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Arch. Gyniik.223, 179-186 (1977)
Gyn ikologie 9 J. F. Bergmann-Verlag 1977
lsolierung und Charakterisierung des Plazenta-Proteins PP5 H. Bohn und W. Winckler Behringwerke AG, Postfach 1140, D-3550 Marburg/Lahn
Isolation and Characterization of the Placental Protein PP5 Summary. The isolation and characterization of placental protein PP5 is described. The purification was achieved by use of immunoadsorbents. From the tissue of one human term placenta an average amount of 15 mg PP5 can be extracted. PP5 apparently is specific for the placenta; it could not be detected in extracts from other human tissues. In sera from pregnant women PP5 is not present or only in trace amounts (< 0.1 mg%). In the ultracentrifuge PP5 was found to have a sedimentation coefficient of 2.8 S and a molecular weight of 36,600 daltons. Electrophoretically the protein migrates as a fast/3:globulin. The isoelectric point was determined to be 4.6, PP5 is a glycoprotein and contains 19.8% carbohydrates (hexoses 10.0%, hexosamine 4.4%, fucose 0.4%, sialic acid 5.0%). The amino acid composition of the protein is reported, too. PP5 was found to inhibit the activity of trypsin and plasmin; the biological role of this protein therefore may be the inhibition of proteases. Key words: Placenta specific protein PP5 - Isolation - Physical and chemical characterization - Protease inhibitor.
Zusammenfassung. Beschrieben wird die Isolierung und Charakterisierung des Plazenta-Proteins PPs. Die Isolierung und Hochreinigung wurde mit Hilfe von Immunadsorbentien durchgef/ihrt. Aus dem Gewebe einer ausgewachsenen menschlichen Plazenta (500 g) lassen sich im Durchschnitt etwa 15 mg dieses Proteins extrahieren. PP5 ist offensichtlich spezifisch f/Jr die Plazenta; im Extrakt von anderen menschlichen Organen konnte es nicht nachgewiesen werden. Im Serum schwangerer Frauen kommt PP5 nicht, oder h6chstens in Spuren (< 0,1 mg%) vor. In der Ultrazentrifuge wurde ffir PP~ ein Sedimentationskoeffizient von 2,8 S und ein Molekulargewicht yon 36 600 ermittelt. Die elektrophoretische Wanderung yon PP5 entspricht der eines schnellen ~l-Globulins. Der isoelektrische
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H. Bohn und W. Winekler Punkt liegt bei pH 4,6. PP5 ist ein Glykoprotein und hat einen Kohlenhydratgehalt von 19,8% (Hexosen 10,0%, Hexosamin 4,4%, Fucose 0,4%, Neuramins/iure 5,0%). Die Aminos~iurenzusammensetzung des Proteins wird ebenfalls mitgeteilt. PP5 inhibiert die Wirkung von Trypsin und Plasmin; seine biologische Funktion besteht m6glicherweise in der Hemmung von Proteasen. Sehliisselwiirter: Placenta-spezifisches Protein PP~ - Isolierung - Physikalische und ehemische Charakterisierung - Proteaseinhibitor.
Einleitung Der w/iBrige Extrakt aus mensehliehen Plazenten enth~ilt eine Reihe von Proteinen, die aus dem Gewebe der Plazenta stammen. Uber den immunologischen Nachweis yon 6 solcher Proteinen hat Bohn 1972 berichtet [1]. Eines dieser Plazenta-Proteine (PP~) erwies sich als spezifisch ffir die Plazenta; dieses Protein konnte nur im Extrakt von Plazenten, nicht abet in Extrakten von anderen fetalen oder adulten Organen des Menschen nachgewiesen werden. Eine vorffiufige Charakterisierung ergab, daB PP5 ein Molekulargewicht von etwa 50 000 und die elektrophoretische Beweglichkeit eines }a-Globulins hat [1], Weitere Untersuchungen zeigten, dab PP5 ein Neuramins/iurehaltiges Glykoprotein ist und auch in Plazenten von Affen vorkommt [2]. fJber eine Isolierung des Proteins mit Hilfe yon Immunadsorbentien und fiber eine vorl/iufige chemische Analyse wurde bereits kurz berichtet [3]. Inzwischen ist dieses plazentaspezifische Antigen weiter gereinigt und besser charakterisiert worden. Vorliegende Arbeit faBt die Ergebnisse dieser Untersuchungen zusammen. Zus/itzlich wird gezeigt, dab das Plazenta-Protein PP5 die proteolytische Wirkung yon Trypsin und Plasmin hemmt.
Material und Methoden
Material Ausgangsmaterial zur Isolierung von PP5 waren menschlichePlazenten, wie sie bei normalen Geburten anfaUen. Die Plazenten wurden bei -20 ~ C eingefroren und bis zur Verarbeitung tiefgek/ihlt anfbewahrt. Rivanol| (2-~,thoxy-6,9-Diaminoakridinlaktat)wurde vonder Hoechst AG bezogen.
