitt durch Samen; I-Iaustorium mit Verbindungsstfick herausprgpariert. 1/2 nat. Gr6~e

wachstum des Mittelstiickes fithrt zur Bildung der r6hrenfSrmigen Kotyledonar-Scheide, wghrend sich am distalen Ende die Hauptwurzel ausbildet. Unterdessen n i m m t das proximale Ende (das Haustorium) im Endosperm kugelige Form an und beginnt das umgebende Nghrgewebe aufzul6sen. I m Verlauf der 2. Woche durchstSftt ein chlorophyllarmes Niederblatt den Seheidenspalt. Aus diesem Blatt, das selber seheidenfSrmig ist, schlfipft bald das erste Laubblatt mit einer harten Spitze. I m Alter yon 3 Woehen (Abb. l e) besteht der ungefghr 5 cm lange Sproft ans der kurzen Laubblattspitze und dem bleichen Niederblatt, das in der unteren Hglfte yon der Scheide umfa~t wird. Diese steht auf der apikalen Seite durch ein kurzes Zwischenstfiek mit dem Haustorium in

Die Mobilisierung des Reservemannans im keimenden Dattelsamen

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Verbindung. Das andere Ende der Scheide wird vom KotyledonarKnoten gebildet, aus dem nach oben der SproB und nach unten die Hauptwurzel abzweigen. Das anfangs kugelige Haustorium streckt sich vor ahem in der L~ngsachse des Samens und nimmt schlieBlieh ganz die Gestalt des Endosperms an, das es aufgel6st und resorbiert hat (Abb. 1 c). Wie die VergrSBerung des Haustoriums im Laufe der Keimung vertauten laBt, wird die Zersetzung des Endosperms yon diesem Organ des Keimlings gesteuert und vo]lzogen. Das embryonale Gewebe besteht zur Zeit der Qnellung auf der dem Endosperm zugekehrten Seite aus kleinen, diinnwandigen, isodiametrisehen Zellen. Die Epidermis hat das Aussehen eines Zy]inderepithels. In der Randzone des ttanstoriums sind Bfindel feiner, langgestreekter Zellen siehtbar, die sich sps zu Gef~Ben differenzieren. Zur Volnmenvermehrung teilen sich nut die Zellen der Epidermis und der darunter liegenden zwei oder drei Schiehten. Daraus resu]tiert ein Fl~chenwaehstum, dem sieh die tiefer gelegenen Zellen anpassen durch teilnngsfreie Ansdehnung und mg.ehtige Erweiterung der Intercellularrgume, wodureh das ganze Gewebe zu einem Schwammparenchym wird. Das Endosperm besteht aus groBen, lgngliehen Zellen mit auff/~llig verdiekten Sekund/~rws (Mannanreserve) und sehr breiten Tfipfeln (vgl. Abb. 3 a). Bei der Quellung ist keine Anderung festzustellen, auBer, dab das Gewebe info]ge der Wasseraufnahme weicher wird. Die Anordnung der Zellen ist radial, so dab die meisten ihre Schma]seite dem Embryo zuwenden. Das sieh ausdehnende Haustorium steht mR seiner ganzen Oberfl~ehe in Beriihrung mit dem Endosperm. Bei der Abbauzone lassen sieh zwei Sehiehten unterscheiden, deren Grenze allerdings nicht seharf gezogen werden kann. Eine dfinne Sehieht unmittelbar in Hanstoriumn~he ist yon gelatin6ser Beschaffenheit nnd reieh]ich mit faserigen Elementen durchwirkt. Sie soll als ,,Verfliissigungszone" bezeichnet werden. Diese wird distal yon der ,,Erweiehungszone" abgelSst, in der die Umrisse der hyalin erseheinenden Einzelzellen und ihre Lumina noch erhalten, aber leicht deformierbar sind. Die ,,Verfliissignng" der Sekund~rwand geht ohne Riieksieht auf die Zellgrenzen vor sieh. Abb. 2 zeigt die Verf]/issigungszone in Aufsicht yon der Haustoriumseite her. Aus Beobachtungen der gleiehen Sehieht im polarisierten Licht geht hervor , dab die faserigen Elemente der Verfl/issigungszone senkrecht zu den L/~ngsw/~nden der intakten Endospermzellen, d.h. tangential zum Haustorium verlaufen. Um die Erweiehungszone genauer zu untersuehen, wurden yon 2 Woehen gekeimten Samen tangential zum ttaustorium Querschnitte angefertigt. Abb. 3 a zeigt eine intakte, Abb. 3 b eine partiell abgebaute Stelle sus der Erweichungszone des gleichen Sehnittes nahe beim

330

L. KEvscK:

ttaustorium, beide im polarisierten Licht. Die Doppelbreehung der sekundgren Wandverdickung verschwindet allm~thlich mit fortsehreitender Aufl6sung, bleibt aber bei der Mittellamelle und Prims erhalten. Diese ungel6sten Teile der Wand werden in Form faseriger Elemente hi der Verflfissigungszone yore vorrfiekenden Haustorium quergedrfiekt und angesammelt.

Abb. 2. Verfli~ssigungszone mit F~serelementen in Aufsicht. • 400 Diese Abbauweise k o m m t erst bei der Ersch6pfung des Endosperms zum Stillstand. Zuerst erreieht das Haustorium den Endospermrand in der Samenmitte, w/~hrend es in Riehtung auf die Spitzen noch weiterwaehsen kann. Die ~uGerste Schicht der geservezellen unmittelbar unter der Sumensehule wird nie ~ngegriffen, und die zwei darunter liegenden Zellreihen k6nnen dem Abbau aueh widerstehen. Das genfigt, um dem ausgehShlten Samen trotz der sehwaehen Schale die ursprfingliche Gestalt zu erhalten und ihn vor mikrobieller Infektion zu sehiitzen. Von der Auf]Ssungsschieht ist im ersehSpften Endosperm naeh Entfernung des H~ustoriums niehts mehr festzuste]len. Of~enbar werden die faserigen Elemente, d.h. vermutlich die cellulosisehen Prim~rw~nde der Endospermzellen allm~hlich aueh einem Abbau unterworfen.

Die Mobilisierung des Reservemann~ns im keimenden Dattelsamen

j ~

331

c~

.2 X

"~ 4z

go ~9

.~r~ r

r

.d

2. Die Mono- und Oligosaccharide im Samen und wachsenden Keimling Wie im methodischen Absehnitt dieser Arbeit dargelegt, warden die verschiedenen Teile des Samens und des jungen Keimlings sep~rat extrahiert und zungchst qualitativ ~uf Mono- und Disaccharide untersucht. Darauf folgten quantitative Bestimmungen, deren Resultate (Durchsehnittswerte yon zwei Versuchsreihen) in Tabelle 1 dargestellt sind.

