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POINT DE VUE D’EXPERT

Comment sélectionner aujourd’hui le meilleur embryon à transférer ? How can we nowadays select the best embryo to transfer? L. Alter a,*, F. Boitrelle a, C. Sifer b a

Service d’histologie embryologie, biologie de la reproduction, cytogénétique et génétique médicale, CHI Poissy/Saint-Germain-enLaye, 10, rue du Champ-Gaillard, 78303 Poissy cedex, France b Service de biologie de la reproduction, CHU Jean-Verdier, AP–HP, avenue du 14-Juillet, 93143 Bondy, France Reçu le 19 janvier 2014 ; accepté le 29 avril 2014

Résumé Le transfert sélectif d’un seul embryon (eSET) permet d’éliminer presque totalement les grossesses doubles sans pour autant compromettre les taux de naissance mais cette pratique impose de savoir sélectionner le meilleur embryon pour le transfert. La morphologie embryonnaire est un paramètre capital et reste aujourd’hui le critère le plus pertinent dans le choix de l’embryon à transférer. L’introduction de l’imagerie time-lapse, qui permet un suivi continu du développement embryonnaire, fournit de nouveaux critères prédictifs du potentiel d’implantation de l’embryon mais l’apport réel de ce système, notamment le rapport bénéfice/coût, n’est à ce jour pas clairement démontré. Dans ce contexte de meilleure sélection embryonnaire, la culture prolongée (CP) jusqu’au stade blastocyste est une pratique incontournable, mais il semble judicieux de la réserver à une population de bon pronostic. Par ailleurs, aucun bénéfice n’est apporté par la pratique du « Preimplantation Genetic Screening » (PGS), analyse du fond chromosomique des embryons par hybridation in situ fluorescente (FISH) à j3. Un « nouveau » PGS est aujourd’hui pratiqué et consiste en une analyse globale du génome au stade blastocyste sur cellules trophoblastiques. Si cette pratique semble améliorer les taux d’implantation, son application en routine ne sera justifiée que si les études randomisées actuellement en cours valident son intérêt clinique. Enfin, il est probable qu’à l’avenir l’évaluation de la qualité embryonnaire intégrera des critères métaboliques fournis par les techniques dites « omics ». Ces nouvelles approches pourraient permettre de disposer de biomarqueurs fiables prédictifs de la qualité embryonnaire voire de grossesses. ß 2014 Publié par Elsevier Masson SAS.

Abstract Multiple pregnancies stand as the most common adverse outcome of assisted reproduction technologies (ART) and the dangers associated with those pregnancies have been reduced by doing elective single embryo transfers (e-SET). Many studies have shown that e-SET is compatible with a continuously high pregnancy rate per embryo transfer. Yet, it still becomes necessary to improve the selection process in order to define the quality of individual embryos – so that the ones we choose for transfer are more likely to implant. First, analysis of embryo morphology has greatly helped in this identification and remains the most relevant criterion for choosing the embryo. The introduction of time-lapse imaging provides new criteria predictive of implantation potential, but the real contribution of this system – including the benefit/ cost ratio – seems to be not yet properly established. In this context, extended culture until blastocyst stage is an essential

* Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (L. Alter). http://dx.doi.org/10.1016/j.gyobfe.2014.05.006 1297-9589/ß 2014 Publie´ par Elsevier Masson SAS.

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practice but it appears wise to keep it for a population showing a good prognosis. Then, the failure of aneuploid embryos to implant properly led to achieve preimplantation genetic screening (PGS) in order to increase pregnancy and delivery rates after ART. However, PGS by fluorescence in situ hybridization (FISH) at day 3 is a useless process – and may even be harmful. Another solution involves using comparative genomic hybridisation (CGH) and moving to blastocyst biopsy. Finally, it is envisaged that morphology will also be significantly aided by non-invasive analysis of biomarkers in the culture media that give a better reflection of whole-embryo physiology and function. ß 2014 Published by Elsevier Masson SAS.

Mots clés : Fécondation in vitro ; Morphologie embryonnaire ; ESET ; Cinétique ; Time-lapse ; Diagnostic pré-implantatoire ; Omics Keywords: In vitro fertilization; Embryo morphology; eSET; Kinetic; Time-lapse; Preimplantation genetic diagnosis; Omics

1. INTRODUCTION Les grossesses multiples issues de l’assistance médicale à la procréation (AMP) constituent un sujet de préoccupation mondiale en termes de santé publique. De nombreuses études montrent que par rapport aux grossesses uniques, les grossesses multiples ont un risque nettement supérieur de morbidité et de mortalité maternelle et il est clairement établi que les risques de toutes les complications périnatales augmentent avec le nombre de fœtus : prématurité, hypotrophie fœtale, séquelles neurologiques, morbidité et mortalité périnatales. Ainsi, limiter le nombre de grossesses multiples apparaît important et de nombreuses publications sur le transfert sélectif d’un seul embryon ont vu le jour ces dernières années. En Europe, le taux de grossesses multiples après transfert d’embryons a régulièrement diminué depuis l’an 2000, passant de 26,9 % à 20,2 % en 2009 [1]. En France, les grossesses gémellaires représentaient 23,3 % des accouchements après FIV ou ICSI entre 2000 et 2004 (données FIVNAT 2006) contre 18,6 % en 2011 (données ABM 2012). Il existe de grandes différences entre les pays européens en ce qui concerne les grossesses multiples mais l’on observe une tendance homogène à transférer un moindre nombre d’embryons. Dès 1993 en Suède, il y eu une volonté de réduire le nombre d’embryons transférés de trois à deux. Il en a résulté une diminution du nombre de grossesses triples, tout en conservant un taux de grossesse et d’accouchement peu différent (National Board of Health and Welfare, 2004). Si aujourd’hui les grossesses triples ont fortement diminué, les grossesses gémellaires issues de l’AMP sont toujours préoccupantes. Face à cette problématique, le transfert sélectif d’un seul embryon (eSET, pour elective single embryo transfer) est le moyen le plus simple d’éviter les grossesses gémellaires. L’utilisation de cette stratégie est variable selon les pays et les premiers à adopter cette politique de transfert furent les pays nordiques, avec en tête la Suède, qui entre 2003 et 2005 a pratiqué 69,4 % d’eSET. À l’inverse, les États-Unis n’ont effectuées que 2,8 % d’eSET durant cette même période [2]. Pourtant, les données publiées montrent qu’une application judicieuse de l’eSET limite largement les grossesses doubles sans pour autant compromettre les taux de naissance. Néanmoins, cette pratique impose de transférer un embryon d’excellente qualité et à fort potentiel implantatoire et il devient donc indispensable de savoir sélectionner le meilleur embryon à replacer afin de ne

