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Interleukin 1-enthaltende Zellen im Cholesteatom des Mittelohres* V .5'chi/Iing, I Bujia, B. Negri, E. Kastenbauer
Interleukin 1-containing Cells in Cholesteatoma of the Middle Ear
Zusainmenfassung Das Mittelohreholesteatom ist charakterisiert durch die Anwesenheit von verhornendem Plattenepithel in der Paukenhohle und den angrenzenden pneumatisierten Rdumen des Felsenbeines. Interleukin 1 (IL-i) ist em autokriner Wachstumsfaktor für normale Keratinozyten und in der Lage, Knoehenabbau hervorzurufen. Die Verteilung der zwei mole-
kularen Spezies von IL-i wurde immunhistoehemiseh im Epithel des Cholesteatomes und normaler Epidermis des Gehorganges sowie der retroaurikulkren Region untersueht. In alien untersuehten Plattenepithelien waren IL-i alpha und IL1 beta in vergleichbaren Mengen vorhanden. Der InterleukinGehalt des Cholesteatom-Epithels war deutlich erhöht gegendber normaler Haut. Alle zelluldren Schichten des Cholesteatom-Epithels fdrbten sich einheitlieh und stark für IL-i alpha und IL-i beta an, wohingegen die Keratinschieht negativ für
IL-i war. Eine besonders starke Reaktion für Basalzellen komite nieht registriert werden. Im Bindegewebe unter dem Plattenepithel des Cholesteatomes fanden sieh vereinzelt intensiv positive Zellen neben negativen Stromazellen. Dureh Doppelfdrbungen lieB sieh zeigen, daB die IL-i -positiven Zel-
len im Stroma vorwiegend Makrophagen waren. Unsere Resultate legen nahe, daB IL-i von zerfallenden Keratinozyten und Zellen der Monozyten-/Makrophagen-Reihe freigesetzt und damit die Proliferation des Cholesteatom-Epithels in autokriner Weise stimuliert wird. Hierdureh konnte es zu einer Steigerung des Knoehenabbaus kommen.
Einleitung Die Bildung eines Cholesteatoms griindet sich auf die Gegenwart verhomenden Plattenepithels im Mittelohr, charakterisiert durch eine ungehemmte Proliferation und die FBhigkeit, Knochen abzubauen.
Seit der Entdeckung des Interlcukin I in transformierten Mausekeratinozyten (20) hat intensive Forschung gezeigt, daB es wesentlich in normaler Haut exprimiert wird (3, 12) und das Potential hat, als cm autokriner Wachstumsfaktor tiir epidermale Zellen zu wirken (22). Darüber hinaus ist IL- 1 der potenteste bisher bekannte knochenabbauende Faktor (7, 11, 24). Laryngo-Rhino-Otol. 71(1992) 271 275 Georg Thieme Verlag Stuttgart . New York
Cholesteatoma of the middle ear and the adjacent temporal bone consists of hyperproliferative keratinizing squamous epithelium in the middle ear cavity, and is capable of destroying the bone. Interleukin- I (IL-I), an autocrine growth factor for epithelial keratinocytes, is characterized by its capacity to initiate bone absorption. Using immunohistochemical methods, the distribution of two different species of interleukin, IL-l alpha and IL-l beta, in cholesteatoma tissue (Fig. 2), the skin of the external ear canal, and the retro-
auricular region was investigated (Fig. 1). Comparable
amounts of both IL- 1-species were found in all sqamous epithelia examined, but interleulcin in cholesteatoma epithelium was increased in comparison with normal epidermis. All cellular layers stained uniformly and equally strongly for IL- 1 alpha and IL- 1 beta, whereas the dead cells of the keratin layer
were negative for both. Some intensely stained cells were found scattered in the connective tissue underlying the basal layer of the cholesteatoma (Fig. 4). Using double staining
techniques these cells were shown to be mainly macrophages (Fig. 6). Our results suggest that IL-i could be liberated from disintegrating keratinocytes and cells of the monocyte-/macrophage lineage, and stimulate the proliferation of the cholesteatoma epithelium in an autocrine manner, thus contributing to the increased bone destruction seen in cholesteatoma.
Diese Eigenschaften machen IL- 1 zu cinem idealen Kandidaten für eine Rolle in der Pathogenese des Cholesteatomes. Zwei verschiedene Spezies sind bisher im Detail
analysiert, IL-i alpha und IL-i beta (2i). Sic weisen nur eine 26 %ige Homologie auf, scheinen jedoch dieselben Rezeptoren zu binden und fast dieselben zellulären Antworten hervorzuru-
fen (8.15.23). Wir haben in dieser Arbeit die Verteilung von IL-i alpha und IL- 1 beta im verhornenden Plattenepithel des Cholesteatoms mit Hilfe von hochspezifischen polyklonalcn Antikdrpern und der Peroxidase-anti Peroxidase-Methode untersucht. Weiterhin haben wir die Natur der lL-l-positiven Zellen analysiert.
* Auszugswcisc vorgetragcn auf dcr 62. Jahresversammlung der Dcut-
schen Gesellschaft für Hals-Nasea-Ohren-Heilkundc. Kopf- und Hais-Chirurgie in Aaehen 1991.
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Ludwig-Maximilians-Universität, Klinikum Grofihadern, Klinik und Poliklinik ifir Hals-, Nasen- und Ohrenkranke, Mflnchen (Direktor: Prof Dr. E. Kasteobauer)
Laryngo-Rhino-Otol. 71 (1992)
Material und Methoden ivIaterialgewinnung: Die Proben wurden unmittelbar wahrend der Operation gewonnen, eingefroren in flOssigem Stiekstnff
und ansehlieflend bei 80 'C gelagert. AntikOrper und irnmunhistocheinische Reagentien: Polykionale Kaninehen-Antikdrper gegen rekombinantes mensehliehes IL-i alpha und IL-i beta (Genzyme, Boston, USA) wurden verwendet. Der Antikdrper gegen IL-I alpha reagierte im Radioimmunoassay und Enzymimmunoassay (ELISA) in einem Bereieh von lOng bis 100 pg nicht uber Kreuz mit IL-I beta. Gieiehes gait umgekehrt. Beide Antiseren sind naeh Angaben des Herstellers gleiebwertig in der Neutralisation der Bioaktivität von IL-i alpha und IL-I beta im Thymozyten-Kostimulations-Assay. Sie sind ebenso gleieh sensitiv in der Erkennung des zugeordneten Antigens im Western- Blot. Für die DoppelfErbungen wurden die Antikorper 1(1-MS (Boehringer, Mannheim), der mit dem phagozytierenden Kompartiment der Monozyten- / Makrophagen-Reihe reagiert und sehr verlaOlieh dermale Phagozyten erkennt, und der antiCD3-AntikOrper (DAKO T3, DAKO Diagnostika, Hamburg), der an das CD3-Antigen aller T-Zellen bindet, verwendet. Der Kaninehen-Peroxi dase-anti Peroxidase(PAP)-Kornplex, der Maus-Alkalisehe Phosphatase-Anti Alkalisehe Phosphatase-Komplex und die BrOekenantikOrper wnrden von DAKO Diagnostika, Hamburg, bezogen.