Herstellung des PPs-Immunadsorbens 500 rrd Anti-PPs-Serum vom Kaninchen wurden gegen 0,03 M Phosphatpuffer(pH 7,0) dialysiert und zur Abtrennung der Immunglobulinean DEAE-Zellulosechromatographiert. Die Immunglobulinfraktion wurde dann mit Sepharose4B, die mit Bromcyan aktiviertworden war, umgesetztund so kovalent an diesen Tr~iger gebunden. Registriertes Warenzeichen der Hoechst AG
Isolierung und Charakterisierung des Plazenta-Proteins PP5
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Isolierung yon PP5 1. F r a k t i o n i e r u n g des E x t r a k t s mit R i v a n o l u n d A m m o n i u m s u l f a t Die fiefgefrorenen Plazenten wurden im Sehneidmischer zerkleinert und bei 10~ C mit 0,5%iger NaC1Lfsung extrahiert. Der Extrakt ist dann nach einem bereits beschriebenen Verfahren mit Rivanol und Ammoniumsulfat fraktiodiert worden [3, 4]. PP5 ging dabei zur Hauptsaehe in die Plazentafraktion V. Die feuehte Paste dieser Fraktion (1 kg) wurde in Wasser gel6st und gegen 0,01 M Tris-HC1-Puffer (pH 8,0) dialysiert (Fraktion 1).
2. A d s o r p t i o n an D E A E - Z e l l u l o s e Aus Fraktion 1 wurde PP5 und andere Proteine im Bateh-Verfahren an DEAE-Zellulose adsorbiert und dann mit einem 0,02 M Tris-HC1-Puffer (pH 6,5), der 8,6 g/1 NaC1 enthielt, wieder eluiert. Die Proteine im Eluat wurden dutch Zugabe von festem Ammoniumsulfat (30% w/v) ausgef'~iltt (Fraktion 2).
3. Gelfiltration an S e p h a d e x G - 1 5 0 Die Weiterreinigung von PP5 erfolgte durch Gelfiltration an Sephadex G-150. Der Nachweis des Proteins im Eluat wurde immunologisch mit einem spezifisehen Antiserum im Geldiffusionstest nach Ouchterlony durchgeffihrt. Die PPs-haltigen Fraktionen wurden vereinigt und mit 30% w/v Ammoniumsulfat pr/izipitiert. Der Niederschlag wurde in Wasser suspendiert und gegen einen 0,1 M Tris-HC1Puffer (pH 8,0), der 1 Mol/1 Natriumchlorid enthielt, dialysiert. Ergebnis: 200 ml einer L6sung mit ca. 30 mg PP5 (Fraktion 3).
4. D u r c h f f i h r u n g der I m m u n a d s o r p t i o n 50 ml der Fraktion 3 wurden auf eine mit PPs-Immunadsorbens gef/illte Sgule (4,5 x 26 cm) aufgebracht. Zum Sp/ilen der S/iule wurde 0,1 M Tris-HC1-Puffer (pH 8,0), der 1 Mol/l NaC1 enthielt, verwendet. Die Elution der an Adsorbens gebundenen Proteine erfolgte mit 3 M Kaliumrhodanidl6sung. Das proteinhaltige Eluat wurde gegen Tris-Puffer dialysiert und auf einem Ultrafilter auf etwa 10 ml eingeengt (Fraktion 4).
5. H o c h r e i n i g u n g In Fraktion 4 waren neben PP5 als Verunreinigung noch Immunglobuline, die schwangerschaftsspezifischen Proteine HPL (humanes Plazenta-Laktogen) und SP1, sowie ein noch nicht n/iher charakterisiertes Gewebsprotein der Plazenta enthalten. Diese Beimengungen wurden durch Immunadsorption, d. h. durch tr/igergebundene Antik6rper gegen diese Verunreinigungen entfernt. Die Adsorption wurde wieder in einer S/iule unter Verwendung des 0,1 M Tris-HC1-Puffers, der 1 Mol/1 NaC1 enthielt, durchgeffihrt. Die PPs-haltige Fraktion im Durehlauf der S/iule war frei von Verunreinigungen. Sie wurde gegen Wasser dialysiert und dann lyophilisiert (Fraktion 5).
Analytische Methoden Bei der physikalischen und chemischen Charakterisierung von PP5 wurden die gleichen Methoden verwendet, wie bei der Untersuchung des Plazenta-Proteins PP1 [5]. Zur Bestimrnung des Sedimenta-
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H. Bohn und W. Winckler
tionskoeftizienten und des Molekulargewichts in der Ultrazentrifuge wurde die Substanz in 0,05 M Phosphatpuffer (pH 6,8), der 0,2 Mol/1 NaC1 enthielt, gel6st. Der Sedimentationskoeffizient ist auf die Basis von Wasser bei 20~ C umgerechnet worden. Zur Ermittlung des Molekulargewichts wurde die Sedimentationsgleichgewichtsmethode herangezogen. Die Bestimmung wurde bei 10 000 UpM vorgenommen. Die Registrierung erfolgte mit UV-Optik bei 280 nm unter Einsatz des photo-elektrischen Scanners. Zur Bestimmung des isoelektrischen Punktes wurde die 440 ml S/iule der Firma LKB, Stockholm, eingesetzt. Das dabei verwendete Ampholingemisch hatte einen pH-Bereich yon 3,5--5,0. Zur Messung des Extinktionskoeffizienten wurde die Substanz 0,1% in Wasser gelSst.
Immunologische Methoden Ein spezifisches Antiserum gegen PP~ wurde dutch Immunisieren yon Kaninchen mit dem gereinigten Antigen gewonnen. Die Immunoelektrophorese wurde in Agar bei pH 8,6 durchgefiihrt. Die quantitative Bestimmung yon PP5 erfolgte mit einer modifizierten Laurell-Technik.
