GENERAL

AND

COMPARATIVE

ENDOCRINOLOGY

32, 195-204 (1977)

Modifications Hypophysaires et Thyroi’diennes chez le Pleurodkle en Milieu Salin MADELEINE

OLIVEREAU, JEAN-MICHEL ET CHRISTIAN AIMAR

OLIVEREAU,

Laboratoire de Physiologie de I’lnstitut Ocianographique, 195 Rue Saint-Jacques, F 75005 Paris, et Laboratoire de Psychophysiologie et Laboratoire d’Embryo/ogie, UniversitC Pierre et Marie Curie, 4 Place Jtrssieu, F 75230 Paris, Cedex. France

Accepted February 7, 1977 L’Adaptation du PleurodMe en eau salBe (NaC!, 9 gilitre) reduit I’activitt des cellules orangeophiles ventrales de I’adCnohypophyse, stimule celle des cellules Crythrosinophiles dorso-caudales et freine celle du lobe intermkdiaire. Les donnCes publikes concemant I’osmortgulation indiquent gGralement en milieu sali une rkduction de la s&xCtion de prolactine (PRL) qui peut &tre reliCe g I’hypoactivitl des cellules orangeophiles marquCes avec un immunstrum anti-PRL ovine. La localisation des s&x&ions somatotrope (STH) et mClanocorticotrope est prt?cisCe en accord avec les r&sultats d’une Crude cytoimmunologique antkrieure. La structure histologique de la thyroide suggere I’idte d’une activitk fonctionnelle accrue en eau salCe pouvant aussi faciliter I’adaptation B ce milieu. In the pituitary gland ofP/eurode/es kept in a saline solution (NaCI, 9g/liter) for 15 days, ventral orangeophilic cells appear less active, dorsal erythrosinophilic cells enlarge, and the intermediate lobe seems less active than in freshwater animals. Caryometric data corroborate these findings. Published results on osmoregulation generally indicate that prolactin (PRL) secretion is reduced in a saline environment, an observation which may be correlated with the hypoactivity detected in the orangeophilic cells simultaneously labelled with an anti-ovine prolactin antibody. The localization of growth hormone (STH) and melanocorticotropic hormone secretion is in accordance with previous cytoimmunological data. The histological structure of the thyroid gland suggests an increased activity in saline solution which may facilitate osmotic adaptation.

Chez un Amphibien, le Pleurodkle, les variations artificielles de l’ionisation atmosphCrique (Olivereau, 1974) entrainent diverses modifications de la cin&ique des processus de la mktamorphose (Aimar et Olivereau, 1974), du comportement (Olivereau et Aimar, 1977) et de l’activiti thyroidienne (rksultats ini?dits). Aprts aCroionisation nCgative, l’effet comportemental se traduit par des sorties plus prCcoces et plus frCquentes hors du milieu aquatique, le passage B une vie terrestre coi’ncidant alors avec une k&atinisation 1 Travail en partie rCalis6 avec l’aide du CNRS. d’Ecologie Physiologique, Contrat N-1843 attribue B J.M.O. ATP

plus avancCe de la peau. Un intermkdiaire neuroendocrinien est tri% probablement impliquk dans ces effets de I’aCroionisation. Deux hormones jouent un r61e capital dans la vitesse du dkroulement de la mCtamorphose des Amphibiens, la prolactine et la thyroxine (Etkin, 1968). Avant d’aborder 1’6tude cytologique de l’hypophyse du PleurodMe soumis B I’aCroionisation, il est nCcessaire d’identifier diverses catigories cellulaires, principalement celle sCcrCtant la prolactine. Deux voies sont possibles: l’une, cytoimmunologique, permet de marquer les cellules rkagissant avec un immunsirum sp6cifique (Doerr-Schott, 1976) et a CtC appliquCe au Pleurodkle 195

