Planta (Berl.) 79, 235--248 (1968)

Untersuchungen tiber die Manganverteilung zwischen Zellfraktionen aus Spinatbl~ittern und ihr Zusammenhang mit dem Manganhaushalt HANS N]~]~RACHEB, l~EINHARD ]~ACHOFEN a n d ING~ID S r E C H T - J ~ G E N S E N Institut ffir Allgemeine Botanik der Universitat Ziirich Eingegangen am 27. Okteber 1967

Investigations on the Distribution o/Manganese between Cell Fractions ]rom Spinach Leaves Summary. 1. Spinach was harvested once a week, beginning five weeks after sowing. The leaves were divided into three categories, according to their height of insertion. For every category, Hill-activity and manganese content (by atomic absorption) were measured. The remaining leaf material was homogenised in distilled water or in a mixture of 0.6 IV[ sucrose and 0.05 ~ Tris/maleate buffer, p H 7.8, and the homogenate was separated by differential centrifugation into two fractions: a green precipitate consisting mainly of chloroplast fragments and a yellow supernatant. Chloroplast fragments, isolated in sucrose medium, were washed with distilled water. Manganese and nitrogen content of the precipitate and the supernatant were determined, as was the chlorophyll concentration of the precipitate. 2. The manganese content in the old leaves and their fractions increased; nitrogen concentration, chlorophyll concentration, chlorophyll/nitrogen and chlorophyll/manganese ratios decreased. 3. The lowest inserted leaves and their fractions had a different chemical composition from the rest: they had a higher manganese and a lower nitrogen content. The chlorophyll/nitrogen ratio of the lamellae was also higher. 4. At the beginning, the lowest inserted leaves had the same manganese content as the seeds. Then the manganese concentration decreased slightly and increased again when leaf decomposition began. 5. We found a chlorophyll/manganese ratio of 104 molecules chlorophyll to 1 atom manganese. 6. Hill activity decreased with increasing age of the shoot. I t seemed to be a function of the shoot age rather than the leaf age. 7. The mariner of preparation had an effect on the chlorophyll/dry weight ratio, but not on the manganese/dry weight and nitrogen/dry weight ratios. Therefore the manganese/chlorophyll and the chlorophyll/nitrogen ratios depended on the manner of preparation.

L Einleitung E i n e d i r e k t e B e t e i l i g u n g des M a n g a n s a n d e r P h o t o s y n t h e s e k a n n h e u t e n i c h t m e h r b e z w e i f e l t w e r d e n ( P m s o N , 1937; G ] ~ ] ~ T S ~ N , 1950; P I ~ s o N et al., 1952; KWSST,V,~, 1955, 1957a, b ; EYSTE~ et al., 1956, 1 9 5 8 a ; I=tIC~T~R, 1961; POSSING~A~ u n d SPENCEr, 1962). E s s c h e i n t

236

H.~EEaACH~, R. B~e~o~E~ und I. SPECHT-Jff~GENSEN:

haupts/~chlich, wenn nicht ausschlieBlich, mit dem Sauerstoff freisetzenden System verknfipft zu sein (K~ssLEi~, 1955, 1957a; RIChTer, 1961; POSSlNGnAM und S P E ~ c ~ , 1961, 1962; AXDEXSO~ et al., 1964). Weniger klar ist, in welcher Form es an diesem ProzeB betefligt ist. KEZqTE~ und MA~N (1955) vermuten, dab zweiwertiges Mangan dutch ein Peroxidasesystem oxidiert wird und auch in vivo ein eigentlicher Oxidations-/l~eduktionscyelus des ionischen Mangans vorliege. Demgegenfiber stehen Arbeiten yon Autoren, welche die Strukturgebundenheit des Mangans betonen, es eher als enzymgekoppelt betrachten and eine zahlenm/~fig feste Beziehung zwisehen Chlorophyll und Mangan annehmen (W~Bu~G, 1946; WHATLV.Y et al., 1951; EYSTEI~ et al., 1958a, b; POSSlNGaA~ und SPEzcc~, 1962; P ~ K und Po~, 1963; A~D~RSON et al., 1964). BEI~T~A~]) und I~OSE~BLATT(1922) sowie GfrTTLER (1941) wiesen bei einer grol]en Zahl wildwachsender Pflanzen steigende Mangangehalte im Laufe ihrer Entwicklang naeh. Es wfirde sich nun bei konstantem Mangan-/Chlorophyllverh/~ltnis der Chloroplasten die Frage aufdr/~ngen, wo die wachsenden Manganmengen gespeichert werden. Es schien uns im Zusammenhang mit diesen Fragen yon Interesse, den Mangangehalt yon Chloroplastenfragmenten als Funktion des Blattalters zu untersuehen und mi~ dem gleichzeitig bestimmten Chlorophyll- und Stickstoffgehalt in Beziehung zu setzen. U m Anhaltspunkte fiber den Manganhaushalt innerhalb der Zellen zu gewinnen, bestimmten wit auch den Mangangehalt tier ganzen B1/~tter sowie des Oberstandes der Chloroplastensedimente. II. Material und Methode Pflanzenmaterial. Spinacea oleracea, Sorte Vital-E, wurde am 20.4. 67 auf drei Feldern (2,5 x 10 m) in Querreihen ausges~t und als Freilandkultur aufgezogen. Unser Ziel war, eine normale, mfglichst gesunde und ertragreiche Spinatkultur zu erzielen, was durch eine auf Bodenanalyse grfindende Dfingung mit gleichen Teilen Superphosphat/Bor, Kaliumsulfat und Ammoniumnitrat en-eicht werden sollte. Der humose, schwach sandige Lehmboden (pH 7,5) tier Versuchsfelder liel] die Gefahr einer luxurierenden Manganaufnahme, welche bei tieferen pH-Werten des Bodens vorhanden w~re (OLsE~, 1934; Mo~IS, I948), aussehlieSen. Ernte. :Beijeder Ernte wurde pro Feld ein 10 om breiter, zufallsmEBigausgew~hlter L/ingsstreifen vollst~ndig abgeerntet, wobei alle gesunden Individuen ffir die Untersuchung verwertet wurden (praktiseh 100%). Die Pflanzen wurden mit der Wurzel ausgerissen, diese abgeschnitten und das Blattwerk des Sprosses, der Insertionshfhe der B1/s entsprechend, in drei Alterskategorien aufgeteilt: Alteste Bl~tter: 2 Kotyledonen -k 2 Laubbl~tter. Mittlere BlOtter: die nachsth5heren 4 Laubbl~tter. Jiingste BlOtter: alle weiteren Laubbl~tter ohne die Tragbl~tter der Blfitenstandsregion (durchschnittlich 3~4 Bl~tter). Nach der Ernte wurden die Blattspreiten yon den Stielen getrennt, mit Leitungswasser grfindlieh gewasehen und fiber Naeht im Dunkeln bei 4~ C aufbewahrt.