faire perdre aucune chance de grossesse au couple en désir d’enfant. Le but de cet article est de faire le point sur les différents critères actuellement utilisés dans l’évaluation de la qualité embryonnaire et de déterminer comment sélectionner le meilleur embryon pour le transfert. 2. CRITÈRES MORPHOLOGIQUES La morphologie embryonnaire observée au microscope tient une place de choix dans l’évaluation de la viabilité de l’embryon. Elle est actuellement le principal critère utilisé pour la sélection de l’embryon à transférer et une bonne maîtrise de ce paramètre est obligatoire pour développer avec succès un programme d’eSET. 2.1. Observations statiques Des classifications embryonnaires existent pour chaque stade de développement, du lendemain de la ponction folliculaire jusqu’au stade blastocyste, cinq jours (j) après la ponction. 2.1.1. Le zygote Scott et Smith [3] publient en 1998 une classification comparative des tailles et positions des pronuclei en intégrant : le nombre, la taille et l’alignement des précurseurs nucléolaires. Elle distingue dans un premier temps cinq grades puis cette classification a été revue en fonction de l’aptitude des embryons à atteindre le stade de blastocyste sous la dénomination de « Zscore » [4]. Z1 et Z2 sont considérés comme les Z-scores donnant les meilleures chances de développement et d’implantation embryonnaires. Bien que des études confirment la différence d’implantation en fonction du profil zygotique, la finesse des paramètres observés fait de cette classification un outil relativement difficile à manier et son intérêt reste controversé. 2.1.2. L’embryon La première division mitotique survient généralement à la fin de la première journée de culture et dès le stade deux cellules, de nombreuses anomalies sont visibles lors de l’observation au microscope. Elles concernent en particulier la régularité des

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blastomères, la présence de fragments ainsi que le degré de nucléation des blastomères. Différentes classifications sont utilisées en France. Celle faisant l’objet d’un consensus des BLEFCO présente l’avantage d’une codification simple et repose sur le nombre de cellules de l’embryon, l’aspect typique des blastomères et le pourcentage de fragments. Au laboratoire, la classification utilisée tient compte de ces trois mêmes critères, mais la codification est différente. Le pourcentage du volume embryonnaire occupé par les fragments est désigné par une lettre : A, B, C ou D, les embryons de type A ne présentant pas de fragments. Le nombre de blastomères est chiffré et au total, le type embryonnaire est désigné par un chiffre et une lettre. Les embryons de type A et B, à condition d’avoir un nombre de cellules conforme au stade de développement, sont ceux ayant le meilleur potentiel implantatoire. Certains auteurs ont proposé des adaptations de la classification BLEFCO en attribuant des points à chaque embryon en fonction de critères prédéfinis (scoring). Une étude portant sur une série de 987 transferts d’un seul embryon [5] a évalué la valeur prédictive relative de chacun des paramètres suivants : absence de blastomères irréguliers, absence de fragmentation (ou fragmentation représentant moins de 20 % du volume embryonnaire) et stade 4 cellules. Cette évaluation a permis de définir un score embryonnaire à 4 points significativement corrélé au taux de grossesse (embryons de score 1 : taux d’implantation = 4 % vs score 4 = 16 %). Par la suite, d’autres auteurs ont montré l’intérêt de combiner ces différents critères. En 2007, Holte et al. [6] ont analysé de manière prospective 2266 cycles de FIV/ICSI, suivis d’un transfert de deux embryons. Cinq critères ont été évalués pour guider le choix des embryons à transférer : le nombre de blastomères, le degré de fragmentation, les différences de taille

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entre les blastomères, la symétrie du clivage et la mononucléarité des blastomères (Fig. 1). Les résultats montrent que ces cinq paramètres sont fortement corrélés au potentiel d’implantation de l’embryon mais seuls le nombre de blastomères, leur mononucléarité et leur taille sont des variables indépendantes. Il a donc été possible d’établir un score fiable de notation des embryons (score IMC pour Integrated Morphology Cleavage), validé statistiquement et prédictif de l’implantation embryonnaire. Ce modèle de notation comprenant le stade de clivage, l’homogénéité de taille des blastomères et leur mononucléarité permet donc d’optimiser la sélection des embryons à transférer.

