--Notur w ssenschaften

Far die GroBproduktion monoklonaler AntikOrper (MAK) stehen zwei prinzipiell verschiedene Wege zur VerfiJgung: in vivo in der Bauchh(Shle von M~usen oder in vitro in verschiedenen Typen von Bioreaktoren [1, 2]. Welche Methode letztendlich zum Einsatz kommt, h~ingt von mehreren Faktoren ab, z.B. wie schnell die MAK benOtigt werden, wieviel Geld f~r die Produktion investiert werden solt, welche Mengen hergestellt werden sollen, ob humane oder murine MAK gewtinscht sind und welche biologischen Eigenschaften die Produktions-Zelle hat. Je nachdem, welcher dieser Punkte priorisiert wird, kann oder mug diese oder jene Technik eingesetzt werden. Oft miissen dabei Kompromisse eingegangen werden. Welche Techniken prinzipiell anwendbar sind und in welcher Weise die genannten Faktoren ber~cksichtigt werden massen, soll nachfolgend beschrieben werden.

Industrielle Produktion monoklonaler Antik6rper

Diethard Baron Boehringer Mannheim GmbH Fakult~it fiJr Biologie der Universitfit, W-7400 Tiibingen, Bundesrepublik Deutschland

Murine monoclonal antibodies (mabs) are produced in either mouse ascites or bioreactors (spinner culture, stirred-tank reactor, airlift reactor, hollow-fiber reactor). Human mabs are produced solely in bioreactors. Encapsulation represents a special technology. Hybridoma cells have to be adapted prior to growth in bioreactors. Of crucial importance is the construction of over-producing cell lines by cell- and gene-technological methods. Manipulated cell lines often produce modified mabs.

Naturwissenschaften 77,465-471 (1990)

© Springer-Verlag 1990

MAK-Herstellung in der Bauchh6hle yon M~iusen (Ascites-Methode) Diese Methode eignet sich nur zur Grol3-Produktion muriner, nicht aber humaner MAK. 5 • 105 bis 5 • 106 Hybridomzellen werden in die BauchhOhle (Peritoneum) von Inzucht-Mfiusen injiziert (Fig. 1). Dort finden die Zellen hinsichtlich Temperatur, pH, N~ihrstoffversorgung etc. optimale Lebensbedingungen vor, wachsen zu hohen Dichten heran und sekretieren die monoklonalen AntikOrper in die BauchhOhle, in der sich eine ser0se Fliissigkeit ansammelt, der Ascites. Zur ErhOhung der Ascites-Menge wird den Mfiusen 5 bis 7 Tage vor der Zellinokulation eine geringe Menge des Mineral(51s Pristan (2,6,10,14-Tetramethylpentadecan) ins Peritoneum injiziert, wodurch eine milde und lokale Entzandungsreaktion hervorgerufen wird. Zur Ascites-Isolierung wird in die BauchhOhle eine dt~nne Kanfile eingeffihrt, durch die die Flt~ssigkeit abtropft. Noch in der BauchhOhle verbliebene Hybridomzellen wachsen wieder heran, und es bildet sich innerhalb weniger Tage neuer Ascites, so dab die Maus nochmals punktiert werden kann, insgesamt 3- bis 4real, bevor sie stirbt oder wegen mangelnder Ascites-Bildung getOtet wird. Pro Punktion werden 2 - 3 m l Ascites mit einem MAK-Gehalt von 5 - 1 0 m g / m l erhalten, pro Maus routinemNJig etwa 50 mg an monoklonalen Antik6rpern. Sie sind jedoch noch zu etwa 20 % durch Antik6rper aus der Spendermaus verunreinigt; zur Isolierung reiner MAK mt~ssen proteinchemische Verfahren wie Ionenaustauschchromatographie oder prfiparative HPLC nachgeschaltet werden. Mit der Ascites-Methode kOnnen yon etwa 1300 Mfiusen (incl. Fehlansfitze und Verluste bei der MAK-Reinigung) maximal 50g MAK hergestellt werden, was 465

MAK-Herstellung in Bioreaktoren Anforderungen an die Zellen

PristanBehandlung

/

7 Tage I n o k u l a t i o n der Hybridomzellen

\

/ 14 Tage

i.p.

1

!

AscitesBi ldung

0,5 ml P r i s t a n

\

5x10 6 Z e l l e n

]

i.p.