Ergebnisse und Diskussion
1. lsolierung Die Fraktionierungsschritte, die zur Isolierung von PP~ aus dem E x t r a k t menschlicher Plazenten ffihrten, sind in Tabelle 1 zusammengefat3t. Die Tabelle enth~ilt auch A n g a b e n fiber Ausbeute und Reinheit des Proteins in den einzelnen Fraktionen. Die ersten Schritte zur Isolierung yon PP5 waren die gleichen wie bei dem friiher beschriebenen Verfahren zur Gewinnung des Plazenta-Proteins PP7 [6]; d . h . PP5 zeigt gegen/iber Rivanol und A m m o n i u m s u l f a t das gleiche F~illungsverhalten wie PP7 und wird auch wie dieses an D E A E - Z e l l u l o s e adsorbiert. Bei der Gelfiltration an Sephadex G-150 erscheint PP5 in der gleichen F r a k t i o n wie PPT. Der n/ichste Schritt zur Reinigung von PP5 war die Anreicherung des Proteins durch Imrnunadsorption. D a s so gewonnene P r o d u k t enthielt als Verunreinigungen noch Immunglobuline, humanes Plazentalaktogen (HPL), schwangerschafts-spezifisches/31-Glykoprotein (SP1) und ein noch nicht n/iher charakterisiertes Gewebsprotein der Plazenta. Der letzte Schritt zur Reinigung yon PP5 bestand in der Entfer-
Tabelle 1 Fraktionen
Schritte
Eiweif3 g
PP5 mg
Reinheit %
1
Nach Fraktionierung mit Rivanol und Ammoniumsulfat
300
70
2
Nach Adsorption an DEAE-Zellulose
96
50
0,05
3
Nach Gelfiltration an Sephadex G-150
3,2
30
0,9
4
Nach Anreicherung durch Immunadsorption
0,04
20
50
5
Nach Reinigung mit Immunadsorbentien
0,012
12
> 99
0,02
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nung dieser Verunreinigungen mit Hilfe von Immunadsorbentien, d. h. mit tr~igergebundenen Antik6rpern gegen diese Antigene. Abbildung i zeigt die Wanderung von hochgereinigtem PP5 im normalen Polyacrylamidgel; das Protein spaltet dabei in mehrere Zonen auf. Eine Abspaltung der Neuraminsiiure mit Neuraminidase (ND) verringert die elektrophoretische Beweglichkeit des Proteins im Gel, beseitigt aber nicht dessen Heterogenit~it.
2. Physikalische und chemische Charakterisierung Das hochgereinigte Protein PP5 wurde physikalisch und chemisch n/iher charakterisiert. Die physikalischen Eigenschaften des Proteins sind in Tabelle 2, die Ergebnisse der chemischen Analysen in den Tabellen 3 und 4 zusammengefal3t.
Abb. 1. ElektrophoretischeAuftrennung im normalen Polyacrylamidgelbei pH 8,6. + ND = Protein mit Neuraminidase behandelt
Abb. 2. Immunelektrophoresein Agar bei pH 8,6. PP5 mit und ohne Behandlung mit Neuraminidase (ND). Auftrennung der Serumproteinezum Vergleich (HS = Human Serum)
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H. Bohn und W. Winckler
Der Sedimentationskoeffizient und das Molekulargewicht sind in der Ultrazentrifuge bestimmt worden. Zur weiteren physikalischen Charakterisierung wurde der isoelektrische Punkt und der Extinktionskoeffizient ermittelt. Die elektrophoretische Beweglichkeit wurde im Agargel und auf Azetatfolien im Vergleich zu den Proteinen des Serums untersucht. PP5 erwies sich dabei als schnelles/31-Globulin; nach Abspaltung der Neuramins~iure mit Neuraminidasewandert das Protein im Bereich der /~2-Globuline (vgl. Abb. 2). Aufgrund der chemischen Zusammensetzung ist PP5 ein Glykoprotein, das 5% Neuraminsiiure und insgesamt 19,8% Kohlenhydrate enth/ilt. Die am hiiufigsten vertretenen Aminos/iuren in diesem Protein sind Asparagins/iure, Glutamins/iure, Leucin und Alanin; auch der Cysteingehalt von PP5 ist relativ hoch.
Tabelle 2. Physikalisehe Eigenschaften von PP5 Sedimentationskoeffizient S~0,w Molekulargewicht Isoelektrischer Punkt Extinktionskoeffizient El~m (280 nm) Elektrophoretische Beweglichkeit
2,8 S 36 600 4,6 10,6 /31
Tabelle 3. Kohlenhydratzusammensetzungvon PP5 Gewichtsprozente Hexosen Hexosamina Fueose Neuramins~iurea Summe
10,0 4,4 0,4 5,0 19,8
a als N-acetyl-Derivate
Tabelle 4. Aminos/iurenzusammensetzungvon PP~ (Reste pro 100 Reste) Lysin Histidin Arginin Asparagins~iure Threonin Serin Glutamins~iure Prolin Glycin
5,10 1,06 6,02 12,36 5,40 5,74 9,66 4,73 7,13
Alanin Cystin/2 Valin Methionin Isoleucin Leucin Tyrosin Phenylalanin Tryptophan