2.1.3. Le blastocyste Dès le 5e jour survient la mise en place du blastocœle, cavité dont l’apparition est excentrée, définissant le blastocyste jeune. Le blastocœle grossit jusqu’à aplatissement des cellules en périphérie qui prennent le nom de trophectoderme et les cellules internes s’organisent pour former le bouton embryonnaire ou masse cellulaire interne (MCI). À ce stade, la classification de Gardner et Schoolcraft [7] a été proposée. Elle repose sur l’évolution du blastocyste et définit six stades en fonction de l’apparition du blastocœle et de l’augmentation de volume qu’il impose à l’embryon (B1 à B6). À partir du stade B3, cette classification est complétée par l’analyse du bouton embryonnaire (type A à C), A représentant un bouton embryonnaire formé de nombreuses cellules bien compactées. Cette classification tient également compte de l’aspect du trophectoderme, aussi caractérisé par trois grades A, B et C (Fig. 2). Le transfert tardif au stade blastocyste est désormais une pratique nécessaire et les nombreuses publications sur le sujet montrent qu’il permet une meilleure sélection de l’embryon

Fig. 1. Paramètres morphologiques de sélection embryonnaire, d’après Holte et al. [6].

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Fig. 2. Classification des blastocystes.

ainsi qu’une meilleure synchronisation de l’embryon et de l’endomètre. En 2011, Goto et al. publient [8] une analyse rétrospective visant à estimer le taux de grossesse après FIV ou ICSI, en fonction de la morphologie du blastocyste et de l’âge de la patiente. Dans ce but, ils analysent 1488 cycles de transfert unique d’un blastocyste congelé. Les blastocystes sont évalués avant et après décongélation en utilisant la classification de Gardner et trois groupes sont constitués en fonction de l’âge des patientes. Les taux de grossesse clinique (CPR), de grossesse viable (VPR) et d’accouchement (DR) sont mesurés dans chacun des groupes. Deux critères sont donc pris en compte ici : la qualité du blastocyste et l’âge de la patiente. Les résultats montrent tout d’abord que la qualité du blastocyste décroît à mesure que l’âge maternel avance ( p < 0,001) et pour un blastocyste de même qualité, les CPR, VPR et DR diminuent

avec l’âge. D’autre part, quel que soit l’âge de la patiente, on observe des taux de grossesse et d’accouchement significativement plus faibles pour les transferts de blastocystes de mauvaise qualité. Il existe donc une corrélation significative entre la qualité du blastocyste et l’issue des tentatives de FIV/ ICSI, en plus de l’influence de l’âge maternel. La classification de Gardner a une valeur prédictive du potentiel de l’embryon à s’implanter et à donner une grossesse évolutive et constitue un critère majeur pour le choix de l’embryon à transférer. De plus, l’aspect du trophectoderme apparaît comme étant un critère morphologique particulièrement important. L’étude d’Ahlstrom en 2011 analyse les issues de 1117 transferts frais d’un blastocyste à j5 en fonction de chacun des trois paramètres de la classification de Gardner (degrés d’expansion, masse cellulaire interne et aspect du trophectoderme). Les résultats montrent que la qualité du

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trophectoderme est le seul critère indépendant significativement corrélé aux taux de grossesses et constitue le paramètre morphologique le plus prédictif de naissances. 2.2. Observations dynamiques La sélection des embryons à replacer est donc essentiellement basée sur des critères morphologiques. Cependant, ceux-ci ne peuvent être dissociés de la notion d’évolution dynamique au cours des 2 à 5 jours de culture et la cinétique du développement embryonnaire constitue un élément important à considérer pour la sélection des embryons. 2.2.1. Clivage précoce La survenue précoce de la première division embryonnaire, environ 26 heures après la fécondation, peut aider à l’évaluation de la qualité embryonnaire [9]. Ce critère à l’avantage d’être facile à établir car l’observation de deux cellules suffit à affirmer la présence d’un clivage précoce et depuis plusieurs années, de nombreuses équipes l’utilisent. D’après les données publiées, la présence d’un clivage précoce est corrélée avec un meilleur potentiel de développement embryonnaire. Ce critère peut même être utilisé de façon plus fine en distinguant les clivages rapides à deux cellules régulières de ceux présentant deux cellules irrégulières et/ou des fragmentations. Dans une étude publiée en 2007 [10], Terriou et al. analysent ces différents types de clivage précoce à 26 heures après FIV ou ICSI sur 371 embryons afin d’évaluer la valeur prédictive du clivage précoce à deux cellules régulières (EEC) sur les taux de grossesse, en plus du score embryonnaire au deuxième jour (j2). Les résultats montrent que parmi les embryons de morphologie satisfaisante à 48 heures, ceux issus de divisions précoces harmonieuses ont un meilleur taux d’implantation que ceux issus de divisions précoces irrégulières. Ce critère dynamique apporterait donc de la prédictivité supplémentaire à la morphologie embryonnaire classique et combiner ces données permet d’affiner le choix de l’embryon à transférer. D’autres études ont par la suite validé l’intérêt de ce paramètre. En 2009, Fu et al. [11] évaluent pour 9544 embryons la présence ou non d’un clivage précoce entre 25 et 29 heures. Là encore, il retrouve de manière significative d’avantage de grossesses par transfert pour les embryons clivés précocement. Néanmoins, certaines publications viennent contredire ces résultats quant à la pertinence de ce paramètre. L’étude de Sundström et Saldeen [12] en 2008 regroupe 275 transferts frais d’un seul embryon et compare deux groupes selon la présence ou non d’un clivage précoce à 25–28 heures. Les résultats montrent que les taux d’implantation et de naissance sont similaires dans les deux groupes et que lorsqu’un embryon de bonne qualité est transféré, le clivage précoce ne semble pas avoir d’intérêt supplémentaire pour prédire son potentiel implantatoire. Ce résultat est confirmé en 2011 par l’étude prospective observationnelle de Sifer et al. [13] qui identifie les critères prédictifs de grossesse clinique après transfert d’un embryon. L’eSET est proposé aux patientes de moins de 37 ans, ayant au moins deux embryons de bonne qualité dont un « top