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dem Antikörper gegen IL- 1 alpha anfdrbbar zu sein. Obwohl anti-IL-i alpha regelmäliig eine geringfligig stdrkere FErbung hervorrief als anti-IL-I beta, wenn Schnitte mit beiden Antikör-
pern in derselben Sitzung inkubiert wurden, bleibt es doch sehwierig, mit Sicherheit die relativen Mengen von IL-i alpha und IL-i beta anzugeben.
Warden dagegen Sehnitte von an das Ohr angrenzender Haut and Cholesteatomgewebe parallel and mit identisehen Antikörper-VerdUnnungen bearbeitet, konnte em si-
gnifikant hoherer Gehalt an IL-I alpha and IL-i beta in den Keratinozyten des Cholesteatomes festgestellt werden (Abb. 2). Die Keratinschicht erschien frei von immunologisch nachweis-
barem IL-i. Weiterhin konnten wir in unseren Proben keine Differenzierung zwischen membrangebundenem and zytoplasmatisehem IL-I vornehmen.
Earbetechnik: Bei 20 'C wurden 4 p.m dieke Gefrierselinitte angefertigt, die ansehhel3end auf gelatinisierte Objekttrager aufgebraeht, zwei Stunden an der Luft getroeknet, in Aluminiumfolie gewiekelt nnd dann bei 80 'C gelagert wurden. Vor der Fhrbung wurden die Objektträger in Azeton für 10 mm fixiert. Gleiehzeitig wurden sie mit 0,3 %igem Wasserstoffperoxid behandeit, urn die endogene Peroxidaseaktivitat zu hemmen. Alle VerdOnnnngen wurden in 5 %igem normalen Sehweineserum (DAKO) vorgenommen. Der erste Antikbrper war 1: 20 verdOnnt, der BrUekenantikorper nnd der PAP-Komplex je 1: 100. Die Inkubatinnszeiten betrugen für den ersten Antikorper, für den BruekenantikOrper und den PAP-Komplex jeweils 30 Minuten in einer feuehten Kammer. Um die Sensitivität zu erhbhen, wurden der Brüekenantikdrper und der PAP-Knmplex jeweils noeh einmal für 10 Minuten appliziert. Als Farbstnff diente 3-Amino-9-hthyiearbazol, und die Objekttrfger wurden ansehheüend mit Harnatoxyhn gegengeffirbt. Die jeweihgen Proben warden parallel und mit identisehen Lösungen inkubiert, urn die Variabihtht der Farbung dureh teehnisehe Ungenauigkeiten so klein wie mogheh zu halten und zu ermOgliehen, daB die Farbeintensitat bei versehiedenen Geweben miteinander vergliehen werden konnte. LieO man den ersten Antikörper weg (negative KontrolIc), konnte keine Hintergrundfhrbung verzeiehnet werden.
Doppelfdrbungen: Naehdem der erste Farbesehritt wie oben angegeben mit Hilfe der PAP-Methode abgesehlossen war, wurde vor der GegenfOrbung mit Hamatoxylin die zweite Antikorperreaktion unter Verwendung der Aikalisehen Phosphatase-Anti Alkalisehe Phosphatase-Methode siehtbar gemaeht. Hierzu wurde Ki-M8 in S%igem Sehweineserum 1: 500 verdünnt, anti-CD3 I : 100. Die Inkubationszeiten warden vie bei der PAP-Methode gewfhlt. Naeh AbsehluB der immunreaktion warden die Sehnitte naeh der Neofuehsinmethode 20 Minuten mit Naphthol-AS-Biphosphat und ansehlieBend mit Hamatoxylin für 5 Minuten gefdrbt. Aueh hier konnte in der Negativkontrolle bei Weglassen des ersten Antikdrpers keine Hintergrundreaktion naehgewiesen werden.
Ergebnisse Normale Epidermis zweier versehiedener, nahe am Mittelohr gelegener Regionen, ndmiieh Gehorgang and re-
troaurikuldrer Bereieh, zeigte eine deutlieh positive Färbung vergleiehbarer Intensitdt für IL-I alpha and IL-i beta. Alle Zelllagen der Epidermis seheinen IL-i unabhdn gig von ihrem Differenzierungsgrad zu enthaiten (Abb. 1). Die basale Zellage der
retroaurikuldren Haut seheint hingegen am deutliehsten mit
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Abb. 1 Gefrinischnitt von retroaurikularer Haul, inkubiert mit einem polykionalen AntikOrper gegen IL-i beta. PAP-Technik. Man erkennt eine deutliche Antarbung der basalen Zellage und nine schwachere Reaktion auch mit den Qbrigen Zellschichten. Gegenfarbung mit Hamatoxylin (200fache VergrOBerung).
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Abb. 2 Gefriersehnitt von Cholesteatomgewebe, inkubiert mit einem polyklonalen Antikorper gegen IL-i beta. PAP-Technik. Sdmtliche Schichten des Cholesteatomepithels zeigen nine deutlich positive Reaktinn mit dem Antikdrper. Eine Unterscheidung zwischen membrangebundenem und zytoplasmatischem IL-i ist nicht mOglich. Gegenfarbung mit Hamatoxylin (400fache VergrOBerung).
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Interleukin 1-enthaltende Zellen un Cho/esteatom des Mittelohres
Tm Bindegewebe unter dern Cholesteatornepithel waren einige Zellen erkennbar, die deutlich intensiver als die Keratinozyten mit den Antikorpern reagierten (Abb. 4). Im Gegensatz hierzu waren IL- 1-positive Zellen im Strorna normaicr Haut kaum zu finden.