332

L. K~trseg: Tabelle 1

Hexosen und Saccharose in verschiedenen Samen- bzw. Keimlingspartien in %

a) b) c) d) e) f) g) h) i)

Embryo troeken Endosperm ungekeimter Samen Endosperm gequollener Samen Endosperm angekeimter Samen Aufl6sungsschieht a Haustorium Seheide Wurzel SproB

Man

Fru

Glu

GM

Sa

1 q-~ 1 38 -----

1 1 1 2 -k 12 3 19 15

5 1 1 2 10 13 64 38 37

-qq-[2 -1 ---

93 98 98 95 50 75 32 43 48

- = ehromatographiseh nieht n~ehweisbar; q- = weniger als 1%, aber ehromatographiseh nachweisb~r. a Enthielt aueh Mannobiose und h6here Oligosaceharide.

Bei a u n d b h a n d e l t es sich u m den E m b r y o bzw. das E n d o s p e r m des t r o c k e n e n Samens, bei c u m das in f e u c h t e m S a n d n a c h E n t f e r n u n g des E m b r y o s 5 T a g e gequollene E n d o s p e r m u n d bei d u m das E n d o s p e r m eines kurz v o r d e m A u s t r e i b e n des K e i m l i n g s s t e h e n d e n Samens. Die A n a l y s e n e bis i sind an ca. 3 W o c h e n g e k e i m t e m M a t e r i a l durchgeffihrt worden, e ist das A u f l 6 s u n g s m a t e r i a l , soweit es sich y o n d e r I n n e n s e i t e des E n d o s p e r m s a b s e h a b e n lieB. A m ergiebigsten w a r es a n den b e i d e n S p i t z e n der Samen, we nach dreiw6chiger K e i m u n g s z e i t noch eine r e l a t i v dicke E n d o s p e r m s c h i c h t a b b a u f g h i g ist. D a a n den H a u s t o r i e n (f) noch A n f l 6 s u n g s m a t e r i a l klebte, w u r d e n sic zur R e i n i g u n g m i t d e s t i l l i e r t e m W a s s e r abgespfilt. Als Scheide (g) wird das ganze Verbindungsstfick zwischen H a u s t o r i u m u n d K o t y l e d o n a r - K n o t e n (inklusiv) bezeichnet, fiber d e m d e r SproB (i) a u s g e k n i c k t u n d u n t e r d e m die W u r z e l (h) a b g e s c h n i t t e n wurde. I n Tabelle 2 sind die Z u c k e r g e h a l t e der in Tabelle 1 angeffihrten Pflanzenteile in Beziehung gesetzt w o r d e n zu deren W a s s e r g e h a l t bzw. Trockengewicht. Die a b s o l u t e n Z u c k e r m e n g e n bezogen auf den W a s s e r g e h a l t v e r m i t t e l n ein B i l d der Zuekerkonzentrationsgef/ille y o n einem Organ z u m a n d e r n ( W A ~ s ~ g , 1952). Die b e i d e n T a b e l l e n zeigen, d a b Saccharose in allen Samen- u n d K e i m l i n g s p a r t i e n , a u s g e n o m m e n in der Scheide (g), v o r h e r r s e h t , obwoh] die Mannose aus d e m E n d o s p e r m des Samens kein d i r e k t e r Vorl~ufer ffir die l ~ o h r z u c k e r s y n t h e s e ist wie die Glucose aus den S t g r k e e n d o s p e r m e n a n d e r e r Samen. Die A h n l i c h k e i t d e r A n a l y s e n r e s u l t a t e des t r o c k e n e n u n d gequollenen E n d o s p e r m s (b u n d c) m a c h t deutlich, d a b die bloBe W a s s e r a u f n a h m e noch keinen A b b a u nach sich zieht, wenn kein E m b r y o v o r h a n d e n ist. Die p r o z e n t u a l e Z u n a h m e y o n F r u c t o s e u n d Glucose im

Die Mobilisierung des Reservemannans im keimenden Dattelsamen

333

Tabelle 2. Hexosen und Sac&arose in verschiedenen Samen- bzw. Keimlingspartien in Beziehung zum Wassergehalt und Troc~engewicht

a) b) c) d) e) I) g) h) i)

Embryo trocken Endosperm ungekeimter Samen Endosperm gequollener Samen Endosperm angekeimter Samen Aufl6sungsschicht Haustorium Seheide Wurzel Sprol~

Man-

Fruc-

nose

rose

Glucose

Gesamtzuckergehalt

Saccharose

7 10 15

2

7 10

2

1

15 1

1 2

11 7 66 65

6

12 145 133 161

7 8 4 7

6 2 2

4 728 958 733 6 713 73 151 209

c~ absoluter Gehalt in mg bei 100 Samen bzw. Keimlingen; fl g Wassergehalt; y = mg Zueker/g Troekengewieht.

900 188 35 28 8 38 4 4 9

4 970 47 742 192 1~ 978 35 21 771 30 18 12 16 2~ 736 51 21~ 225 12 84 350 10 6C 435 18 7~

mg Zueker je

E n d o s p e r m gekeimter 8amen (d) gegentiber jenem ungekeimter (c) d/irfte dutch cine Invertasewirkung zustande kommen. Die Aufl6sungsschicht (e) ist der einzige Oft mit ciner nennenswerten Mannosekonzentration. Diese Hexose ist also das E n d p r o d u k t des Abbaus u n d der Ausgangsstoff ftir weitere Synthesen. I m H a u s t o r i u m (f) linden sich neben viel Rohrzueker nur seine bciden Bausteine Glucose und Fructose in fast gleicher Menge, was wohl mit einem Invertaseglcichgewieht zu erklgren ist. N a c h K~IED~MA~S und B]~EVERS (1967b) enthglt auch der ]~ieinus-Kotyledo, vor allem in den Intercellularriiumen, neben der grogen Menge Saccharose ihrc beidcn H y d r o l y s e n p r o d u k t e . Auffgllig ist die hohe Gesamtznckerkonzentration im Haustorinm, die jene in der Aufl6sungsschicht etwa u m das Dreifache /ibcrtrifft. Die Zucker (Mannose u n d eventuell Saccharose) m/issen demnach durch aktive Resorption ins H a u s t o r i n m gelangen. Der betrgchtliche Glueosegehalt der Scheide (g) verglichen mit der relativ geringcn R o h r z u e k e r m c n g e hgngt wohl mit der T r a n s p o r t f u n k t i o n dieses ,,Bindegliedes" z u s a m m e n : Saccharose wird nicht angehguft, sondern bef6rdert, u n d die Glucose k a n n aus den Stgrkek6rnern stammen, die in Gefgl~nghe besonders hgufig beobaehtet wurdcn. I n der Aufl6sungssehieh~ wurden nach Fraktionierung auf einer Sephadex-Sgule mit I-Iilfe yon Testsubstanzen papierchromatographiseh Mannobiose, Mannotriose und Mannotetraose im ungefghren Mengenverhgltnis 1 0 : 2 : 1 naehgewiesen. A u g e r d e m fanden sieh noeh Spuren yon Oligosaechariden, die neben Mannose aueh Glucose enthielten. Vermutlich handelt es sieh dabei u m die y o n ASPIC~ALL st al. (1958)

