Blur, Band 32, Seite 185-194 (1976) Lehrstuhl ftir Innere Medizin, speziell H~matologie, der Universit~t Miinchen (Kommissarischer Vorstand: Prof. Dr. R. Marx)

Leukozyten- und Erythrozyten-lnteraktion mit Kollagen in vitro: Eine rasterelektronenrnikroskopische Untersuchung Leopold Balleisen nnd Rudolf Marx

Zusammenfassung An Hand rasterelektronenmikroskopischer Bilder wird gezeigt, dab eine Interaktion yon Leukozyten und Erythrozyten mit fibrillfirem und polymerisierendem (Typ I und III) Kollagen m6glich ist nnd unter bestimmten Testbedingnngen beobachtet werden kann. Eine m6gliche pathogenetische Bedentung der Kollagen-, Leukozyten- und Erythrozyten-Interaktion wird diskutiert. Summary Scanning microscopic investigations show the interaction of Leukocytes and Erythrocytes with fibrillar and aggregating type I and type III collagens in vitro. Leukocytes, in the presence of collagen, form loose aggregates within a minute and these aggregates, after 15 to 30 minutes, coalesce and become compact. The close association of the fibrillar collagens to the leukocyte surfaces is shown. Fibrillar collagen and collagen in solution with erythrocytes form only loose aggregates. Qualitative differences between the various collagen preparations were not found. The pathogenetic implications of these observations are briefly discussed. Key words: Collagen, Scanning microscope.

Bei der systematischen Analyse der Interaktion yon Kollagen und Kollagenderivaten mit menschlichen Thrombozyten [2,3] wurde von uns beobachtet, dab nicht nut die Blutpl~ttchen durch Adhesion und Aggregation oder Ausbreitung an Kollagenfibrillen mit Kollagen in enge Beziehung treten k6nnen, sondern dab auch Leukozyten und Erythrozyten mit Kollagenfibrillen und polymerisierendem Kollagen reagieren k6nnen. Das Ziel dieser Arbeit war es, diese Interaktionen im Rasterelektronenmikroskop darzustellen. Material und Methoden Blur Ven&es fgumanbluf wurde nach Punktion einer oberflachlichen Armvene im Verhfiltnis 9 : 1 mit 3,8proz. Natriumcitrat (pH 7,0) oder 2proz. EDTA (pH 7,2) vermischt und dadurch gerinnungsgehemmt. Eine weitgehend leukozyten- und thrombozytenfreie Erythro~;ylenEingegangen am 6. 10. 1975.

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suspension wurde durch Zentrifugieren yon Citrat- oder EDTA-Blut bei 90 •

10 min lang, rlach Suspendierung der sedimentierten Erythrozytela in zellfreiem Plasma und einmaligem Waschen und Resuspendierung im Plasma gewonnen. Die Konzentration dabei wurde auf 150000 bis 200000 Erythrozyten/mm a eingestellt. Leuko~.yten wurden nach einstiindiger Spontansedimentation unter Zusatz yon 1 ml Macrodex | zu 10 ml Blut aus dem {3berstand gewonnen. Eine weitgehend thrombozytenfieie Leukozytensuspension wurde durch 4- bis 5maliges Abzentrifugieren der Leukozyten bei 90 • g 8 min lang bei Zimmertemperatur, durch Dekantieren des Uberstandes und jeweilige Resuspendierung im dextranfreien Plasma erhalten. Fi.ir die Untersuchung eines Leukozyten/Thrombozyten-Gemisches wurde die Waschprozedur lediglich einmal durchgefiihrt. Kollagen Gel6stes Typ-I-Kollagen vom Kalb und Typ-III-Kollagen aus Humanhaut wurde, wie in frtiheren Arbeiten beschrieben [1,2,3], hergestelk mad in 0,05 proz. Essigs~iure gel6st (1 mg/ml). Als fibrilliires Kollagen verwendeten wir Kollagenfibrillen aus Achillessehnen vom Pferd der Fa. HORMON-Chemie, Mtinchen. Ein fibrill~ires Kollagenpr~iparat aus menschlichen Sehnen verschiedener Herkunft wurde nach [15] hergestellt. Reaktionsbedingungen Bei allen Versuchen wurden 50 btg Kollagen zu 1 ml der auf die Reaktionstemperatur erw~irmten Zellsuspension yon pH 7,4 zugegeben, die Probe 1 rain mild geschiittelt und dann bis zum gewiinschten Zeitpunkt stehen gelassen. Der pH-Wert der Zellsuspension iindert sich durch Zugabe der sauren Kollagenl6sung nicht. Unterbrochen wurde die Reaktion dutch Zugabe yon Glutaraldehydl6sung [23]. Die Wirkung yon gelSslem Typ-I- und Typ-YII-Kollagen auf Leukozyten und Erythrozyten wurde bei 37 ~ C in Citratplasma untersucht. Das Kollagen wurde in gel6ster Form zugegeben und die Reaktion nach 1 min bzw. 15 und 30 min unterbrochen. Die verwerldeten Kollagene bilden unter diesen Bedingungen innerhalb yon 15 min fibrill~ire Kollagenaggregate [3]. Die Wirkung der Kollagenfibrillen wurde bei Zimmertemperatur in Citrat- und EDTAPlasma untersucht und die Reaktion ebenfalls jeweils nach 1 min bzw. 30 rain unterbrochen. Parallel zu allen Untersuchungen wurden Kontrollen unter denselben Bedingungen durchgeftihrt, wobei lediglich die Kollagenl6sung durch den Puffer ersetzt wurde. Die rasterelektronenmikroskopischen Untersuchungen wurden an einem Stereoscan Cambridge Marc II durchgeftihrt. Nach Reaktionsunterbrechung konnten die Leukozyten- bzw. Erythrozyten-Kollagenaggregate eine Stunde spontan auf Glasobjekttriiger sedimentieren, wurden dann in 2,Sproz. Glutaraldehyd (in Phosphatpuffer pH 7,4) fixiert, in einer aufsteigenden ~thanolreihe entw~issert, luftgetrocknet und mit Gold bedampft.