Inkubierte man die Schnitte im Rahmen der Doppelfdrbungen mit einem zweiten Antikdrper, der alle T-Zellen erkennt (anti-CD-3), so reagierten einzelne der IL-1-positiyen Zeilen im Stroma des Cholesteatoms auch mit diesern Antikorper und stellen somit T-Zellen dar (Abb. 5). Die
gende Zahi der IL-I -positiven Zellen wird jedoch durch den
___
Antikorper Ki-M8 erkannt und läBt sich daher der Gruppe der Makrophagen zuordnen (Abb. 6).
Diskussion Wie bere its in der detaillierten Arbeit von Antti/a u. Mitarb. (3) beschrieben, beeinflul3t die Auswahl der Gewebepraparation isnd des ersten Antikorpers die relative Farbeintensität für IL-i alpha und IL-i beta ausgesprochen stark. Aus diesem Grund wurden in der vorliegenden Arbeit Gefrierschriitte und die Azetonfixation als Vorbehandiung ausgewählt, urn em Maximum an Gewebearchitektur und antigenen Struk-
turen der individuellen Proteine zu erhalten. Die messengerRNA von IL-I alpha so]1 in Keratinozyten vorherrschen (17), aber wir konnten lediglich eine geringfugig höhere Intensität der Färbung für IL-I alpha im Vergleich zu IL-i beta in alien untersuchten Plattenepithelien nachweisen. Dieser Befund befindet sich in Einkiang mit den imrnunhistochemischen Unter-
4,
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.., F; it4-i4 Abb.3 Gefrierschnitt von Cholesteatomgewebe, inkubiert mit
Abb. 4 Gefrierschnitt von Cholesteatomgewebe, inkubiert mit
einem polykionalen Antikbrper gegen IL-i alpha. PAP-Technik. Die erkennbaren Hohlrãume sind von einem einschichtigen kubischen Epithel ausgekleidet, das nicht mit dem verwendeten AntikOrper reagiert und am ehesten Resten von Mittelohrmukosa entspricht. Gegenfarbung mit Hämatoxylin (200fache Vergroulerung).
einem polyklonalen AntikOrper gegen IL-i alpha. PAP-Technik. Man erkennt deutlich das bindegewebige Stroma und in ihm verstreut stark IL-i-positive Zellen. Gegenfarbung mit Hamatoxylin (400fache VergrOllerung).
Abb. 5 Gefrierschnitt von Cholesteatomgewebe, inkubiert mit einem polykionalen Antikorper gegen IL-i alpha. PAP-Technik. Im zweiten Schritt Reaktion mit einem monoklonalen Antikörper gegen CD-3. APAAP-Technik. Die für beide Antikorper positiven Zellen entsprechen 1-Zellen. Gegenfärbung mit Hamatoxylin (l000fache Ver-
Abb. 6 Gefrierschnitt von Cholesteatomgewebe, inkubieü mit einem polyklonalen Antikorper gegen IL-i alpha. PAP-Technik. Im zweiten Schritt Reaktion mit dem monoklonalen Antikorper Ki-M8, der die meisten der dermalen Phagozyten erkennt. APAAP-Technik. Die für beide AntikOrper positiven Zellen entsprechen Makrophagen. Gegenfarbung mit Hamatoxylin (i000fache VergroBerung)
grol3erung).
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An einigen Schnitten konnten Hohlräume im bindegewebigen Stroma gefunden werden, die von einem isoprismatischen Epithel ausgekleidet waren. Daher lag es nahe, daB es sich hierbei urn Reste von Mittelohrmukosa handelt. Diese Zellen waren negativ fir IL-i (Abb.3).
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suchungen von Anttila u. Mitarb. (3). Das Muster der Anfdrbung ifir IL-i ffir retroaurikuläre und Gehörgangshaut scheint dasselbe zu scm wie für Haut von anderen Körperregionen (3).
In unseren Untersuchungen zeigte die basale Zeilage des Cholesteatomepithels kein besonders intensives Färbeverhalten für IL-I, wie es von Ahn u. Mitarb. (2) angegeben wurde. Dieser Unterschied könnte auf euler unterschiedlichen Empfindlichkeit der Epitoperkennung verschiedener Antiseren und monokionaler Antikorper beruhen (3).
Tm Hinblick auf semen deutlich erhöhten Gehalt an Interleukin I scheint sich das Cholesteatomepithel wie aktivierte Keratinozyten zu verhalten (16). Da dieser Zeiltyp aber auch Rezeptoren für eine Reihe anderer Zytokine beherbergt, könnte die IL-i-Stimulation von synergistischen Effekten verschiedener Faktoren auf das Cholesteatomepithel herrühren.
Eine beträchtliche Zahi von Zellen im Bindegewebe unterhaib des Cholesteatomepithels zeigt eine deutliche Reaktion mit IL-i. Unsere Doppelfdrbungen verdeutlichen, daB
diese Zellen vorwiegend zum Monozyten-/Makrophagen-System gehoren und entweder einen Entzilndungs- oder einen Tmmunprozel3 im dem Cholesteatomepithel benachbarten Gewebe
anzeigen. IL-i ist em wichtiges extrazelluläres Signal in der spezifischen Monozyten-Lymphozyten-Interaktion und wird nicht als wesentliches Monozytenprodukt angesehen. Die mononukleären Zeilen, die in der Lage sind, reifes IL-I Zn sezernieren (13), gelten ais eine andere wichtige Queue von IL-i im erkrankten Mittelohr. Der Differenzierungsgrad und die funktionellen Eigenschaften der IL-i- positiven Monozyten im Cholesteatom bleiben noch zu untersuchen.
Em kleinerer Teil der IL-1-positiven Zellen im Stroma ist nach den Doppelfdrbungen positiv für CD-3 (Abb. 5), entspricht also T- Zellen. Die Fähigkeit von einigen T-ZeIlen,
V Schilling, J Bufla, B. IVegri, E. Kastenbauer
Anfdrbung für IL-i (2 und diese Arbeit). Ob die IL-I-Moleküle in der Keratinmasse durch irgendeinen Mechanismus zerstört oder einfach beim Färbevorgang ausgewaschen werden, bleibt zu kiären.