334

L. KEvso~:

untersuchten Di- und Trisaecharide mit je einem Glueoserest. Ihre Rf-Werte im Laufmittel C stimmten mit den Angaben yon ASPI~ALL et al. (1. e.) iiberein. 3. Polysaccharide der Extraktionsri~ckst~inde

Die Ergebnisse der halbquantitativen Bestimmung der tIydrolysenprodukte der in 80 %igem J~thanol unl6slichen Oligo- und Polysaccharide der einzelnen Organe des keimenden Samens sind in Tabelle 3 dargestellt. Die Ergebnisse in Tabelle 3 deuten darauf bin, dag nur im Endosperm Mannane in gr6Beren Mengen vorkommen, w/~hrend die Zellw/inde der Tabelle 3. Die Zuckerbausteine der Polysaccharide des Endosperms und der verschiedenen Teile des Keimlings

Man

Glu

Gal

Arab

Xyl

Rha

@

+

Sp

Sp

--

Haustorium

~- + -~ + ++++ Sp

~- +

--

-~ @

Sp

Seheide

Sp

+

+

+ -c

Sp

Wurzel

81o.

~-

~-

~- -~

Sp

SproB

Sp

+++§ § @ + + ~++ 4- ~- @ @ ++ -~ @ ~- + +++

~-

+

~-

Sp

Endosperm

q- = ca. 10 % ; Sp = Spur. versehiedenen Organe des Keimlings vorwiegend aus Cellulose und daneben aus kleinen Quantitgten Xylanen, Galaktanen, Arabinanen oder Arabinogalaktanen aufgebaut sind. Der in Alkohol unlSsliehe l~fiekstand der Aufl6sungssehieht wurde z.T. direkt hydrolysiert und analysiert (Tabelle 4, a), z.T. wurde er mit 7%igem Kaliumhydroxyd extrahiert, worauf die Zueker der alkalil6sliehen (Tabelle 4, b) wie der alkaliunl6sliehen Polysaeeharide (Tabelle 4, e) naeh der Hydrolyse bestimmt wurden. Aus Tabelle 4 geht hervor, dag der Mannangehalt der ganzen Auf16sungssehieht zwar noeh sehr hoeh, aber im Vergleieh zu jenem im Endosperm (89% ?r im Hydrolysat) doch merklieh vermindert ist. Der auffallend hohe Gehalt an Galaktoseresten im Kaliumhydroxydextrakt kann so gedeutet werden, dab die galaktosehaltigen Kettenenden yon Mannan A und B nieht oder doch langsamer abgebaut werden, und dab sie sieh im Laufe der Mannanmobilisierung anreiehern. Da sieh

Die Mobilisierung des Reservemannans im keimenden Dattelsamen

335

diese Bruehsttieke gut mit 7%igem Kaliumhydroxyd 16sen lassen (vgl. Tabelle 4, b und e), mfissen sie ziemlieh niederpolymer sein. Der prozentuelle Gehalt an Glueoseresten in der alkaliunl6sliehen Fraktion (Tabelle 4, e) der Aufl6sungssehieht ist h6her Ms jener des intakten Endosperms, was auf eine Anreieherung der Cellulose im Verlaufe des Tabelle 4. Die Zuc]cerbausteine der Polysaccharide der Au/16sungsschicht in %

a) In 80 %igem Athanol Unl6sliches b) 7% KOH-Extrakt e) In 7 % KOH UnlSsliehes

Man

Glu

Gal

Arab

Xyl

74 68 81

8 2 13

12 20 5

6 10 1

Sp Sp --

Zellwandabbaus sehlief3en l&13t. Eine noeh st&rkere Celluloseanreieherung zeigte sieh in einem Prgparat, das vorwiegend aus der Verfltissigungszone der AuflSsungssehieht bestand, nnd das yon der Aul3enseite yon etwa erbsengrogen Itaustorien gewonnen worden war. Dieses Material war gleich behandelt worden wie die Fraktion e in Tabelle 4, und die Itydrolyse ergab Mannose and Glucose im Verhi~ltnis 52:48. 4. Enzymnachweis

a) Beim histochemischen Naehweis der Phosphatase stimmten die Befunde am IIaustorium mit den Resultaten yon FnEY (1954) iiberein. Fast in allen Zellen konnten sowohl geringe Mengen anorganisches Phosp h a t als auch starke Phosphataseaktivit/it nachgewiesen werden. Die grSBte Phosphataseaktivit~tt war in der Epidermis und den anschlieBenden Zellschichten festzustellen. Besonders stark reagierten die Zellen in GefgBnghe und auf der Verbindungslinie von den Gefggen zur Epidermis. Der Zellinhalt der Epidermis zeigte eine sehwache schwarze K6rnung, w~thrend die Radial- und AuBenwi~nde sehr dunkel erschienen. Bei der Kontrolle (Priifung auI anorganisches Phosphat) hingegen waren die dunkelsten Wandstellen jene zur Subepidermis bin. I m unangegriffenen Tell des Endosperms konnte im Gegensatz zu den Ergebnissen yon Fn]~Y (1. c.) bei 3stfindiger Inkubation mit Substrat nur sehr geringe Phosphataseaktivitg~ festgestellt werden. Einzig die Endospermschicht unmittelbar unter der Samenschale wies Zellen mit Phosphatasewirkung auf (Abb. 4). Die zu Beginn der Keimung wenige Zellen umfassende Aufl6sungssehieht zeigte wenig anorganisches Phosphat an und keine Phosphatase. Auch in den sp/~teren Entwieklungsstadien blieb die Phosphatasereaktion sehr schwach. Dieser negative Befund kSnnte unter Umst/inden dadurch erkl/~rt werden, dab das Substrat sehr langsam in die intakten Endospermzellen eindringt. D a r u m wurden frische Mikrotomschnitte 20 Std start nut 3 Std inkubiert.

