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Hyperproliferationsassoziierte Keratin 1 6-Expression im Cholesteatom* V Schilling', I BujIa', Anja Holly', R Schulz2 I
Ludwig-Maximilians-Universitat, Klinikum Grol3hadern, Klinik und Polikitnik für Hals-, Nasen- und Ohrenkranke (Direktor: Prof. Dr. E. Kastenbauer)
Zusammenfassung
____________
Im geschichteten Plattenepithel korreliert die Position einer Zelle direkt mit ibrem Differenzierungszustand und mit der Expression bestimmter Zytokeratine. Mit Hilfe der hochauflösenden Gelelektrophorese und immunhistochemischer Untersuchungen (APAAP-Methode) wurden Proben von Cholesteatomen und normaler Haut auf das Vorkommen
des als Proliferationsmarker bekannten Keratins 16 (K 16) untersucht. Sowohi in den mit monokionalen Antikörpern gegen K 13/K 16 inkubierten Schnitten als auch in der Gelelektrophorese konnte K 16 nachgewiesen werden. Aus den Versuchen lied sicli ableiten, dad das Cholesteatomepithel, wie andere hyperproliferative Krankheitsbilder auch, K 16 exprisãmtliche miert, und zwar in gleichmãBiger Verteilung Epithelschichten. Somit kann das Cholesteatom als lokal
Hyperproliferation-Associated Keratin 16 Expression in the Cholesteatoma Epithelium The position of a cell in a stratified squamous epithelium correlates with its state of differentiation as well as with the expression of certain cytokeratins. By means of both
immunohistochemistry using the APAAP method and high resolution one-dimensional gel electrophoresis, specimens of cholesteatoma epithelium and normal ear skin were investigated whether they contain keratin 16 (K 16) which is known to be a marker of hyperproliferation. It could be shown that K 16 is expressed in all layers of cholesteatoma epithelium. Further
to prove this fact gel electrophoresis was used showing a protein band at the localization of keratin 16. Hence, cholesteatoma can be seen as a locally hyperproliferative disease.
hyperproliferative Erkrankung eingeordnet werden.
Schlüsselwörter Cholesteatom
Proliferation — Zytokeratine
Einleitung Im geschichteten Plattenepithel korreliert die Position euler Zelle direkt mit ihrem Differenzierungszustand und mit der Expression bestimmter Zytokeratine. Diese sind wasserunldsliche Strukturproteine, die em dichtes Netzwerk von intermediären Filamenten bilden, das sich zwischen dem Zellkern und der Plasmamembran ausspannt. Während in normaler Epidermis nur die basale Zellschicht rnitotisch aktiv ist, zeigen alle hyperproliferativen Krankheitsbilder der Haut, die bisher charakterisiert wurden, eine gestörte Architektur des verhornenden Epithels mit suprabasalen mitotischen Zellen (16). Weiterhin findet man in ihnen eine verstärkte Expression eines niedermolekularen, sauren Zytokeratins mit einem Molekulargewicht von 48 kD, das im Emlang mit Mo/i (12) als Keratin 16 (K 16) katalogisiert wird. Aus diesem Grunde wurde K 16 als molekularer Marker der Hyperproliferation von Plattenepithelien vorgeschlagen (16).
Laryngo-Rhino-Otol. 71(1992) 584 587 Georg Thieme Verlag Stuttgart . New York
Key words Cholesteatoma Proliferation — Cytokeratins
Im Mitte]ohrcholesteatom findet man verhornendes Plattenepithel, das durch ungehernmtes Wachstum charakterisiert wird. Scm hyperproliferatives Verhalten ist bisher nicht eindeutig geklkrt. In dieser Arbeit wird untersucht, ob das
Cholesteatomepithel K 16 exprimiert und sich dadurch dem hyperproliferativen Phänotyp zuordnen läl3t.
Material und Methoden 7VIaterialgewinnung: Jeweils Lehn Proben von Chole-
steatomen und normaler Haut wurden während der Operationen gewonlien, sofort in flOssigem Stickstoffeingefroren und anschliefend bei 80 C aufbewahrt.
Antikdrper und imrnunhistochenjische Reagentien.' Die Antikorper K 8.12 (8,11), em monokionaler Antikorper, der gegen die Keratine 13 und 16 gerichtet ist, und KS 1 A3, ebenfalls monokional und gegen Keratin 13 allein gerichtet, wurden von der Firma Sigma Chemical Company (St. Louis, USA) für die erste Antigen-AntikdrperReaktion erworben. Der Bruckenantikörper für die Alkalische Phosphatase-Anti Alkalische Phosphatase (APAAP) Methode, em Kaninchen
Auszugsweise vorgetragen auf dem Jubiläumskongrell der Vereinigung Südwestdeutscher Hals-Nasen-Ohren-Arzte im September 1991 in Munchen.
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2Ludwig-Institut fir Krebsforschung, Uppsala, Schweden
Hyperprolzferationsassoziierte Keratin JO-Expression irn C'holesteatoni
Laryngo-Rhino-OtoI. 71 (1992) 585
anti-Mans Immunoglobulin wurde von der Firma DAKO (Hamburg, Deutschland) bezogen und in einer Verdiinnung von 1: 100 angewandt.