Neben den Keratinozyten stimulieren IL-I a!pha und IL-i beta auch die Proliferation norrnaier humaner Hautfibrobiasten (23) sowie embryonaier Lungenfibroblasten, in denen hochaffine Rezeptoren nachgewiesen wurden (6). IL-i könnte als parakriner Auslöser des Fibrobiastenwachstums im Cholesteatom flingieren, wodurch der zeiiuiãre Nachschub gesichert würde, wenn das Plattenepithel proiiferiert. Ahn u. Mitarb. (2) betonen die mögiiche Induktion von Knochenabbauvorgangen durch IL-i, das im Cholesteatomepithel produziert wird. Obwohl diese Hypothese attraktiv ist, ist der Nachweis die bioiogische Aktivität des IL-i im Cholesteatom noch nicht geftihrt. Sie wiesen ledigiich IL-i in Cholesteatomschnitten nach. Besonders zu beachten ist bier ei-
ne mögiiche Wechseiwirkung mit IL-I-Inhibitoren, wie sie schon bei anderen Erkrankungen beschrieben wurde (18). Obwohi IL-i alpha'/NmRNA in Keratinozyten starker exprimiert zu sein scheint als IL-i beta1/NmRNA (17) und beide Spezies verschiedenen Regulationsmechanismen unterliegen könnten, spezifizieren Ahn u. Mitarb. (2) in ihrer Arbeit nicht das Molekül, das ihr Antikorper erkennt. Sie beschreiben alierdings eine erhöhte Menge von IL-i in den basalen Schichten des Cholesteatomepithels, em Befund, den wir nicht bestãtigen können, da wir eine starke und gleichmällige Färbung ailer Zeflschichten beobachteten.
Dewhirst u. Mitarb. (7) berichtcten Uber die Isoiierung eines vorherrschenden knochenresorbierenden Proteins im stimulierten Leukozyten-Kulturmedium and wiesen seine Identität mit IL-i beta nach. Weiterhin wurde gezeigt, daB rekombinantes murines IL-i beta eine erhebliche Knochende-
IL-i zu produzieren, ist bekannt (1). Damit könnte sich dieser Zeiltyp im Sinne einer autokrinen Stimulation selbst aktivieren und könnte weiterhin in den ProzeB von Wundheilung und Fibrose einbezogen sein, da IL-i die Proliferation von Fibroblasten induziert.
struktion hervorrufen kann (10). Auch IL-u alpha ist in der
Das ungehemmte Wachstumsverhalten des
Um den Knochenabbau durch IL-I zu induzieren, sind Osteoblasten erforderlich (26). IL-I stimuliert nicht direkt die vorherrschenden knochenresorbierenden Zellen, die Osteoklasten. Wahrscheinlich werden noch unbekannte Osteoblastenprodukte durch IL-i -Einwirkung ausgeschuttet, die die koordiriierte Demineralization und den Abbau des Kollagens durch Osteoklasten vermitteln. Eine weitere Mäglichkeit ist cine direkte Interaktion zwischen Osteoblasten und Osteokiasten, die letztere zur Knochenresorption anregt.
Cholesteatomepithels ist unter Otologen gut bekannt. IL-i kann das Wachstum von normalen Keratinozyten stimulieren (22). In
diesem Zelltyp wurde eine wichtige IL-i-Spezies mit einem Molekulargewicht von 31 kD nachgewiesen und als nicht prozessiertes IL-I alpha erkannt (5). Deshalb wurde angenommen (5), dali der IL-i aipha-Vorläufer in einen intrazellulären, autokrinen Signaiweg im Keratinozyten eingebunden sein könnte. Andererseits könnte IL-i von terminal differenzierten Epithelzellen freigesetzt werden, in den abgeschilferten Keratinschuppen akkumulieren und auf unreifere epitheliale Zellschichten einwirken. Die Anwesenheit grolier IL-1-Mengen im Cholesteatom im Zusammenhang mit dem hyperproliferativen Phänotyp (25) fUhrt zu der Annahme, dali dieses Zytokin einen autokrinen Mechanismus in Gang setzen könnte, indem es dem Choiesteatomepithel einen permanenten und sich selbst unterhaitenden Stimulus zur Verfugung steilen könnte.
Dem IL-i-Voriäufer fehlt em klassisches Signalpeptid (19). Membrangebundenes und intrazeliuläres IL-I wurde in normaler Epidermis nachgewiesen (3). Die Keratinschicht des Cholesteatomepithels zeigt allerdings keine positive
Lage, Knochenabbau zu stimuiieren (9). Wir konnten in diesem Zusammenhang zeigen, dali beide IL- 1 -Spezies in signifikanten Mengen im Cholesteatomepithel und in Zellen des daninterliegenden Bindegewebes nachzuweisen sind.
Weiterhin ist bekannt, daB normale und maligne entartete Keratinozyten neben IL-i auch parathormonahniiche Peptide sezernieren (14), die ebenfaiis potente Stimuiatoren für den Knochenabbau sind. Daher wird es von Interesse sein herauszufinden, ob Cholesteatomepithei parathormonähnl iche Substanzen in signifikanten Mengen synthetisiert. 1,25-Dihydroxivitamin D3 (i,25-(OH)2D3) spielt
ebenfalls eine wichtige Rolie in der Reguiation des Knochenstoffwechsels und der Differenzierung von Keratinozyten. Allein für diesen Vitamin D-Metaboliten existieren hochaffine intrazeiIuläre Rezeptoren. DaB normale menschliche Keratinozyten in
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Interleukin 1-enthaltende Zellen irn Cholesteatom des Mittelohres
werden. Die Anwesenheit eines Vitamins, das Knochenabbau durch Monozyten direkt stimuliert, scheint eine faszinierende 1-lypothese für das Cholesteatom zu sein. Allerdings bleibt es ab-
zuwarten, ob em synergistischer Effekt von IL-i, parathormonähnliclien Peptiden und 1 ,25-(OH)2D3 erforderlich ist, urn die starke Knochenresorption in der Umgebung eines Cholesteatomes zu erklären.
Danksagung
___________________
Wir möchten an dieser SIdle Herrn Dr. Peter Schulz, Ludwig-Institut für Krebsforschung, Uppsala, Schweden, herzlich für seine enge Kooperation sowie Frau K Lempart für ihre geschickte technische Assistenz im Labor danken.
Die Arbeit wurde unterstützt durch eine Fdrderung der ,,Münchener Medizinischen Wochenschrift".