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embryon », et pour lesquelles il s’agit d’un premier ou deuxième cycle de FIV/ICSI. Les résultats montrent que la survenue d’une grossesse clinique après eSET est associée de manière significative à l’âge maternel et au nombre d’embryons de bonne qualité obtenus à j2 ou j3. Par contre, pour ces embryons de bonne qualité, les taux d’implantation sont semblables quel que soit leur score zygotique, leur degrés de fragmentation et la survenue ou non d’un clivage précoce. Il apparaît donc que les critères utilisés pour définir les embryons de bonne qualité, à savoir la présence de 6 à 9 cellules à j3, moins de 20 % de fragmentation et l’absence de blastomère multinucléé, sont ceux à retenir pour l’eSET, associés à l’âge maternel et au rang de tentative. Néanmoins, Lamazou et al. publient en 2010 [14] une étude visant à appliquer les critères d’eSET proposés dans la littérature à la population du centre afin d’évaluer le pourcentage de leur population éligible à l’eSET selon ces critères. Les résultats montrent que ces critères d’inclusion ne concernent qu’une minorité de la population étudiée (2,4 % à 10,8 %) et ne modifieront donc que peu les taux de grossesses géméllaires. Il convient donc d’essayer d’élargir les critères d’éligibilité à l’eSET, notamment l’âge maternel, fixé à 37 ans ici. En effet, l’étude de Veleva et al. [15] qui analysent les résultats d’eSET chez des patientes de 36 à 39 ans montre des taux de grossesse semblables à ceux retrouvés dans les études portant sur des femmes plus jeunes. Il serait donc envisageable d’étendre la pratique de l’eSET jusqu’à un âge maternel limite de 39 ans. 2.2.2. Jour du transfert Si l’intérêt du clivage précoce est discrédité par les résultats de l’étude de Sifer et al. [13], le jour du transfert embryonnaire apparaît lui comme étant un paramètre important à prendre en compte. En effet, les résultats de cette même étude montrent une diminution significative du taux de grossesses cliniques lorsque l’eSET est effectué à j2 par rapport à j3, probablement liée à une meilleure sélection embryonnaire. Il semblerait donc préférable, dans une population à bon pronostic éligible à l’eSET, d’effectuer le transfert à j3 plutôt qu’à j2. Ce résultat est en accord avec une méta-analyse précédemment publiée sur ce sujet [16] même si aucune différence significative en termes de taux de grossesse évolutive et de taux d’accouchement entre les transferts embryonnaires frais à j2 ou j3 n’est observée. Par ailleurs, lorsque l’embryon est replacé à j3, la qualité embryonnaire est généralement appréciée de manière quotidienne jusqu’au moment du transfert. Mais existe-t-il réellement un intérêt à évaluer ces critères toutes les 24 heures ? La publication de Racowsky et al. [17] en 2009 vise à établir un modèle prédictif pour la sélection de l’embryon à j3 et montre qu’une évaluation à j1 seulement est insuffisante pour prédire le développement embryonnaire, le pouvoir discriminant étant le moins bon. A contrario, il n’est pas retrouvé de différence significative entre une évaluation à j2 seul, j3 seul ou quotidienne jusqu’à j3. Sachant que cette pratique impose de sortir les embryons des conditions optimales de gaz et de température de l’incubateur, l’analyse de la morphologie

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embryonnaire uniquement avant le transfert à j3 pourrait être préférable dans la mesure où elle fournit la même valeur prédictive. Toujours dans le but d’améliorer la sélection embryonnaire en vue d’eSET, le transfert embryonnaire au stade blastocyste est une pratique de plus en plus utilisée. La culture prolongée (CP) jusqu’à j5 présente de nombreux avantages, notamment d’un point de vue cytogénétique puisque les embryons les plus déséquilibrés chromosomiquement n’atteindront pas le stade de blastocyste [18]. De plus, les nombreuses données publiées révèlent des taux d’implantation nettement supérieurs après transfert au stade blastocyste. L’étude de Papanikolaou et al. [19] parue en 2008 rassemble les résultats de six études randomisées, soit 1654 patientes séparées en deux groupes selon que le transfert s’effectue au stade j2/j3 ou au stade blastocyste. Les résultats montrent que le taux de naissance par patiente est significativement plus élevé lorsque le transfert se fait au stade de blastocyste ( p = 0,005) mais la CP expose au risque de ne pas obtenir de blastocystes à transférer et les taux d’annulation retrouvés sont aussi significativement plus importants. La CP jusqu’au stade blastocyste aboutit donc à une diminution du nombre d’embryons transférables ou congelables, mais les taux d’implantation sont nettement améliorés après transfert à j5 par rapport à j2/j3 lorsqu’un même nombre d’embryons est transféré. Les données publiées par Guerif et al. [20] en 2009 confirment ces résultats pour les transferts frais de blastocystes. Dans une étude prospective portant sur 478 couples pour lesquels un seul embryon est transféré soit à j2 (n = 243), soit au stade blastocyste (n = 235), le taux d’accouchement est mesuré, incluant les transferts frais et congelés dans les deux groupes. Ces résultats montrent un taux d’accouchement par cycle significativement plus élevé après transfert frais d’un blastocyste par rapport au transfert d’un embryon clivé à j2. Cependant, le transfert d’un embryon clivé décongelé conduit à de meilleurs résultats que le transfert d’un blastocyste décongelé, du fait de taux de survie plus faibles après congélation/décongélation pour les blastocystes (77 % à j2 vs 65 % à j5). Au total, le taux de naissance cumulée par couple, incluant les transferts frais et congelés, est similaire dans les deux groupes (34,2 % à j2 vs 37,9 % à j5). Néanmoins, l’amélioration des techniques de cryoconservation des blastocystes pourrait modifier ces résultats et l’apport certain de la vitrification est attendu ici. En effet, les résultats montrent que la vitrification permet d’obtenir, à tous les stades embryonnaires, de meilleurs taux de survie et en particulier de meilleurs taux de survie intacte [21]. La CP est donc aujourd’hui une pratique incontournable mais son bénéfice clinique n’est pas, à ce jour, clairement démontré dans la littérature et la pratiquer de façon systématique ne semble pas être justifiée. En effet, l’analyse de l’étude de Blake et al. [22], qui regroupe les données de 18 essais randomisés, montre que le taux de naissance par transfert embryonnaire frais est significativement supérieur après CP uniquement lorsque la randomisation était faite à j2/ j3, lorsque de nombreux embryons de bonne qualité étaient

