478
H. Skrabeiund L. Mettler:Isolierungvon Sperma-Antigenen
Im syngenen System bei Sensibilisierung von C-57-black-6-M/iusen mit 57Bl/6Spermatozoen ergaben sich im Vergleich zu mit Erythrozytensuspensionen sensibilisierten M/iusen der Kontrollgruppe deutlich erh6hte Titer. Bei der in vitro-Fertifisation kam es im Vergleich zu den Kontrollkulturen mit einer 35%igen Befruchtungsrate zu einer signifikanten Einschr/inkung der in vitroKonjugation mit einer Befruchtungsrate von 15-20%. Dieser Versuch ist ein Beispiel der vielf/iltigen M6glichkeiten, die das System der in vitro-Fertilisation zur K1/irung der Mechanismen konjugationsst6render Einflul3faktoren bietet.
76. D. Masson, G. Steimel, D. Krebs, F. Lehmann (Hamburg): Zum Naehweis zellfixierter Sperma-Antlkiirper beim Mensehen
Manuskript nicht eingegangen.
77. H. Skrabei, L. Mettler* (Univ.-Frauenklinik Kiel): Isolierung von SpermaAntigenen und ihre Reaktion mit spermagglutinierenden und spermimmobilisierenden Seren Bei Frauen mit ungekl/irter Sterilit/it werden h/iufig im Serum AntikSrper gefunden, die Spermatozoen agglutinieren oder immobilisieren (Wilson, 1954; Isojima et al., 1968). Es ist von Interesse, die Sperma-Antigene zu isolieren, die die Bildung dieser AntikSrper hervorrufen. Es w/ire dann m6glich: 1. Durch Injektion dieser Antigene eine Toleranz gegen Spermatozoen zu erzeugen. 2. Mit Hilfe dieser Antigene ein Kontrazeptivum auf immunologischer Basis zu entwickeln. Da die verantwortlichen Antigene sich wahrscheinlich an der Oberfl/iche der Spermatozoen befinden, wandten wit zu ihrer Loslfsung Methoden an, bei welchen ausschliel31ich Proteine der Sperma-Membran freigesetzt werden und keine Cytoplasma-Proteine austreten (Skrabei u. Mettler, 1977, in Vorber.), wie durch diskelektrophoretische Trennung und Tetrazolumf'~irbung der LDH-Isoenzyme gezeigt werden konnte. Zur Gewinnung der Antigene befreiten wird die Spermatozoen sorgf/iltig vom Sperma-Plasma und behandelten sie anschliel3end mit einem Gemisch von 0,075% Triton X-100 und 0,075% Hyamin 2389 (Zaneveld et al., 1972). Dabei werden eine grol3e Anzahl von Proteinen freigesetzt. F[ihrt man mit diesen Proteinnen eine Immunelektrophorese gegen spermagglutinierende oder immobilisierende Seren aus, so sollte sich ein vorhandenes Antigen durch eine Pr/izipitation zu erkennen geben. Bei Anwendung yon Triton X-100 und Hyamin 2389 zur Freisetzung von Membran-Antigenen konnte eine solche Pr/izipitation nicht erhalten werden. Deshalb wurde zur Antigen-Detektion ein Hemmtest durchgeffihrt. Dabei wird das spermaantik6rperhaltige Serum vor der Zugabe zu den Spermatozoen eine Stunde bei 37 ~ C und 12 Std bei 4 ~ C mit Antigen inkubiert. *
Unterstfitzt durch die Deutsche ForschungsgemeinschaftSFB 111-A-5
B. J. Kloseet al.: Die EPH-Gestoseaus immunbiologischerSicht
479