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Dr med. Vo/ker Schilling Klinik und Poliklinik für Hals-, Nasen- und Ohrenkranke der Ludwig-Maximilians-Universität München Klinikum Grollhadern Marchioninistr. 15 8000 Milnchen 70
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der Lage sind, 1,25-(OH)2D3 ausgehend von einem physiologischen Vorläufer zu produzieren, konnte nachgewiesen werden (4). Offensichtlich wird es von epidermalen Zellen nicht aktiv Sezerniert, könnte aber von zerfallenden Keratinozyten freigesetzt
Laryngo-Rhino-Otol. 71(1992) 275
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Interleukin 1-containing Cells in Cholesteatoma of the Middle Ear
Zusainmenfassung Das Mittelohreholesteatom ist charakterisiert durch die Anwesenheit von verhornendem Plattenepithel in der Paukenhohle und den angrenzenden pneumatisierten Rdumen des Felsenbeines. Interleukin 1 (IL-i) ist em autokriner Wachstumsfaktor für normale Keratinozyten und in der Lage, Knoehenabbau hervorzurufen. Die Verteilung der zwei mole-
kularen Spezies von IL-i wurde immunhistoehemiseh im Epithel des Cholesteatomes und normaler Epidermis des Gehorganges sowie der retroaurikulkren Region untersueht. In alien untersuehten Plattenepithelien waren IL-i alpha und IL1 beta in vergleichbaren Mengen vorhanden. Der InterleukinGehalt des Cholesteatom-Epithels war deutlich erhöht gegendber normaler Haut. Alle zelluldren Schichten des Cholesteatom-Epithels fdrbten sich einheitlieh und stark für IL-i alpha und IL-i beta an, wohingegen die Keratinschieht negativ für
IL-i war. Eine besonders starke Reaktion für Basalzellen komite nieht registriert werden. Im Bindegewebe unter dem Plattenepithel des Cholesteatomes fanden sieh vereinzelt intensiv positive Zellen neben negativen Stromazellen. Dureh Doppelfdrbungen lieB sieh zeigen, daB die IL-i -positiven Zel-
len im Stroma vorwiegend Makrophagen waren. Unsere Resultate legen nahe, daB IL-i von zerfallenden Keratinozyten und Zellen der Monozyten-/Makrophagen-Reihe freigesetzt und damit die Proliferation des Cholesteatom-Epithels in autokriner Weise stimuliert wird. Hierdureh konnte es zu einer Steigerung des Knoehenabbaus kommen.
Einleitung Die Bildung eines Cholesteatoms griindet sich auf die Gegenwart verhomenden Plattenepithels im Mittelohr, charakterisiert durch eine ungehemmte Proliferation und die FBhigkeit, Knochen abzubauen.
Seit der Entdeckung des Interlcukin I in transformierten Mausekeratinozyten (20) hat intensive Forschung gezeigt, daB es wesentlich in normaler Haut exprimiert wird (3, 12) und das Potential hat, als cm autokriner Wachstumsfaktor tiir epidermale Zellen zu wirken (22). Darüber hinaus ist IL- 1 der potenteste bisher bekannte knochenabbauende Faktor (7, 11, 24). Laryngo-Rhino-Otol. 71(1992) 271 275 Georg Thieme Verlag Stuttgart . New York
Cholesteatoma of the middle ear and the adjacent temporal bone consists of hyperproliferative keratinizing squamous epithelium in the middle ear cavity, and is capable of destroying the bone. Interleukin- I (IL-I), an autocrine growth factor for epithelial keratinocytes, is characterized by its capacity to initiate bone absorption. Using immunohistochemical methods, the distribution of two different species of interleukin, IL-l alpha and IL-l beta, in cholesteatoma tissue (Fig. 2), the skin of the external ear canal, and the retro-
auricular region was investigated (Fig. 1). Comparable
amounts of both IL- 1-species were found in all sqamous epithelia examined, but interleulcin in cholesteatoma epithelium was increased in comparison with normal epidermis. All cellular layers stained uniformly and equally strongly for IL- 1 alpha and IL- 1 beta, whereas the dead cells of the keratin layer
were negative for both. Some intensely stained cells were found scattered in the connective tissue underlying the basal layer of the cholesteatoma (Fig. 4). Using double staining
techniques these cells were shown to be mainly macrophages (Fig. 6). Our results suggest that IL-i could be liberated from disintegrating keratinocytes and cells of the monocyte-/macrophage lineage, and stimulate the proliferation of the cholesteatoma epithelium in an autocrine manner, thus contributing to the increased bone destruction seen in cholesteatoma.
Diese Eigenschaften machen IL- 1 zu cinem idealen Kandidaten für eine Rolle in der Pathogenese des Cholesteatomes. Zwei verschiedene Spezies sind bisher im Detail
analysiert, IL-i alpha und IL-i beta (2i). Sic weisen nur eine 26 %ige Homologie auf, scheinen jedoch dieselben Rezeptoren zu binden und fast dieselben zellulären Antworten hervorzuru-
fen (8.15.23). Wir haben in dieser Arbeit die Verteilung von IL-i alpha und IL- 1 beta im verhornenden Plattenepithel des Cholesteatoms mit Hilfe von hochspezifischen polyklonalcn Antikdrpern und der Peroxidase-anti Peroxidase-Methode untersucht. Weiterhin haben wir die Natur der lL-l-positiven Zellen analysiert.
* Auszugswcisc vorgetragcn auf dcr 62. Jahresversammlung der Dcut-
schen Gesellschaft für Hals-Nasea-Ohren-Heilkundc. Kopf- und Hais-Chirurgie in Aaehen 1991.
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Ludwig-Maximilians-Universität, Klinikum Grofihadern, Klinik und Poliklinik ifir Hals-, Nasen- und Ohrenkranke, Mflnchen (Direktor: Prof Dr. E. Kasteobauer)
Laryngo-Rhino-Otol. 71 (1992)
Material und Methoden ivIaterialgewinnung: Die Proben wurden unmittelbar wahrend der Operation gewonnen, eingefroren in flOssigem Stiekstnff
und ansehlieflend bei 80 'C gelagert. AntikOrper und irnmunhistocheinische Reagentien: Polykionale Kaninehen-Antikdrper gegen rekombinantes mensehliehes IL-i alpha und IL-i beta (Genzyme, Boston, USA) wurden verwendet. Der Antikdrper gegen IL-I alpha reagierte im Radioimmunoassay und Enzymimmunoassay (ELISA) in einem Bereieh von lOng bis 100 pg nicht uber Kreuz mit IL-I beta. Gieiehes gait umgekehrt. Beide Antiseren sind naeh Angaben des Herstellers gleiebwertig in der Neutralisation der Bioaktivität von IL-i alpha und IL-I beta im Thymozyten-Kostimulations-Assay. Sie sind ebenso gleieh sensitiv in der Erkennung des zugeordneten Antigens im Western- Blot. Für die DoppelfErbungen wurden die Antikorper 1(1-MS (Boehringer, Mannheim), der mit dem phagozytierenden Kompartiment der Monozyten- / Makrophagen-Reihe reagiert und sehr verlaOlieh dermale Phagozyten erkennt, und der antiCD3-AntikOrper (DAKO T3, DAKO Diagnostika, Hamburg), der an das CD3-Antigen aller T-Zellen bindet, verwendet. Der Kaninehen-Peroxi dase-anti Peroxidase(PAP)-Kornplex, der Maus-Alkalisehe Phosphatase-Anti Alkalisehe Phosphatase-Komplex und die BrOekenantikOrper wnrden von DAKO Diagnostika, Hamburg, bezogen.