Abb. 1 Gefriersehnitt von retroaurikularer Haut, inkubiert mit dem monokionalen Antikorper K 8.12 gegen K 13 und K 16.
Alle Antikdrper wurden in PBS unter Zusatz von 5 %igem normalem Sehweineserum (DAKO, Hamburg) verdunnt.
Jm,nunhistoche;nische Anfcirbung: Cholesteatomund Hautproben wurden für 10 Minuten fixiert. Um unspezifische Bindungen zu bloekieren, wurden die Sehnitte anschlieOend mit 1:5 in PBS verddnntem Schweineserum für 20 Minuten behandelt. Sodann folgte die Inkubation mit dem ersten AntikOrper für 30 Minuten in einer
feuchten Kammer bei 37 C, bevor mit dem Brüekenantikdrper und auch mit dem APAAP-Komplex ffir ebenfalls 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Um die Farbreaktion zu entwiekeln, wurde die Neu-Fuehsin-Methode (6) verwendet. Für die Negativkontrolle wurde der erste Antikorper dureb 5 %iges normales Sehweineserum ersetzt.
basale und die suprabasalen Zellschichten zeigen eine positive Reaktion mit dem AntikOrper. he ist dureh Kreuzreaktion mit den Keratinen 5 und 14 verursacht. Gegenfarbung mit Hamatoxylin (Originalvergra8erung 400fach).
—
Gewionung der Proteinfraktioneo: Die Aufarbeitung der Gewebeproben für die Geielektrophorese erfolgte naeb Wild u. Mit-
arb. (17). Naeh Wasehen in eiskaltem Ca2 und Mg2-entha1tendem EBSSH (Hepes-gepufferte Earles Salzidsung) wurde das Epithel vom darunterliegenden Bindegewebe dureb fiinfminütiges Erhitzen auf 60 C in der o. a. EBSSH-Ldsung abgelOst und ansehlie0end emeut mehnnals in eiskalter EBSSH-Ldsung gewasehen. Proben von etwa 50 mg Feuehtgewiebt wurden ansehliellend in einem Milliliter 20mM Tris-HCI, pH
Abb. 2 Gefriersehnitt von Cholesteatomgewebe, inkubiert mit dem monokionelen Antikdrper K 8.12 gegen K 13 und K 16.
7,4, aufgenommen. Zugesetzt wurden 1 mM PMSF (Phenylmethylsulfonyifluorid) undjeweils 5 sg/ml von Pepstatin und Antipain. Dureh Anwendung von Seherkraften (Potter naeb Elvehjem, 3 Minuten 1500 Umdrehungen pro Minute) und Ultrasehall (Branson Sonifier, 5 x 20 Impulse bei einer Zykluszeit von 20% und 70% Leistung) wurde das Gewebe homogenisiert. Sodann wurden Proben von 0,1 ml mit 1 ml eines Triton/Hoehsalz-Puffers (1 % Triton X-lOO, 600mM KC1, 5mM
APAAP-Teehnik.
Samtliche Schichten des Cholesteatomepithels zeigen eine
EDTA, 5mM FGTA, 50mM Tris-HC1, pH 7,4 und Protease-Inhibitoren wie oben angegeben) extrahiert. Naeh Zentrifugieren mit 40 000 x g 10 Minuten wurde der verbliebene Niedersehlag in 1 ml von 125 mM Tris-HC1, pH 6,8, aufgenommen und als Zytokeratinhaltige Fraktion für die Elektrophorese eingesetzt.
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Gelelektrophorese: Naehdem die Zytokeratinfraktionen im Elektrophoresepuffer aufgenommen waren, erfolgte die emdimensionale Trennung der Proteine unter Zusatz von Natriumdodeeylsulphat (SDS) (10). Hierzu wurden 12,5 %ige Gele einer Hbhe von t2,5 cm und einer Dieke von 0,75 mm bei einem Massenverbältms Aerylamid: Bisacrylamid von 200: 1 hergestellt. Zur Polymerisierung wurden 2jwI/ml GellOsung TEMED und 1,67 RI/mi Gellosung 10% Aminoniumpersuiphat zugesetzt. AnsehlieBend wurde die Elektrophorese mit einem LIKE-System bei einer Kammertemperatur von 20 C und einer konstanten StrornstArke von 25 mA durehgefdhrt.
Resultate Jenmunhistochemie Für die Fixierung der Schnitte, die mit den monokionalen Antikörpem K 8.12 oder KS lA3 inkubiert werden soliten, wurden verschiedene Methoden der Fixierung getestet (Formalin, Azeton, Athanol, Azeton/Ather (60/40)) und auch unfixierte Schnitte inkubiert. Für den AntikOrper K 8.12 envies sich die Azeton/Ather-Fixierung im Verhdltnis 60:40 als die beste Vorbehandlung, wdhrend die reine Azetonfixierung bei der Verwendung des K 13 erkennenden Antikorpers KS 1 A3 die besten Resultate zeitigte.