Manganverteilung zwischen Zellfraktionen aus Spinatbl~ttern

237

Eraktionierung. Bei der Wahl der Fraktionierungsmethode waren wit sehr eingeengt, weft zwei sich widersprechende Anforderungen beriicksichtigt werden mugten: Einerseits sollten am gleichen Tag drei verschiedene Blattmaterialien in solchen Mengen verarbeitet werden, dag die entsprechenden Chloroplastenfraktionen ffir den Mangannaehweis geniigend grog sind. Anderseits w~ren ganze Chloroplasten oder reine Chloroplastenlamellen erwfinscht gewesen. Beides kann nur die Dichtegradientenzentrifugation im strengeren Sinn rein liefern (LE~c~, 1961 ; BIn~L, 1965). Ihre Umst~ndlichkeit und die relativ kleinen, pro Arbeitsgang erh~ltlichen Chloroplastenmengen schlossen die Anwendung dieses Verfahrens leider aus. Wit mugten uns daher mit einem Pr~parationsweg begnfigen, bei dem eine groge Ausbeute an weitgehend stromafreien Lamellen (B) erwartet werden kann (JAcoBI und PERNE~, 1961; BIE~rL, 1965; Pn~]~R, 1965) mit einem heterogenen Uberstand (C), der alle iibrigen Zellbestandteile enthi~lt (Cytoplasma, Stroma, Mitochondrienffagmente, l%ibosomen). Um auch ffir den ~berstand das Troekengewicht als Bezugsgr5ge nehmen zu kSnnen, aber auch um eine gewisse Kontrolle fiber den Einflug der Fraktionierungsmethode auf das Ergebnis zu erhalten, wurde noch ein zweiter Pr~parationsweg mit Wasser als Aufschlugmedium angewandt. Das geerntete Blattmaterial jeder Alterskategorie wurde entweder vollst~ndig verarbeitet oder eine representative Probe yon 250 g ausgew~hlt. Die BlOtter wurden einzeln mit Papiertiichlein getrocknet, yon Hand zerkleinert, das Frisehgewicht festgestellt und vor der Probenentnahme gut gemischt. Die Fraktionierung ging nach folgendem Plan vor sieh: Hillreaktion (24 g) zerkleinertes Blattmaterial A Manganbestimmung (15 g)

I

1. Hiilfte: Puffer/Saceharose-Aufschlul3 90" im Mixer, Filtration dureh Ki~setuch

I

Homogenat 1 rain bei 1000 • g in Kiihlzentrifuge

I

Uberstand 10 rain bei 37000 • g '- Uberstand C Sediment mit 10faehem Volumen kaltem dest. Wasser anfsehlgmmen, 1 Std im Dunkeln bei bei 4 ~ C stehen lassen

I

2. H~lfte: Wasseraufsehlug 90" im Mixer, Filtration durch K~setuch

I

Homogenat 1 rain bei 1000 • g in Kfihlzentrifuge

I

~berstand 10 min bei 37000 • g

I

- - 0-berstand C'

Sediment B'

I

10 min bei 37000 • g zentrifugieren

I

Sediment B Fiir den Aufschlug im Mixer wurde das Pfanzenmaterial im Verh~ltnis 1:1 (G/V) mit ka]ter L5sung oder dest. Wasser versetzt. Das Puffer-Saecharose-Gemisch enthielt 0,6 m Saccharose und 0,05 m Trismaleat-Puffer vom pH 7,8. Ffir die Zentrifugation stand uns eine Kiihlzentrifuge zur Verfiigung. Die angegebenen g-Zahlen sind Maximalwerte. Die beiden Sedimente B und B' wurden mit kaltem dest. Wasser aufgenommen, mit Ultraschall homogenisiert und auf ein bestimmtes Volumen gebracht. Von den ~berst~inden C und C' zweigten wir je 10 ml fiir die Gesamt-Sticks~offbestimmung ab, yon den Fraktionen B und B' ]e 10 ml fiir die Chlorophyll- und Stickstoffbestimmung.