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Ascites-Punktion

Zent r i fugat ion

l

U

Ascites Zellen

Fig. 1. Herstellung von monoklonalen Antik0rpern in der Bauchh6hle yon M~iusen und Gewinnung der Bauchh6hlenfltissigkeit (Ascites)

far Haltung und Handhabung entsprechende R~iumlichkeiten und geschultes Personal voraussetzt. Die Methode eignet sich auch zur Herstellung geringer Mengen an humanen MAK, wegen der AbstoBung von humanen Zellen durch das murine Immunsystem sind jedoch immungeschwfichte Tiere (bestrahlte nackte M~use) und bestimmte zellkulturtechnologische Tricks nOtig. Da diese Methode angesichts des hohen Zeit- und Kostenaufwandes und der geringen Ausbeuten (5 mg pro Maus) far eine MAK-GroBproduktion ungeeignet ist, soll hier auf weitere Details verzichtet werden [3]. Auf jeden Fall massen bei der Ascites-Produktion Mfiuse getOtet werden, was angesichts der verschfirften Tierschutzgesetze und der begraBenswerten Abschaffung aberflassiger Tierversuche besonders relevant ist. So besteht die folgerichtige Weiterentwicklung in der Suche, Etablierung und Optimierung yon in-vitro-Verfahren, d.h. die Kultivierung von Hybridomzellen in Bioreaktoren bzw. Fermentern. 466

Hybridomzellen, die in Bioreaktoren kultiviert werden sollen, mt~ssen bestimmte Kriterien erfiillen [4]: keine Kontamination durch Mycoplasmen (eine Selbstverst~ndlichkeit in der Zellkultur), Wachstum unter Serum-reduzierten (1 bis 2 % Serum) oder Serum-freien Bedingungen, hinreichende Stabilit~t gegenaber mechanischer Beanspruchung, konstante MAK-Produktionsrate, weniger als 5 % Nicht-Produzenten zu Beginn der Fermentation (d.h. die Zellen sollten frisch kloniert sein) und Wachstum in Suspension, was bei murinen Hybridomzellen meistens und bei humanen Hybridomen immer gegeben ist. Viele Hybridomzell-Typen erffillen die meisten Kriterien von sich aus, w~hrend andere erst durch Langzeitkultivierung unter entsprechenden Bedingungen umgewOhnt werden m~issen, was mit Zeit, Kosten und evtl. auch sparbaren Einschr~tnkungen hinsichtlich Wachstumsgeschwindigkeit und MAK-Produktionsleistung verbunden sein kann. Besonders wichtig ist das Wachstum unter Serum-reduzierten oder Serum-freien Bedingungen, da auf diese Weise die Herstellungskosten drastisch gesenkt werden kOnnen und die Weiterverarbeitung (down-stream processing) der MAK wegen der geringen Konzentration an begleitenden Fremdproteinen erleichtert, beschleunigt und kostenganstiger gestaltet werden kann. Allerdings sind zur Zeit gute Serum-freie Medien fast ebenso teuer wie der Zusatz von 5 bis 10% fOtalem K~lberserum (FKS), was sich jedoch bei einer steigenden Nachfrage nach derartigen Medien sicherlich ~ndern wird. Weniger gebrfiuchlich, aber bisweilen praktikabel, ist der Ersatz von fOtalem Kfilberserum dutch Serum von neugeborenen K~,lbern (new-born calf serum) oder Pferdeserum, das jedoch im Vergleich zu FKS grol3e Mengen an Immunglobulinen enth~ilt (10 mg/ml, FKS < 0,5 mg/ml) und die biochemische Aufarbeitung der MAK stark beeintr~chtigen kann bzw. die Ausbeuten deutlich reduziert.

Bioreaktoren Es gibt Reaktor-Typen, die sich hinsichtlich Anschaffungspreis, Arbeitsvolumen, MeB- und Regeltechnik, Kultivierungszeit der Zellen und maximal zu erreichende Zell- und MAK-Konzentrationen stark voneinander unterscheiden (Tabelle 1). Die einfachsten ReaktorTypen sind Spinner-Flaschen, Roller-Flaschen und Wannenstapel. Spinner-Flaschen (Fig. 2) sind ablicherweise Glasflaschen mit einem maximalen Volumen von 20 1 (Arbeitsvolumen etwa 15 1), in denen die

Tabelle 1. Die wichtigsten Typen von Bioreaktoren for die MAKProduktion 1.