In normaler Haut wurde eine Anifirbung in den
basalen und teilweise in den suprabasalen Sehiehten siehtbar, wenn der Antikorper K 8.12 gegen K 13 und K 16 angewandt wurde (Abb. 1). Auch die Anhangsgebilde der Haut zeigten nur eine Reaktion in den basalen Sehiehten, während im Cholesteatom bei einer Verdünnung von 1: 100 sehon eine krdflige Farbung aller Epithelsehiehten zu erkennen war (Abb. 2).
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weitgehend gleichma8ig positive Reaktion mit dem AntikOrper. Gegenfarbung mit Hamstoxyiin (Originelvergrd8erung 200fech).
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Wurde die APAAP-Teehnik in Verbindung mit dem AntikOrper gegen K 13 angewandt, konnten die basalen Schichten normaler Haut bereits bei einer Verdünnung von 5000 gefdrbt werden — eine Reaktion, die auch durch Verdünnungen bis hinauf zu I : 15000 nicht verschwand (Abb. 3). Im Cholesteatom waren alle Schichten des Epithels gleichmdllig gefarbt, wobei die basale Schieht bei einer VerdUnnung von 1:500 deutlieher reagierte (Abb. 4).
Alle Kontrollversuehe, bei denen der erste AntikOrper dureh normales Sehweineserum ersetzt worden war, zeigten keine positive Reaktion.
Gelelektrophorese
In der eindimensionalen Gelelek trophorese konnte in den Hautproben kein Keratin 13 nachgewicsen werden (Bahn 2, Abb. 5), wohingegen in einigen Cholestealomproben (n = 3) eine schwache Bande in Hohe des Keratin 13 siehtbar war (Bahn 3, Abb. 5). Man erkennt dieses Keratin leicht in
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APAAP-Technik. Die
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Gefrierschnitt von Cholesteatomgewebe, inkubiert mit dem monoklonalen Antikarper KS 1A3 gegen K 13. APAAPTechnik. AntikOrper 1:500 verdUnnt. Alle Epithelschichten weisen eine gleichmaBige Anfarbung mit Betonung der Basalis auf. Gegen-
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farbung mit Hämatoxylin (Originalver-
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Abb.4
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Abb. 3 Gefrierschnitt von retroaurikulärer Haut, inkubiert mit dem monoklonalen Antikorper KS 1A3 gegen K 13. APAAP-Technik. Antikarper 1: 15000 verdUnnt. Die basale Zellschicht und vereinzelte
groBerung lOOfach).
•
Zellen der suprabasalen Zellschichten zeigen eine positive Reaktion mit dem AntikOrper (Pfeile). Kreuzreaktivitaten gegen verschiedene Keratine sind hierfUr verantwortlich. Gegenfarbung mit Hamatoxylin (OriginalvergroBerung 400fach).
Keratine I und 10 als Marker der terminalen Differenzierung in
den oberen Lagen.
—
Das Keratinmuster des Cholesteatoms wurde von Van Blitterswijk u. Mitarb. sowie Ghao und Huang (2,4) ausfGhrlich untersucht. Sie fanden eine starke Expression von Keratin 10 und nur eine fokale und inkonstante Expression der Keratine 4, 18 und 19. Hierdurch wird eine enge Verwandtschaft des Cholesteatornepithels zur Haut des äuBeren Gehörganges nahegelegt. —
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In der vorliegenden Arbeit wurde das Choleste-
Abb. 5 Vergleichende SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese dreier Gewebeproben von Gaumentonsille (Bahn 1), Haut (Bahn 2) und Cholesteatomepithel (Bahn 3). Die verschiedene Banden markierenden Zahien bezeichnen Zytokeratine nach einer international gebrauchlichen Nomenklatur.
der als Kontrolle gleichzeitig untersuchten Tonsille, die es reichlich enthält (Bahn 1, Abb. 5). In derselben Untersuchung konnte gezeigt werden, daB Keratin 16 im Cholesteatom (n =8) vorkommt, in normaler Haut dagegen fehlt. Diskussion
Norrnale Epidermis enthält in erster Linie die hochmolekularen, basischen Typ lI-Keratine 1 und 5 mit einem Molekulargewicht von 67 kD bzw. 58 kD sowie die niedermolekularen, sauren Typ 1-Keratine 10 und 14 mit einem Molekulargewicht von 56,5 bzw. 5OkD zu nennen (3,12). Meistens treten
basische und saure Keratine zueinander in Bezug. So findet man die Keratine 5 und 14 in den basalen Zellschichten und die
atom auf seine Anwesenheit von Keratin 16 untersucht, das nach Literaturauffassung (14, 16) als Marker der proliferierenden Keratinozyten angesehen wird. Man findet dementsprechend an spontan proliferierenden Keratinozyten in der Zelikultur eine starke Expression von K 16 (9). Dasselbe PhZnomen lGBt sich bei Basaliomen, Plattenepithelkarzinornen (5) oder auch bei der Psoriasis (7, 11) nachweisen. Die Expression von K 16 gibt somit keine Auskunft em
eventuell malignes Krankheitsgeschehen, sondern Jediglich eine verstärkte Proliferation des Epithels.