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(Olivereau et al., 1976). l’autre est experimentale. Afin d’agir sur la structure des cellules a prolactine, nous avons eu recours a l’immersion en eau salee (NaCl, 9 g/litre) qui, chez une autre espece, Ambystoma mexicanurn, entraine des modifications du metabolisme hydro-mineral dont une ilevation de la natrimie et de la pression osmotique serique (Ireland et Simons, 1976) reproduites par l’injection de prolactine chez l’animal hypophysectomise place en milieu desionid (Wittouck, 1975); de plus, chez l’animal intact, la prolactine reduit la perte de sodium sans affecter la natremie (Wittouck, 1973). L’hypothese d’un freinage de la decharge de prolactine en eau salee peut done Ctre envisagee, processus qui doit entrainer une modification de la cytologic hypophysaire. MATiRlEL

ET MIkTHODES

Un lot de Pleuradeles uwltlii Michah., au milieu de la phase larvaire (proches du stade 53 de la table de Gallien et Durocher, 1957) est garde pendant 15 jours dans une solution de chlorure de sodium a 9 g/l, et compare a des temoins conserves en eau deuce, a m&me temperature (20”) et meme photoperiode (12L:12D). La region ctphalique est fix&e au Bouin Hollande sublime et la region thyroidienne au Bouin alcoolique. Les hypophyses (coupes de 4 pm) et les thyroides (5 pm) sont colorees avec le tetrachrome au bleu d’alizarine, le PAS-orange G, le ClevelandWolfe, l’aldehyde-fuchsine, et l’hematoxyline au plomb. Les surfaces nucleaires des cellules a prolactine, somatotropes et melanotropes sont mesurees, en coupe longitudinale, par planimetrie apres trace effectue avec la chambre a dessiner Wild, a un grossissement Iineaire de 1400 fois. Les moyennes de 10 valeurs pour une meme categoric cellulaire mesurees sur diverses coupes proches du plan median sagittal different au maximum de 3, 4, et 7% respectivement pour les elements PRL, STH et MSH. Les hauteurs tpitheliales de la thyroide sont mesurees dans 10 follicules par animal dans les 2 lobes. L’erreur standard de la moyenne de chaque lot est calculee a partir des valeurs moyennes pour chaque animal et les comparaisons sont effectuees selon le test t de Student. Les techniques cytoimmunologiques et les immunserums utilises ont ete dicrits anttrieurement (Olivereau et al., 1976).

RbULTATS

Les Pleurodeles &dies sont en fin de metamorphose; tous ceux en eau salee pos-

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&dent deja une peau keratinisee et plissee alors que chez ceux en eau deuce, les replis de la peau keratinide sont moins marques et dans un cas, l’ipiderme contient encore de tres nombreuses cellules de Leydig. I. Hypophyse

(u) Animaux en eau douce. La glande comprend une petite zone triangulaire rostro-ventrale correspondant a la zone tuber-ale (Dellmann et al., 1974) a proximite de laquelle s’identifient des cellules dont le cytoplasme est color-i en pourpre avec le tetrachrome et en gris avec l’himatoxyline au plomb. Elles sont glneralement en contact avec les capillaires situ& entre la lame infundibulaire et l’adenohypophyse, mais on peut aussi observer quelques cellules isolees parmi les cellules a prolactine plus caudales. 11 s’agit de cellules corticotropes en accord avec leur identification chez Rana temporaria (Larsen et al., 1971), la localisation rostrale de l’activite corticotrope chez Triturus cristatus (Mazzi et al., 1973) et nos don&es cytoimmunologiques chez le Pleurodele (Olivereau et al., 19761, obtenues avec des immunsirums anti-1-24 ACTH (Fig. 1) et anti-17-3gACTH. Dans la pars distalis, il est aise de distinguer 2 zones. L’une, rostro-ventrale, bien vascularisee, comprend essentiellement de grosses cellules arrondies aux noyaux volumineux (surface moyenne de 82,7 c 1,9 pm*) avec plusieurs nucleoles, au cytoplasme riche en granules colorables avec l’orange G et l’erythrosine. Ces elements disposes surtout a la peripherie des cordons glandulaires, generalement autour des nombreux capillaires (Fig. 6) sont rev&% par un immunsirum anti-prolactine ovine (Fig. 2). D’autres cellules plus petites, anguleuses ou allongees, pauvres en cytoplasme, contiennent des granulations glycoprotidiques PAS et AF positives, color&es avec le bleu d’aniline. Quelques cellules ont un cytoplasme peu granule, depourvu d’affinite tinctoriale nette. La 2e region plus dorsale et posterieure, beaucoup moins volumineuse et moins vas-