disponibles aux stades précoces. En revanche, aucun bénéfice significatif n’était attribué à la CP lorsqu’elle était décidée en amont, au début de la stimulation ovarienne, voir à j0 ou j1 de la tentative de FIV/ICSI. Le transfert tardif au stade blastocyste semble donc avoir un réel intérêt lorsque réservé à une population de bon pronostic, également éligible à l’eSET. La CP permet donc dans ces conditions de mieux sélectionner l’embryon à transférer et depuis quelques années, une meilleure prédiction précoce du développement du blastocyste est envisagée grâce aux données fournies par le time-lapse. 2.2.3. Time-lapse Pour pallier les limites de l’observation intermittente, Payne et al. ont développé le time-lapse, système permettant de suivre de façon continue le développement précoce embryonnaire. La publication de Mio et Maeda [23] en 2008, illustre bien l’intérêt de cet équipement. Des étuves équipées de caméras intégrées permettent de maintenir les embryons dans des conditions de culture optimales stables et d’acquérir des images digitales rapprochées sans sortir les embryons de l’étuve et les données ne montrent aucun effet délétère de cet outil sur la morphologie embryonnaire ni sur les taux de grossesse clinique. Plusieurs systèmes time-lapse sont disponibles actuellement et de nombreuses publications sur le sujet ont vu le jour ces dernières années, soulignant toutes l’importance des événements précoces du développement embryonnaire. Notamment, les résultats publiés par Wong et al. [24] en 2010 suggèrent que les étapes qui précèdent l’activation du génome embryonnaire permettent de prédire le développement jusqu’au stade blastocyste. Les observations faites révèlent que les embryons qui atteignent le stade blastocyste suivent une cinétique de développement stricte et prévisible lors des premières divisions. Trois paramètres dynamiques semblent prédire le développement ultérieur de l’embryon jusqu’à j5 : la durée de la première cytokinèse, le temps entre la première et la deuxième mitose et l’apparition synchrone des troisième et quatrième blastomères (Fig. 3). La pertinence de ces critères et l’importance du « timing » des évènements précoces ont été confirmés dans plusieurs études récentes et le concept de « morphocinétique » est apparu, qui combine la morphologie et la cinétique de développement embryonnaire [25]. Les données de la littérature montrent l’existence de marqueurs morphocinétiques prédictifs du développement embryonnaire, susceptibles d’être utilisés afin d’affiner le choix de l’embryon à transférer mais l’intérêt clinique de ces paramètres reste à confirmer et des études prospectives sont en cours. En effet, si l’observation en continu du développement embryonnaire permet d’envisager une amélioration globale des aspects embryologiques de l’AMP, le rapport bénéfice/coût du time-lapse n’est encore, à ce jour, pas clairement démontré. Aucune étude ne permet notamment d’affirmer que les bénéfices apportés par ce système sont dus aux critères cinétiques fournis ou simplement au maintien des embryons dans des conditions de gaz et de température optimales.

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Fig. 3. Timing des premières divisions embryonnaires, d’après Wong et al.