2. 3. 4. 5.

Spinner-Flaschen Roller-Flaschen Wannen-Stapel Rahrkessel-Fermenter + / - Perfusion Airlift-Fermenter (ALF) + / - Perfusion Hohlfaser-Modul + / - Perfusion Enkapsulierung

02

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iiiiii iiiii

COz Zell-Ernte

Medium + Zellen RQhrst~bchen RQhrmotormotor

Fig. 2. Aufbau und Funktionsweise einer Spinner-Kultur

Zellen mit einem Magnetrahrer durchmischt und auger Temperatur und pH keine weiteren Parameter durch spezielle Sonden erfagt und reguliert werden. Die Statisierung des pH erreicht man durch den Betrieb in temperierten CO2-Brutschrfinken, Begasung in Brutrfiumen oder Zusatz yon zellkulturgfingigen Puffern, z.B. HEPES-Puffer. Ahnliches gilt auch far Roller-Flaschen, die ein Arbeitsvolumen von maximal 11 haben und bei denen die Zellen durch konstante Rotation der liegenden Flaschen durchmischt werden. Wannenstapel haben ein variables Volumen, und die Zellen werden nicht mechanisch durchmischt. Allerdings werden Rollerflaschen und Wannenstapel mehr fiir die Kultivierung adh~renter Zellen als far Suspensionszellen verwandt. Alle drei Systeme sind vergleichsweise billig, erfordern keine aufwendige Elektronik und sind einfach zu bedienen, haben jedoch den grogen Nachteil, dag die Zellen wegen des Fehlens von Kontroll- und RegulierungsmOglichkeiten sehr rasch in unganstige Wachstumsbedingungen geraten (saurer pH, Mangel an Sauerstoff, Verarmung des Mediums an essentiellen Nfihrstoffen und Faktoren), so dab die Kulturen nach 7 bis 10 Tagen geerntet werden massen und nur Zelldichten von etwa 2. 106/ml und durchschnittliche MAK-Konzentrationen von 50#g/ml er-

reicht werden, ein Wert, der natarlich stark von der Produktionsleistung der Hybridomzellen abh~ngt. Eine wesentliche Verbesserung stellen die klassischen Rahrkessel-Fermenter dar (Fig. 3), die schon seit Jahrzehnten zur Kultivierung von Mikroorganismen verwendet werden, zur Hybridom-Kultivierung abet noch hinsichtlich Kesselverhfiltnis (HOhe zu Durchmesser etwa 2:1), Begasungs-Methoden, DurchmischungsPrinzip und Mediumregenerierungs-Systemen konstruktiv ver~tndert werden massen. Sie haben ein sehr variables Arbeitsvolumen von 500ml bis 100001 und kOnnen mit ausgefeilter Meg- und Regelelektronik ausgestattet werden, so dag pH, Po2, Pco2, Redox-Potential, Temperatur, Rahrleistung und Trabung gemessen und nach Bedarf reguliert werden kOnnen. Far die Zelldurchmischung stehen mehrere Rahrwerk-Typen zur Verfagung (Blattrahrer, Plattenrahrer, gegenlfiufige Propeller, Transportschrauben etc.), und die Entwicklung besserer Rahrsysteme hfilt immer noch an. Mit der klassischen Rahrkessel-Technologie werden in etwa 14 Tagen Kultivierungsdauer Zell-Endkonzentrationen von 4-106/ml und MAK-Konzentrationen von ca. 200 #g/ml erreicht. Trotz der fortgeschrittenen Technologie hat dieser Reaktor-Typ noch zwei Schwachpunkte: eine rasche Verarmung des Mediums an essentiellen Nfihr- und Wachstumsstoffen und eine relativ starke Beanspruchung der Zellen dutch die mechanische Durchmischung. Die Verarmung kann durch kontinuierliche Zugabe definierter Mediumskomponenten behoben werden, was aber selten geschieht, oder durch die Perfusionstechnik (s. unten). Die mechanische Beanspruchung kann durch andere Reaktortypen reduziert werden. Beim Airlift-Reaktor, der in Dimensionen bis 8 0001 far die MAK-Produktion eingesetzt wird, werden die Zellen durch einen kontinuierlichen und gerichteten Flt~ssigkeitsstrom durchmischt, der durch aufsteigende, am Boden des Reaktors austretende Luftblasen erzeugt wird (Fig. 4). Er kann ebenfalls mit aufwendiger Meg- und Regeltechnik bestackt und mit der Perfusionsmethode kombiniert werden; in 2 - 3 Wochen Reaktorbetrieb werden Zelldichten bis 5. 106/ml und MAK-Konzentrationen bis 400/~g/ml erreicht. Allerdings werden die Zellen mehr gestregt, als man auf den ersten Blick vermuten sollte. Es hat sich in der Praxis gezeigt, dab an der Grenzflfiche zwischen Luftblase und Flt~ssigkeit hohe Spannungskr~fte auftreten, die empfindliche Zellen schfidigen kOnnen. Ganz anders liegen die Verhfiltnisse beim HohlfaserReaktor (Fig. 5). Die zentrale Einheit ist eine Plastikr6hre (Modul) mit einem Volumen von etwa 1 bis 2 1, in der sich ein Bandel aus ca. 400 porOsen Glas- und Plastikkapillaren befindet, deren Poren ein Ausschlugmolekulargewicht von etwa 10000 Dalton haben. In Fig. 5 ist eine Kapillare mit den Poren vergr6467