336

L. KEUSCH:

Abb. 4. Querschnitt durch die guBere Partie des Endosperms mit 8amenschale. P h o s p h a t a s e a k t i v i t g t in einigen wenigen Endospermzellen unterhalb der Samenschale (--~). Inkubationszeit 3 Std. Schnittdicke 20 i• Vergr. 60 •

Abb. 5 a - - d . Querschnitte durch Endosperm. a u n d b auBerhalb, c u n d d in der Abbauzone. a u n d e Kontrollen (ohne Substrat) zum Nachweis yon anorg~nischem Phosphat. b u n d d Proben auf Phosphatase. Inkubationszeit 20 Std. Schnittdicke 20 ~. 3 • nat. GrSBe

Die Mobilisierung des Reservemannans im keimenden Dattelsamen

337

Abb. 5 bestiitigt jedoch die Ergebnisse der k/irzeren Inkubationszeiten. Die zwei Endospermsehnitte a und b der Abb. 5 berfihren das Haustorium noeh nieht. Sie enthalten kein anorganisehes Phosphat (a) and nur in der/~ugersten Endospermsehieht Phosphatase (b). Die beiden Sehnitte e und d ffihren dureh das Endosperm und das (herausgefallene) Haustorium. Hier ist die Reaktion auf anorganisehes Phosphat (e) sehr sehwaeh, die Phosphataseaktivit~t in der Umgebung des Haustoriums, d.h. in der Aufl6sungszone, und aueh in der Sehieht unter der Samensehale kr/~ftig (d). Fiir die Phosphatase im I-Iaustorium- bzw. Aufl6sungssehieht-Homogenisat wurde ein pH-Optimum yon 6,4 festgestellt. Die Aktivit/it belief sieh auf 0,3 Roehe-Einheiten (y anorganisehes Phosphat pro Minute bei 38 ~ j e ttaustorium. In der AuflSsungssehieht war sie bedeutend niedriger. Das Enzym wird gehemmt dureh Tartrat, noeh mehr dureh Fluorid und vollst~ndig dureh Ammoniummolybdat (vgl. Tv~TER und T v ~ n , 1960), alle in 0,05 M Konzentration. Damit wird besti~tigt, was der histoehemisehe Naehweis vermuten lieB : Die gr6gte Aktivitgt der sauren Phosphatase findet sieh im Haustorium. Die Aufl6sungssehieht seheint nut geringe Mengen des Enzyms zu enthalten, die vermutlieh aus dem Haustorinm herausdiffundiert sind, haben doch aueh CHANG und BA~DUnSKI (1964) bei der Maiswurzel extraeellul/ire Phosphatase naehgewiesen. b) Bei der Pr/ifung auf die Anwesenheit yon Phosphorylase in der AuflSsungssehieht betrug die Menge des aus M-1-P bzw. G-1-P freigesetzten anorganisehen Phosphates bei den Ans/ttzen ohne Ammoniummolybdat abet mit primer-Substanzen (Mannotetraose oder Mannan A} naeh 1 Std Inkubation 5,3 bzw. 7,1%. Die Kontrollans/itze ohne primerSubstanzen ergaben gleieh hohe Werte. Die Menge freier Mannose oder Glucose entspraeh dem anorganisehen Phosphat. Das liel~ vermuten, dal~ eine reine Phosphatasewirkung vorlag. Durum wurde in einer weiteren Versuehsreihe unter sonst gleiehen Bedingungen Ammoniummolybdat in millimolarer Konzentration dem i~eaktionsgemiseh zugeffigt. Tatsiiehlieh fund nun keine Spaltung der Hexosephosphate mehr statt. Demnaeh war nieht eine Phosphorylase, sondern eine Phosphatase verantwortlieh ffir die Spaltung von M-1-P and G-1-P. Das erkl/~rt aueh, warum die erwghnten primer-Substanzen keinen aktivierenden EinfluB auf das Enzym ausiibten. Phosphorylase fehlt also in der Aufl6sungssehieht oder hag nur eine /~ugerst sehwaehe Aktivitgt. e) Da es trotz mehrfaeher Versuehe nieht gelungen war, Nueleotide oder Zuekernueleotide aus der Aufl6sungssehieht zu isolieren, wurde der Nachweis yon Nucleotidyltrans/erasen versueht. Dazu wurden L6sungen, die neben U T P oder GTP Mannose-C 14 bzw. Mannose-l-Phosphat enthielten, mit homogenisiertem AuflSsungssehiehtmaterial oder mit ganzen 23a

P l a n t a (Berl.), Bd. 78

338

L. KEuseH:

tIaustorien inkubiert. In keinem dieser F/~lle konnte aber die Bildung yon Zuckernucleotiden in der InkubationslSsung festgestellt werden. Es kann daher auf die Abwesenheit der entspreehenden Nueleotidyltransferasen in der Aufl6sungssehicht gesehlossen werden. SchlieBlieh wurde noeh versucht, Nucleotidyltransferasen im Haustoriuminnern naehzuweisen. Zu diesem Zwecke wurden dieselben Substrate wie oben mit tIaustoriumhomogenisat oder mit den Ammoniumsulfatf/~llungen yon homogenisierten Itaustorien inkubiert. Im Gegensatz zu GTP wurde bei dem U T P und Mannose-C 14 enthaltenden Substrat ein radioaktives Zuekernucleotid gebildet, das sich im L6sungsmittel G chromatographiseh wie UDP-M oder UDP-G verhielt und auf dem Autoradiogramm eine deutliehe Sehw~rzung hervorrief. Wurde bei gleichen Versuehsbedingungen Mannose-C i4 dureh nieht radioaktives Mannose-1Phosphat ersetzt, so war die Bildung des Nucleotiddiphosphatzuekers (gemessen an der Absorption der eluierten Chromatogrammflecken) stgrker mit U T P denn mit GTP als Substrat. Es kann somit im Haustorium die Anwesenheit yon ATP:D-Mannose-l-Phosphotransferase und yon U T P :~-D-Mannose-l-Phosphat Uridyltransferase vermutet werden. 5. Resorptionsversuche mit radioaktiven Zuckern Die Erni~hrung des Keimlings mit radioaktiven Hexosen sollte AuL schlfisse geben fiber die Resorption der Zucker durch das Haustorium und ihr weiteres Sehicksal ira Stoffwechselgeschehen. Drei Wochen alte Keimpflanzen wurden saint den Haustorien aus dem Samen herauspr/~pariert und unter identischen Bedingungen mit Mannose-C14 oder Glucose-C 14 ern/~hrt, um m6gliche Unterschiede in der Aufnahme und Verwertung der zwei Zucker aufzuzeigen. Die N~hrl6sungen wurden in ffinf Intervallen w/~hrend der 4stfindigen Inkubation chromatographiert. In beiden F~tllen zeigten sich erstmals nach 15 rain schwache Flecken yon radioaktivem Rohrzucker, die sich nach 35, 75 und 240 rain leicht verst~rkten (Abb. 6a und b). Kleine Mengen radioaktiver Fructose traten schon nach 5minutiger Inkubation auf (Abb. 6 b). Die zwei ~thanolextr~kte-der Haustorien nach 4stiindiger Inkubation waren nicht zu unterscheiden: Saecharose war in beiden Versuchen praktisch der einzige radioaktive Zucker und u n g e ~ h r in gleichen ~[engen vorhanden (Abb. 6c). Um die in den Haustorien abgelagerte St~rke auf Radioaktivit~t zu prfifen, wurden die Rficksti~nde der ~thanolextraktion der Haustorien 15 Std bei 37 ~ mit Pankreas-Amylase (ca. 10000 Wohlgemut-Einheiten) inkubiert und abzentrifugiert. Die fiberstehenden L6sungen enthielten radioaktive Oligosaccharide mit sehr kleinen l%f-Werten (Laufmittel D). Diese wurden hydrolysiert und das I-Iydrolysat chromatographiert (Laufmittel C und D), wobei der Hauptfleck sich als radioaktive Glucose