Die Antik6rper im Serum reagieren unter diesen Bedingungen mit dem dazugeh6rigen Antigen, wodurch der Antik6rpertiter im Serum gesenkt wird. Dieses wurde in dem anschliel3enden Mikrospermagglutinationstest (Friberg, 1974; Grad/u. Mettler, 1977) bzw. Mikrospermimmobilisationstest (Hustedt u. Hjort, 1974) festgestellt. Zur Isolierung der Antigene unterwarfen wir den Detergentien-Extrakt einer dreifachen Chromatografie. Im ersten Schritt wurde der Extrakt an Sephadex G-50 chromatografiert. Das Chromatogramm zeigte das haupts/ichliche Auftreten von niedermolekularen Verbindungen. Die erhaltenen Fraktionen wurden mit Hilfe des beschriebenen Hemmtestes gepr/ift. Dabei fanden sich bei 2 von 5 erhaltenen Fraktionen ein R/ickgang des Immobilisationstiters. Die aktiven Fraktionen trennten wir in einem 2. Chromatografieschritt an einer Ionenaustauschs~iule von DEAE-Cellulose. Die resultierenden Fraktionen pr/iften wir erneut mit Hilfe des Hemmtestes. Die gr613te Fraktion wurde weiter an CMCellulose gereinigt. Da die Immobilisation ein komplementabh~ingiger Prozel3 ist, pr/iften wir durch eine Komplementbindungsreaktion ob die Titersenkung durch Komplementinaktivierung hervorgerufen wird. Dazu inkubierten wir das Komplement mit einer aktiven Fraktion 30 Minuten. Dann wurde das Indikatorsystem zugesetzt. Es ergab sich jedoeh mit und ohne Zusatz von Antigen der gleiche H/imolysetiter. Da somit unser Antigen keinen antikomplement~iren Faktor darstellt, k6nnen wir annehmen, dal3 wir in den isolierten Peptidfraktionen echte Antigene gegen spermimmobilisierende Antik6rper isoliert haben. Aufgrund des geringen Molekulargewichtes der isolierten, noch weiter zu reinigenden Antigene erscheint es recht aussichtsreich, die Zusammensetzung und Sequenz der Verbindung zu analysieren und einer Totalsynthese zuzuf/ihren. Zusammenfassung: Durch Detergentienextraktion und anschliel3ender Chromatografie an Sephadex G-50, DEAE-Cellulose und CM-Cellulose konnten PeptidFraktionen gewonnen werden, die den Titer immobilisierender Antik/Srper in weiblichen Seren senkten. Durch Komplementbindungsreaktion wurde gezeigt, dab die Fraktionen keinen Einflul3 auf die Komplementaktivit/it aus/iben.
78. F. D. DaUenbach (Heidelberg): Worauf beruht die F~ihigkeit von Trophoblastzellen wie Krebszellen invasiv zu waehsen?
Manuskript nicht eingegangen. 79. B.J. Klose, F. Langer, D. Bauer (Erding): Die EPH-Gestose aus immunbiologiseher Sieht
Unter 873 Gestosef'~illen(= 19,1%) yon 4574 Geburten an der TU Mfinchen im Zeitraum von 3 Jahren fiel die grol3e Zahl von Atopikerinnen mit nachgewiesener famili/irer Disposition und signifikant-allergischer Symptomatik auf. Wir stellten uns deshalb folgende Fragen: 1. Sind Gestotikerinnen auch Atopikerinnen? Wenn ja, miissen Immunglobuline vom Typ E (Reagine) vorhanden sein.
H. Skrabeiund L. Mettler:Isolierungvon Sperma-Antigenen
Im syngenen System bei Sensibilisierung von C-57-black-6-M/iusen mit 57Bl/6Spermatozoen ergaben sich im Vergleich zu mit Erythrozytensuspensionen sensibilisierten M/iusen der Kontrollgruppe deutlich erh6hte Titer. Bei der in vitro-Fertifisation kam es im Vergleich zu den Kontrollkulturen mit einer 35%igen Befruchtungsrate zu einer signifikanten Einschr/inkung der in vitroKonjugation mit einer Befruchtungsrate von 15-20%. Dieser Versuch ist ein Beispiel der vielf/iltigen M6glichkeiten, die das System der in vitro-Fertilisation zur K1/irung der Mechanismen konjugationsst6render Einflul3faktoren bietet.
76. D. Masson, G. Steimel, D. Krebs, F. Lehmann (Hamburg): Zum Naehweis zellfixierter Sperma-Antlkiirper beim Mensehen
Manuskript nicht eingegangen.