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THYRO’I‘DE,

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FIGS. 1-5. Immunoenzymologie de l’hypophyse du Pleurodele en eau deuce avec le comple ‘xe peroxydase-anti-peroxydase. x 375. FIG. I. Zone rostrale: IS anti’-*’ ACTH. Marquage des cellules corticotropes surtout au voisinage de la lame infundibulaire (LI) bordant le recessus infundibulaire (RI). E: Noyaux des cellules Cpendymaires. PRL et STH; zones oh prtdominent respectivement les cellules Claborant la prolactine et l’honnone somatotrope. FIG. 2. Zone ventrale: IS anti-prolactine ovine. Marquage des cellules a prolactine. V: Vaisseaux sanguir IS. FIG. 3. Zone plus dorsale entre les cellules PRL et la pars intermedia (PI). IS anti STH humaine. Marqua cse des cellules STH contenant des granulations erythrosinophiles (fleches). FIGS. 4 et 5. Lobe intermediaire a proximite de la neurohypophyse (NH). Marquage de la majorite dles cellules avec un IS antirez4 ACTH (Fig. 4) et anti-a-MSH (Fig. 5).

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Hypophyse de Pleurodele. Tetrachrome d’Herlant. Filtre vert. X 930. f 3GS. 6-9. F ‘IG. 6. Cellules a prolactine, orangeophiles densement granulees avec de gros noyaux en eau ( (fkl zhes); V: Vaisseaux sanguins. F 'IG. 7. Cellules a prolactine moins granulees avec noyau souvent plus petit, en eau sake (fleches). F 'IF. 8. Cellules somatotropes (STH) a noyau irrigulier, generalement peu granulees sauf quelques unes (flbc :he) proches de la lame infundibulaire (LI), en eau deuce. F IG. 9. Cellules STH a noyau plus volumineux et cytoplasme granule en eau sake.

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cularisee que la precedente, est composee de cellules au cytoplasme peu abondant, ma1 differencie, avec des noyaux de forme plus irreguliere (Fig. 8); seule la region proche de l’eminence mediane et de ses capillaires possede des cellules au cytoplasme finement granule colorable surtout avec l’erythrosine, au noyau contenant souvent un reseau de chromatine dense (surface moyenne de 55,5 + 2,2 pm2) et un nucleole peu rep&able. L’immunoenzymologie revble que leurs granulations sont marquees par un immunserum antisomatotrope humaine (Fig. 3). Une faible activite mitotique s’observe dans la pars distalis.

Lapars intermedia est composee de cellules tres allongees ou fusiformes (Fig. lo), surtout a la peripherie du lobe, au cytoplasme finement vacuolaire, colorable en gris clair avec l’hematoxyline au plomb. Les noyaux (surface de 969 k 2,l km2) contiennent quelques gros nucleoles. Des cellules Crythrosinophiles, probablement somatotropes, sont occasionnellement prisentes dans ce lobe dont la vascularisation parait limitee a l’interface neurointermediaire. L’etude cytoimmunologique indique que les cellules de ce lobe sont t-evelees par des immunsirums anti-o-MSH (Fig. 5) et anti-P-MSH, mais aussi anti-1-24 ACTH et anti-17-3g ACTH (Fig. 4). Elles doivent done 2tre considerees comme melanocorticotropes, en accord avec les resultats obtenus chez divers Mammiferes et Teleosteens (Olivereau et al., 1976). Quelques cellules MSH isolies peuvent s’observer dans la pars distalis, dans la zone a predominance somatotrope. (6) Animaux en eau salge. Les modifications les plus marquantes sont les suivantes: dans les cellules orangeophiles de la zone ventrale, le cytoplasme est parfois moins densement granule, le noyau est moins volumineux (61,7i1,7 pm2, soit -25,6% P < 0,001, Fig. 7) et les nucleoles peu visibles. Le maintien d’une forte colorabilite du cytoplasme dans la majorite