Die 1VIobilisierungdes Reservemannans im keimenden Dattelsamen

339

Abb. 6a--c. Autoradiogramme zu den Resorptionsversuehen. a N[annose-InkubationslSsung 0, 5, 15, 35, 75 und 240 rain naeh Versuehsbeginn ehromatographiert (Laufmittel D). Exponierungszeit 5 Tage. b Glucose-InkubationslSsung. Versuchsanordnung wie a. c Athanolextrakt der Haustorien nach 4 Std Inkubation chromatographiert (Laufmittel D). GA Ghcose-Ansatz; MA Mannose-Ansatz. Exponieruugszeit 10 Tage. S Saeeharose, G Glucose, M Mannose, E Fructose

erwies. Also darf angenommen werden, dab im Haustorium schon nach 4stiindiger Inkubgtion mit Mannose-C14 oder Glueose-Cl4 radioaktive transi~orische St/hoke gebildet worden war. Diese Resultate beweisen, dab das lebende Iiaustorium in vitro auch Glucose resorbieren kann, und dab es aus Glucose wie aus Mannose sehr rasch Saceharose hersteii~, die es z.T. an den Keimling weiterleitet. 6. Abbau yon M a n n a n A dutch das Hctustorium in vitro

Zur Untersuehung des Abbaus yon Mannan A in vitro wurde dasselbe in Phosphatpuffer gel6st u n d mit Haustorien yon 3 Wochen M~en Keimlingen inkubiert. N a c h einer Inkuba~ionszei~ y o n 15 Std wurde das noch hochpolymere, nur wenig abgebaute Polysaccharidma~erial mit Athanol 23*

340

L. KEUSe~:

ausgef/illt und die Mono- und Oligosaccharide auf Sephadex G-10 getrennt und laapierchromatographiseh charakterisiert. Neben grogen Mengen Mannose lieBen sieh wenig Glucose, Galaktose, Saecharosc und Myoinosit nachweisen, ferner Mannobiose, -triose, -tetraose und -pentaose. Aueh ein Disaccharid (M23) und ein Trisaccharid (M34), die neben Mannose- noch Glucosereste enthielten, traten auf. Das Myoinosit zeigte in mehreren L6sungsmitteln denselben t~f-Wert wie die authentische Substanz, war nicht hydrolysierbar und nicht reduzierend. Der Vergleieh der t{f-Werte der Mannose-Oligosaeeharide mit authentischen t~eferenzsubstanzen und die Beziehung des gl~-Wertes [RM= l o g ( 1 -

1)1 zum

Polymerisationsgrad (FaE~cI~ und WILD, 1953) zeigte, dab es sich bei ihnen um eine homologe Reihe handelt, deren niederstes Glied die fl-l,4-D-Mannopyranosyl-D-Mannose ist. Das Disaecharid M23 (l~f in A zwisehen M2 und N3) lieferte bei der Hydrolyse gquimolare Mengen yon Mannose und Glucose und stimmte in seinem t~f-Wert (in A und D) mit authentischer fl-l,4-D-Mannopyranosyl-D-Glucose, aber nieht mit fi-l,4-D-Glueopyranosyl-D-Mannose iiberein. M34 (Rf in A zwischen M3 und M4) ergab bei der Hydrolyse ebenfalls Glucose neben Mannose. Offenbar handelt es sich bei diesen beiden Substanzen um das glucosehaltige Di- bzw. Trisaceharid, die AS~'mALL et al. (1958) bei der Partialhydrolyse yon Mannan A mit Schwefelsgure erhalten haben. Eine Probe des dureh Haustorien partiell abgebauten Mannans A wurde zur Bestimmung der relativen Anteile der Tabelle 5. Relative Anteile der .Mono- einzelnen Mono- und Oligosaecharide auf einer Kohle/Celit-Ss adsorund wichtigsten Oligosaceharide in der LSsung des teilweise abgebauten biert und dann mit Wasser und Mannans A in % steigenden J, thanolkonzentrationen Glu GM Sa Nan M2 M3 fraktioniert eluiert. Die nieht einheitliehen Fraktionen wurden papier6 3 35 43 11 2 chromatographiseh weiter aufge9 4 -67 17 3 trennt. Die Resultate sind in Tabelle 5 dargestellt. Da die Saccharose kein Abbauprodukt des Mannans ist, sondern Bus den Haustorien hinausdiffundicrt sein dfirfte, wie vermutlich such das in kleinen Mengen vorliegende Myoinosit, wurden in Tabelle 5 die Relativprozente auch unter AusschluB dieses Zuckers angeftihrt. Um die Herkunft des Rohrzuekers aus den Haustorien sieherzustellen, wurden solehe 90 min in destilliertem Wasser vorgewasehen und dann einige Stunden in erneuertes Spiilwasser gelegt. Die Zuekeranalyse des Spfilwassers und der Vergleich mit jener der Aufl6sungsschicht und des tIaustoriums sprechen fiir den Austritt yon Saccharose sowie Fructose und Glucose Bus letzterem (Tabelle 6).

Die Mobilisierung des Reservemannans im keimenden Dattelsamen

341

Tabelle 6. Vergleich der Zuclcergemische in AuflSsungsschicht, Haustorien und Haustorienspi~twasser yon 100 Samen in %

Aufl6sungsschicht Spfilwasser Haustorien

Man Fru

Glu

S~

Total

38 Sp --

10 6 13

50 87 75

26 mg 96 mg 218 mg

+ 7 12

Mit einem wei~eren Versuch wurde das Mengenverh~ltnis der beim Abbau entstandenen reinen Mannose-Oligosaccharide untereinander bestimmt, u m AufsehluB fiber die Abbauweise zu bekommen. Dazu wurde die Oligosaeeharidfr~k~ion aus tier Kohle/Celit-Ss papierchromatoTabelle 7. Mengenverhgltnis der reinen graphisch aufgetrennt. Die Resultate Mannose-Oligosaccharide der Tabelle 7 weichen etwas yon M2 M3 M4 denen der Tabelle 5 ab, weil die Versuehsbedingungen nieht identiseh Gew.-% 58 18 24 waren. Mol.- % 70 15 15