238

H. NEERACHE~, R. BACHOFE~und I. SPECttT-JfiRGENSEN:

Zur Feststellung des Trockengewichts wurden die Suspsnsionen odsr zsrkleinsrten Blitter auf die VeraschungsgsfgBe (50 ml Weithalserlenmeyer, Pyrex odsr Duran) verteilt, 72 Std bei 95~ C getroeknet, und vor tier Wigung 1 Std im Exsiceator abgekiihlt. Manganbestimmung. Die Ansiitzs (100--700 mg TG Pflanzenmaterial) wurdsn auf dem elektrisch geheizten Sandbad mit 15 ml eines Gsmisches yon 70% PerchlorsguIe und konz. Salpetersgure (Vsrhiltnis 1:10) vorsichtig verascht (Arbeitsvorsehriften zur Vermsidung yon Explosionen s. Analytical Methods Committee Report 1959) und bis zur Troekne eingedampft. Bei Bedarf wurde der ProzeB mit wsitsren 5 ml Portionen Siuregemisches so oft wiederholt, bis die Asche farblos w'ar.

Die Manganbestimmung erfolgts mittsls Atomabsorption auf einem BeckmanSpektrophotometer DB und Sehreibsr. Die 1Vfsssungsn wurden mit den yon der Firma empfohlenen Einstellungen ausgefiihrt. Es zsigte sich, dab der Salzgehalt dsr w~Brigen Probsn 0,02--0,05% nieht fibersteigen sollte. Bei hThsren Salzkonzentrationen erhisltsn wit zu tiefe Manganwerts. Der Verasehungsrtiekstand wurde daher mit dest. Wasser aufgsnommen und so stark verdfinnt, dab die totale Salzkonzentration um 0,05 % lag. Zur Kontrolle stellten wit yon diessr Ausgangs16sung zwei zusitzliehe u her und untsrsuehten in Parallelbestimmungen die Linearit~t der Werte. Die Durchsehnittsmangankonzentrationen im linearen Nachweisbereich betrugen 0,01--0,19g/ml (Mefempfindlichkeit: 0,01 tzg/ml = 1% Absorption), so dab der Sehreiber auf vierfaehs Verstirkung eingestellt werden muBte. Um Manganausf~llungen zu verhindern, wurden dis LSsungen mit 1 Vol.-% 0,1 M HC1 angss~uert und iriseh bestimmt. EDTA-Zugabsn hattsn keinen Effekt auf das Resultat. Bei den Gehaltsangaben der Fraktionen handelt es sieh um Mittslwerts aus ~ Proben, wobsi jede Probe wiederum einem Durehsehnitt aus 4--5 Messungen sntspricht. Eine laufends Kontrolle der Eishkurve erwies sieh als unumgi~nglieh. ChlorophyUbestimmung. Sie erfolgts naeh der Methods von ARNON (1949). Gesamt-Stieksto//-Bestimmung. Es wurde dis yon HU~HRrES (1956) beschriebene Mikrokjeldahl-NIethode angewandt. Hillreaktion. Ihr Vsrlauf wurds colorimetrisch mit DBIP als Hillreagens verfolgt.

III. Resultate 1. Entwicklungszustand der Blgtter bei der Ernte Vier W o c h e n n a c h der A u s s a a t e r n t e t e n ~ r z u m ersten Mal, n a c h h e r i n wSchentlichen A b s t ~ n d e n , i m g a n z e n ffinfmal. Alle faulen B l i t t e r w u r d e n verwor~en, ebenso S e i t e n s p r o B b l i t t e r u n d Blfitenstandstragbliitter. Z u r B e u r t e i l u n g des E n t w i c k l u n g s z u s t a n d e s stfitzten wir u n s auch auf das Frisch- u n d Trockengewicht der BlOtter pro B l a t t k a t e gorie, bezogen auf die I n d i v i d u e n z a h l . Die ~ltesten B l i t t e r durchliefen w ~ h r e n d der Versuchsperiode einen vo]lsti~ndigen E n t w i c k l u n g s c y c l u s bis z u m A b s t e r b e n , w ~ h r e n d die fibrigen Bli~tter keine ~uBerlich sichtb a r e n Alterszeichen zeigten (Tabelle 1).

2. Einflufl der Au/bereitungsmethode au] alas Ergebnis Vergleicht m a n die aus d e m Wasseraufschlu~ resultierenden Chloroplas~enfragmente m i t solchen aus dem Puffer/Saccharoseaufschlul~, so

Manganverteilung zwisehen Zell~raktionen aus Spinatbl~ttern

239

Tabelle I. Der F,ntwicklungszustand der Bliitter bei der Ernte Ernte Nr.

Pflanzen- ~.lteste BlOtter alter (Woehen)

1

4

2

5

3

6

4

7

5

8

Kotyledonen ausgewaehsen, beide LaubblEtter noeh im Waehstum begriffen Alle Kotyledonen noch gut erhalten, Laubbl~tter fast ausgewachsen Kotyledonen gelblieh, teilweise abgefallen, Laubbl~tter ausgewaehsen Nut noeh vereinzelt Kotyledonen. Laubblotter beginnen zu vergilben. Vereinzelt Seitensprogbfldung begonnen BlOtter gelblieh grfin his gelb, viele abgefallen oder verfault

Mittlere BlOtter

Jfingste BlOtter

die zwei untersten BlOtter gut, die zwei folgenden kaum entwickelt alle vier BlOtter gut entwiekelt. Internodienstreekung beghmt age BlOtter praktisch ausgewachsen

--

die meisten BlOtter gesund und kr~ftig, erst wenigemit Vergilbungszeichen, vereinzelt Seitenspro~bildung

sehwaeh entwiekelt

zwei bis drei gut entwiekelte BlOtter. Blfitenstand in Bfldung begriffen

die meisten Bl~tter noeh niehr ausgewachsen, dmlkelgriin. Bliihbeginn

zeigt sich, dag im ersten Fall die Chlorophyll/Stickstoff- und die Chlorophyll/TrockengewichtsverMltnisse durchwegs kleiner (durchschnittlich 23 bzw. 15 %), die Mangan/Oh]orophyllverhifltnisse grSBer waren (durchschnittlich 26%). Dagegen streuten die lYIangan/Trockengewicht-, Mangan/Stickstoff- u n d Stickstoff-Trockengewicht-Quotienten zufallsm~Big u m den theoretischen Mittelwert. Bei der Darstellung der Ergebnisse wurde daher fiir die zuf~llig streuenden Quotienten der Durchschnitt y o n B u n d B ' bzw. C u n d C' genommen. Bei den fibrigen Quotienten mit systematischer Tendenz wurden die Werte fiir B u n d B ' gesondert aufgeffihrt.