Ergebnisse Die rasterelektronenmikroskopischen Bilder zeigen die W i r k u n g der Kollagene auf Leukozyten u n d Erythrozyten. Gel6st zugegebenes T y p - I - und T y p - I I I - K o l l a g e n polymerisierte im Plasma bei 37 ~ C innerhalb y o n 15 rain [3]. Geukoz_yten reagierten auf gel6st zugegebenes K o l l a g e n unter den gew~thlten Bedingungen innerhalb y o n 1 min dutch die Bildung y o n lockeren Leukozytenaggregaten, in denen die einzelnen Leukozyten unver~indert erscheinen. Nach 30 rain fanden sich gr/SBere Leukozytenaggregate, in denen die Einzelleukozyten eine deutliche Verschmelznngstendenz zeigten (Abb. 1 a u n d b). K o l l a g e n war nicht sichtbar, es mag &arch die aggregierenden Leukozyten eingeschlossen sein.

Leukozyten- und Erythrozyteninteraktion mit Kollagen

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Abb. la, b: Leukozytenaggregate durch polymerisierendes Kollagen in Citratplasma bei 37~ C nach t5 rain (a) und 30 rain (b). Die Leukozyten zeigen eine deutliche Verschmelzungstendenz. KolIagen ist nicht sichtbar (a : • 5300; b: x 1100).

Ein Unterschied zwischen Typ-I-Kollagen (Kalb) und Typ-III-Kollagen (Mensch) ist nicht zu sehen. Fibrillates Kollagen reagierte im Citrat- wie im EDTA-Plasma schneli mit Leukozyten, die Kollagenfibrillen traten in engen Kontakt zur Zelloberflgche (Abb. 2a und b). Nach ]~ingerer Einwirkungszeit bildeten sich ebe~falls Leukozytenaggregate.

Abb. 2a, b: Interaktion von Leukozyten und Kollagenfibrillen in Citrat- (a) und EDTA- (b)Plasma bei Zimmertemperatur. Reaktionszeit 1 rain. Innerhalb kurzer Zeit kommt es zu einem intensiven Kontakt yon Kollagenfibrillen und der Leukozytenmembran (• 10 000).

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Vermehrt wurden im EDTA-Plasma Einzelleukozyten beobachtet, die an Kollagenfibrillen Pseudopodien und fltigels Forts~tze bildeten (Abb. 3a-c).

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-4--- C

Abb. 3 a-c : Leukozytenreaktion yon Einzelleukozyten auf Kollagenreiz in EDTAPlasma bei Zimmertemperatur. Reaktionszeit 30 rain. Die Leukozyten bilden Pseudopodien (a), fliigelf6rmige (b) oder auch diinrm (c) Fortsfitze an Kollagenfibrillen (a: • b: • und c: •

Deutliche Unterschiede zwischen Citrat- und EDTA-Plasma einerseits und den verschiedenen Fibrillenpr~iparaten andererseits wurden nicht gefunden. Sind im Plasma neben den Z.eukogyten noch Thromboz3ten vorhanden, so kam es nebeneinander zur Leukozyten-/Kollagen- (Abb. 4a), Lenkozyten-/ThrombozytenReaktion (Abb. 4b) und zu gemischten Leukozyten-/Thrombozyten-/Kollagenaggregaten. Ohne Kollagen wurde unter diesen genannten Testbedingungen in Normalblnt eine Thrombozytenadh~sion an Leukozyteta nur vereinzelt beobachtet. l m Gegensatz zur Leukozytensuspension konnte nach Zugabe gel6sten Kollagens polymerisiertes Kollagen an den Erythro~ytenaggregaten beobachtet werden (Abb. 5).