D. Diskussion 1. Mannanabbau

Schon das morphologische Bfld des Keimungsverlaufes 1/~Bt vermuten, dab das tIaustorium den Abbau des Endosperm-1%eservematerials veranlaBt. Die AuflSsungsschicht grenzt stets an das Haustorinm, auch wenn dieses yon seiner normMen Gestalt abweicht. Die Enzyme fiir diese AuflSsung werden demnaeh offensichtlich yore Keimling abgegeben, sind also Exoenzyme wie die g-Amylase, die bei der Mobilisierung der St~rke in den Gramineensamen v o m Scutellum sezerniert wird (DuR~, 1960). DaB das Haustorium ~ats/~chhch diese Enzyme abseheidet, wird dadurch besb~tigt, dab die bloBe Quellung des Samens nach Entfernung des E m b r y o s zu keiner Bfldung yon freier Mannose im Endosperm ffihr~ (Tabelle 1, c). Die direkt an alas Haustorium grenzende Zone der AufI6sungssehieht (Verflfissigungszone) ist mit feinen faserigen Elementen durehsetzt (Abb. 2), die im polarisierten Licht sehr deutlieh hervortreten. Hier wird der Abbau der Mannane so weir fortgesetzt, dab die gebilde~en Kohlenhydrate v o m tIaustoriumepithel resorbiert werden kSnnen. Die Anreieherung der faserigen Elemente in Haustoriumn/~he geht mit einer Glueosezunahme im I t y d r o l y s a t der Restpolysaeeharide der Verflfissigungszone parallel (Mannose : Glucose 52:48), was auf eine groBe l%esistenz der cellulosisehen Prims der Endospermzellen schlieBen 1/~Bt. 23b

Planta (Berl.), Bd. 78

342

L. KEUSCH:

Die Experimente yon PuRI]~WITSCI< (1898) zum Beweis des Endospermabbaus unabhangig yore Keimling scheinen nicht schlfissig. Er ersetzte das Haustorinm yon angekeimten Samen durch ein Gipssaulchen, das die Verbindung zwischen Endosperm und Kulturfliissigkeit herstellte. Die Mannose, die er in der LSsung nach 2 - - 4 Wochen fand, stamm~e zwar aus der AuflSsungsschicht, aber damit ist die yore Keimling unabhangige ,,Entleerung des Reservestoffbehalters" noch nicht bewiesen, denn die Enzyme, die das Haus~orium vorher an die Auf15sungsschicht abgegeben hatte, konnten im •erlauf der Versuehe noch weiterwJrken und Mannose produzieren. Den beiden Mannantypen A a n d B kommen wohl nur beim Anfbau der Endospermze]lwande verschiedene Funktionen zu. Mannan B fibernimmt die Aufgabe des Cellu]osegerfistes der meisten anderen Pflanzenzellen, wird abet doch zusammen mit dem darin inkrustierten Mannan A mobilisiert. Beim Abbau konnte kein sicherer Hinweis auf die leichtere oder schwerere MobJJisierung eines der beiden Mannantypen gefunden werden. Da die Zellen in der Erweiehungszone ihre ursprfingliehe Gestalt noch beibehalten, ist es nicht wahrscheinhch, da2 das Geriistmaterial dort schon wesentlich abgebaut wird. Anderseits erforderb die deutliche Hyalinisierung der ganzen Wand doch mehr als eine blo2e Quel]ung. Beim ]~bergang in die Verflfissigungszone wfl-d die ganze Sekundarwand au~gelSst, wahrend die resistentere Primarwand (und Mittellamelle ?) in das verflfissigte Material hineinragt und faserige Strange bfldet. Weder die aul~ere noch die innere Grenze der Erweichungszone ver]auft en~lang der Zellgrenzen. In der AuflSsungsschiehf is~ das Verhaltnis yon Mannan A zu B ca. 2:1, d.h. sehr ahnlich wie im intakten Endosperm (Li~])~KE, 1927; MEIER, 1958). Dieser Befund spricht ffir den gleichzeitigen Abbau beider Mannane. Allerdings ist zu bedenken, dal3 das Mannan B im Laufe der Depolymerisierung den Polymerisationsgrad yon Mannan A durchlaufen muG, und dab andererseits Mannan A dauernd zu Mannose abgebaut und diese aus der Verflfissigungszone entfernt wird. Das Endprodukt der Mannandepolymerisierung ist monomer. Nur so kann die hohe Konzentration der freien Mannose in der Aufl5sungsschicht erklart werden. Die Abbauversuche lieferten aus Mannan A (DP ca. 19) bemerkenswerte Quantitaten Oligosaeeharide bis hinauf zur Mannopentaose. Vor allem der Prozentsatz der erhaltenen Mannobiose war relativ hoeh (vgl. Tabelle 5), was auf die sukzessive Abspaltung yon Mannobiose-Einheiten hindeutet. Fast sieher kann m a n aussehlieBen, da$ yon einem Molekiilende her ein Mannoserest naeh dem andern freigesetzt wird. Ware alas namlieh der Fall, k5nnten die Mannobiosereste hSchstens etwa 10 % der Monosen ausmachen, und man miiSte erst noeh annehmen, da6 der Abbau auf dem Mannobiosestadinm stehen bliebe.

Die Mobilisierungdes Reservemannans im keimendenDattelsamen

343

Eine rein zuf/fllige Spaltung des Mannanmolekals irgendwo in der Kette ware aueh denkbar. Es ist aber eher anzunehmen, dab ein Enzym die Verkfirzung der Mannane um je zwei Einheiten besorgt (vgl. ~-Amylase), und dann ein anderes, der Maltase beim St~rkeabbau vergleiehbares Enzym die entstandene Biose zerlegt. Fiir die Mannanmobilisierung kommen Phosphorylasen oder Hydrolasen in Frage. Das negative Resultat des Phosphorylasenachweises in der AuflSsungsschich~ schlieBt die Phosphorolyse aus, allerdings unter der Voraussetzung, dab die angewandten Versuchsbedingungen dem geaktionsmechanismus eventuell vorhandener Phosphorylasen gerecht wurden. Bei den betreffenden Versuchen walrde namlich angenommen, dab Mannanphosphorylasen analog den bekannten St/~rkephosphorylasen arbeiten nnd bei einem UbersehuB yon Mannose-l-Phosphat mit einer pr~mer-Substanz (z.B. Mannotetraose) Mannan aufbauen warden (vgl. AKAZAWA, 1965, S. 278). Gegen das Vorkommen yon Phosphorylasen in der AuflSsungssehieht spreehen aber aueh noeh andere Griinde. So lieBen sieh in ihr keine Zuekerphosphate nachweisen. Dieser Befund ws beim Vorhandensein einer Phosphorolyse nur dann denkbar, wenn gleiehzeitig eine Phosphatase wirksam w~re. die die Reaktionsprodukte sofort zu freien Hexosen spaltete. In der Aufl5sungssehieht selbst konnte jedoch nut sehr wenig Phosphatase gefunden werden, die sonst gewShnlieh dort vorhanden ist, wo phosphorolytische Kohlenhydratspaltung stattfindet (vgl. SA~T~, 1966). Im Falle der Phosphorolyse darfte man im Endosperm ferner ein gewisses Quantum freies Phosphat erwarten, was aber naeh Abb. 5c nicht der Fall ist, vor allem nieht in der Zone um das Haustorium herum. Es ist also wahrscheinlieh, da6 das Haustorinm eine oder mehrere Mannanasen (Hydrolasen) in das umliegende Endosperm sezerniert.