3. Mangan-, Stickstof/- und Chlorophyllgehalt in bezug au/ das Trockengewicht a) Mangangehalt. Der Mangangehalt der einzelnen Blattkategorien u n d ihrer Fraktionen ist in Abb. 1 dargestellt. Es werden bei der Besprechung der Kurvenverl~ufe nur statistisch gesicherte Unterschiede

240

H. NEERACHER, R. BACItOFENund I. SPECmS-Jf)P~s.NSEN:

=

(t-Pr/ifung, Duncantest, Varianzanalyse, P 99%) berficksichtigt. Wir sttitzten uns bei den Berechnungen auf DOE~FFEL (1965). ]Die untersten Bls der Pflanze hatten im Zeitpunkt der ersten Ernte den gleichen Mangangehalt wie die Samen (27,1 Fg/gTG). Nachher sank er leicht ab bis zur ns Ernte, b]ieb dann innerhalb der Grenze bis zur vierten E r n t e konstant und stieg scMieBlich bis zur letzten Ernte stark an. Die h6her angewachsenen B1Atter wiesen yon

o70c

/

30 -

~"

0

2

I

~'~'~'-'~'~

I

3 Ernte-Nr.

I

&

I

5

Abb. 1. Mangangehalt auf das Trockengewicht bezogen. - - ~lteste BlOtter; . . . . mittlere BlOtter; . . . . jfingste B1/~tter; 9 ganzes Blair (A); @ Chloroplastenfragmente (B ~-B'); O Uberstand (C) Anfang an konstante Mangangehalte auf; erst bei der letzten Ernte war er auch bei ihnen leicht erhSht. Die untersten BlOtter batten gegeniiber den fibrigen mehr Mangan pro Trockengewicht, wi~hrend zwischen den mittleren und den obersten Bl~ttern eine Aui3erst geringe, bei Ernte 3 nicht gesicherte Differenz bestand. Die ~ b e r s t a n d e (Cytoplasma, Mitochondrienfragmente, Kernfragmente, Stroma) enthielten genere]l weniger 1Kangan pro Trockengewicht als die ganzen BlOtter; die Entwicklungstendenz war aber dieselbe, ausgenommen bei den jiingsten Bl~ttern, wo der Mangangehalt w~hrend der ganzen Versuchsperiode im l~berstand konstant blieb. Der aus der Fraktionierung der untersten Bli~tter resultierende Uberstand wies gegenfiber den anderen Oberst~nden den hSchsten Mangangehatt auf (nicht gesichel~ bei der dritten Ernte, unterste und oberste B1Atter). Die Uberst~nde aus den fraktionierten mittleren B1Attern hatten bis zur vierten Ernte den geringsten Mangangehalt, fibertrafen aber bei der letzten Ernte die Werte der obersten BlOtter.

Manganverteilung zwischen Zellfraktionen aus Spinatblattern

241

lJber die Chloroptastenfraktionen l~Bt sich sehr wenig statistisch Gesichertes aussagen, weil die Konzentrationsunterschiede zwischen den Priipara~ionspaaren B und B' eine breite Streuung aufweisen (Vertrauensbereich der Mittelwertserie 2. 4. Ernte 2 = 11,9 gegenfiber 1,35 fiir A und 1,3 ffir C'!) und die Anzahl der Freiheitsgrade viel zu klein war. Gesiehert (P = 99 % ) sind die hSheren Gehalte gegeniiber den Ubersti~nden und der starke Anstieg in den Lamel]en der untersten Bli~tter

loo[-

. . . . . .

bUI-

~

~

"~',,~-~ ~

~

~o ~

O!

2

3 Ernte-Nr.

Z,

5

Abb. 2. Gesamtstickstoff-Gehalt auf das Trockengewich~ bezogen. - - Alteste Bl~tfer; . . . . mittlere BlOtter; . . . . jiingste BlOtter; Q Chloroplastenfragmente (B -{-B'); 9 ~berstand (C') bei der letzten Ernte. Mehr l~Bt sich auf Grund der Ergebnisse nicht aussagen. b) Sticksto//gehalt. Der Stiekstoffanteil am Trockengewicht blieb w~hrend der ganzen Entwickhmgsperiode der BlOtter innerhalb der Schwankungsgrenze des Verfahrens konstant (Abb. 2). Den ~u6er]ich sichtbaren Alterungsvorgi~ngen der untersten Bliitter ging ein Absinken des Stickstoffantells am Trockengewicht parallel. Dies ~uBerte sich besonders ausgepri~gt bei der Chloroplastenfraktion. Die Chloroplastenfragmente batten einen hSheren Stickstoffgehalt als die dazugehSrigen 1)bersti~nde. Je hSher die BlOtter angewachsen waren, desto hSher lag der Stickstoffgehalt der Fraktionen. c) Chlorophyllgehalt. Aus den Ergebnissen in Tabelle 2 lassen sieh nur zwei Tatsachen mit Sicherheit herauslesen: Der Alterungsvorgang bei den untersten Bl~ttern findet seinen Ausdruck im scharfen Abfall des Chlorophyllanteils am Trockengewicht. Das Pr~parationsverfahren fibt einen entscheidenden Eil~lU6 auf die relative Chlorophyllmenge der entsprechenden Chloroplastenfragmente aus. Bei Wasseraufschlul~ ist der Chlorophyllantell am Trockengewicht geringer. Da6 es sich nicht um Chlorophyllverluste, sondern um geringere Troekensubstanzverluste handelt, zeigt sieh, wenn m a n den totalen Chlorophyllgehalt der Fraktionen