ET

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des cellules malgre l’atrophie nucleaire semble correspondre a une retention de granules; cette interpretation se trouve renfor&e par la conservation d’une franche fluorescence apres marquage avec I’antiprolactine ovine et conjugue fluorescent (Olivereau et al., 1977). Une activite mitotique n’est plus decelee dans cette region souvent moins vascularisee. Les cellules glycoproteiques sont legbrement hypertrophiies, surtout moins granulees que celles en eau deuce. La zone de lapars distalis ou predominent les cellules irythrosinophiles s’est developpee et en coupe sagittale mediane, elle est presque Cgale a celle occupee par les chez plusieurs cellules orangeophiles animaux. Le cytoplasme est plus abondant, bien granule surtout dans la par-tie basale adjacente aux capillaires et les noyaux sont hypertrophies (surface de 67,2 k 1,4 pm2, soit +21,8% P < 0,001, Fig. 9); les cellules bien differenciees s’etendent maintenant de l’eminence mediane jusqu’a l’extrimite caudale de la glande, tout au long de lapars in termedia.

Les cellules du lobe intermediaire ont un cytoplasme plus dense et plus colorable, geniralement moins abondant; les espaces intercellulaires sont marques dans 3 cas seulement. La surface nucleaire est reduite (74,7 + 1,5 pm2, soit -23% P < 0,001, Fig. 11) cependant la pigmentation n’est pas affectee par ce sejour en eau salee. 2. Thyroi’de (u) Animaux en eau deuce. Chez les Pleurodbles au stade 55b ou c, la thyroi’de presente un ralentissement d’activite par rapport aux stades precedents (Charlemagne, 1966) fait que nous avons pu verifier ici et sur une serie de 20 autres temoins. Les follicules ovalaires ont un epithelium de hauteur moyenne de 16,8 k 0,7 pm et les indices de resorption de la colloi’de intraluminaire sont rarement observes malgre la presence de gouttelettes

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F tcs. 10 et II. Cellules du lobe intermddiaire bordant la neurohypophyse eau deuce (Fig. IO) qu’en eau salCe (Fig. 11). x 930. F IGS. 12 et 13. Glande thyroi’de qui par&t histologiquement plus active, thyr ,oglobuline, en eau Sal&e (Fig. 13) qu’ en eau deuce (Fig. 12). x 150.