Leukozylen- und Erythro~yieninteraklion mif Kollagen

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Qualitative Unterschiede in der Aggregatbildung durch polymerisierendes Typ-Iund Typ-III-Kollagen (Abb. 5) und fibrill~ires Kollagen (Abb. 6a und b) einerseits und Citrat- und EDTA-Plasma andererseits wurden nicht gesehen. Die Bindung der einzelnen Erythrozyten an das Kollagen erschien weniger fest als diejenige der Leukozyte•. H~tufig beobachtet wurde die Anhes yon Kollagenfibrillen im Bereich der zentralen Erythrozytenvertiefung (Abb. 7).

Abb. 4a, b: In Leukozyten-/Thrombozyten-Suspensionen in Citratplasma kommt es nach Kollagenzusatz zur Reaktion yon Kollagenfibrillen mit Thrombozyten oder Leukozyten und zur Ausbildung reiner Leukozyten-Thrombozytenaggregate (a) neben Aggregaten, die alle Komponenten umfassen (b). Reaktionszeit 1 rain ( X 10000).

Abb. 5 : Polymerisierendes Typ I-(Kalb) oder Typ III-(Human) Kollagen aggregiert Erythrozyten. Citratplasma. Reaktionszeit 30 min bei 37~ C (• 5000).

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Abb. 6a, b: Interaktion yon Erythrozyten und Kollagenfibrillen in Citrat-(a) und EDTA(b)-Plasma nach 1 min bei Zimmertemperatur (a: • 2000 ; b : • 5000).

Abb. 7: Interaktion yon Erythrozyten und Kollagenfibrillen nach 30 min in EDTAPlasma. Die Anheftung der KollagenfibriUen in der zentralen Erythrozytenvertiefung wird hiiufig gefunden (• 5000).

Besprechung Die Adh~ision der Thrombozyten am freiliegenden Kol]agen nach Oef~iBverletzungen und Endothelabschilferung ist ein entscheidender Schritt fiir die Wiederherstellung der Endothelintegritfit oder auch ein Lokalisationss fi~r das Entstehen - insbesondere arterieller - Thromben. Der molekulare Mechanismus dieser Interaktion wird zur Zeit untersucht. Unsere Untersuchungen zeigen, dab auch eine Interaktion y o n Leukozyten und Erythrozyten mit Kollagen unter bestimmten Bedingungen vorkommt.