242

I-I. N]~ERACHER,t~. BAC]tOFENund I. SPECHT-JuRGENSEN: Tabelle 2. ChlorophyUgehalt der Chloroplasten/ragmente (rag ChZ/gTG)

Ernte Nr.

Unterste BlOtter

)/Iittlere BlOtter

Oberste BlOtter

B

B'

B

B'

B

B'

1 2 3 4 5

62,5 77,2 80,0 40,1

54,2 74,8 21,6 3,7

66,7 54,3 55,9

65,6 36,1 54,3

62,8 60,2

71,3 58,4 61,5

berechnet: Bei gleich groBen Mengen Ausgangsmaterial erhiflt man mit beiden Verfahren ungefghr gleich viel Chlorophyll; der Wasseraufschlul~ liefert sogar etwas mehr. Anders ausgedrfickt: Die Chloroplastenfragmente aus dem Puffer/Saccharose-Aufschlu]~ mit einmaliger Waschung sind s an wasserl6slichen Substanzen oder, was auf dasselbe herauskommt, besser gewaschen.

4. Das ChlorophyU/Sticksto[/verhdltnis Wie aus Tabelle 3 crsichtlich ist, ~nderte sich das Chlorophyll/Stickstoffverh~ltnis erst bei Beginn der AbsterbevorgAnge in st~rkorem Mal~. Tabelle 3. Chlorophyll/Sticksto//verhgttnis (mg Chl/mg N) Ernte Nr. 1 2 3 4 5

Unterste Bli~tter

Mittlere BlOtter

Oberste BlOtter

B

B'

B

B'

B

B'

0,83 0,99 0,62 0,37

0,78 0,82

0,80 0,71 0,74

0,78 0,76

0,83 0,76 0,79

0,97 1,16 1,43 0,75

Es wurde lfleiner, weft der Chlorophyllabbau dem Proteinabbau vorauseflt (Abb. 2, Tabelle 2). Auff~llig ist die Ubereinstimmung der Werte bei Chloroplastfragmenten aus den mittleren and obersten Bl~ttern, w/~hrend solche aus den untersten B1Attern h6here Quotienten aufwieson. Der Pr~parationsweg hatte auch auf das Chlorophyll/Stickstoffverh~ltnis einen EinfluB. Die tieferen Werte bei Wasseraufschlul~ (keine Waschung) sind nicht auf Chlorophyllverluste, sondern auf schw~chere Stickstoffauswaschung zurfickzufiihren. Es scheint, dal~ die Fragmente aus den jungen unters~en Bl~ttern besonders Ieicht Protein verlieren. Bei den fibrigen Bls waren die Unterschiede zwischen den beiden Pri~parationen rmr noch gering.

Manganverteilung zwischen Zellffaktionen aus Spinatbl/~ttern

243

5. Der Mangangehalt au/ den Sticksto// bezogen Das Mangan/Stickstoffverhiiltnis der Chloroplastenffagmente zeigte w~hrend der ganzen Blattentwicklung leicht ansteigende Tendenz (Abb. 3), nahm mit Beginn der Abbauvorgs bei den untersten Bls sehr stark zu und war hier bei der letzten E m t e um eine GrSl~enordmmg hSher als zu Beginn der Entwicklung. Die zugehSrigen ~berst~nde 7,0V

6,8}-

/

1,2 1,0 0,8

O,& 0,2

g__ _ _ _

0

2

~.--.-----.=::8

3 Frnte-Nr.

4

5

Jbb. 3. Mangangehalt auf den Stickstoff bezogen. --Alteste Bl/itf~r; . . . . mittlere Bls . . . . jfingste Blgtter; @ Chloroplastenfragmente (B-{-B'); 9 [Tberstand (C + 03 hatten dagegen bis zu Beginn der Abbauvorg~nge konstante Mangan/ Stickstoffquotienten. Da der Stickstoffgehalt der Chloroplastenfragmente mit steigender InsertionshShe der Bl&tter zunahm, sank das Mangan/Stickstoffverhi~ltnis je hSher die Bls angewachsen waren. Die Unterschiede sind allerdings sehr gering.