= RI]hrgeschwindigkeit

@:ruc NghrlSsung pO,pCO,pHI

~o

optische Dichte Biornasse)

(~

Temperalu~r }====~~~ ~"2~

Produktentnahme

HeizunglKOhlung

Fig.3.AufbauundFunktionsweiseeinesFermenters(Rt~hrkesselFermenter)

Luft Auslass

Elnlass

t

II

oo°1:0°1 I

' Io:o/oo°l

I

Fig.4.AufbauundFunktionsweiseeinesAirlift-Reaktors 468

Sterilfilter

@

Luft Kontrolle

Bert dargestellt. Die Hybridomzellen befinden sich auBerhalb der Kapillaren im sogenannten extrakapillaten Raum (ca. 300-600 ml) und werden dutch Diffusion mit frischem N~ihrmedium versorgt, das st~indig durch die Kapillaren gepumpt wird. Die niedrige AusschluBgrenze hat zwei Vorteile: erstens bleiben die meisten Serum-Komponenten im extrakapillaren Raum, so dab das zirkulierende Medium kein Serum enthalten muB, und zweitens bleiben auch die MAK im extrakapillaren Raum, werden konzentriert und nicht dutch das Nahrmedium verdannt wie bei den iibrigen, bisher beschriebenen Reaktor-Typen. So werden extrem hohe Zelldichten yon etwa 108 pro ml extrakapillarem Volumen und MAK-Konzentrationen von mehr als 1 mg/ml erreicht. Der besondere Vorteil des HohlfaserReaktors besteht darin, dab die Zellen unter tiberaus schonenden Bedingungen heranwachsen und weder bewegt noch mechanisch belastet werden, auch empfindlichste Zellen gedeihen. Nachteile sind der hohe Mediumverbrauch und das geringe Arbeitsvolumen, das jedoch durch Hintereinanderschalten von maximal 10 Modulen betr~ichtlich vergr0Bert werden kann. Riihrkessel-Fermenter, Airlift-Fermenter und Hohlfaser-Reaktor k0nnen mit Perfusionsanlagen kombiniert

.

.

.

.

n e u e s Medium m l t Serum

:

Ernte-Tank Zel len

::::::::::::::::::::::::::

lang, und die Fermentierung wird dann abgebrochen, wenn die Zellen den Kugel-Innenraum ausgeftillt haben und Zelldichten von etwa 108/ml und MAK-Konzentrationen von 1 mg/ml Innenraum erreicht sind. Allerdings ist im Endstadium der Fermentation die Zell-Vitalit~it oft signifikant beeintr~ichtigt, es kOnnen bis 20 % tote Zellen vorhanden sein. Wegen technischer Probleme bet der Enkapsulierung und der Ernte der MAK sowie wegen der reduzierten Zell-Vitalit~it hat sich diese Methode noch nicht durchgesetzt; Experten sehen in ihr jedoch eine zukunftsweisende Technologie.