77. H. Skrabei, L. Mettler* (Univ.-Frauenklinik Kiel): Isolierung von SpermaAntigenen und ihre Reaktion mit spermagglutinierenden und spermimmobilisierenden Seren Bei Frauen mit ungekl/irter Sterilit/it werden h/iufig im Serum AntikSrper gefunden, die Spermatozoen agglutinieren oder immobilisieren (Wilson, 1954; Isojima et al., 1968). Es ist von Interesse, die Sperma-Antigene zu isolieren, die die Bildung dieser AntikSrper hervorrufen. Es w/ire dann m6glich: 1. Durch Injektion dieser Antigene eine Toleranz gegen Spermatozoen zu erzeugen. 2. Mit Hilfe dieser Antigene ein Kontrazeptivum auf immunologischer Basis zu entwickeln. Da die verantwortlichen Antigene sich wahrscheinlich an der Oberfl/iche der Spermatozoen befinden, wandten wit zu ihrer Loslfsung Methoden an, bei welchen ausschliel31ich Proteine der Sperma-Membran freigesetzt werden und keine Cytoplasma-Proteine austreten (Skrabei u. Mettler, 1977, in Vorber.), wie durch diskelektrophoretische Trennung und Tetrazolumf'~irbung der LDH-Isoenzyme gezeigt werden konnte. Zur Gewinnung der Antigene befreiten wird die Spermatozoen sorgf/iltig vom Sperma-Plasma und behandelten sie anschliel3end mit einem Gemisch von 0,075% Triton X-100 und 0,075% Hyamin 2389 (Zaneveld et al., 1972). Dabei werden eine grol3e Anzahl von Proteinen freigesetzt. F[ihrt man mit diesen Proteinnen eine Immunelektrophorese gegen spermagglutinierende oder immobilisierende Seren aus, so sollte sich ein vorhandenes Antigen durch eine Pr/izipitation zu erkennen geben. Bei Anwendung yon Triton X-100 und Hyamin 2389 zur Freisetzung von Membran-Antigenen konnte eine solche Pr/izipitation nicht erhalten werden. Deshalb wurde zur Antigen-Detektion ein Hemmtest durchgeffihrt. Dabei wird das spermaantik6rperhaltige Serum vor der Zugabe zu den Spermatozoen eine Stunde bei 37 ~ C und 12 Std bei 4 ~ C mit Antigen inkubiert. *
Unterstfitzt durch die Deutsche ForschungsgemeinschaftSFB 111-A-5
B. J. Kloseet al.: Die EPH-Gestoseaus immunbiologischerSicht
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Die Antik6rper im Serum reagieren unter diesen Bedingungen mit dem dazugeh6rigen Antigen, wodurch der Antik6rpertiter im Serum gesenkt wird. Dieses wurde in dem anschliel3enden Mikrospermagglutinationstest (Friberg, 1974; Grad/u. Mettler, 1977) bzw. Mikrospermimmobilisationstest (Hustedt u. Hjort, 1974) festgestellt. Zur Isolierung der Antigene unterwarfen wir den Detergentien-Extrakt einer dreifachen Chromatografie. Im ersten Schritt wurde der Extrakt an Sephadex G-50 chromatografiert. Das Chromatogramm zeigte das haupts/ichliche Auftreten von niedermolekularen Verbindungen. Die erhaltenen Fraktionen wurden mit Hilfe des beschriebenen Hemmtestes gepr/ift. Dabei fanden sich bei 2 von 5 erhaltenen Fraktionen ein R/ickgang des Immobilisationstiters. Die aktiven Fraktionen trennten wir in einem 2. Chromatografieschritt an einer Ionenaustauschs~iule von DEAE-Cellulose. Die resultierenden Fraktionen pr/iften wir erneut mit Hilfe des Hemmtestes. Die gr613te Fraktion wurde weiter an CMCellulose gereinigt. Da die Immobilisation ein komplementabh~ingiger Prozel3 ist, pr/iften wir durch eine Komplementbindungsreaktion ob die Titersenkung durch Komplementinaktivierung hervorgerufen wird. Dazu inkubierten wir das Komplement mit einer aktiven Fraktion 30 Minuten. Dann wurde das Indikatorsystem zugesetzt. Es ergab sich jedoeh mit und ohne Zusatz von Antigen der gleiche H/imolysetiter. Da somit unser Antigen keinen antikomplement~iren Faktor darstellt, k6nnen wir annehmen, dal3 wir in den isolierten Peptidfraktionen echte Antigene gegen spermimmobilisierende Antik6rper isoliert haben. Aufgrund des geringen Molekulargewichtes der isolierten, noch weiter zu reinigenden Antigene erscheint es recht aussichtsreich, die Zusammensetzung und Sequenz der Verbindung zu analysieren und einer Totalsynthese zuzuf/ihren. Zusammenfassung: Durch Detergentienextraktion und anschliel3ender Chromatografie an Sephadex G-50, DEAE-Cellulose und CM-Cellulose konnten PeptidFraktionen gewonnen werden, die den Titer immobilisierender Antik/Srper in weiblichen Seren senkten. Durch Komplementbindungsreaktion wurde gezeigt, dab die Fraktionen keinen Einflul3 auf die Komplementaktivit/it aus/iben.
78. F. D. DaUenbach (Heidelberg): Worauf beruht die F~ihigkeit von Trophoblastzellen wie Krebszellen invasiv zu waehsen?
Manuskript nicht eingegangen. 79. B.J. Klose, F. Langer, D. Bauer (Erding): Die EPH-Gestose aus immunbiologiseher Sieht
Unter 873 Gestosef'~illen(= 19,1%) yon 4574 Geburten an der TU Mfinchen im Zeitraum von 3 Jahren fiel die grol3e Zahl von Atopikerinnen mit nachgewiesener famili/irer Disposition und signifikant-allergischer Symptomatik auf. Wir stellten uns deshalb folgende Fragen: 1. Sind Gestotikerinnen auch Atopikerinnen? Wenn ja, miissen Immunglobuline vom Typ E (Reagine) vorhanden sein.