Leukozyten- und Erythrogyteninteraktion mit Kollagen

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{Jber die Wirkung yon Kollagen auf andere Blutzellen und tiber die m6gliche pathogenetische 13edeutung dieser Wechselbeziehung liegen nut wenige Untersuchungen vor. Die Adhgsion yon Leukozyten am Subendothel einer denaturierten Kaninchenaorta, zeitlich nach der abgelaufenen Thrombozytenaggregation, wurde 1972 beschrieben [20]. Einzelne Leukozyten reagierten ~ihnlich wie Thrombozyten auf diese kollagenhaltige Oberftfiche durch Ausbildung yon Pseudopodien und Ausbreitungsformen [10, 19]. Kollagen erh6ht auch in vitro die Adh~ision von Leukozyten an Glas [5] und f6ralert die Ausbreitung von Leukozyten auf Silikon oder Zaponlack (Balleisen, Marx, unver6ffentl. Befunde). In Leukozyten frischer arterieller Thrombe/~ wurde Typ-III-Kollagen, welches in arteriellen Gef~Ben unmittelbar subendothelial liegt, immunhistochemisch nachgewiesen und gezeigt, dab die Phagozytose von Typ-III-Kollagen durch Leukozyten auch in vitro m6glich ist [9]. {dber die Rolle der Leuko~ylen in diesem Zusammenhang k6nnen jedoch nur Vermutungen angestellt werden. M6glich erscheint die Funktion der Leukozyten als ,,Reinigungszellen", welche fiir das Abr~umen der Thromben mitverantwortlich sind. Bekannt ist das nachtritgliche Einwandern von Leukozyten in Thromben, welches dutch chemotaktische Stoffe aus durch Kollagen aggregierten Thrombozyten beeinfluBt sein k6nnte [25]. M6glicherweise sind diese chemotaktischen Stoffe Kollagenbruchstiicke, welche durch Thrombozytenkollagenase freigesetzt wurden [6]. Von solchen kleinmolekularen Kollagenbruchstiicken ist eine starke chemotaktische Aktivit/it bekannt [12]. Die Leukozyten selbst k6nnen sich auch wirkungsvoll am Kollagenabbau beteiligen, da auch sie fiber eine Kollagenase verffigen [18]. Leukozyten k6nnen offensichtlich auch direkt mit freiliegendem Kollagen reagieren und m6gen auch noch weitere Wirkungen am GefitB entfalten. Da sie ~ihnlich wie Thrombozyten zu einer Release-Reaktion angeregt werden k6nnen, wobei auch vasoaktive Stoffe freigesetzt werden [7], ist ein Beitrag zur Gef~Bkontraktion m6glich. Auch verm6gen sie evtl. ~hnlich wie Thrombozyten durch ihre Ausbreitnng anf dem Endotheldefekt eine Art Schutzfunktion austiben. Die Bedeutung der Y~rythrozjten ftir H~mostaseph~inomene in vivo und in vitro ist gesichert: Nicht nur sind sie als passives Ffillmaterial im Fibrinnetzwerk bei der normalen VerschluBthrombusbildung wichtig, sie sind auch in vitro, wie zuerst Marx [ 16] und Hubrich [ 13] zeigen konnten, ffir die Pl~ittchenadhiision in vitro in Glaskapillaren unerl~Blich. Dabei spiek die Freisetzung von ADP-Spuren aus den im artefiziellen System mikrotraumatisierten Erythrozyten eineRolle [8, 11]. Am Modell der desendothelisierten Kaninchenaorta wurde gezeigt [24], dab ffir die Adhitsion der Pliittchen am Subendothel ebenfalls Erythrozyten bedeutsam sind, vermutlich weil sie das rheologische Verhalten der Pl~ttchen und dadurch deren Adhesion-Agglomeration am Subendothel beeinflussen k6nnen. Unsere Ergebnisse zeigen, dab auch eine direkte Beziehung zwischen Kollagenfibrillen und einzelnen Erythrozyten vorkommt, wobei die Verklebung zwischen den Erythrozyten und den Kollagenfibrillen bevorzugt an der Erythrozyten-Diskush6hlung erfolgt.

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Unsere Beobachtungen stehen in Einklang mit anderen Befunden [1, 14,21,22], deren experimentelle Ergebnisse ebenfalls auf eine Beteiligung des aus Erythrozyten s A D P ' s bei der Entstehung y o n M i k r o e m b o l i e n und bei der T h r o m bogenese schliegen lassen. Die Reaktion y o n E r y t h r o z y t e n u n d Leukozyten mit Kollagenfibrillen kann auch als Restfunktion gedeutet werden, die sich entwicklungsgeschichtlich aus der Abstammung aller Blutzellen y o n weniger spezialisierten Blutzellen niederer Tierarten herleitet. E i n e n weiteren AufschluB fiber diesbeziiglich m/Sgliche Zusammenh~inge k6nnten h~imostaseologische Untersuchungen an weniger spezialisierten Blutzellen niederer Spezies geben.

Diese Untersuchungen wurden vom Sonderforschungsbereich 51 (Medizinische Molekularbiologie und Biochemie in Miinchen) untersttitzt.

Literatur: 1. Arfors K. E. & Berquist D.: Platelet aggregability and vessel contraction in microvascular haemostasis. M#rovasc. R. 9, 22 (1975). 2. Balleisen L., Marx R. & Kiihn K. : [2ber die stimulierende Wirkung yon Kollagen und Kollagenderivaten auf die Ausbreitung und Folienadh~ision yon Thrombozyten im defibrinogenisierten Menschencitratplasma und in tierischen Citratplasmen. Blur 31, 96 (1975). 3. Balleisen L., Gay S., Marx R. & Ktihn K. : Comparative investigations on the influence of human and bovine collagen types I, II and III on the aggregation of human platelets. Klin. Wschr. 53, 903 (1975). 4. Balleisen L., Marx R. & Kiihn K.: Platelet-collagen interaction. The influence of native and modified collagen (type I) on the aggregation of human platelets, lm Druck (Haemostasis 1976). 5. Banks D. C. & Mitchell J. R. A. : Leukozytes and Thrombosis. III. Effect of white cell behaviour of substances with induced or inhibited platelet aggregation. Thrombos. Diathes haemorrh. 30, 62 (1973). 6. Chesney C. M., Harper E. & Colman R. W.: Human platelet collagenase. J. C/in. Invest. 53, 1647 (1974). 7. Eggleston P. A. & Eggleston A. W.: Platelet and leukocyte aggregation associated with antigenic leukocyte histamin release. Lab. Invest. 31,421 (1974).