7,55 7,12 4,40 0,91 2,60 7,75 4,89 5,61 1,88
Isolierung und Charakterisierung des Plazenta-Proteins PP5
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3. Nachweis und Bestimmung Zum Nachweis und zur Bestimmung yon PP5 wurden immunologische Methoden verwendet. In einer fr/iheren Untersuchung war zum Nachweis yon PP5 in Organextrakten der Geldiffusionstest nach Ouchterlony eingesetzt worden. Dabei konnte PP~ nur im Extrakt aus Plazenten, nicht abet in Extrakten aus anderen fetalen und adulten Organen des Menschen nachgewiesen werden [1, 3]. PP5 erwies sich demnach als spezifisch ffir die Plazenta. Mit Hilfe einer modifizierten Laurell-Technik wurde nun der Gehalt an PP5 in frfihen (8-14 Wochen alten) und ausgewachsenen Plazenten quantitativ immunologisch bestimmt. Die Plazenten wurden extrahiert und PP5 aus den entsprechenden Extrakten durch Immunadsorption entfernt. In den vom Immunadsorbens eluierten Fraktionen ist die Konzentration von PP5 dann ermittelt worden. Die Untersuchung ergab, daf3 sich aus einer ausgewachsenen menschlichen Plazenta (600 g) im Durchschnitt 15 mg PP5 extrahieren lassen. Die frfihen Plazenten enthielten auf Gewicht bezogen etwa dieselbe Menge PPs, d. h. pro 100 g Feuchtgewicht konnten etwa 3 mg PP5 extrahiert werden. Ein mit PP5 immunologisch identisches Protein kommt in Plazenten von Affen vor [2]. Mit der Immunfluoreszenztechnik wurde PP5 in der Plazenta vom Menschen sowohl im Zottenepithel als auch im Zottenstroma lokalisiert. Bei Affenplazenten ist spezifische Fluoreszenz haupts~ichlich im Cytoplasma des Syncytiotrophoblasten nachgewiesen worden [2, 8]. In Normalseren kommt PP5 nicht vor. Auch in Seren yon schwangeren Frauen aus dem 9. Monat der Gravidit~it und in Seren yon Patienten mit malignen Erkrankungen konnte mit der modifizierten Laurell-Technik (Nachweisgrenze 0,1 mg PPJ100 ml) kein PP~ nachgewiesen werden [9]. PP5 scheint aber doch gelegentlich in Spuren (< 0,1 rag/100 ml) in Schwangerenseren vorzukommen: Bei 2 yon 4 Schwangerenseren, die an Sephadex G-150 aufgetrennt und deren Fraktionen auf dem Ultrafilter stark eingeengt wurden, konnte in der niedermolekularen Fraktion, die mit und nach dem Albumin yon der Siiule kommt, mit Hilfe der modifizierten Laurell-Technik eindeutig PP5 nachgewiesen werden. Zu einer genauen Untersuchung fiber das Vorkommen des plazentaspezifischen Proteins PP5 in Seren schwangerer Frauen, bzw. in Seren yon Patienten mit trophoblastischen Tumoren mfif3ten empfindlichere Methoden (Radioimmunoassay, Enzymimmunoassay) herangezogen werden.
4. Testung auf biologische Funktionen Bei der Untersuchung auf biologische Aktivit~iten wurde gefunden, dab PP~ auf Fibrin-Agar-Elektrophoreseplatten bzw. auf Fibrinogen-Agaroseplatten die proteolytische Wirkung yon Trypsin und Plasmin hemmt. Abbildung 3 zeigt den Nachweis der Hemmung von Trypsin nach elektrophoretischer Auftrennung des Proteins auf Fibrin-Agar-Elektrophoreseplatten. Aus Abbildung 3 ist auch ersichtlich, dab nach Abspaltung der Neuraminsfiure mit Neuraminidase die Hemmwirkung des Proteins erhalten bleibt. Die biologische Funktion yon PP~ besteht m6glicherweise in der Hemmung yon Proteasen.
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H. Bohn und W. Winckler
Abb. 3. Nachweis der Hemmung von Trypsin nach elektrophoretischer Auftrennung der Proteine auf Fibrin-Agar-Platten. + ND = Protein rnit Neuraminidase behandelt i
Danksagung. Die frfihen menschlichen Plazenten wurden uns von Professor W. R. Jones (Bedford Park), zur Verffigung gestellt. Die Untersuchungen in der Ultrazentrifuge verdanken wir Herrn Dr. T. Kranz, die Bestimmung der Aminos~iuren Herrn Dr. H, Zilg und Frau B. Hentze, die Analyse der Kohlenhydrate Herrn J. Schfning. Bei den immunologischen Untersuchungen wurden wir von Frl. R. Walter und Herrn P. Cieplik, bei der Bestimmung des isoelektrischen Punktes von Herrn H. Spenler unterstfitzt. Die Untersuchungen auf Fibrinogen-Agaroseplatten hat Dr. H. Karges durchgef/ihrt.