Das Mittelohrcholesteatom kann zwar nicht als em generell hyperproliferatives Krankheitsbild angesehen werden (1). SolIte sich allerdings em prinzipiell oder lokal hyperproliferativer Charakter bestatigen lassen, müBte in den entspre-
chenden Bereichen eine verstärkte Expression von K 16 im Vergleich zu Proben gesunder Haut vorliegen.
Der In-situ-Nachweis dieser Uberexpression war jedoch schwierig, da kein kommerziell zu erwerbender monokionaler Antikorper erhältlich ist, der isoliert K 16 erkennt. Insofern wurde versucht, durch die Reaktion benachbarter Ge-
webeschnitte mit zwei verschiedenen Antikorpern, die zum einen isoliert K 13 (KS 1A3), zum anderen K 13 und K 16 die Verteilung des Proliferationsrnarkers K 16 zu gewinnen. Weitere Schwierigkeiten bestanden darin, daB die von den Antikörpern erkannten Epitoerkennen (K 8.12), RllckschlUsse
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C' Schilling, I. BujIa, Anja Holly P Schulz
586 Laryngo-Rhino-Olol. 71(1992)
Hyperprolferationsassoziierte Keratin 16-Expression un C]holesteatoin
Fixierung getestet werden muBten, urn eirie mdglichst zuverlässige In-situ-Erkennung hervorzurufen. Verwirrend war zunächst die Anfdrbung der ba-
salen und suprabasalen Schichten der Hautproben mit beiden Antikorpem, da weder K 13 noch K 16 im verhornenden Plattenepithel gesunder Haut gefunden werden (12). Auch durch erhebliche Verdunnungen lieJ3 sich diese Anfdrbung nicht urngehen, so daB hierfür eine auch vom Hersteller zugestandene Kreuzreaktivität verantwortlich gernacht werden muBte. Diese wurde dann auch im Immunbiot nãher untersucht, urn festzustellen, mit weichen Keratinen die verwendeten Antikörper noch reagieren. Bei den Blotversuchen konnte der Nachweis erbracht werden, daB der Antikorper K 8.12 auch die Zytokeratine 5 (schwach) und 14 (stark) erkennt. Hierdurch ist die Anffirbung der basalen und suprabasalen Schichten erklärt, da diese Keratine regelmäBig in diesen Schichten vorkommen. Da im Cholesteatom darüber hinaus auch die oberhaib der Basalis liegenden Schichten angefarbt sind, die nach den Arbeiten Uber die Anwesenheit (13) und Verteilung (15) dieser Keratine dort nicht
exprimiert werden, mull die Anfdrbung in der verstärkten APAAP-Technik auf die Expression von K 16 zuruckzuffihren scm. Dies hat seine Richtigkeit, obwohl Ghao und Huang (4) in ihrer Arbeit die Anwesenheit von K 16 nicht nachweisen konnten, wenngleich sie Antikörper des gleichen Kiones (K 8.12) verwendeten. Unterschiedlich sind lediglich die Bezugsquellen. Ursächiich fir die verschiedenen Ergebnisse könnte die germgere Empfindlichkeit der angewandten Technik sein, da sich Chao und Huang der indirekten Immunfluoreszenz bedienten. Weiterhin kann angefUhrt werden, daB die indirekte lmmunfluo-
reszenz der zitierten Arbeitsgruppe auch den Nachweis einer fokalen Expression von K18 und K 19 nicht zuliell, der Van BlitterswUk u. Mitarb. (2) immunhistochemisch mit der Peroxidase-anti Peroxidase-Methode gelang. Leider zeigte sich in den Immunbiot-Versuchen mit dem zweiten Antikörper KS 1A3, daB dieser mit mehreren anderen Keratinen (K 1, K4, K5, K 10, K 18) kreuzreagiert, so daB die Interpretation der immunhistochemisehen Anifirbungen am Cholesteatom sehr erschwert wurde und damit eine sinnvolle Auswertung der Schnitte nicht mdglich war.
Urn die Anwesenheit des Zytokeratins 16 als Marker der Hyperproliferation zu untermauem, wurden noch Gelelektrophoresen, und zwar an normaler Haut, Tonsillenepithel und Cholesteatornepithel, durchgefiihrt. Hierbei konnte eine deutliche Bande für K 16 im Cholesteatomepithel sichtbar gemacht werden und damit das hyperproliferative Verhalten des Cholesteatomepithels cindeutig bewiesen werden.