V Schilling, I Bufla, B. Negri, P2. Kastenbauer
dem Antikörper gegen IL- 1 alpha anfdrbbar zu sein. Obwohl anti-IL-i alpha regelmäliig eine geringfligig stdrkere FErbung hervorrief als anti-IL-I beta, wenn Schnitte mit beiden Antikör-
pern in derselben Sitzung inkubiert wurden, bleibt es doch sehwierig, mit Sicherheit die relativen Mengen von IL-i alpha und IL-i beta anzugeben.
Warden dagegen Sehnitte von an das Ohr angrenzender Haut and Cholesteatomgewebe parallel and mit identisehen Antikörper-VerdUnnungen bearbeitet, konnte em si-
gnifikant hoherer Gehalt an IL-I alpha and IL-i beta in den Keratinozyten des Cholesteatomes festgestellt werden (Abb. 2). Die Keratinschicht erschien frei von immunologisch nachweis-
barem IL-i. Weiterhin konnten wir in unseren Proben keine Differenzierung zwischen membrangebundenem and zytoplasmatisehem IL-I vornehmen.
Earbetechnik: Bei 20 'C wurden 4 p.m dieke Gefrierselinitte angefertigt, die ansehhel3end auf gelatinisierte Objekttrager aufgebraeht, zwei Stunden an der Luft getroeknet, in Aluminiumfolie gewiekelt nnd dann bei 80 'C gelagert wurden. Vor der Fhrbung wurden die Objektträger in Azeton für 10 mm fixiert. Gleiehzeitig wurden sie mit 0,3 %igem Wasserstoffperoxid behandeit, urn die endogene Peroxidaseaktivitat zu hemmen. Alle VerdOnnnngen wurden in 5 %igem normalen Sehweineserum (DAKO) vorgenommen. Der erste Antikbrper war 1: 20 verdOnnt, der BrUekenantikorper nnd der PAP-Komplex je 1: 100. Die Inkubatinnszeiten betrugen für den ersten Antikorper, für den BruekenantikOrper und den PAP-Komplex jeweils 30 Minuten in einer feuehten Kammer. Um die Sensitivität zu erhbhen, wurden der Brüekenantikdrper und der PAP-Knmplex jeweils noeh einmal für 10 Minuten appliziert. Als Farbstnff diente 3-Amino-9-hthyiearbazol, und die Objekttrfger wurden ansehheüend mit Harnatoxyhn gegengeffirbt. Die jeweihgen Proben warden parallel und mit identisehen Lösungen inkubiert, urn die Variabihtht der Farbung dureh teehnisehe Ungenauigkeiten so klein wie mogheh zu halten und zu ermOgliehen, daB die Farbeintensitat bei versehiedenen Geweben miteinander vergliehen werden konnte. LieO man den ersten Antikörper weg (negative KontrolIc), konnte keine Hintergrundfhrbung verzeiehnet werden.
Doppelfdrbungen: Naehdem der erste Farbesehritt wie oben angegeben mit Hilfe der PAP-Methode abgesehlossen war, wurde vor der GegenfOrbung mit Hamatoxylin die zweite Antikorperreaktion unter Verwendung der Aikalisehen Phosphatase-Anti Alkalisehe Phosphatase-Methode siehtbar gemaeht. Hierzu wurde Ki-M8 in S%igem Sehweineserum 1: 500 verdünnt, anti-CD3 I : 100. Die Inkubationszeiten warden vie bei der PAP-Methode gewfhlt. Naeh AbsehluB der immunreaktion warden die Sehnitte naeh der Neofuehsinmethode 20 Minuten mit Naphthol-AS-Biphosphat und ansehlieBend mit Hamatoxylin für 5 Minuten gefdrbt. Aueh hier konnte in der Negativkontrolle bei Weglassen des ersten Antikdrpers keine Hintergrundreaktion naehgewiesen werden.
Ergebnisse Normale Epidermis zweier versehiedener, nahe am Mittelohr gelegener Regionen, ndmiieh Gehorgang and re-
troaurikuldrer Bereieh, zeigte eine deutlieh positive Färbung vergleiehbarer Intensitdt für IL-I alpha and IL-i beta. Alle Zelllagen der Epidermis seheinen IL-i unabhdn gig von ihrem Differenzierungsgrad zu enthaiten (Abb. 1). Die basale Zellage der
retroaurikuldren Haut seheint hingegen am deutliehsten mit
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Abb. 1 Gefrinischnitt von retroaurikularer Haul, inkubiert mit einem polykionalen AntikOrper gegen IL-i beta. PAP-Technik. Man erkennt eine deutliche Antarbung der basalen Zellage und nine schwachere Reaktion auch mit den Qbrigen Zellschichten. Gegenfarbung mit Hamatoxylin (200fache VergrOBerung).
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Abb. 2 Gefriersehnitt von Cholesteatomgewebe, inkubiert mit einem polyklonalen Antikorper gegen IL-i beta. PAP-Technik. Sdmtliche Schichten des Cholesteatomepithels zeigen nine deutlich positive Reaktinn mit dem Antikdrper. Eine Unterscheidung zwischen membrangebundenem und zytoplasmatischem IL-i ist nicht mOglich. Gegenfarbung mit Hamatoxylin (400fache VergrOBerung).
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Interleukin 1-enthaltende Zellen un Cho/esteatom des Mittelohres
Tm Bindegewebe unter dern Cholesteatornepithel waren einige Zellen erkennbar, die deutlich intensiver als die Keratinozyten mit den Antikorpern reagierten (Abb. 4). Im Gegensatz hierzu waren IL- 1-positive Zellen im Strorna normaicr Haut kaum zu finden.