2. Saccharosesynthese Der ruhende Embryo enth~lt fast nur Saccharose als ]Ssliehen Zueker. Das best~tigt, was sehon G~u~ss (1902) vermutet hat, dab der t~ohrzucker die erste Nahrung des Embryos ist. Die Saceharosekonzentration im Itaustorium ist mit Abstand die hSehste in allen Organen des sich entwiekelnden Keimlings. Sie ist also das aus der resorbierten Hexose entstandene Endprodukt. Dies wird best/itigt dureh die Ernghrungsversuehe mit radioaktiver Mannose und Glucose. Das Haustorium wandelt diese Hexosen sehr rasch in Saccharose urn, die in beiden Zuckerbausteinen gleich stark markiert erscheint. Die Umwandlung yon Itexosen in Rohrzucker bei der l~esorption ist bekannt beim Gramineenseutellum und wurde neulich auch im Ricinuskeimling beobaehtet (K~IEDEMANNund B ~ E v ~ s , 1967a und b). Der wahrseheinliehste Ort der Synthese ist das Haustoriumepithel, das auch die aktive Resorption

34~

L. K~vsc~:

der Monosen besorgt. Nach einer Beobaehtung der erw/~hnten Autoren ist die Saccharosesynthese sogar in den Intereellularr/tumen des Resorptionsorgans mSglich. Es seheint, dab Glucose, Fructose und Saccharose sehr leicht aus dem ttaustorium hinausdiffundieren, wenn man dasselbe in Wasser oder eine ws LSsung legt. Bei der Ern~hrung der tIaustorien mit Mannose-C 14 bzw. Glucose-C ]4 traten nach einer Versuchsdauer yon 5 min radioaktive Fructose und Glucose, und nach 15 rain auch radioaktive Saccharose in der InkubationslSsung auf (Abb. 6a und b). DaB diese Zueker nicht augerhalb des Haustoriums gebildet worden sind, ergab sich aus dcr Analyse des Sp/ilwassers der Haustorien und aus dem Vergleieh mit den Zuckerextrakten der Aufl6sungsschicht und der Haustorien (Tabelle 6). Falls auch im Dattelhaustorium Saccharose in den Intereellularrgumen gebfldet wird, kann sic oder auch Glucose und Fructose leieht in den Zellwgnden wandcrnd nach auBen gelangen. Ein solcher Austritt yon Saeeharose aus dem l~esorptionsorgan in die umgebende L6sung wurde iibrigens auch yon H u ~ P ~ E Y s und GAI~I~ARD (1966) beim keimenden Maiskorn beobachtet. Auch die folgende Uberlegung zeigt, dab Fructose, Glucose und Saccharose nicht augerhalb des Haustoriums gebildet werden. Beim Ern~hrungsvcrsuch mit Mannose-C14 war die Radioaktivit~t per Mol Substanz nach 4stfindiger Inkubation bei Glucose, Fructose und Saccharose in der l%eaktionsl6sung mindestens zwanzig Mal geringer als bei der Mannosc. Das bedeutet, dab diese drei Zucker im wesentlichen aus inaktivem, vor Versuchsbeginn im Haustorium vorhandenem Material stammen m/issen. Die theoretiseh denkbaren Reaktionen, die vom Mannan zur Saecharose fiihren kSnnen, sind in Abb. 7 zusammengestellt. Die freie Mannose kann aus dem Endospermmannan hydrolytisch (1) oder phosphorolytisch (4) unter naehfolgender Phosphatasecinwirkung (5) gebildet werden, wobei unsere Befunde, wie oben dargelegt, den phosphorolytisehen Abbau ausschliegen. AnschlieBend kann die Umwandlung Mannose-->Fructose (2) durch eine Mannose-Ketol-Isomerase (5.3.1.7) erfolgen, wie sic yon PALLEI~ONIand DOUDO~O~F (1956) in Pseudomonas saccharophila nachgewiesen worden ist. Die so entstandene Fructose k6nnte dann mit U D P - G (3) auf dem normalen Weg wie im Weizenkeimling in die Saccharose eingebaut werden (L]~LoI~ und C ~ n I ~ I , 1953). Das ist nach unseren Untersuchungen der wahrscheinlichste Weg vom MaIman zur Saccharose. Die Itauptfrage, die nicht endg/iltig beantwortet werden konnte, ist, wic das U D P - G oder eventuell ein anderes Glucose-Nucleotid (GDP-G ?) gebfldet wird, das mit der Fructose zu Saccharose oder mit Fructose6-Phosphat zu Saecharose-6s-Phosphat zusammentritt. Prinzipiellbesteht

Die Mobilisierung des Reservemannans im keimenden Da~telsamen

345

Mannan UDPSaccharose UDP-Gh

l] Manno!~-l-P

/ \ Mannose

Fructose .t

UTP- xGlucose-l~P_P

~

Mannose-1,6-P

~ / M a n n o s e - 6 -P

~

~ UTP/GTP

Fructose-6-P

UDP-M/GDP-M

11~ __UDP-G/GDP-G

PP~ UDP-Gn

Saccharose Abb. 7. Hypothetische Reaktionsabl~ufe ffir die Saccharosebildung aus Marman 3 die MSglichkeit, d~[~ aus der Mannose fiber die Reaktionen 5, 13 und 16 UDP- G oder GDP- G gobfldet wfirde. Tats~ehlich ist, wie oben dargeleg~, in vitro mit H~ustoriumhomogenisat and mit U T P und Mannose-C 14 ~ls Substrat sin radioaktives Zuekernucleotid entstanden, das sieh chromatographiseh wie UDP-M und/oder UDP-G verhidt. Boi Verwendung yon GTP als Substrat konnte hingegen kein radioak~ives Zuekernueleotid naehgewiesen werden. Das ist etwas eigenartig, denn sowohl in tierisehen Zellen (ST~oMr~G~,R, 1962) wie in hSheren Pflanzen (GR~,aom~ et al., 1965) and in niederen Organismen (PoNTIS et al., 1957; Z ~ s e ~ , 1965) ist normalerweise GDP-M die ,,aktivierte" Form der Mannose. UDP-M ist bis heute nieht aus Pflanzen isoliert worden. Itingegen haben PO~TXS et al. (1960) in Eremothecium GDP-M und GDP-G nebeneinander gefunden. MUNeH-P~T~SE~ (1956) hat die Guanylyltransfer~se (2.7.7.13) inBierhefe festgestell~. BAR~R und HASSID (1965) haben naehgewiesen, dab d~s 3 Die auf Grund der vorliegenden Arbeit gesicherten oder wahrseheinlichsten Reaktionsabl~ufe sind fett gedruckt.