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Di; med. Volker Schilling Ludwig-Maximilians-Universität Klinikum Grollhadern Klinik und Poliklinik für Hals-, Nasen- und Ohrenkranke Marchioninistr. 1 5 7000 Munchen 70
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pe durch die Fixierung in ihrer sterischen Konfiguration z.T. erheblich verändert werden, so daB differente Verfahren zur
Lwyngo-Rhino-Otol. 71 (1992) 587
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Zusammenfassung
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Im geschichteten Plattenepithel korreliert die Position einer Zelle direkt mit ibrem Differenzierungszustand und mit der Expression bestimmter Zytokeratine. Mit Hilfe der hochauflösenden Gelelektrophorese und immunhistochemischer Untersuchungen (APAAP-Methode) wurden Proben von Cholesteatomen und normaler Haut auf das Vorkommen
des als Proliferationsmarker bekannten Keratins 16 (K 16) untersucht. Sowohi in den mit monokionalen Antikörpern gegen K 13/K 16 inkubierten Schnitten als auch in der Gelelektrophorese konnte K 16 nachgewiesen werden. Aus den Versuchen lied sicli ableiten, dad das Cholesteatomepithel, wie andere hyperproliferative Krankheitsbilder auch, K 16 exprisãmtliche miert, und zwar in gleichmãBiger Verteilung Epithelschichten. Somit kann das Cholesteatom als lokal
Hyperproliferation-Associated Keratin 16 Expression in the Cholesteatoma Epithelium The position of a cell in a stratified squamous epithelium correlates with its state of differentiation as well as with the expression of certain cytokeratins. By means of both
immunohistochemistry using the APAAP method and high resolution one-dimensional gel electrophoresis, specimens of cholesteatoma epithelium and normal ear skin were investigated whether they contain keratin 16 (K 16) which is known to be a marker of hyperproliferation. It could be shown that K 16 is expressed in all layers of cholesteatoma epithelium. Further
to prove this fact gel electrophoresis was used showing a protein band at the localization of keratin 16. Hence, cholesteatoma can be seen as a locally hyperproliferative disease.
hyperproliferative Erkrankung eingeordnet werden.
Schlüsselwörter Cholesteatom
Proliferation — Zytokeratine
Einleitung Im geschichteten Plattenepithel korreliert die Position euler Zelle direkt mit ihrem Differenzierungszustand und mit der Expression bestimmter Zytokeratine. Diese sind wasserunldsliche Strukturproteine, die em dichtes Netzwerk von intermediären Filamenten bilden, das sich zwischen dem Zellkern und der Plasmamembran ausspannt. Während in normaler Epidermis nur die basale Zellschicht rnitotisch aktiv ist, zeigen alle hyperproliferativen Krankheitsbilder der Haut, die bisher charakterisiert wurden, eine gestörte Architektur des verhornenden Epithels mit suprabasalen mitotischen Zellen (16). Weiterhin findet man in ihnen eine verstärkte Expression eines niedermolekularen, sauren Zytokeratins mit einem Molekulargewicht von 48 kD, das im Emlang mit Mo/i (12) als Keratin 16 (K 16) katalogisiert wird. Aus diesem Grunde wurde K 16 als molekularer Marker der Hyperproliferation von Plattenepithelien vorgeschlagen (16).
Laryngo-Rhino-Otol. 71(1992) 584 587 Georg Thieme Verlag Stuttgart . New York
Key words Cholesteatoma Proliferation — Cytokeratins
Im Mitte]ohrcholesteatom findet man verhornendes Plattenepithel, das durch ungehernmtes Wachstum charakterisiert wird. Scm hyperproliferatives Verhalten ist bisher nicht eindeutig geklkrt. In dieser Arbeit wird untersucht, ob das
Cholesteatomepithel K 16 exprimiert und sich dadurch dem hyperproliferativen Phänotyp zuordnen läl3t.
Material und Methoden 7VIaterialgewinnung: Jeweils Lehn Proben von Chole-
steatomen und normaler Haut wurden während der Operationen gewonlien, sofort in flOssigem Stickstoffeingefroren und anschliefend bei 80 C aufbewahrt.
Antikdrper und imrnunhistochenjische Reagentien.' Die Antikorper K 8.12 (8,11), em monokionaler Antikorper, der gegen die Keratine 13 und 16 gerichtet ist, und KS 1 A3, ebenfalls monokional und gegen Keratin 13 allein gerichtet, wurden von der Firma Sigma Chemical Company (St. Louis, USA) für die erste Antigen-AntikdrperReaktion erworben. Der Bruckenantikörper für die Alkalische Phosphatase-Anti Alkalische Phosphatase (APAAP) Methode, em Kaninchen
Auszugsweise vorgetragen auf dem Jubiläumskongrell der Vereinigung Südwestdeutscher Hals-Nasen-Ohren-Arzte im September 1991 in Munchen.
Dieses Dokument wurde zum persönlichen Gebrauch heruntergeladen. Vervielfältigung nur mit Zustimmung des Verlages.
2Ludwig-Institut fir Krebsforschung, Uppsala, Schweden
Hyperprolzferationsassoziierte Keratin JO-Expression irn C'holesteatoni
Laryngo-Rhino-OtoI. 71 (1992) 585
anti-Mans Immunoglobulin wurde von der Firma DAKO (Hamburg, Deutschland) bezogen und in einer Verdiinnung von 1: 100 angewandt.