La sélection du meilleur embryon à transférer en vue d’eSET repose donc en grande partie sur l’analyse de la morphologie embryonnaire et la mise en place de classifications appropriées. Des critères dynamiques sont venus s’ajouter à l’évaluation du potentiel implantatoire de l’embryon et depuis quelques années, l’introduction de nouvelles approches non morphologiques tend également à optimiser ce choix. 3. CRITÈRES NON MORPHOLOGIQUES L’avènement de la génomique, technique invasive d’exploration du génome embryonnaire et plus récemment de la métabolomique, de la transcriptomique et de la protéomique, techniques non invasives d’étude du sécrétome de l’embryon, apporte de nouveaux facteurs prédictifs de la qualité embryonnaire. 3.1. Approches invasives 3.1.1. « Preimplantation Genetic Diagnosis » (PGD) En France, la pratique du diagnostic pré-implantatoire (DPI) est autorisée depuis 1999 pour les couples ayant une forte probabilité de donner naissance à un enfant atteint d’une maladie génétique grave reconnue comme incurable au moment du diagnostic. Le DPI permet de déterminer le statut génétique ou chromosomique d’un embryon obtenu par fécondation in vitro (avec ICSI) avant son transfert dans l’utérus en prélevant un ou deux blastomères à j3. Les blastomères sont ensuite analysés soit par biologie moléculaire pour les maladies monogéniques, soit par des techniques d’hybridation in situ fluorescente (FISH) pour les indications chromosomiques ou pour certaines maladies dont la transmission est liée au sexe. Le diagnostic moléculaire repose sur le principe de la PCR ( polymerase chain reaction) et l’analyse se faisant sur cellule unique (blastomère), le DPI moléculaire se heurte à un problème majeur : la faible quantité d’ADN génomique disponible. En effet, le contenu en ADN d’un blastomère est minime (5–10 pg), alors qu’un diagnostic génétique « classique » est fondé sur l’amplification d’une quantité d’ADN de l’ordre de 50 à 500 pg (10 000 à 100 000 cellules). Un important nombre de cycles d’amplification est donc requis pour effectuer le diagnostic, ce qui intensifie les problèmes qui affectent couramment tous les tests PCR. Le risque de contamination par de l’ADN étranger ou parental entraîne ainsi un risque accru de diagnostic erroné. De plus, le phénomène d’allèle drop

out (ADO), qui peut être défini comme un échec d’amplification n’affectant qu’un seul des allèles parentaux présents dans une cellule isolée, peut aussi donner lieu à un résultat inexact, bien que diminué de manière drastique par l’utilisation de nouveaux protocoles. Ces contraintes imposent donc un réglage minutieux des conditions de PCR et l’analyse moléculaire peut s’avérer très exigeante sur le plan technique. Le diagnostic cytogénétique (hors diagnostic de sexe) concerne les patients porteurs d’une anomalie chromosomique de structure, particulièrement à risque de produire des gamètes comptant un nombre incorrect de chromosomes. Il fait appel à la technique de FISH sur des cellules interphasiques, qui permet de détecter grâce à l’hybridation de sondes adéquates les segments chromosomiques impliqués dans les éventuels déséquilibres méiotiques survenus lors de la ségrégation des chromosomes impliqués dans le remaniement. Le service de cytogénétique de l’hôpital Necker Enfants Malades a développé des sondes de grande taille (1 à 2 Mb) pour chaque extrémité télomérique, afin de réduire le taux d’hybridation inefficace (pour mémoire la taille des sondes commerciales est de 0,2 à 0,4 Mb). L’utilisation de ces sondes a permis de réduire le taux de non-réponse lors d’un DPI de 20 à 2 % et la FISH constitue aujourd’hui une technique fiable et résolutive pour le diagnostic des déséquilibres chromosomiques. Cependant, le DPI chromosomique se heurte à une difficulté majeure, inhérente à la physiologie des premières divisions embryonnaires : l’instabilité chromosomique générant le mosaïcisme, phénomène selon lequel les cellules d’un embryon n’ont pas toutes le même contenu chromosomique. En effet, les données récentes de la littérature révèlent que jusqu’à 90 % des embryons humains sont mosaïques à j3 [26,27] l’analyse d’un ou deux blastomères n’étant alors pas représentative du statut global de l’embryon. Par conséquent, de nombreux pays effectuent désormais la biopsie à j5 et l’analyse porte alors sur des cellules du trophectoderme (Fig. 4). Cette technique présente l’avantage de fournir plus de matériel pour le diagnostic (5 à 10 cellules), limitant ainsi le risque d’erreur dû au mosaïcisme, tout en laissant la masse cellulaire interne, à l’origine de l’embryon, intacte [28]. De nombreux résultats ont été publiés ces dernières années en faveur de cette pratique et des études randomisées sont en cours pour confirmer l’intérêt clinique du DPI au stade blastocyste. Cette remise en question récente des pratiques dans le cadre DPI fait suite aux questions soulevées par la pratique depuis une quinzaine d’années du « Preimplantation Genetic Screening » (PGS), analyse du fond chromosomique des embryons.

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Fig. 4. Biopsie des cellules du trophectoderme à j5, d’après Kokkali et al.

3.1.2. « Preimplantation Genetic Screening » (PGS) Le PGS est pratiqué dans de nombreux pays pour les couples à risque d’obtenir des embryons porteurs d’anomalies chromosomiques de nombre (aneuploïdies) dans les indications suivantes : âge maternel avancé, antécédents de fausses couches à répétition et échecs répétés d’implantation. Cette pratique part du constat que l’aneuploïdie est extrêmement courante chez les embryons en division et mène à l’arrêt du

développement, à l’échec d’implantation ou à l’avortement spontané. Il a donc été avancé qu’en ayant recours au dépistage des aneuploïdies en pré-implantatoire et en ne transférant que les embryons normaux sur le plan chromosomique, les issues de FIV s’en trouveraient améliorées. La pratique du PGS s’est largement répandue durant les années 2000 et comme pour le DPI, les embryons en division étaient biopsiés et l’analyse des blastomères était faite par technique de FISH mais dans le cadre du PGS, 6 à 15 chromosomes par embryon étaient examinés

Fig. 5. Métabolisme du glucose et taux de grossesse, d’après Gardner et al. A. Consommation de glucose par l’embryon à j4 et issue de FIV (rythme cardiaque fœtal). B. Consommation de glucose par l’embryon à j5 et issue de FIV (rythme cardiaque fœtal).