346

L. KEuse~:

Enzymsystem der Polysaccharidsynthese in Phaseolus aureus GDPMannose und GDP-Glucose nicht unterscheidet, und ELBE~:r und HASSID (1966) machten die Epimerisierung yon GDP-Mannose zu GDP-Glucose wahrscheinlich. Ob GDP-Glucose start UDP-Glucose ffir die Saccharosesynthese dienen kann, ist nicht untcrsucht worden. Hingegen wirkt das Guanosinnucleotid als Glucosyllieferant bei anderen Saccharidsynthesen mit (BA~BE~ et al., 1964). Da, wie schon erw~hnt, keine Anhaltspunkte ffir die Bildung yon GDP-Zuckernucleotiden gefunden werden konnten, ist eine direkte Isomerisierung yon Fructose oder Mannose bzw. deren Phosphaten zu Glucose (2, 2', 8 oder 6, 7, 8 oder 6, 7') und anschlieBende Bfldung yon UDP-G (9, 10) wahrscheinlicher. Die freie Mannose o d e r Fructose wird in diesem Falle yon einer Mannokinase, wie sie Bu]~])r~G und M)~cK~NoN (1955) in Schistosoma man~oni nachgewiesen haben, bzw. ~ructokinase (2.7.1.7 bzw. 2.7.1.4) phosphoryliert (6 bzw. 2'). Ein Phosphomannose-Isomerase-System (7, 8 bzw. 7') wurde yon S L ] ~ (1950) aus tierischem Gewebe isoliert. GOLDSWO~T~Yund STgEET (1965) haben die l~eaktion Mannose-6-Phosphat~-Fructose-6-Phosphat (5.3.1.8) (7) in der Tomatenwurzel gefunden. Die Glucosephosphat-Isomerase (5.3.1.9) (8) ist verbreitet im Pflanzenreich ebenso die Phosphoglucomutase (2,7.5.1) (9). Das daraus entstehende Glucose-l-Phosphat reagiert dann mit UTP (2.7.7.9) (10), um als UDP-Glucose mat Fructose-6Phosphat (2.4.1.14) oder Fructose (2.4.1.13) in bekannter Weise Saccharose-6-Phosphat oder Saceharose zu bflden (11, 3).

3. Transport Die Wanderung der Reservesaccharose vom Endosperm in die Auf16sungsschicht zu Beginn der Keimung 1/~Bt sich damit erkl/~ren, dab die Konzentration in dieser Schicht einen Tiefpunkt aufweist (vgl. Tabelle 2, e). Mit dem l~bertritt aus der Aufl6sungsschicht in das Haustorium muB jedoch ein fast ffinffaehes Konzentrationsgefi~lle fiberwunden werden, was eine aktive Leistung des ,,Saugorganes" effordert. Schon sehr bald nach Beginn der Keimung tritt in der Aufl6sungssehicht und nur in ihr ffeie Mannose auL Sie ~ r d von dort unter gleichzeitiger Umwandlung gegen ein hohes osmotisches Gef~lle vom Haustorium resorbiert. Der radioaktive Rohrzucker, der nach Ern~hrung des Keimlings mit Mannose-C 14 im Scheiden- und Wurzelextrakt erscheint, verri~t ihn als die Transport~orm zwischen Bildungs- und Verbrauchsort. Er wird erst im wachsenden Gewebe hydrolysiert und verwertet. Ein Tefl der im Haustorium aus der Mannose gebfldeten Glucose bzw. Fructose und Saccharose wird sehr rasch in Sti~rke umgebaut. Das geht daraus hervor, dab ein in vitro mit Amylase durchgeffihrter Abbau der ttaustorium-

Die Mobilisierung des Reservemannans im keimenden Dattelsamen

347

st~rke nach kurzer Inkubation mit Mannose-C14 bereits radioaktive Glucose lieferte. Die Glucosemenge in der Scheide (Tabelle 1, g) ist zwar doppelt so groB wie die der Saccharose, aber als waBrige LSsung betrachtet (T~belle 2) steht sic mit der Glucose des Haustoriums im Gleichgewicht, was gegen ihre Transportfunktion spricht. Die Saecharose ist demnach aueh im Dattelkeimling der wichtigste Transportzucker.

Zusammenhssung Die morphologische und biochemische Untersuchung der EndospermauflSsung des keimcnden Dattelsamens zeigte, dab der Keimling die Reservestoffe mit Hflfe yon Exoenzymen mobilisiert. Die Depolymerisierung der Mannan-Kettenmolek/ile spielt sich in der AuflSsungsschicht in unmittelbarer N/~he des ttaustorinms ab. In einer Erweichungszone, die mehrere Zellschichten umfaBt, wird die gequollene Sekundarwand nur so welt zersetzt, dab sic ihre urspr/ingliche Gestalt noch beibeh~lt, wahrend sic in der diinneren Veffltissigungszone vollst~ndig gelSst und bis zur Mannose abgebaut wird. Nur die cellnlosische Prhn/~rwand widersteht dem Abbau und geht in Form faseriger Elemente in die Verfltissigungszone ein. Nach den Ergcbnissen der qualitativen und quantitativen Zuckerbestimmungen ist ffeie Mannose das Endprodukt des Mannanabbaus, das vom Itaustoriumepithel resorbiert und umgewandelt wird. Unter den Oligosacchariden, die in vitro durch Inkubation yon Mannan A-L6sungen mit Haustorien gewonnen wurden, fanden sich Brnchstiicke yon reinen Mannanketten, Mannose bis Mannopentaose, neben geringen Mengen yon Oligosaeehariden, die Glucose- und Mannosereste enthielten. Interessanterweise wurde auch Myoinosit isoliert. Das Fehlen yon phosphorylierten Zwisehenprodukten und yon Phosphorylase-Aktivitat in der AuflSsungsschicht weist auf einen hydrolytisehen Abbau der Mannane bin. Bei der Resorption durch den Keimling wird die Mannose in Saccharose umgewandelt. Der Mechanismus dieser Synthese konnte nicht eindeutig abgeklart werden. In der AuflSsungsschicht seheinen keine Zuckernucleotide gebildet zu werden. Bei den Versuehen, mit Haustorinmfermenten in vitro Zuckernucleotide zu bilden, reagierte nur UTP, nieht aber GTP mit Mannose. Die yore Mannan zur Saccharose f/ihrenden Reaktionsabls und der Zuekertransport yore Endosperm zum Keimling werden diskutiert. Die vorliegende Arbeit wurde am Botanischen Institut tier Universit~t Freiburg, Schweiz, unter der Leitung yon Prof. Dr. It. MEIER durchgeftihrt, dem ich an dieser Stelle fiir die vie]en Anregungen und Diskussionen herzlich danke.

348

L. KEusc~:

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Die Mobilisierung des Reservemannans im keimenden Dattelsamen

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[Mobilisation of reserve mannan in germinating date seeds].

Morphological and biochemical studies of the decomposition of endosperm tissue in germinating date seeds have shown that the mobilisation of reserve s...
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