Hohl f a s e r - M o d u l

Basal-Medium ohne S e r u m

Probleme, Probleml6sungen und zukiinftige Entwicklungen

MediumVorbereitung

Fig. 5. Aufbau und Funktionsweise eines Hohlfaser-Reaktors

werden, durch die das verbrauchte Medium nach dem Dialyse- und Gegenstrom-Prinzip st~indig regeneriert wird und so die Verarmung an essentiellen N~ihrstoffen weitgehend kompensiert werden kann. Daraus resultiert jedoch ein hoher Mediumverbrauch, so dab sich dieses Prinzip nur in kleinem MaBstab (Reaktorvotumen bzw. Mediummenge bis 100 1) verwirklichen l~il3t. Auf weitere M6glichkeiten und Reaktor-Typen ftir die MAK-Produktion, wie Kultivierung in DialyseSchl~iuchen [5], Keramik-Reaktor, Festbett-Reaktor mit por6sen Glaskugeln oder Festbett-Schwamm-Reaktor, soll hier nicht n~iher eingegangen werden, da sie (noch) von untergeordneter Bedeutung sind. Die lange Liste an verschiedenen Reaktoren verdeutlicht jedoch, dag auf diesem Gebiet eine rege Forschungs- und Entwicklungs-Aktivit~it herrscht und noch kein ideales Reaktor-System gefunden wurde. Ein vOllig anderes Prinzip stellt die Enkapsulierung dar, bet der die Hybridomzellen in semipermeablen hohlen Kagelchen (Durchmesser 0,5 bis 3mm, AusschluB-Molekulargewicht 10 000 bis 50 000 Dalton) aus polymerem Material (Alginat, Poly-L-Lysin, Polyurethan, Carrageenan, Agarose, Polyacrylamid) eingeschlossen und dann meistens in Rtihrkessel-Fermentern kultiviert werden [6, 7]. Dadurch werden die enkapsulierten Zellen vor mechanischem Streg geschtitzt, autocrine Wachstumsfaktoren und die MAK in den Ktigelchen angereichert und die Zellen durch Diffusion mit N~ihrstoffen versorgt. Die Kultivierungszeiten sind mit 3 bis 14 Wochen vergleichsweise

Bet der Grogproduktion von MAK bestehen zur Zeit drei haupts~ichliche Probleme (Tabelle 2): die geringe MAK-Produktionsrate von Hybridomzellen (durchschnittlich etwa 30#g/24h pro 106 Zellen), ihre lange Generationszeit (12 bis 24h) und die Bildung modifizierter AntikOrper, was besonders bet der Zulassung von MAK zu in-vivo-Diagnostik oder Therapie relevant ist. Nachfolgend sollen die MOglichkeiten zur Behebung dieser Probleme vorgestellt werden. Die Produktionsleistung kann dadurch erhOht werden, dab die ,,normal" produzierenden Hybridomzellen zu aberproduzierenden Zellen konvertiert werden, wofiir sich zellkulturtechnologische und gentechnologische Methoden anbieten. Zur ersten Kategorie zfihlen die Behandlung der Zellen mit kurzkettigen Fettsguren (Butters~ure), langkettigen Fetts~iuren (Undecyls~ure), Dimethylsulfoxid, Tumorpromotoren (z.B. PhorbolMeristyl-Acetat), Cytostatika (Cycloheximid), Mutagenen (N-Nitroso-Methyl-Harnstoff, Ethyl-MethanSulfonat) und UV-Bestrahlung; weitere MOglichkeiten sind die Passage durch eine syngene Maus und die Zell-Fusion mit sich selbst. Die meisten dieser Methoden fiihren jedoch nur selten zum Erfolg, da sie mehr oder weniger auf Mutationsvorg~inge abzielen, die mit einer H~ufigkeit von 10 .3 bis 10 . 4 im Bereich der Synthese- und Regulationsgene fiir AntikOrper zufiillig auftreten und im giinstigen Fall zur Erh0hung der MAK-Produktionsrate ftihren. Das ist jedoch eine sehr ,,blinde" und ungerichtete Vorgehensweise nach Tabelle 2. Die derzeitigen Hauptprobleme bet der grol3technischen Produktion yon MAK 1. 2. 3.