6. Das Chlorophyll/Manganverhdltnis Den in Tabelle 4 angegebenen Werten liegt ein Molekulargewicht von 900 Iiir Chlorophyll zugrunde (SIED~L, 1956). Auch aus dem Chlorophyll/Mangan-Verhs lal~t sich der AlterungsprozeB ablesen: Auf ein Tabelle 4. Chlorophyll/Manganverh~iltnis (Anzahl Chlorophyll-Molekiile pro Manganatom) Emte Hr. 1

2 3 4 5

Unterste Blatter

Mittlere Bls

Oberste Blatter

B

B'

B

B'

B

B'

100 99 33 3

82 159 104 80

118 78 78

175 86

136 84 104

113 104 130 55

244

H.N~RaO~R,R. Bac~o~x und I. SPEOHT-J~RGENSEN:

Tabelle 5 Hillaktivitiit (--AOD/mg Chl/min) Ernte Un%erste Mittlere Nr. Blgtter Blgtter 1 2 3 4 5

0,52 0,72 0,46 0,55 0,33

0,54 0,58 0,35 0,32

Oberste Blgtter

Atom Mangan trifft es immer weniger Molekiile Chlorophyll. Bei intakten Blgttern betrggt das Verhgltnis durchsehnittlieh 104. 7. Die Hillreaktion

Die Hfllaktivits der einzelne~ Blattkategorien untersehieden sieh wenig; sie waren mit Chloroplasten aus absterbenden Blgttern nieht schwgcher als mit solehen aus gleiehzeitig geernteten jfingeren Blgttern (Tabelle 5) und sehienen eher eine Funktion des SproBalters als des Blattalters zu sein. Mit zunehmendem SproBalter sank die Hillaktivitgt. 0,40 0,36

IV. Diskussion Die yon uns gefundenen I a n g a n g e h a l t e liegen im Rahmen dessert, was in der Literatnr angegeben wird. GOTrL~X~ (1941) land bei Herbstspinat 41 txg/g TG, B ~ i ~ A ~ D und SILB~STrI~ (1955) wiesen 28 ~g/g T G naeh. GemgB unseren Erfahrungen schwankt der Mangangehalt des kguflichen Spinats zwisehen 20--50 ~g/g TG. Die relativ tiefen Werte unserer eigenen Kulturen lassen sich zwanglos auf das leicht alkalisehe p i t des kul%ivierten Bodens zurfickffihren (OLs~N, 1934). B~T~AIqD and R O S ~ L A T T (1922) teilten die yon ihnen auf Mangangehalt untersuehten Pflanzen in vier Kategorien ein, entsprechend vier versehiedenen En~wicklungen des Mangangehalts im Laufe des Alterungsprozesses. Spinat wfirde, yon dieser Einteilung her gesehen, in die zweite Kategorie gehSren: Von einem gewissen Ausgangsgehalt aus sinkt die Mangankonzentration leieht, bleibt dann konstant und steigt erst in der SchluBphase auf ein fiber dem Ausgangsgehalt liegendes Maximum. G~dTTL~ (1941) unterschied zwischen manganliebenden und manganarmen Pflanzen: Bei den Nanganarmen (Gehalt unter 100 ~g/g TG) bleibt die Mangankonzentration w~hrend der Entwieldung in engen Grenzen konstant, wghrend er bei den Manganophilen dauernd ansteigt. Weder BErTrAnD noeh G~TTLE~ geben eine Deutung fiir die beobaehteten Manganstiege bei alternden Pflanzen. Unausgesproehen steht aber die Idee dahinter, dab es sich um for~gesetzte Manganaufnahme mit ansehlieBender Speieherung handle. Diese Annahme erklgrt wahrseheinlieh den Saehverhalt weitgehend aber nieht vollstgndig. Vor allem die Vorggnge beim Chloroplastenabbau lassen sich nicht mit dieser Deutung in 13bereinstimmung bringen. Bereehnet man die stoffliehe Zusammensetzung der alternden Chloroplastenlamellen anf Grund tier Angaben y o n PARK nnd Po~ (1963) ffir normale Lamellen und unter der Annahme, dab nur

Manganverteilung zwischen Zelgraktionen aus Spinatblattern

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Protein und Chlorophyll abgebaut werden und versehwinden, die iibrigen Anteile aber konstant bleiben, so mfiBte man bei den Lamellen aus den gltesten B1/~ttern in Ernte 5 um 100 ~g/g TG Mangan linden, bei Ernte 4 etwa 70 ~g/g TG; naehweisen konnten wir aber nur 69,3 bzw. 43,5 ~g/g TG. Diese Zah]en sprechen eher daffir, dab in einer ersten Phase des Chloroplastenabbaues sogar Mangan abtransportiert wird, dann aber bei fortschreitender Aufl6sung der Strukturen nicht mehr; es bleibt liegen. Aueh die Zunahme des Mangangehaltes bei den untersten Bl~ttern l~Bt sich wahrscheinlieh auf ~hnliehe Weise erkl~ren: Der Mangangehalt pro Blatt scheint weitgehend konstant zu sein. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dab vor allem das unterste Laubblattpaar sieh in seiner stofflichen Zusammensetzung yon den iibrigen Blgttern unterscheidet: Es zeigt einen h6heren Mangan- und einen tieferen Stickstoffgehalt a]s die fibrigen Blatter und zwar in beiden Fraktionen. Dies spricht daffir, dab dem untersten Laubblattpaar im SproBverband eine Sonderrolle zngewiesen ist. Sehon MOTHES (1930) hat im Zusammenhang mit Untersnchungen des Stiekstoffhaushaltes yon Tabakbli~ttern gefunden, dab die ~ltesten Bl~ttter anderen Gesetzen gehorchen als die fibrigen. Anssagen fiber die stoffliehe Zusammensetzung der Chloroplastenfragmente sind auf Grund unserer Ergebnisse leider nur in engen Grenzen mSglich. U m aus einem bestimmten Blattmaterial einigermaBen gut reproduzierbare Lamellen-Pr~tparate zu erhalten, sind offensiehtlich mehr Waschungen notwendig. Immerhin kann gesehlossen werden, daft die Zusammensetzung der Chloroplastenfragmente (Stickstoff, Chlorophyll, Mangan) erst bei Beginn der Abbauvorg~nge sieh entscheidend veriindert, weil der Chlorophyllabbau dem Proteinabbau vorauseilt und der Salzanteil nicht entspreehend abnimmt. Aui~erdem seheinen die Lamellen arts den untersten Blattern ein h6heres Chlorophyll/Stiekstoffverhi~ltnis zu haben als solche arts den iibrigen B1/~ttern. Dieser Quotient war Gegenstand einer ausftihrlichen Untersuchung yon BIngL (1965). Er land ftir gut gewasehene Lamellen einen konstanten Wert yon 1,15. Unsere Quotienten waren, auger ffir die Fragmente aus den untersten Bl~ttern bei Zucker/PufferaufschluB, durchwegs kleiner (0,75--0,80), was bei der offensiehtlich unvol]st~ndigen Auswaschung des 15slichen Lamellenstickstoffes nieht fiberraschen kann. Die in der Literatur angegebenen Werte fiir das Chlorophyll/Mangan-Verhaltnis schwanken zwisehen 14 (Chloroplastenfragmente, W~ATLS~Y, 1951) und 605 (Chloroplasten, EXSTEI~ et al., 1958b). Eine Zusammenstellung ist bei KOK et al. (1966) zu linden. Unsere Zahlen liegen in der Gr5i~enordnung der yon PARK und PoN (1963) gefundenen Werte fiir Quantosomen. Die Frage, ob das Verhi~ltnis streng konstant bleibt, Schwankungen unterworfen ist oder sich in engeren Grenzen gerichtet i~ndert, k6nnen wir 18