(NH) avec

paraissant indice

plus actives

de r&sorption

en de la

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THYROiDE,

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intracellulaires apicales (Fig. 12); la glande proteiques de la zone ventro-caudale puisreste cependant tres vascularis6e. sent exercer une fonction thyreotrope (b) Animaux en eau salt?e. Ce traitement confirmCe par leur activation simultanee de provoque une stimulation de l’activite celle de la glande thyroide, en accord avec thyroidienne, en particulier une augmental’interpretation proposee par Pasteels tion significative de la hauteur epitheliale (1957). (20,7 + 0,2 pm, +25% P < 0,001, Fig. 13) La distinction entre cellules PRL et celet du volume des noyaux. La peripherie de lules STH pose Cgalement un problbme. la colloide est frequemment vacuolisee et L’affinite tinctoriale envers l’orange G est l’epithelium plus sinueux est horde de caracteristique des cellules STH chez de nombreux capillaires basaux. La colloide nombreuses espbces, en particulier les est plus souvent coloree avec le bleu Poissons, et celIe envers l’erythrosine l’est d’aniline alors que chez les temoins elle a des cellules secretant la PRL dans l’ensemune affinite envers l’orange G. Cependant ble des Vertebres, interpretation envisagee en fin d’experience, aucune activite par Andrieux (1971). La signification des mitotique n’est decelee. rtsultats de l’immunofluorescence chez divers Amphibiens Anoures et Urodeles a CtC DISCUSSION discutee recemment (Doerr-Schott, 1976). L’adinohypophyse du Pleurodele a CtC Les donnees obtenues chez Pleurodeles Ctudiee par Pasteels (1957), mais la descrip(Olivereau et al., 1976) montrent que les tion pendant la metamorphose est faite en cellules orangeophiles reagissent avec un fonction de la longueur museau-anus sans immunserum (IS) anti-PRL ovine et les reference a la table de Gallien et Durocher irythrosinophiles avec 1’1s anti-STH (1957) parue la m&me an&e et il n’est pas humaine, mais nous avons aussi signale sur toujours aise de se referer aux resultats ob- certaines lames un faible marquage des celtenus a une epoque ou les cellules corticolules PRL avec 1’1s anti-STH en accord tropes et celles secretant la prolactine avec les resultats d’Hayashida ef al. (1973). n’etaient pas encore identifiees chez les De m&me, Pehlemann et Bade (1976) Vertebres inferieurs. soulignent les discordances entre cytologic La structure gedrale d&rite par An- et cytoimmunologie, mais leurs resultats (hepatectomie partielle) les drieux (197 1) est en accord avec nos obser- experimentaux vations. Les cellules hypophysaires presen- incitent a conclure que STH est Claboree contant un dimorphisme sexuel (Andrieux et par les cellules Al, orangeophiles, aux donnees de l’immunoCollenot, 1974) semblent absentes ou tres trairement Chez le Discoglosse, les rarement represent&es aux stades 55b et c. fluorescence. essentiellement Ce n’est qu’en fin de metamorphose (55b) cellules A1 produiraient qu’apparait la proteine serique liant spe- PRL, mais la source de STH reste a priciser (N’Diaye Alassane Salif, 1976). cifiquement le 17/3oestradiol chez la femelle En eau deuce, la PRL exogene stimule la (Martin et Collenot , 1975). Chez Xenopus , LH n’est decelee dans l’hypophyse qu’un a retention du sodium chez Triturus cristatus 3 mois apres la metamorphose (Evenett et (Sampietro et Vercelli, 1968), Notophthalmus (Brown et Brown, 1973) et Necturus Thornton, 1971). L’identification des cellules TSH des (Pang et Sawyer, 1974), mais ce role dans la Amphibiens pose encore un probleme et regulation de la natremie a CtC contest6 (Crim, 1972); Ambystoma peut s’adapter a meme les techniques cytoimmunologiques un milieu desionise m&me aprbs ne fournissent pas toujours des resultats (Kerstetter et Kirschner, concluants (Doerr-Schott, 1976). I1 hypophysectomie 1971) tout comme intact il suppot-te des semblerait toutefois que les cellules glyco-

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milieux plus concentres (Kirschner et al., 1971). En eau sake, la PRL exogene accr&t la retention de sodium like au milieu chez Xenopus (Giunta et al., 1973) exercant un role defavorable. Chez Pleurodeles , l’immersion en eau sake doit done reduire la d&charge de PRL comme elle le fait chez les Tel&o&ens euryhalins. La retention de granulations orangeophiles chez le Pleurodele en eau sake contraste avec la digranulation presque complete des cellules PRL chez les Teleosteens en eau de mer; ce fait par&t lie au milieu, sensiblement isosmotique pour le premier, mais hypertonique pour ces derniers, et peutCtre aussi a une duke d’adaptation limitee a 15 jours. La reduction significative de la surface nucleaire des cellules orangeophiles souligne leur hypoactivite et confirme qu’elles sont la source de prolactine, concordant avec nos donnees cytoimmunologiques (Olivereau et al., 1977). Cette interpretation est en accord avec les resultats de l’immunofluorescence chez Necturas oh sont rev&es les granulations colorees en orange vif (Thompson et Trimble, 1975), Alytes obstetricans oti le marquage s’observe dans l’hypophyse in situ (Remy et Dubois, 1974) ou greffee (Disclos et RCmy, 1974), B44fo b44f0, dans les cellules carminophiles (Hansen et Hansen, 1976) et divers Anoures et Urodeles (Doerr-Schott, 1976); seules les cellules PRL de Tritunrs seraient localisees dans une zone dorsocaudale (Vellano et ul., 1973). L’hyposicretion de PRL en milieu sale serait aussi attestee chez Xenopus par l’accroissement de l’activite Na+ = K+ATPasique de la peau impliquee dans les Cchanges ioniques (Jiirss et al., 1973), t-eponse similaire a celle notee dans les branchies de Poissons transferes en eau de mer. Le developpement des cellules erythrosinophiles semble correspondre a une secretion accrue de STH chez le Pleurodele; elle pourrait etre impliquee