Geringe MAK-Produktions-Rate der S~iuger-Zellen L6sung: Oberproduzenten Lange Generationszeit der Sguger-Zellen L6sung: MAK-Produktion in Hefen oder Bakterien Bildung modifizierter MAK bet der Fermentation LOsung: sensitive Analytik

469

dem Prinzip ,,Hoffnung", wobei die Hauptschwierigkeit im Erfassen dieses Mutationsereignisses in einer Hybridomzell-Population (mindestens 104 Zellen) liegt. Daftir eignet sich nur die Einzel-Zellablage, was bedeutet, dab die Vertiefungen von mehr als einhundeft 96er Mikrotiterplatten quantitativ zu testen wgten, um zumindest einen mutierten Zellklon zu erfassen, was praktisch unm0glich ist. Wesentlich transparenter und zielgerichteter sind die gentechnologischen Methoden, bei denen bestimmte Produzenten-Linien mit den MAK-Genen transformiert werden. Dabei mt~ssen folgende Schritte durchlaufen werden: indirekte Identifizierung und Isolierung der Gene fiir die Immunglobuline (Ig) tiber die cDNA, Klonierung der MAK-Gene (= cDNA), Auswahl oder Konstruktion eines geeigneten Vektors, Insertion der MAK-Gene, Klonierung des Konstruktes, Auswahl von geeigneten Produzenten-Zellen, Transformation der Zellen und Kultivierung in Bio-Reaktoren. Insgesamt miissen etwa 1 bis 2 Jahre veranschlagt werden, abh~ingig yon der genetischen Konstellation der Hybridomzelle und dem Know-how des Labors. Von besonderer Bedeutung ist die Auswahl tier richtigen Produzenten-Zelle, die folgende Kriterien erftillen sollte: keine eigene Ig-Produktion, intakter Ig-KettenSekretionsmechanismus, hinreichende Stabilittit ftir Amplifizierungen, Wachstum in Suspension und Eignung zur Anzucht in Bioreaktoren. Zur Zeit werden als Produzenten-Zellen bevorzugt die bekannten murinen Myelomzell-Linien wie die P3x63Ag8.653 oder die P3-NS1/1-Ag4-1 genommen, da sie die Forderungen hinreichend erf~illen und, ein entscheidender Punkt, von sich aus die molekulare Ausriistung zur Synthese grol3er AntikOrper-Mengen mitbringen. Zur Steigerung der Produktionsleistung bietet sich noch die Amplifizierung der MAK-Gene in der transformierten Zell-Linie an, was aber oft mit verminderter Vitalittit und Verl~ingerung der Generationszeit verbunden ist; besser w~ire die zielgerichtete (homologe) Integration von Enhancer-Sequenzen im Bereich der Ig-Gene; in dieser speziellen Form ist das jedoch noch nicht gelungen, wohl aber die ortsspezifische Integration anderer Gene. Dieses gentechnologische Verfahren zur Erh0hung der MAK-Produktion wird bereits von einer Reihe von Labors (routinem~Big) angewandt und ist zweifelsohne die Methode der Zukunft, zumal weltweit an der Optimierung der Einzelschritte gearbeitet wird [8]. Das Problem der langen Generationszeit von eukaryontischen Produktions-Zellen kOnnte dadurch umgangen werden, dab man versucht, MAK in Hefen oder Bakterien herzustellen, was abet mit betr~ichtlichen Schwierigkeiten verbunden ist. Der Vorteil von Hefen ist ihre kurze Generationszeit, ihre problemlose Kultivierung in groBen Mengen und die Tatsache, dab sie die Antik6rper glykosylieren (Antik6rper sind von 470