8. Gaardner A., Jonsen J., Laland S. Hellem A. & Oweren P. A. : Adenosine diphosphate in red cells as a factor in the adhesiveness of human blood platelets. Nature 192, 531 (1961). 9. Gay S., Balleisen L., Remberger K., Fietzek P. P., Adelmann B. C. & Kiihn K. : Immunhistochemical evidence for the presence of collagen type I l l in human arterial walls, arterial thrombi and in leukozytes, incubated with collagen in vitro. Klin. Wschr. 53, 898 (1975). 10. Haudenschild D., Baumgartner H. R. & Studer A. : Significance of fixation procedure for preservation of arteries. Experientia 28, 828 (1972). 11. Hellem A. J.: The adhesiveness of human blood platelets in vitro. Stand. J. din. Lab. Invest. Suppl. 51 (1960). 12. Houck J. & Chang D. : The chemotactic properties of the product of collagenolysis. Proc. Soc. Exp. Med. 138, 69 (1971). 13. Hubrich J.: Modellversuche zur Pathogenese der Thromben r u m Standpunkt der Thrombozytenadh~ision. Diss. Univ. Mtinchen, 1958. 14. v. Kaulla K. N. : In vitro inhibition of aggregation of human erythrocytes by synthetic fibrinolytic compounds. Arznei. Forsch. 25, 152 (1975). 15. Ktihn K., Gral3man W. & Hofman U. : Die elektronenmikroskopische Anf/irbung des Kollagens und die Ausbildung

Leukozyten- und Erythrowteninteraktion mit Kollagen einer

hochunterteilten Querstreifung.

X. f. J~Talurforsch. 13, 154 (1958). 16. Marx R. : 17ber den Einflug der Erythrozyten auf die Tbrombozytenadhfision und -agglomeration. FoL haemat. 6, 1 (1961). 17. Miiller-Berghaus G. & Eckhardt T. : The role of granulocytes in the activation of intravascular coagulation and the precipitation of soluble fibrin by endotoxin. Blood 45, 631 (1975). 18. Oronsky A. L., Perper R. J. & Schroder H. C. : Phagocytic release and activation of human leukocyte procollagenase. Nature (Lond.) 246, 417 (1973). 19. Stemerman M. D. : Vascular intima components precursors of thrombosis. In: Progress in haemostasis and thrombosis, VoI 2, p. i. (Edt.: Th. Spaet). Grune & Stratton, INC. New York, San Francisco, London 1974. 20. Stemerman M. D.: Platelet interaction with intimal connective tissue, ln: Platelets: Production, function, transfusion and storage, p. 157. (Edts.: Mario G. Baldini & Shirly Ebb@ Grune &

193

Stratton. INC. New York, San Francisco, London 1974. 21. Surgenor D. MacN.: The red blood cell and blood coagulation system. In: The red blood cell. Sec. edt. Vol. 1, p. 351. Edt.: Douglas MacN. Surgenor. Acad. Press. New York, London 1974. 22. Surgenor D. MacN.: Erythrocytes and blood coagulation. Thrombos. Diathes haemorrh. (Stutfgart) 32, 247 (1974). 23. Thompson R. J. & MacKencie R. D.: A method for preparing and staining the platelet-collagen interaction for microscopic observations. J. Clin. Palh. 26, 78 (1973). 24. Turitto V. T. & Baumgartner It. R.: Platelet interaction with subendothelium in a perfusion system: Physical role of red blood cells. Microvasc. R. 9, 335 (1975). 25. Weksler B. B. : The platelet in inflammation: Interaction with complement to promote chemotaxis. In: Platelets: Production, function, transfusion and storage, p. 277. Edts : Mario G. Baldini and Shirly Ebbe. Grune & Stratton, INC. New York, San Francisco, London 1974.

Anschr. d. Verf. : Dr. L. Balleisen, I. Med. Klinik d. Univ. Mtinchen, Ziemssenstr. 1, 8000 Mtinchen 2.

[Leukocyte and erythrocyte interaction with collagen in vitro: scanning electron microscopy study].

Scanning microscopic investigations show the interaction of Leukocytes and Erythrocytes with fibrillar and aggregating type I and type III collagens i...
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