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dans les modifications du metabolisme azote et glucidique d&rites en eau salee chez XenopLls (Jiirss et Schlisio, 1975) qui cependant ne prisente qu’un gain ponderal minime (Spannhof et Dittrich, 1967), mais il est bien connu que chez les Amphibiens, PRL exogtne ou endogene semble douie d’une action plus nette sur la croissance que celle de STH. La localisation dorsocaudale des cellules STH chez Pleurodeles est similaire a celle observee chez Nectophrino’ides (Zuber-Vogeli et al., 1975) et voisine de celle caudale chez B14fo (Hansen et Hansen, 1976). La signification physiologique de l’activation thyro’idienne Cvaluee d’apres la structure histologique est inconnue, mais chez Notophthalmus l’apport de thyroxine provoque une perte de sodium alors que la presence simultanee de PRL maintient une natremie normale (Brown et Brown, 1973). Une stimulation thyrdidienne confirmee par l’etude cytoenzymologique s’observe Cgalement chez de jeunes Xenoplds ileves dans un milieu contenant 12,5 g de NaCl/ litre (Spannhof et Fiedler, 1971; Spannhof et Spittler, 1974). Cette activation peut Ctre attribuee a une decharge accrue d’hormone thyreotrope, mais aussi a la reduction vraisemblable de la secretion de PRL: en effet, PRL reduit la captation de 1311 chez la Salamandre en phase terrestre (Tassava et Lorsheider, 1972) et freine la stimulation provoquee par TSH chez Xenopus hypophysectomise (Regard, 1974). L’hypoactivite des cellules du lobe intermediaire est de mime intensite chez Ambystoma et Xenoplrs (Ireland et Simons, 1976) et Plewodeles telle que peut la traduire la reduction de l’aire nucleaire, mais chez celui-ci la dilatation des espaces intercellulaires est inconstante et souvent La signification phypeu Cvidente. siologique de la reponse de ce lobe n’est pas connue car le role du gros peptide de type corticotrope elabore par lapurs inter-

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media de B&O arenawm (Estivariz et Iturriza, 1975) et Xenopus laevis (Hopkins, 1975) reste B &cider. L’action stimulante d’a-MSH sur la captation de sodium chez Bufu arenavum (Iturriza et al., 1973), qui pourrait expliquer la rkduction d’activitC de ce lobe en eau Sal&e, reste toutefois B confirmer. BIBLIOGRAPHIE Aimar, C., et Olivereau, J. M. (1974). Influences de I’ionisation atmosphtrique sur le developpement metamorphose d’un Amphibien, et la (Pleurodeles waltlii Michah., Urodele). C. R. Acad. Sci. (Paris) Ser. D 278, 1621-1624. Andrieux, B. (1971). Morphogenese et cytodifferenciation de I’hypophyse de Plearodeles waltlii Michahelles. These Doctorat, 3e cycle, Paris, pp. I-51. Andrieux, B., et Collenot, A. (1974). Determinisme du dimorphisme sexuel d’une categoric de cellules adenohypophysaires chez Pleurodeles waltlii Michah. (Amphibien, Urodele). Ann. Endocrinol. 35, 368-374. Brown, P. S., et Brown, S. C. (1973). Prolactin and thyroid hormone interactions in salt and water balance in the newt Notophthalmus viridescens. Gen.

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