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(les chromosomes 13, 16, 18, 21, 22, X et Y le plus souvent). Cependant, des études récentes sont venues remettre en cause l’intérêt clinique de cette pratique. Depuis 1997, un rapport de l’ESHRE analyse les données concernant le PGD de l’ensemble des centres participant au consortium Européen. Harper et al. [29] présentent dans leur papier un aperçu des dix premières années, en réunissant les données publiées entre 1997 et 2007 et pour la première fois depuis 1997, le nombre de cycles de PGS réalisés est en baisse dans le dernier rapport de l’ESHRE publié. Cette tendance peut s’expliquer par le fait que plusieurs centres ont réduit ou stoppé leur pratique du PGS, suite à la publication ces dernières années de plusieurs essais randomisés qui peinent à démontrer le bénéfice apporté par cette technique. En 2007, Mastenbroek et al. [30] ont signalé les résultats d’un essai randomisé à double insu, multicentrique et de grande envergure, qui démontrent qu’une FISH visant neuf chromosomes (1, 13, 16, 17,18, 21, X et Y) sur un blastomère biopsié à j3 ne constitue pas un moyen efficace d’améliorer les taux de grossesse pour les femmes âgées de 35 à 41 ans. Ces résultats sont renforcés par l’étude de Staesssen et al. [31] en 2008 qui n’observent pas d’augmentation des taux de naissance après PGS pour les femmes de moins de 36 ans et par Hardarson et al. [32] pour les femmes de plus de 38 ans. De même, en 2010 les études de Debrock et al. [33] et de Milán et al. [34] confirment l’absence de bénéfices apportée par le PGS en termes de grossesses cliniques et de naissances. Au total, plus de onze essais randomisés ont été publiés et il est désormais admis que la pratique du PGS par FISH à j3 est inefficace voire délétère. Depuis, plusieurs hypothèses ont été avancées pour expliquer ces résultats. Tout d’abord, l’impact de la technique d’aspiration en elle-même sur le développement ultérieur de l’embryon a toujours été très discuté. Deux études récentes ont montré que la biopsie de deux blastomères au stade huit cellules influait négativement sur l’aptitude de l’embryon à évoluer jusqu’au stade blastocyste. Il en résulte une diminution du nombre d’embryons disponibles pour le transfert [35] et une diminution du taux de naissances lorsque comparé au groupe contrôle [36]. De plus, l’analyse d’une ou deux cellules n’est pas forcément représentative du reste de l’embryon du fait de l’importance du mosaïcisme à j3. Les données de la littérature montrent que le développement embryonnaire précoce se démarque par l’importance des anomalies chromosomiques retrouvées à ce stade et ce d’autant que le nombre de chromosomes analysés est important. En effet, des équipes ayant appliquées des méthodes d’étude globale du génome pour l’analyse d’un blastomère à j3 révèlent que 60 % à 90 % des embryons sont mosaïques à ce stade [26,27]. Si des taux importants de mosaïcisme persistent au stade de blastocyste, ce phénomène diminue entre j3 et j5, soit par arrêt de développement des embryons les plus déséquilibrés, soit par « auto-correction » des anomalies chromosomiques. Dans son étude, BarbashHazan et al. [37] ré analysent par FISH à j5 des embryons diagnostiqués aneuploïdes à j3 et retrouve ces phénomènes de correction (self-correction), puisque près de 10 % des embryons aneuploïdes à j3 étaient parfaitement euploïdies à j5. De fait,

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l’analyse d’un ou deux blastomères à j3 dans le cadre du PGS peut donc conduire à exclure, à tort, un embryon potentiellement viable. De plus, l’analyse d’un blastomère par FISH ne porte que sur un nombre restreint de chromosomes (15 au plus), ne permettant donc qu’un dépistage partiel des aneuploïdies. Le PGS, lorsque pratiqué par FISH à j3, n’est donc pas représentatif du statut chromosomique global de l’embryon et s’expose à un risque important d’erreur diagnostique. Par conséquent, il est aujourd’hui nécessaire d’évaluer d’une part, l’avantage de nouvelles techniques permettant une analyse globale du génome, comme la CGH Array et, d’autre part, l’intérêt d’effectuer le dépistage au stade blastocyste sur cellules trophoblastiques. De nombreux pays utilisent déjà cette pratique en routine depuis plusieurs années et rapportent une amélioration des taux d’implantation, mais la pratique de ce « nouveau » PGS par CGH Array à j5 ne sera réellement justifiée que si les études randomisées actuellement en cours valident son intérêt clinique [38]. 3.2. Approches non invasives De nombreux travaux actuels s’orientent plutôt vers une approche fonctionnelle pour prédire la viabilité embryonnaire. Il s’agit ici d’étudier le métabolisme de l’embryon (métabolomique), les ARN messagers transcrits à partir de son ADN (transcriptomique) et les protéines qui en sont issues (protéomique). Ces nouvelles techniques se regroupent sous le terme générique « omics » et contrairement à la génomique, elles sont non invasives puisqu’elles étudient les surnageants de culture des embryons. De plus, du fait d’une amélioration très nette de leur sensibilité, ces techniques présentent l’avantage de pouvoir être réalisées sur les quantités infimes de produit sécrétées par un seul embryon. Ces analyses reposent sur des techniques de spectrométrie, de chromatographie, de résonance magnétique nucléaire, de microarrays et sur l’utilisation de logiciels bioinformatiques. 3.2.1. Protéomique La protéomique s’appuie sur le fait que les protéines sécrétées par un embryon attestent d’un profil d’expression de certains gènes et donc conditionnent une activité fonctionnelle pouvant influencer le devenir de cet embryon. Il existe des approches spécifiques qui étudient des « protéines candidates » et des approches plus globales qui visent à définir des profils protéiques de sécrétome associés à la capacité de développement ou d’implantation de l’embryon. Dans plusieurs études, Katze-Jaffe et al. [39] analysent par spectrométrie de masse le profil d’expression protéique du sécrétome aux différents stades du développement précoce embryonnaire. Les résultats montrent l’expression de protéines différentes au cours du développement de l’embryon et des profils de sécrétion ont pu être associés à la capacité d’atteindre le stade de blastocyste. En particulier, l’ubiquitine s’est révélée être un marqueur corrélé au développement embryonnaire. D’autre part, les embryons qui dégénèrent montrent une expression significativement accrue de plusieurs biomarqueurs