P l a n t a (Berl.), Bc[. 79

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H. NEERACHER,R. ~ACHOFENund I. SPECHT-JuRGENSEN:

aus unseren Versuchen nicht entscheiden. Gesichert ist jedoch die Abnahme des Quotienten bei den untersten Bl~ttern im Zusammenhang mit dem Ch]oroplastenabbau.

Zusammenfassung 1. I m Freiland gezogene Spinatkulturen wurden vom 2. Monat an einmal w6chentlich geerutet und die BlOtter, gem~i~ ihrer InsertionshShe a m SproB, in drei verschiedenen Kategorien vereinigt. Ffir jede Blattkategorie warden die Hil]aktiviti~t und der Mangangehalt (AtomAbsorption) bestimmt, darauf das iibrige Blattmaterial mit Puffer/ Saecharose bzw. Wasser aufgeschlossen und mittels Differentialzentrifugation in Chloroplastenfragmente und Oberstand fraktioniert. Ffir die Chloroplastenfragmente wurden der Mangan-, Stickstoff- a n d Chlorophyllgehalt bestimmt, ffir den Uberstand der Stiekstoff- und Mangangehalt. 2. Die BlOtter zeigten in der Abbauphase folgen.de Symptome: Sowohl das ganze Blatt als auch die beiden Fraktionen wiesen steigende Mangangehalte auf, die beiden Fraktionen sinkende Stickstoffgehalte und die Chloroplastenfragmente zusiitzlich sinkende Chlorophyllgehalte, Chlorophyll/Stiekstoff- und Chlorophyll/Mangan-Quotienten. 3. Die untersten Bls hatten eine yon de~J. fibrigen Laubbli~ttern abweichende stoffliche Zusammensetzung: Sie enthielten mehr Mangan und weniger Stickstoff pro g TG, aueh in den Fraktionen. Das Ch]orophyll/Stiekstoffverh~iltnis der Lamellen war hSher. 4. Die untersten Bls hatten bis zur ersten Ernte den gleichen Mangangehalt wie die Samen. Nachher sank er leieht und stieg erst in der letzten Phase des Abbaues wieder an. Bei den fibrigen Bli~ttern war der Mangangehalt yon Anfang an konstant. 5. Bei den Lamellen aus intakten Bl~ttern k a m e n durehsehnittlieh 104 Molekfile Chlorophyll auf 1 Atom Mangan. 6. Die Hillaktivit~t n a h m mit zunehmendem SproBalter bei allen Bls ab. Sie schien eher eine Funktion des Sproi~alters als des Blattalters zu sein und war in allen Blattkategorien ungefs gleieh groin. 7. Die Art des AufsehluBmediums und des Fraktionierungsweges hatte einen Einflul~ auf das Chlorophyll/Troekengewichtsverh~ltnis, nicht aber auf das Mangan-Trockengewichts- und Stiekstoff/Trockengewiehtsverhi~ltnis. Entspreehend waren die 5Iangan/Chlorophyll- und Stiekstoff-Quotienten vom Pri~parationsweg abh~ngig.

Chlorophyll/

Manganverteilung zwischen Zellfraktionen aus Spinatbli~ttern

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Literatur Analytical Methods Committee l~eport: Notes on perehloric acid and its handling in analytical work. Analyst (Lond.) 84, 214--216 (1959). ANDERSON, J. M., N. K. BO~A~DMAN, and D. J. DAVID: Trace metal composition of fractions obtained by digitonin fragmentation of spinach chloroplasts. Biochem. biophys, t~es. Commun. 17, 685--689 (1964). AI~NoH, D. I. : Cooper enzymes in isolated chloroplasts. Polyphenoloxydase in Beta vulgaris. Plant Physiol. 24, 1--15 (1949). BERTRAND,G., et M. ]-:~OSENBLATT : Sur la r6partition du mangan6se clans l'organisme des plantes sup@rieures. Bull. Soc. chim. Fr. 31, 345--352 (1922). - - , et L. SILBERSTEIN: Teneur en mangan@se d'environ cinq cents @chantillons de phan@rogames. Ann. Inst. Nat. Rech. agronom., S@r. A 6, 523--535 (1955). BIEttL, B.: Des Chlorophyll-Stickstoff-Verhaltnis isolierter Chloroplasten und Chloroplastenfraktionen in Abh~ngigkeit von Isolierungs- und Fragmentierungsmethoden. Planta (Berl.) 67, 265--280 (1965). DOERFFEL, K.: Beurteilung yon Analysenverfahren und -ergebnissen. BerlinHeidelberg-New York: Springer 1965. EYSTEI~, C., T. E. BROWN, and H. A. TAN~E~: Manganese requirement with respect to respiration and the Hill reaction in Chlorella pyrenoidosa. Arch. Biochem. 64, 240--241 (1956). , and S. L. HOOD: Manganese requirements with respect to growth, Hill reaction and photosynthesis. Plant Physiol. 33, 235--241 (1958a). - - P h y s i o l o g i c a l effects of manganese deficiency. In: LAmB (ed.), Trace elements. :New York and London: Academic Press 1958b. GERRETSEN, F. C. : Manganese in relation to photosynthesis. II. Redox potentials of illuminated crude chloroplast suspensions. Plant and Soil (Hague) 2, 159--193