Natur aus Glykoproteine), was f~ir bestimmte immunbiologische Funktionen von AntikOrpern (Komplement-Aktivierung, Halbwertszeit) ausschlaggebend ist; auBerdem besteht das Risiko, dab Antik0rper ohne Kohlenhydrate immunogene Eigenschaften annehmen. Es hat sich jedoch gezeigt, dab die durch genmanipulierte Hefen synthetisierten MAK nicht das natt~rliche Glykosylierungsmuster aufweisen (z.B. mehr Mannose-Reste, andere Zucker-Sequenz), so dab ,,unnattirliche" AntikOrper gebildet werden, deren Verwendung ftir die in-vivo-Diagnostik und Therapie am Menschen nur in Ausnahmef~illen (vitale Indikation, keine wiederholten Applikationen) mOglich ist. Normalerweise werden die MAK in signifikanten Mengen intrazellul~ir akkumuliert (mehrere Prozent des Gesaint-Proteins), so dab die Hefezellen zur Isolation der Antik0rper zuerst zerstOrt werden miissen. Durch geeignete Konstruktion des Vektors kann jedoch auch erreicht werden, daf~ die MAK ins Medium sekretiert werden, dann allerdings in Mengen von nur wenigen /~g/ml. Bleiben noch die mit MAK-Genen transformierten Bakterien. Ihr offensichtlicher Vorteil ist die kurze Generationszeit und die problemlose Ztichtung in beliebigen Mengen. Ihr entscheidender Nachteil ist jedoch, dab sie keine Glykosylierungsreaktionen durchftihren kOnnen und inaktive Antik0rper bilden. Far ein Bakterium ist ein MAK ein Fremdk0rper, der intrazellul~tr als dichtes und denaturiertes Molektilpaket in sogenannten ,,inclusion bodies" (IB, frtihere Bezeichnung ,,refractile bodies") ,,entsorgt" wird. Es ist noch nicht gelungen, aus solchen IB signifikante Mengen (> 3 %) an kompletten und nativen MAK zu gewinnen. So versucht man zur Zeit, zumindest separate Antik6rper-Ketten und Antik6rper-Fragmente (leichte Kette, Fd-Fragmente, Fab-Fragmente, einkettige AntikOrper) in Bakterien in aktiver Form herzustellen. Ein weiteres Problem ist der intrazellul~ire proteolytische Abbau der Antik/3rper-Fragmente, an dem ,,Polizisten"-Enzyme beteiligt sind, die nicht-passende oder fremde Proteine abbauen. Dieses Problem kann dadurch umgangen werden, dab spezielle, mutierte Bakterienst~imme verwendet werden, denen bestimmte Proteasen (heat-shock-Proteasen) fehlen, und/oder daf~ der Ig-Kette eine dem Bakterium ,,vertraute" Sequenz ( 7 - 1 2 Aminos~uren) gentechnologisch angeftigt wird, so dab die Proteinkette nicht mehr proteolytisch attackiert wird. Allerdings mug man dann noch, ebenfalls mit gentechnologischen Methoden, zwischen dieser ,,Eigen"-Sequenz und der eigentlichen Ig-Kette eine spezifische Spaltstelle (etwa 5 - 15 Aminos~iuren lang) einfiigen, damit nach der Isolierung der IB und nach Protein-Renaturierung die ~iberscht~ssige ,,Eigen"-Sequenz wieder mit spezifischen Proteasen abgespalten werden kann.

Das Hauptproblem liegt jedoch in der Etablierung von Methoden zur Renaturierung der aus den IB gewonnehen Antik0rper-Teite; zur Zeit kOnnen bei einkettigen AntikOrpern maximal nur etwa 12 % der in den IB vorhandenen Immunglobulin-Ketten in einer biologisch aktiven und strukturell nativen Form isoliert werden. Das ist eine vergleichsweise geringe Ausbeute, da in den IB bis 20 % des gesamten Bakterien-Proteins als denaturierte Antik0rper vorliegen, die es zu nutzen gilt. Wie bei den Hefen kann man durch geeignete Vektor-Wahl auch eine Exkretion der AntikOrper erreichen, allerdings wiederum nur in Mengen von wenigen #g/ml. Es zeichnet sich jedoch klar ab, dab es bei einem weiteren Ausbau des Repertoires an proteinchemischen und gentechnologischen Techniken in den n~ichsten 3 bis 5 Jahren mOglich sein wird, Antik0rperFragmente und evtl. sogar komplette Antik0rper durch Bakterien herstellen zu lassen. Dabei ist jedoch zu bedenken, dab man zur Zeit immer erst noch Hybridom-Zellen als Gen-Lieferanten benOtigt, bevor man mit den Bakterien arbeiten kann; noch weiter in die Zukunft reichende Entwicklungen betreffen die Etablierung von Methoden, um aus immunisierten oder sogar nicht-immunisierten Tieren und Menschen die passenden B-Zellen/Plasmazellen und letztendlich auch Gene zu isolieren und anzureichern (z.B. tiber die PCR = polymerase-chain-Reaktion), mit denen die Bakterien dann transformiert werden kOnnen. Erfolgversprechende Ans~tze in dieser Richtung gelangen bei der Herstellung von Dom~n-AntikOrpern, eine Art Mini-Antik0rper, d e r n u r noch aus der variablen Region der Schwerkette besteht und immer noch Antigen binden kann [12, 131. Bei der Produktion von MAK durch manipulierte pround eukaryontischen Zellen mug man verstgrkt mit der Bildung sogenannter modifizierter MAK rechnen,