Inkubierte man die Schnitte im Rahmen der Doppelfdrbungen mit einem zweiten Antikdrper, der alle T-Zellen erkennt (anti-CD-3), so reagierten einzelne der IL-1-positiyen Zeilen im Stroma des Cholesteatoms auch mit diesern Antikorper und stellen somit T-Zellen dar (Abb. 5). Die
gende Zahi der IL-I -positiven Zellen wird jedoch durch den
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Antikorper Ki-M8 erkannt und läBt sich daher der Gruppe der Makrophagen zuordnen (Abb. 6).
Diskussion Wie bere its in der detaillierten Arbeit von Antti/a u. Mitarb. (3) beschrieben, beeinflul3t die Auswahl der Gewebepraparation isnd des ersten Antikorpers die relative Farbeintensität für IL-i alpha und IL-i beta ausgesprochen stark. Aus diesem Grund wurden in der vorliegenden Arbeit Gefrierschriitte und die Azetonfixation als Vorbehandiung ausgewählt, urn em Maximum an Gewebearchitektur und antigenen Struk-
turen der individuellen Proteine zu erhalten. Die messengerRNA von IL-I alpha so]1 in Keratinozyten vorherrschen (17), aber wir konnten lediglich eine geringfugig höhere Intensität der Färbung für IL-I alpha im Vergleich zu IL-i beta in alien untersuchten Plattenepithelien nachweisen. Dieser Befund befindet sich in Einkiang mit den imrnunhistochemischen Unter-
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.., F; it4-i4 Abb.3 Gefrierschnitt von Cholesteatomgewebe, inkubiert mit
Abb. 4 Gefrierschnitt von Cholesteatomgewebe, inkubiert mit
einem polykionalen Antikbrper gegen IL-i alpha. PAP-Technik. Die erkennbaren Hohlrãume sind von einem einschichtigen kubischen Epithel ausgekleidet, das nicht mit dem verwendeten AntikOrper reagiert und am ehesten Resten von Mittelohrmukosa entspricht. Gegenfarbung mit Hämatoxylin (200fache Vergroulerung).
einem polyklonalen AntikOrper gegen IL-i alpha. PAP-Technik. Man erkennt deutlich das bindegewebige Stroma und in ihm verstreut stark IL-i-positive Zellen. Gegenfarbung mit Hamatoxylin (400fache VergrOllerung).
Abb. 5 Gefrierschnitt von Cholesteatomgewebe, inkubiert mit einem polykionalen Antikorper gegen IL-i alpha. PAP-Technik. Im zweiten Schritt Reaktion mit einem monoklonalen Antikörper gegen CD-3. APAAP-Technik. Die für beide Antikorper positiven Zellen entsprechen 1-Zellen. Gegenfärbung mit Hamatoxylin (l000fache Ver-
Abb. 6 Gefrierschnitt von Cholesteatomgewebe, inkubieü mit einem polyklonalen Antikorper gegen IL-i alpha. PAP-Technik. Im zweiten Schritt Reaktion mit dem monoklonalen Antikorper Ki-M8, der die meisten der dermalen Phagozyten erkennt. APAAP-Technik. Die für beide AntikOrper positiven Zellen entsprechen Makrophagen. Gegenfarbung mit Hamatoxylin (i000fache VergroBerung)
grol3erung).
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An einigen Schnitten konnten Hohlräume im bindegewebigen Stroma gefunden werden, die von einem isoprismatischen Epithel ausgekleidet waren. Daher lag es nahe, daB es sich hierbei urn Reste von Mittelohrmukosa handelt. Diese Zellen waren negativ fir IL-i (Abb.3).
Laryngo-Rhino-Otol. 71 (1992) 273
Lwyngo-Rhino-Otol. 71(1992)
suchungen von Anttila u. Mitarb. (3). Das Muster der Anfdrbung ifir IL-i ffir retroaurikuläre und Gehörgangshaut scheint dasselbe zu scm wie für Haut von anderen Körperregionen (3).
In unseren Untersuchungen zeigte die basale Zeilage des Cholesteatomepithels kein besonders intensives Färbeverhalten für IL-I, wie es von Ahn u. Mitarb. (2) angegeben wurde. Dieser Unterschied könnte auf euler unterschiedlichen Empfindlichkeit der Epitoperkennung verschiedener Antiseren und monokionaler Antikorper beruhen (3).
Tm Hinblick auf semen deutlich erhöhten Gehalt an Interleukin I scheint sich das Cholesteatomepithel wie aktivierte Keratinozyten zu verhalten (16). Da dieser Zeiltyp aber auch Rezeptoren für eine Reihe anderer Zytokine beherbergt, könnte die IL-i-Stimulation von synergistischen Effekten verschiedener Faktoren auf das Cholesteatomepithel herrühren.
Eine beträchtliche Zahi von Zellen im Bindegewebe unterhaib des Cholesteatomepithels zeigt eine deutliche Reaktion mit IL-i. Unsere Doppelfdrbungen verdeutlichen, daB
diese Zellen vorwiegend zum Monozyten-/Makrophagen-System gehoren und entweder einen Entzilndungs- oder einen Tmmunprozel3 im dem Cholesteatomepithel benachbarten Gewebe
anzeigen. IL-i ist em wichtiges extrazelluläres Signal in der spezifischen Monozyten-Lymphozyten-Interaktion und wird nicht als wesentliches Monozytenprodukt angesehen. Die mononukleären Zeilen, die in der Lage sind, reifes IL-I Zn sezernieren (13), gelten ais eine andere wichtige Queue von IL-i im erkrankten Mittelohr. Der Differenzierungsgrad und die funktionellen Eigenschaften der IL-i- positiven Monozyten im Cholesteatom bleiben noch zu untersuchen.
Em kleinerer Teil der IL-1-positiven Zellen im Stroma ist nach den Doppelfdrbungen positiv für CD-3 (Abb. 5), entspricht also T- Zellen. Die Fähigkeit von einigen T-ZeIlen,
V Schilling, J Bufla, B. IVegri, E. Kastenbauer
Anfdrbung für IL-i (2 und diese Arbeit). Ob die IL-I-Moleküle in der Keratinmasse durch irgendeinen Mechanismus zerstört oder einfach beim Färbevorgang ausgewaschen werden, bleibt zu kiären.