(1950). Gi)TTLER, R. : Uber den Gehalt wildwachsender Pflanzen an Kalium, Phosphor, Eisen und Mangan. Forschungsdienst (Berl.) 11, 485--522 (1941). HUMPHRIES, E.C.: Mineral compounds and ash analysis. In: PAECH-TRAcY, Moderne Methoden der Pflanzen~nalyse, Bd. I, S. 408--502. Berlin-GSttingenHeidelberg: Springer 1956. JACOBI, G., u. E. PERNER: Strukturelle und biochemisehe Probleme der Chloroplastenisolierung. Flora (Jena) 1~0, 209--226 (1961). KE~TEN, R. H., and P. J. G. MANH: The oxidation of manganese by illuminated chloroplast preparations. Biochem. J. 61, 279--286 (1955). KESSLER, E.: On the role of manganese in the oxygen-evolving system of photosynthesis. Arch. Biochem. 59, 527--529 (1955). --Stoffwechselphysiologische Untersuchungen an Hydrogenase enthaltenden Griinalgen. Planta (Ber].) 49, 4 3 5 ~ 5 4 (1957a). - - W. ARTHUR, and J. E. BRVGGER: The influence of manganese and phosphat on delayed light emission, fluorescence, photoreduction and photosynthesis in algae. Arch. Biochem. 71, 326--335 (1957b). KOK, B., and G. M. CHENIAE: Kinetics and intermediates of the oxygen evolution step in photosynthesis. In: SANADI, Current topics in bioenergetics. New York and London : Academic Press 1966. LEEC~I, R. M., and R. J. ELLIS: Coprecipitation of mitochondria and chloroplasts. Nature (Lond.) 190, 790--792 (1961). MORRIS, H. D. : The soluble manganese content of acid soils and its relation to growth and manganese content of sweet clover and lespedeza. Soil. Sci. Soc. Amer., Proc. 13, 362--371 (1948). 18"

248

H. N~ERAC~EI~ et al. : Manganverteilung zwischen Zellfraktionen

MOT:~IES,K. : Zur Kermtnis des N-Stoffweehsels h5herer Pflanzen. Planta (Berl.) 12, 686--731 (1930). OLsEYr C. : ~ b e r die Manganaufnahme der Pflanzen. Biochem. Z. 269, 329--348 (1934). PARK, R. B., and N. G. P o x : Chemical composition and the structure of lamellae isolated from Spinacea oleracea chloroplasts. J. molee. Biol. (Lond.) 6, 105--114 (1963). PE~NE~, E. : Elektronenmikroskopisehe Befunde fiber Ver/~ndcrungen im Membransystem von Spinatchloroplasten nach Isolierung und Fragmcntierung. Planta (Berl.) 66, 44--64 (1965). PIRso~c,A.: Ern/~hrungs- und stoffweehselphysiologische Untersuchungen an Fontinalis und Chlorella. Z. Bot. (Jena) 31, 193--267 (1937). - - C. TIc~u u. G. W ] ~ E L ~ I : Stoffwechsel und MinerMsMzern/ihrung einzelliger Gr~nMgen. I. Vergleichende Untersuehungen an Mangelkulturen yon Ankistrodesmus. Planta (Berl.) 40, 199--253 (1952). POSS]:NG~AM, J. V., and D. SPENCER: The effect of manganese deficiency on photophosphorylation and the oxygen-evolving sequence in spinach chloroplasts. Biochim. biophys. Aeta (Amst.) 52, 379--381 (1961). - - - - Manganese as a functional component of chloroplasts. Aust. J. biol. Sci. 15, 58--68 (1962). RICl~TV,R, G. : Die Auswirkungen yon Mangan-Mangel auf Wachstum und Photosynthese bei der Blaualge Anacystis nidulans. Planta (Berl.) 57, 202--214 (1961). SIEDEL, W.: Pyrrole, Pyrrolfarbstoffe und Derivate. In: I~AUEN (Hrsg.), Bioehemisches Taschenbuch, S. 393. Berlin-G5ttingen-Heidelberg: Springer 1956. WAI~BURG, O.: Schwermetalle als Wirkungsgruppen yon Fermenten. Berlin: Saenger 1946. WHATLEu F. R., L. 0EDIt, and D. I. ARNo~q: Distribution of micronutrient metals in leaves and chloroplast fragments. Plant Physiol. 26, 414--418 (1951). Dr. H. NEERACm~a Dr. I. SPEC]=IT-JURGENSEN Prof. Dr. R. BACHOFE~ Inst. f. Allgem. Botanik der Univ. CH 8006 Ziirieh (Schweiz) Ki~nstlergasse 16