Literatur 1. Bohn, H.: Nachweis und Charakterisierung von 15slichen Antigenen in der menschlichen Plazenta. Arch. Gyn/ik. 212, 165 (1972) 2. Bohn, H., Sedlacek, H.: Eine vergleichende Untersuchung yon plazentaspezifischen Proteinen bei Mensch und subhumanen Primaten. Arch. Gyn~ik. 220, 105 (1975) 3. Bohn, H.: Isolation and characterization of placental specific proteins SP1 and PPs. Protides of the Biological Fluids, Proceedings of the 24th Colloquium, Briigge 1976, edited by H. Peeters 4. Bohn, H.: Nachweis und Charakterisierung yon Schwangerschaftsproteinen in der menschlichen Plazenta, sowie ihre quantitative immunologische Bestimmung im Serum schwangerer Frauen. Arch. Gyn/ik. 210, 440 (1971) 5. Bohn, H., Kraus, W.: Isolierung und Charakterisierung des Plazenta-Proteins PPr Arch. Gyn/ik. 221, 73 (1976) 6. Bohn, H., Winckler, W.: Isolierung und Charakterisierung eines neuen Gewebsproteins (PPT) aus menschlichen Plazenten. Arch. Gyn/ik. 222, 5 (1977) 7. Bohn, H.: Isolierung des Plazenta-Proteins PP2 und seine Identifizierung als Ferritin. Arch. Gyn~ik. 215, 263 (1973) 8. Sedlacek, H. H., Rehkopf, R., Bohn, H.: Immunofluorescence histological localization of human pregnancy and placenta proteins in the placenta of man and monkeys (cynomolgus). Behring Institute Mitt. 59, 81 (1976) 9. Bohn, H.: Die Antigene der menschlichen Plazenta. Klin. Wschr. 53, 547 (1975)
Eingegangen am 30. August 1977
Arch. Gyniik.223, 179-186 (1977)
Gyn ikologie 9 J. F. Bergmann-Verlag 1977
lsolierung und Charakterisierung des Plazenta-Proteins PP5 H. Bohn und W. Winckler Behringwerke AG, Postfach 1140, D-3550 Marburg/Lahn
Isolation and Characterization of the Placental Protein PP5 Summary. The isolation and characterization of placental protein PP5 is described. The purification was achieved by use of immunoadsorbents. From the tissue of one human term placenta an average amount of 15 mg PP5 can be extracted. PP5 apparently is specific for the placenta; it could not be detected in extracts from other human tissues. In sera from pregnant women PP5 is not present or only in trace amounts (< 0.1 mg%). In the ultracentrifuge PP5 was found to have a sedimentation coefficient of 2.8 S and a molecular weight of 36,600 daltons. Electrophoretically the protein migrates as a fast/3:globulin. The isoelectric point was determined to be 4.6, PP5 is a glycoprotein and contains 19.8% carbohydrates (hexoses 10.0%, hexosamine 4.4%, fucose 0.4%, sialic acid 5.0%). The amino acid composition of the protein is reported, too. PP5 was found to inhibit the activity of trypsin and plasmin; the biological role of this protein therefore may be the inhibition of proteases. Key words: Placenta specific protein PP5 - Isolation - Physical and chemical characterization - Protease inhibitor.
Zusammenfassung. Beschrieben wird die Isolierung und Charakterisierung des Plazenta-Proteins PPs. Die Isolierung und Hochreinigung wurde mit Hilfe von Immunadsorbentien durchgef/ihrt. Aus dem Gewebe einer ausgewachsenen menschlichen Plazenta (500 g) lassen sich im Durchschnitt etwa 15 mg dieses Proteins extrahieren. PP5 ist offensichtlich spezifisch f/Jr die Plazenta; im Extrakt von anderen menschlichen Organen konnte es nicht nachgewiesen werden. Im Serum schwangerer Frauen kommt PP5 nicht, oder h6chstens in Spuren (< 0,1 mg%) vor. In der Ultrazentrifuge wurde ffir PP~ ein Sedimentationskoeffizient von 2,8 S und ein Molekulargewicht yon 36 600 ermittelt. Die elektrophoretische Wanderung yon PP5 entspricht der eines schnellen ~l-Globulins. Der isoelektrische
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Einleitung Der w/iBrige Extrakt aus mensehliehen Plazenten enth~ilt eine Reihe von Proteinen, die aus dem Gewebe der Plazenta stammen. Uber den immunologischen Nachweis yon 6 solcher Proteinen hat Bohn 1972 berichtet [1]. Eines dieser Plazenta-Proteine (PP~) erwies sich als spezifisch ffir die Plazenta; dieses Protein konnte nur im Extrakt von Plazenten, nicht abet in Extrakten von anderen fetalen oder adulten Organen des Menschen nachgewiesen werden. Eine vorffiufige Charakterisierung ergab, daB PP5 ein Molekulargewicht von etwa 50 000 und die elektrophoretische Beweglichkeit eines }a-Globulins hat [1], Weitere Untersuchungen zeigten, dab PP5 ein Neuramins/iurehaltiges Glykoprotein ist und auch in Plazenten von Affen vorkommt [2]. fJber eine Isolierung des Proteins mit Hilfe yon Immunadsorbentien und fiber eine vorl/iufige chemische Analyse wurde bereits kurz berichtet [3]. Inzwischen ist dieses plazentaspezifische Antigen weiter gereinigt und besser charakterisiert worden. Vorliegende Arbeit faBt die Ergebnisse dieser Untersuchungen zusammen. Zus/itzlich wird gezeigt, dab das Plazenta-Protein PP5 die proteolytische Wirkung yon Trypsin und Plasmin hemmt.
Material und Methoden
Material Ausgangsmaterial zur Isolierung von PP5 waren menschlichePlazenten, wie sie bei normalen Geburten anfaUen. Die Plazenten wurden bei -20 ~ C eingefroren und bis zur Verarbeitung tiefgek/ihlt anfbewahrt. Rivanol| (2-~,thoxy-6,9-Diaminoakridinlaktat)wurde vonder Hoechst AG bezogen.
Herstellung des PPs-Immunadsorbens 500 rrd Anti-PPs-Serum vom Kaninchen wurden gegen 0,03 M Phosphatpuffer(pH 7,0) dialysiert und zur Abtrennung der Immunglobulinean DEAE-Zellulosechromatographiert. Die Immunglobulinfraktion wurde dann mit Sepharose4B, die mit Bromcyan aktiviertworden war, umgesetztund so kovalent an diesen Tr~iger gebunden. Registriertes Warenzeichen der Hoechst AG
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Isolierung yon PP5 1. F r a k t i o n i e r u n g des E x t r a k t s mit R i v a n o l u n d A m m o n i u m s u l f a t Die fiefgefrorenen Plazenten wurden im Sehneidmischer zerkleinert und bei 10~ C mit 0,5%iger NaC1Lfsung extrahiert. Der Extrakt ist dann nach einem bereits beschriebenen Verfahren mit Rivanol und Ammoniumsulfat fraktiodiert worden [3, 4]. PP5 ging dabei zur Hauptsaehe in die Plazentafraktion V. Die feuehte Paste dieser Fraktion (1 kg) wurde in Wasser gel6st und gegen 0,01 M Tris-HC1-Puffer (pH 8,0) dialysiert (Fraktion 1).