Neben den Keratinozyten stimulieren IL-I a!pha und IL-i beta auch die Proliferation norrnaier humaner Hautfibrobiasten (23) sowie embryonaier Lungenfibroblasten, in denen hochaffine Rezeptoren nachgewiesen wurden (6). IL-i könnte als parakriner Auslöser des Fibrobiastenwachstums im Cholesteatom flingieren, wodurch der zeiiuiãre Nachschub gesichert würde, wenn das Plattenepithel proiiferiert. Ahn u. Mitarb. (2) betonen die mögiiche Induktion von Knochenabbauvorgangen durch IL-i, das im Cholesteatomepithel produziert wird. Obwohl diese Hypothese attraktiv ist, ist der Nachweis die bioiogische Aktivität des IL-i im Cholesteatom noch nicht geftihrt. Sie wiesen ledigiich IL-i in Cholesteatomschnitten nach. Besonders zu beachten ist bier ei-
ne mögiiche Wechseiwirkung mit IL-I-Inhibitoren, wie sie schon bei anderen Erkrankungen beschrieben wurde (18). Obwohi IL-i alpha'/NmRNA in Keratinozyten starker exprimiert zu sein scheint als IL-i beta1/NmRNA (17) und beide Spezies verschiedenen Regulationsmechanismen unterliegen könnten, spezifizieren Ahn u. Mitarb. (2) in ihrer Arbeit nicht das Molekül, das ihr Antikorper erkennt. Sie beschreiben alierdings eine erhöhte Menge von IL-i in den basalen Schichten des Cholesteatomepithels, em Befund, den wir nicht bestãtigen können, da wir eine starke und gleichmällige Färbung ailer Zeflschichten beobachteten.
Dewhirst u. Mitarb. (7) berichtcten Uber die Isoiierung eines vorherrschenden knochenresorbierenden Proteins im stimulierten Leukozyten-Kulturmedium and wiesen seine Identität mit IL-i beta nach. Weiterhin wurde gezeigt, daB rekombinantes murines IL-i beta eine erhebliche Knochende-
IL-i zu produzieren, ist bekannt (1). Damit könnte sich dieser Zeiltyp im Sinne einer autokrinen Stimulation selbst aktivieren und könnte weiterhin in den ProzeB von Wundheilung und Fibrose einbezogen sein, da IL-i die Proliferation von Fibroblasten induziert.
struktion hervorrufen kann (10). Auch IL-u alpha ist in der
Das ungehemmte Wachstumsverhalten des
Um den Knochenabbau durch IL-I zu induzieren, sind Osteoblasten erforderlich (26). IL-I stimuliert nicht direkt die vorherrschenden knochenresorbierenden Zellen, die Osteoklasten. Wahrscheinlich werden noch unbekannte Osteoblastenprodukte durch IL-i -Einwirkung ausgeschuttet, die die koordiriierte Demineralization und den Abbau des Kollagens durch Osteoklasten vermitteln. Eine weitere Mäglichkeit ist cine direkte Interaktion zwischen Osteoblasten und Osteokiasten, die letztere zur Knochenresorption anregt.
Cholesteatomepithels ist unter Otologen gut bekannt. IL-i kann das Wachstum von normalen Keratinozyten stimulieren (22). In
diesem Zelltyp wurde eine wichtige IL-i-Spezies mit einem Molekulargewicht von 31 kD nachgewiesen und als nicht prozessiertes IL-I alpha erkannt (5). Deshalb wurde angenommen (5), dali der IL-i aipha-Vorläufer in einen intrazellulären, autokrinen Signaiweg im Keratinozyten eingebunden sein könnte. Andererseits könnte IL-i von terminal differenzierten Epithelzellen freigesetzt werden, in den abgeschilferten Keratinschuppen akkumulieren und auf unreifere epitheliale Zellschichten einwirken. Die Anwesenheit grolier IL-1-Mengen im Cholesteatom im Zusammenhang mit dem hyperproliferativen Phänotyp (25) fUhrt zu der Annahme, dali dieses Zytokin einen autokrinen Mechanismus in Gang setzen könnte, indem es dem Choiesteatomepithel einen permanenten und sich selbst unterhaitenden Stimulus zur Verfugung steilen könnte.
Dem IL-i-Voriäufer fehlt em klassisches Signalpeptid (19). Membrangebundenes und intrazeliuläres IL-I wurde in normaler Epidermis nachgewiesen (3). Die Keratinschicht des Cholesteatomepithels zeigt allerdings keine positive
Lage, Knochenabbau zu stimuiieren (9). Wir konnten in diesem Zusammenhang zeigen, dali beide IL- 1 -Spezies in signifikanten Mengen im Cholesteatomepithel und in Zellen des daninterliegenden Bindegewebes nachzuweisen sind.
Weiterhin ist bekannt, daB normale und maligne entartete Keratinozyten neben IL-i auch parathormonahniiche Peptide sezernieren (14), die ebenfaiis potente Stimuiatoren für den Knochenabbau sind. Daher wird es von Interesse sein herauszufinden, ob Cholesteatomepithei parathormonähnl iche Substanzen in signifikanten Mengen synthetisiert. 1,25-Dihydroxivitamin D3 (i,25-(OH)2D3) spielt
ebenfalls eine wichtige Rolie in der Reguiation des Knochenstoffwechsels und der Differenzierung von Keratinozyten. Allein für diesen Vitamin D-Metaboliten existieren hochaffine intrazeiIuläre Rezeptoren. DaB normale menschliche Keratinozyten in
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Interleukin 1-enthaltende Zellen irn Cholesteatom des Mittelohres
werden. Die Anwesenheit eines Vitamins, das Knochenabbau durch Monozyten direkt stimuliert, scheint eine faszinierende 1-lypothese für das Cholesteatom zu sein. Allerdings bleibt es ab-
zuwarten, ob em synergistischer Effekt von IL-i, parathormonähnliclien Peptiden und 1 ,25-(OH)2D3 erforderlich ist, urn die starke Knochenresorption in der Umgebung eines Cholesteatomes zu erklären.
Danksagung
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Wir möchten an dieser SIdle Herrn Dr. Peter Schulz, Ludwig-Institut für Krebsforschung, Uppsala, Schweden, herzlich für seine enge Kooperation sowie Frau K Lempart für ihre geschickte technische Assistenz im Labor danken.
Die Arbeit wurde unterstützt durch eine Fdrderung der ,,Münchener Medizinischen Wochenschrift".
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Dr med. Vo/ker Schilling Klinik und Poliklinik für Hals-, Nasen- und Ohrenkranke der Ludwig-Maximilians-Universität München Klinikum Grollhadern Marchioninistr. 15 8000 Milnchen 70
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