Abb. 1 Gefriersehnitt von retroaurikularer Haut, inkubiert mit dem monokionalen Antikorper K 8.12 gegen K 13 und K 16.
Alle Antikdrper wurden in PBS unter Zusatz von 5 %igem normalem Sehweineserum (DAKO, Hamburg) verdunnt.
Jm,nunhistoche;nische Anfcirbung: Cholesteatomund Hautproben wurden für 10 Minuten fixiert. Um unspezifische Bindungen zu bloekieren, wurden die Sehnitte anschlieOend mit 1:5 in PBS verddnntem Schweineserum für 20 Minuten behandelt. Sodann folgte die Inkubation mit dem ersten AntikOrper für 30 Minuten in einer
feuchten Kammer bei 37 C, bevor mit dem Brüekenantikdrper und auch mit dem APAAP-Komplex ffir ebenfalls 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Um die Farbreaktion zu entwiekeln, wurde die Neu-Fuehsin-Methode (6) verwendet. Für die Negativkontrolle wurde der erste Antikorper dureb 5 %iges normales Sehweineserum ersetzt.
basale und die suprabasalen Zellschichten zeigen eine positive Reaktion mit dem AntikOrper. he ist dureh Kreuzreaktion mit den Keratinen 5 und 14 verursacht. Gegenfarbung mit Hamatoxylin (Originalvergra8erung 400fach).
—
Gewionung der Proteinfraktioneo: Die Aufarbeitung der Gewebeproben für die Geielektrophorese erfolgte naeb Wild u. Mit-
arb. (17). Naeh Wasehen in eiskaltem Ca2 und Mg2-entha1tendem EBSSH (Hepes-gepufferte Earles Salzidsung) wurde das Epithel vom darunterliegenden Bindegewebe dureb fiinfminütiges Erhitzen auf 60 C in der o. a. EBSSH-Ldsung abgelOst und ansehlie0end emeut mehnnals in eiskalter EBSSH-Ldsung gewasehen. Proben von etwa 50 mg Feuehtgewiebt wurden ansehliellend in einem Milliliter 20mM Tris-HCI, pH
Abb. 2 Gefriersehnitt von Cholesteatomgewebe, inkubiert mit dem monokionelen Antikdrper K 8.12 gegen K 13 und K 16.
7,4, aufgenommen. Zugesetzt wurden 1 mM PMSF (Phenylmethylsulfonyifluorid) undjeweils 5 sg/ml von Pepstatin und Antipain. Dureh Anwendung von Seherkraften (Potter naeb Elvehjem, 3 Minuten 1500 Umdrehungen pro Minute) und Ultrasehall (Branson Sonifier, 5 x 20 Impulse bei einer Zykluszeit von 20% und 70% Leistung) wurde das Gewebe homogenisiert. Sodann wurden Proben von 0,1 ml mit 1 ml eines Triton/Hoehsalz-Puffers (1 % Triton X-lOO, 600mM KC1, 5mM
APAAP-Teehnik.
Samtliche Schichten des Cholesteatomepithels zeigen eine
EDTA, 5mM FGTA, 50mM Tris-HC1, pH 7,4 und Protease-Inhibitoren wie oben angegeben) extrahiert. Naeh Zentrifugieren mit 40 000 x g 10 Minuten wurde der verbliebene Niedersehlag in 1 ml von 125 mM Tris-HC1, pH 6,8, aufgenommen und als Zytokeratinhaltige Fraktion für die Elektrophorese eingesetzt.
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Gelelektrophorese: Naehdem die Zytokeratinfraktionen im Elektrophoresepuffer aufgenommen waren, erfolgte die emdimensionale Trennung der Proteine unter Zusatz von Natriumdodeeylsulphat (SDS) (10). Hierzu wurden 12,5 %ige Gele einer Hbhe von t2,5 cm und einer Dieke von 0,75 mm bei einem Massenverbältms Aerylamid: Bisacrylamid von 200: 1 hergestellt. Zur Polymerisierung wurden 2jwI/ml GellOsung TEMED und 1,67 RI/mi Gellosung 10% Aminoniumpersuiphat zugesetzt. AnsehlieBend wurde die Elektrophorese mit einem LIKE-System bei einer Kammertemperatur von 20 C und einer konstanten StrornstArke von 25 mA durehgefdhrt.
Resultate Jenmunhistochemie Für die Fixierung der Schnitte, die mit den monokionalen Antikörpem K 8.12 oder KS lA3 inkubiert werden soliten, wurden verschiedene Methoden der Fixierung getestet (Formalin, Azeton, Athanol, Azeton/Ather (60/40)) und auch unfixierte Schnitte inkubiert. Für den AntikOrper K 8.12 envies sich die Azeton/Ather-Fixierung im Verhdltnis 60:40 als die beste Vorbehandlung, wdhrend die reine Azetonfixierung bei der Verwendung des K 13 erkennenden Antikorpers KS 1 A3 die besten Resultate zeitigte.