2. A d s o r p t i o n an D E A E - Z e l l u l o s e Aus Fraktion 1 wurde PP5 und andere Proteine im Bateh-Verfahren an DEAE-Zellulose adsorbiert und dann mit einem 0,02 M Tris-HC1-Puffer (pH 6,5), der 8,6 g/1 NaC1 enthielt, wieder eluiert. Die Proteine im Eluat wurden dutch Zugabe von festem Ammoniumsulfat (30% w/v) ausgef'~iltt (Fraktion 2).
3. Gelfiltration an S e p h a d e x G - 1 5 0 Die Weiterreinigung von PP5 erfolgte durch Gelfiltration an Sephadex G-150. Der Nachweis des Proteins im Eluat wurde immunologisch mit einem spezifisehen Antiserum im Geldiffusionstest nach Ouchterlony durchgeffihrt. Die PPs-haltigen Fraktionen wurden vereinigt und mit 30% w/v Ammoniumsulfat pr/izipitiert. Der Niederschlag wurde in Wasser suspendiert und gegen einen 0,1 M Tris-HC1Puffer (pH 8,0), der 1 Mol/1 Natriumchlorid enthielt, dialysiert. Ergebnis: 200 ml einer L6sung mit ca. 30 mg PP5 (Fraktion 3).
4. D u r c h f f i h r u n g der I m m u n a d s o r p t i o n 50 ml der Fraktion 3 wurden auf eine mit PPs-Immunadsorbens gef/illte Sgule (4,5 x 26 cm) aufgebracht. Zum Sp/ilen der S/iule wurde 0,1 M Tris-HC1-Puffer (pH 8,0), der 1 Mol/l NaC1 enthielt, verwendet. Die Elution der an Adsorbens gebundenen Proteine erfolgte mit 3 M Kaliumrhodanidl6sung. Das proteinhaltige Eluat wurde gegen Tris-Puffer dialysiert und auf einem Ultrafilter auf etwa 10 ml eingeengt (Fraktion 4).
5. H o c h r e i n i g u n g In Fraktion 4 waren neben PP5 als Verunreinigung noch Immunglobuline, die schwangerschaftsspezifischen Proteine HPL (humanes Plazenta-Laktogen) und SP1, sowie ein noch nicht n/iher charakterisiertes Gewebsprotein der Plazenta enthalten. Diese Beimengungen wurden durch Immunadsorption, d. h. durch tr/igergebundene Antik6rper gegen diese Verunreinigungen entfernt. Die Adsorption wurde wieder in einer S/iule unter Verwendung des 0,1 M Tris-HC1-Puffers, der 1 Mol/1 NaC1 enthielt, durchgeffihrt. Die PPs-haltige Fraktion im Durehlauf der S/iule war frei von Verunreinigungen. Sie wurde gegen Wasser dialysiert und dann lyophilisiert (Fraktion 5).
Analytische Methoden Bei der physikalischen und chemischen Charakterisierung von PP5 wurden die gleichen Methoden verwendet, wie bei der Untersuchung des Plazenta-Proteins PP1 [5]. Zur Bestimrnung des Sedimenta-
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tionskoeftizienten und des Molekulargewichts in der Ultrazentrifuge wurde die Substanz in 0,05 M Phosphatpuffer (pH 6,8), der 0,2 Mol/1 NaC1 enthielt, gel6st. Der Sedimentationskoeffizient ist auf die Basis von Wasser bei 20~ C umgerechnet worden. Zur Ermittlung des Molekulargewichts wurde die Sedimentationsgleichgewichtsmethode herangezogen. Die Bestimmung wurde bei 10 000 UpM vorgenommen. Die Registrierung erfolgte mit UV-Optik bei 280 nm unter Einsatz des photo-elektrischen Scanners. Zur Bestimmung des isoelektrischen Punktes wurde die 440 ml S/iule der Firma LKB, Stockholm, eingesetzt. Das dabei verwendete Ampholingemisch hatte einen pH-Bereich yon 3,5--5,0. Zur Messung des Extinktionskoeffizienten wurde die Substanz 0,1% in Wasser gelSst.
Immunologische Methoden Ein spezifisches Antiserum gegen PP~ wurde dutch Immunisieren yon Kaninchen mit dem gereinigten Antigen gewonnen. Die Immunoelektrophorese wurde in Agar bei pH 8,6 durchgefiihrt. Die quantitative Bestimmung yon PP5 erfolgte mit einer modifizierten Laurell-Technik.