die gegenilber den nativen Antik6rper-Molekiilen folgende Ver~inderungen aufweisen [9]: partielle proteolytische Andauung, inkorrekte Ausbildung und partielle Oxidation yon Disulfid-Brticken, Desaminierung yon Asparagin in Nachbarschaft zu Glycin und Serin, Austausch yon Methionin durch Nor-Leucin, inkorrekte Glykosylierung und ver~inderte dreidimensionale Struktur. Zur Zeit liegt die Hauptschwierigkeit auf der analytischen Seite und dem eindeutigen Nachweis derartiger struktureller Ver~inderungen. Das ist sowohl ftir den Forscher wichtig, der diese MAK herstellt und die Techniken optimieren will, als auch ftir denjenigen, der einen MAK als Medikament zulassen will und gegeniiber den Zulassungsbeh6rden in der Beweispflicht steht und zeigen muB, daf3 der biotechnologisch hergestellte MAK nativen Charakter hat [10, 11]. Zur Zeit bewegen sich beide Seiten noch in einer gewissen Grauzone, und es bedarf noch intensiver Forschungsaktivit~it, bis entsprechende Tests vorliegen, die hinreichend sensitiv, schnell, billig und aussagekr~iftig sind.

1. Birch, J. R., et al.: Trends Biotech.3, 162 (1985) 2. Handa-Corrigan,A. : Biotechnology6, 784 (1988) 3. Baron, D., Hartlaub, U.: Humane monoktonale Antik6rper. Stuttgart: G. Fischer 1987 4. Bessler, W. G., Baron, D. : Naturwissenschaften75, 496 (1988) 5. SjOgren-Jansson, E., Jansson, S.: J. Immunol. Meth. 84, 359 (1985) 6. Duff, R. : Trends Biotech.3, 167 (1985) 7. Nielsson,K., et al. : Nature 302, 629 (1983) 8. Rodwell, J. D.: ibid, 342, 99 (1989) 9. Baron, D.: Immunol. Spekt. 4, 12 (1989) 10. Emmrich, F.: Dtsch. Med. Wschr. 112, 194 (1987) 11. Krtiger, D. : Pharm. Ind. 48, 1 (1986) 12. Ward, E. S., et al. : Nature 341, 544 (1989) 13. Baron, D.: Immunol. Spekt. 5, 12 (1990)

Erratum A. Baader: An Ascending Visual Neural Pathway in Locusts Naturwissenschaften 77, 3 3 8 - 340 (1990) The legends of Figs. 1 and 2 should read: Fig. 1. A) IN 5105 of the first abdominal neuromere. Bar 100/xm. It responds to B) light-Off as well as to C) movements of the horizon to the ipsilateral side and D) to a progressive visual flow field (CF contrast frequency). E) In the wind-stimulated animal current injections into IN 5105 elicit head turns (to the ipsilateral side) and abdomen deflections (ipsilaterally and downwards) together with activity in a depressor flight muscle. Horizontal bar 0.5 s for B, E; 1 s for C, D

Fig. 2. A) Structure of IN 730 in the metathoracic ganglion. Reconstruction of a Lucifer Yellow-filled neuron. The black triangles indicate central tracheae separating the metathoracic and abdominal neuromeres. Bar 100 #m. B) Responses of 730 to the artificial horizon moving from the horizontal position (= 0 °) 25 o to the left (= downward of the monitor trace in all figures), then 50 o to the right and 25 ° back to horizontal. The histogram for eight such movements shows a preference in the response of 730 for horizon turns to the left side. C) Injection of + 7 nA (bridge not balanced) elicits a train of action potentials and subsequent head turn and abdomen deflection. Horizontal bar 0.4 s 471

[Industrial production of monoclonal antibodies].

Murine monoclonal antibodies (mabs) are produced in either mouse ascites or bioreactors (spinner culture, stirred-tank reactor, airlift reactor, hollo...
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