In normaler Haut wurde eine Anifirbung in den
basalen und teilweise in den suprabasalen Sehiehten siehtbar, wenn der Antikorper K 8.12 gegen K 13 und K 16 angewandt wurde (Abb. 1). Auch die Anhangsgebilde der Haut zeigten nur eine Reaktion in den basalen Sehiehten, während im Cholesteatom bei einer Verdünnung von 1: 100 sehon eine krdflige Farbung aller Epithelsehiehten zu erkennen war (Abb. 2).
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weitgehend gleichma8ig positive Reaktion mit dem AntikOrper. Gegenfarbung mit Hamstoxyiin (Originelvergrd8erung 200fech).
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Wurde die APAAP-Teehnik in Verbindung mit dem AntikOrper gegen K 13 angewandt, konnten die basalen Schichten normaler Haut bereits bei einer Verdünnung von 5000 gefdrbt werden — eine Reaktion, die auch durch Verdünnungen bis hinauf zu I : 15000 nicht verschwand (Abb. 3). Im Cholesteatom waren alle Schichten des Epithels gleichmdllig gefarbt, wobei die basale Schieht bei einer VerdUnnung von 1:500 deutlieher reagierte (Abb. 4).
Alle Kontrollversuehe, bei denen der erste AntikOrper dureh normales Sehweineserum ersetzt worden war, zeigten keine positive Reaktion.
Gelelektrophorese
In der eindimensionalen Gelelek trophorese konnte in den Hautproben kein Keratin 13 nachgewicsen werden (Bahn 2, Abb. 5), wohingegen in einigen Cholestealomproben (n = 3) eine schwache Bande in Hohe des Keratin 13 siehtbar war (Bahn 3, Abb. 5). Man erkennt dieses Keratin leicht in
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APAAP-Technik. Die
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Gefrierschnitt von Cholesteatomgewebe, inkubiert mit dem monoklonalen Antikarper KS 1A3 gegen K 13. APAAPTechnik. AntikOrper 1:500 verdUnnt. Alle Epithelschichten weisen eine gleichmaBige Anfarbung mit Betonung der Basalis auf. Gegen-
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farbung mit Hämatoxylin (Originalver-
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Abb.4
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Abb. 3 Gefrierschnitt von retroaurikulärer Haut, inkubiert mit dem monoklonalen Antikorper KS 1A3 gegen K 13. APAAP-Technik. Antikarper 1: 15000 verdUnnt. Die basale Zellschicht und vereinzelte
groBerung lOOfach).
•
Zellen der suprabasalen Zellschichten zeigen eine positive Reaktion mit dem AntikOrper (Pfeile). Kreuzreaktivitaten gegen verschiedene Keratine sind hierfUr verantwortlich. Gegenfarbung mit Hamatoxylin (OriginalvergroBerung 400fach).
Keratine I und 10 als Marker der terminalen Differenzierung in
den oberen Lagen.
—
Das Keratinmuster des Cholesteatoms wurde von Van Blitterswijk u. Mitarb. sowie Ghao und Huang (2,4) ausfGhrlich untersucht. Sie fanden eine starke Expression von Keratin 10 und nur eine fokale und inkonstante Expression der Keratine 4, 18 und 19. Hierdurch wird eine enge Verwandtschaft des Cholesteatornepithels zur Haut des äuBeren Gehörganges nahegelegt. —
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In der vorliegenden Arbeit wurde das Choleste-
Abb. 5 Vergleichende SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese dreier Gewebeproben von Gaumentonsille (Bahn 1), Haut (Bahn 2) und Cholesteatomepithel (Bahn 3). Die verschiedene Banden markierenden Zahien bezeichnen Zytokeratine nach einer international gebrauchlichen Nomenklatur.
der als Kontrolle gleichzeitig untersuchten Tonsille, die es reichlich enthält (Bahn 1, Abb. 5). In derselben Untersuchung konnte gezeigt werden, daB Keratin 16 im Cholesteatom (n =8) vorkommt, in normaler Haut dagegen fehlt. Diskussion
Norrnale Epidermis enthält in erster Linie die hochmolekularen, basischen Typ lI-Keratine 1 und 5 mit einem Molekulargewicht von 67 kD bzw. 58 kD sowie die niedermolekularen, sauren Typ 1-Keratine 10 und 14 mit einem Molekulargewicht von 56,5 bzw. 5OkD zu nennen (3,12). Meistens treten
basische und saure Keratine zueinander in Bezug. So findet man die Keratine 5 und 14 in den basalen Zellschichten und die
atom auf seine Anwesenheit von Keratin 16 untersucht, das nach Literaturauffassung (14, 16) als Marker der proliferierenden Keratinozyten angesehen wird. Man findet dementsprechend an spontan proliferierenden Keratinozyten in der Zelikultur eine starke Expression von K 16 (9). Dasselbe PhZnomen lGBt sich bei Basaliomen, Plattenepithelkarzinornen (5) oder auch bei der Psoriasis (7, 11) nachweisen. Die Expression von K 16 gibt somit keine Auskunft em
eventuell malignes Krankheitsgeschehen, sondern Jediglich eine verstärkte Proliferation des Epithels.