Ergebnisse und Diskussion
1. lsolierung Die Fraktionierungsschritte, die zur Isolierung von PP~ aus dem E x t r a k t menschlicher Plazenten ffihrten, sind in Tabelle 1 zusammengefat3t. Die Tabelle enth~ilt auch A n g a b e n fiber Ausbeute und Reinheit des Proteins in den einzelnen Fraktionen. Die ersten Schritte zur Isolierung yon PP5 waren die gleichen wie bei dem friiher beschriebenen Verfahren zur Gewinnung des Plazenta-Proteins PP7 [6]; d . h . PP5 zeigt gegen/iber Rivanol und A m m o n i u m s u l f a t das gleiche F~illungsverhalten wie PP7 und wird auch wie dieses an D E A E - Z e l l u l o s e adsorbiert. Bei der Gelfiltration an Sephadex G-150 erscheint PP5 in der gleichen F r a k t i o n wie PPT. Der n/ichste Schritt zur Reinigung von PP5 war die Anreicherung des Proteins durch Imrnunadsorption. D a s so gewonnene P r o d u k t enthielt als Verunreinigungen noch Immunglobuline, humanes Plazentalaktogen (HPL), schwangerschafts-spezifisches/31-Glykoprotein (SP1) und ein noch nicht n/iher charakterisiertes Gewebsprotein der Plazenta. Der letzte Schritt zur Reinigung yon PP5 bestand in der Entfer-
Tabelle 1 Fraktionen
Schritte
Eiweif3 g
PP5 mg
Reinheit %
1
Nach Fraktionierung mit Rivanol und Ammoniumsulfat
300
70
2
Nach Adsorption an DEAE-Zellulose
96
50
0,05
3
Nach Gelfiltration an Sephadex G-150
3,2
30
0,9
4
Nach Anreicherung durch Immunadsorption
0,04
20
50
5
Nach Reinigung mit Immunadsorbentien
0,012
12
> 99
0,02
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nung dieser Verunreinigungen mit Hilfe von Immunadsorbentien, d. h. mit tr~igergebundenen Antik6rpern gegen diese Antigene. Abbildung i zeigt die Wanderung von hochgereinigtem PP5 im normalen Polyacrylamidgel; das Protein spaltet dabei in mehrere Zonen auf. Eine Abspaltung der Neuraminsiiure mit Neuraminidase (ND) verringert die elektrophoretische Beweglichkeit des Proteins im Gel, beseitigt aber nicht dessen Heterogenit~it.
2. Physikalische und chemische Charakterisierung Das hochgereinigte Protein PP5 wurde physikalisch und chemisch n/iher charakterisiert. Die physikalischen Eigenschaften des Proteins sind in Tabelle 2, die Ergebnisse der chemischen Analysen in den Tabellen 3 und 4 zusammengefal3t.
Abb. 1. ElektrophoretischeAuftrennung im normalen Polyacrylamidgelbei pH 8,6. + ND = Protein mit Neuraminidase behandelt
Abb. 2. Immunelektrophoresein Agar bei pH 8,6. PP5 mit und ohne Behandlung mit Neuraminidase (ND). Auftrennung der Serumproteinezum Vergleich (HS = Human Serum)
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Der Sedimentationskoeffizient und das Molekulargewicht sind in der Ultrazentrifuge bestimmt worden. Zur weiteren physikalischen Charakterisierung wurde der isoelektrische Punkt und der Extinktionskoeffizient ermittelt. Die elektrophoretische Beweglichkeit wurde im Agargel und auf Azetatfolien im Vergleich zu den Proteinen des Serums untersucht. PP5 erwies sich dabei als schnelles/31-Globulin; nach Abspaltung der Neuramins~iure mit Neuraminidasewandert das Protein im Bereich der /~2-Globuline (vgl. Abb. 2). Aufgrund der chemischen Zusammensetzung ist PP5 ein Glykoprotein, das 5% Neuraminsiiure und insgesamt 19,8% Kohlenhydrate enth/ilt. Die am hiiufigsten vertretenen Aminos/iuren in diesem Protein sind Asparagins/iure, Glutamins/iure, Leucin und Alanin; auch der Cysteingehalt von PP5 ist relativ hoch.
Tabelle 2. Physikalisehe Eigenschaften von PP5 Sedimentationskoeffizient S~0,w Molekulargewicht Isoelektrischer Punkt Extinktionskoeffizient El~m (280 nm) Elektrophoretische Beweglichkeit
2,8 S 36 600 4,6 10,6 /31
Tabelle 3. Kohlenhydratzusammensetzungvon PP5 Gewichtsprozente Hexosen Hexosamina Fueose Neuramins~iurea Summe
10,0 4,4 0,4 5,0 19,8
a als N-acetyl-Derivate
Tabelle 4. Aminos/iurenzusammensetzungvon PP~ (Reste pro 100 Reste) Lysin Histidin Arginin Asparagins~iure Threonin Serin Glutamins~iure Prolin Glycin
5,10 1,06 6,02 12,36 5,40 5,74 9,66 4,73 7,13
Alanin Cystin/2 Valin Methionin Isoleucin Leucin Tyrosin Phenylalanin Tryptophan
7,55 7,12 4,40 0,91 2,60 7,75 4,89 5,61 1,88
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3. Nachweis und Bestimmung Zum Nachweis und zur Bestimmung yon PP5 wurden immunologische Methoden verwendet. In einer fr/iheren Untersuchung war zum Nachweis yon PP5 in Organextrakten der Geldiffusionstest nach Ouchterlony eingesetzt worden. Dabei konnte PP~ nur im Extrakt aus Plazenten, nicht abet in Extrakten aus anderen fetalen und adulten Organen des Menschen nachgewiesen werden [1, 3]. PP5 erwies sich demnach als spezifisch ffir die Plazenta. Mit Hilfe einer modifizierten Laurell-Technik wurde nun der Gehalt an PP5 in frfihen (8-14 Wochen alten) und ausgewachsenen Plazenten quantitativ immunologisch bestimmt. Die Plazenten wurden extrahiert und PP5 aus den entsprechenden Extrakten durch Immunadsorption entfernt. In den vom Immunadsorbens eluierten Fraktionen ist die Konzentration von PP5 dann ermittelt worden. Die Untersuchung ergab, daf3 sich aus einer ausgewachsenen menschlichen Plazenta (600 g) im Durchschnitt 15 mg PP5 extrahieren lassen. Die frfihen Plazenten enthielten auf Gewicht bezogen etwa dieselbe Menge PPs, d. h. pro 100 g Feuchtgewicht konnten etwa 3 mg PP5 extrahiert werden. Ein mit PP5 immunologisch identisches Protein kommt in Plazenten von Affen vor [2]. Mit der Immunfluoreszenztechnik wurde PP5 in der Plazenta vom Menschen sowohl im Zottenepithel als auch im Zottenstroma lokalisiert. Bei Affenplazenten ist spezifische Fluoreszenz haupts~ichlich im Cytoplasma des Syncytiotrophoblasten nachgewiesen worden [2, 8]. In Normalseren kommt PP5 nicht vor. Auch in Seren yon schwangeren Frauen aus dem 9. Monat der Gravidit~it und in Seren yon Patienten mit malignen Erkrankungen konnte mit der modifizierten Laurell-Technik (Nachweisgrenze 0,1 mg PPJ100 ml) kein PP~ nachgewiesen werden [9]. PP5 scheint aber doch gelegentlich in Spuren (< 0,1 rag/100 ml) in Schwangerenseren vorzukommen: Bei 2 yon 4 Schwangerenseren, die an Sephadex G-150 aufgetrennt und deren Fraktionen auf dem Ultrafilter stark eingeengt wurden, konnte in der niedermolekularen Fraktion, die mit und nach dem Albumin yon der Siiule kommt, mit Hilfe der modifizierten Laurell-Technik eindeutig PP5 nachgewiesen werden. Zu einer genauen Untersuchung fiber das Vorkommen des plazentaspezifischen Proteins PP5 in Seren schwangerer Frauen, bzw. in Seren yon Patienten mit trophoblastischen Tumoren mfif3ten empfindlichere Methoden (Radioimmunoassay, Enzymimmunoassay) herangezogen werden.
4. Testung auf biologische Funktionen Bei der Untersuchung auf biologische Aktivit~iten wurde gefunden, dab PP~ auf Fibrin-Agar-Elektrophoreseplatten bzw. auf Fibrinogen-Agaroseplatten die proteolytische Wirkung yon Trypsin und Plasmin hemmt. Abbildung 3 zeigt den Nachweis der Hemmung von Trypsin nach elektrophoretischer Auftrennung des Proteins auf Fibrin-Agar-Elektrophoreseplatten. Aus Abbildung 3 ist auch ersichtlich, dab nach Abspaltung der Neuraminsfiure mit Neuraminidase die Hemmwirkung des Proteins erhalten bleibt. Die biologische Funktion yon PP~ besteht m6glicherweise in der Hemmung yon Proteasen.
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Abb. 3. Nachweis der Hemmung von Trypsin nach elektrophoretischer Auftrennung der Proteine auf Fibrin-Agar-Platten. + ND = Protein rnit Neuraminidase behandelt i
Danksagung. Die frfihen menschlichen Plazenten wurden uns von Professor W. R. Jones (Bedford Park), zur Verffigung gestellt. Die Untersuchungen in der Ultrazentrifuge verdanken wir Herrn Dr. T. Kranz, die Bestimmung der Aminos~iuren Herrn Dr. H, Zilg und Frau B. Hentze, die Analyse der Kohlenhydrate Herrn J. Schfning. Bei den immunologischen Untersuchungen wurden wir von Frl. R. Walter und Herrn P. Cieplik, bei der Bestimmung des isoelektrischen Punktes von Herrn H. Spenler unterstfitzt. Die Untersuchungen auf Fibrinogen-Agaroseplatten hat Dr. H. Karges durchgef/ihrt.
Literatur 1. Bohn, H.: Nachweis und Charakterisierung von 15slichen Antigenen in der menschlichen Plazenta. Arch. Gyn/ik. 212, 165 (1972) 2. Bohn, H., Sedlacek, H.: Eine vergleichende Untersuchung yon plazentaspezifischen Proteinen bei Mensch und subhumanen Primaten. Arch. Gyn~ik. 220, 105 (1975) 3. Bohn, H.: Isolation and characterization of placental specific proteins SP1 and PPs. Protides of the Biological Fluids, Proceedings of the 24th Colloquium, Briigge 1976, edited by H. Peeters 4. Bohn, H.: Nachweis und Charakterisierung yon Schwangerschaftsproteinen in der menschlichen Plazenta, sowie ihre quantitative immunologische Bestimmung im Serum schwangerer Frauen. Arch. Gyn/ik. 210, 440 (1971) 5. Bohn, H., Kraus, W.: Isolierung und Charakterisierung des Plazenta-Proteins PPr Arch. Gyn/ik. 221, 73 (1976) 6. Bohn, H., Winckler, W.: Isolierung und Charakterisierung eines neuen Gewebsproteins (PPT) aus menschlichen Plazenten. Arch. Gyn/ik. 222, 5 (1977) 7. Bohn, H.: Isolierung des Plazenta-Proteins PP2 und seine Identifizierung als Ferritin. Arch. Gyn~ik. 215, 263 (1973) 8. Sedlacek, H. H., Rehkopf, R., Bohn, H.: Immunofluorescence histological localization of human pregnancy and placenta proteins in the placenta of man and monkeys (cynomolgus). Behring Institute Mitt. 59, 81 (1976) 9. Bohn, H.: Die Antigene der menschlichen Plazenta. Klin. Wschr. 53, 547 (1975)
Eingegangen am 30. August 1977