Das Mittelohrcholesteatom kann zwar nicht als em generell hyperproliferatives Krankheitsbild angesehen werden (1). SolIte sich allerdings em prinzipiell oder lokal hyperproliferativer Charakter bestatigen lassen, müBte in den entspre-
chenden Bereichen eine verstärkte Expression von K 16 im Vergleich zu Proben gesunder Haut vorliegen.
Der In-situ-Nachweis dieser Uberexpression war jedoch schwierig, da kein kommerziell zu erwerbender monokionaler Antikorper erhältlich ist, der isoliert K 16 erkennt. Insofern wurde versucht, durch die Reaktion benachbarter Ge-
webeschnitte mit zwei verschiedenen Antikorpern, die zum einen isoliert K 13 (KS 1A3), zum anderen K 13 und K 16 die Verteilung des Proliferationsrnarkers K 16 zu gewinnen. Weitere Schwierigkeiten bestanden darin, daB die von den Antikörpern erkannten Epitoerkennen (K 8.12), RllckschlUsse
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C' Schilling, I. BujIa, Anja Holly P Schulz
586 Laryngo-Rhino-Olol. 71(1992)
Hyperprolferationsassoziierte Keratin 16-Expression un C]holesteatoin
Fixierung getestet werden muBten, urn eirie mdglichst zuverlässige In-situ-Erkennung hervorzurufen. Verwirrend war zunächst die Anfdrbung der ba-
salen und suprabasalen Schichten der Hautproben mit beiden Antikorpem, da weder K 13 noch K 16 im verhornenden Plattenepithel gesunder Haut gefunden werden (12). Auch durch erhebliche Verdunnungen lieJ3 sich diese Anfdrbung nicht urngehen, so daB hierfür eine auch vom Hersteller zugestandene Kreuzreaktivität verantwortlich gernacht werden muBte. Diese wurde dann auch im Immunbiot nãher untersucht, urn festzustellen, mit weichen Keratinen die verwendeten Antikörper noch reagieren. Bei den Blotversuchen konnte der Nachweis erbracht werden, daB der Antikorper K 8.12 auch die Zytokeratine 5 (schwach) und 14 (stark) erkennt. Hierdurch ist die Anffirbung der basalen und suprabasalen Schichten erklärt, da diese Keratine regelmäBig in diesen Schichten vorkommen. Da im Cholesteatom darüber hinaus auch die oberhaib der Basalis liegenden Schichten angefarbt sind, die nach den Arbeiten Uber die Anwesenheit (13) und Verteilung (15) dieser Keratine dort nicht
exprimiert werden, mull die Anfdrbung in der verstärkten APAAP-Technik auf die Expression von K 16 zuruckzuffihren scm. Dies hat seine Richtigkeit, obwohl Ghao und Huang (4) in ihrer Arbeit die Anwesenheit von K 16 nicht nachweisen konnten, wenngleich sie Antikörper des gleichen Kiones (K 8.12) verwendeten. Unterschiedlich sind lediglich die Bezugsquellen. Ursächiich fir die verschiedenen Ergebnisse könnte die germgere Empfindlichkeit der angewandten Technik sein, da sich Chao und Huang der indirekten Immunfluoreszenz bedienten. Weiterhin kann angefUhrt werden, daB die indirekte lmmunfluo-
reszenz der zitierten Arbeitsgruppe auch den Nachweis einer fokalen Expression von K18 und K 19 nicht zuliell, der Van BlitterswUk u. Mitarb. (2) immunhistochemisch mit der Peroxidase-anti Peroxidase-Methode gelang. Leider zeigte sich in den Immunbiot-Versuchen mit dem zweiten Antikörper KS 1A3, daB dieser mit mehreren anderen Keratinen (K 1, K4, K5, K 10, K 18) kreuzreagiert, so daB die Interpretation der immunhistochemisehen Anifirbungen am Cholesteatom sehr erschwert wurde und damit eine sinnvolle Auswertung der Schnitte nicht mdglich war.
Urn die Anwesenheit des Zytokeratins 16 als Marker der Hyperproliferation zu untermauem, wurden noch Gelelektrophoresen, und zwar an normaler Haut, Tonsillenepithel und Cholesteatornepithel, durchgefiihrt. Hierbei konnte eine deutliche Bande für K 16 im Cholesteatomepithel sichtbar gemacht werden und damit das hyperproliferative Verhalten des Cholesteatomepithels cindeutig bewiesen werden.
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Di; med. Volker Schilling Ludwig-Maximilians-Universität Klinikum Grollhadern Klinik und Poliklinik für Hals-, Nasen- und Ohrenkranke Marchioninistr. 1 5 7000 Munchen 70
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pe durch die Fixierung in ihrer sterischen Konfiguration z.T. erheblich verändert werden, so daB differente Verfahren zur
Lwyngo-Rhino-Otol. 71 (1992) 587