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qui pourraient être impliqués dans des mécanismes d’inhibition de la croissance et d’apoptose. De plus, ces travaux suggèrent qu’il existe une « signature protéique » du sécrétome permettant de déterminer l’état de ploïdie d’un embryon. L’impact de ces profils ou des biomarqueurs identifiés reste à évaluer de manière prospective sur un plus grand nombre d’échantillons mais si les recherches en cour confirment ces résultats, cette approche constituerait un outil puissant pour la sélection des embryons, en permettant d’évaluer à la fois le potentiel de développement et la constitution chromosomique de l’embryon sans être invasif. 3.2.2. Métabolomique La métabolomique consiste en l’analyse du métabolisme embryonnaire et plusieurs études ont déjà montré une corrélation entre le statut métabolique de l’embryon et sa viabilité. Il existe des approches précises qui s’intéressent au métabolisme énergétique ou à la consommation d’oxygène et des approches spectrales plus globales. Des travaux sur le métabolisme des acides aminés suggèrent que le « turn-over » de certains acides aminés des embryons est corrélé à l’obtention d’une grossesse après transfert. En outre, Botros et al. [40] désignent le pyruvate comme un marqueur potentiel de la viabilité embryonnaire. Ce résultat confirme les données de Gardner et al. [41] en 2001 qui avaient également montré une consommation en pyruvate, mesurée au quatrième jour, significativement plus importante pour les embryons atteignant le stade de blastocyste. D’autre part, ces mêmes travaux se rejoignent quant au métabolisme du glucose. Les résultats montrent qu’une hausse significative de la métabolisation du glucose à j4 reflète le potentiel de développement de l’embryon. De surcroît, l’étude de Gardner et al. [42] en 2011 conclut que la consommation de glucose par l’embryon serait prédictive de l’issue de la FIV (Fig. 5) voire même du sexe de l’embryon. Ses résultats mettent donc en évidence des différences métaboliques entre les embryons en fonction de leur capacité à donner des naissances et l’étude de ces métabolismes permettrait une meilleure sélection de l’embryon à transférer. Les approches plus globales, ou métabolomiques, visent à fournir des profils caractéristiques des embryons à haut potentiel de développement et d’implantation. Ces techniques fournissent une image complète du métabolisme embryonnaire et du profil d’expression des gènes et les travaux réalisés dans ce domaine ont conduit à calculer un « score de viabilité » de l’embryon à partir de son profil métabolomique établi par spectroscopie. L’étude de Seli et al. [43] publiée en 2010 compare ce score de viabilité et la morphologie embryonnaire pour prédire les issues de FIV après transfert d’un blastocyste à j5. Au total, 198 embryons et milieux de cultures sont analysés et les résultats montrent que l’index de viabilité est plus prédictif de grossesses que les critères morphologiques utilisés en routine. La combinaison de ces deux paramètres pourrait donc permettre de donner plus de chances aux couples ayant recours à l’AMP mais de nouveau, la validation de ces approches nécessite une confirmation par des études prospectives.

4. CONCLUSION Les recherches menées au cours des dernières décennies ont fourni de nombreux critères visant à améliorer la sélection de l’embryon à transférer afin de ne faire perdre aucune chance de grossesse au couple dans le cadre de l’eSET. La morphologie embryonnaire est un paramètre capital pour évaluer les chances de succès en fécondation in vitro et reste aujourd’hui le critère le plus pertinent dans le choix de l’embryon à transférer. En accordant à la cinétique de développement embryonnaire autant de crédit que les critères morphologiques utilisés en routine, le time-lapse pourrait entraîner une modification de nos pratiques en AMP. S’il semble être un outil efficace d’aide à la décision dans la sélection de l’embryon, le rapport bénéfice/coût de ce système reste à évaluer et des études randomisées sont en cours afin de mesurer son apport réel. Dans ce contexte de meilleure sélection embryonnaire, la culture prolongée jusqu’au stade blastocyste est une pratique incontournable et ce d’autant que la vitrification permet désormais d’obtenir d’excellents taux de survie à ce stade. Néanmoins, la pratiquer de façon systématique ne semble pas justifié et il est judicieux de réserver la CP à une population de bon pronostic, lorsque de nombreux embryons de bonne qualité sont disponibles à j2/j3. Pour affiner la sélection, certains pays ajoutent des techniques invasives en pratiquant le PGS, qui lorsque réalisé par FISH à j3, ne présente aucun intérêt clinique. L’apport des techniques récentes permettant une analyse globale du génome est attendu ici, associées à une biopsie différée à j5 qui permet un diagnostic plus juste tant pour le DPI que pour le PGS. Enfin, l’émergence des nouvelles technologies « omics » pourrait à l’avenir modifier nos pratiques. À l’heure actuelle, l’application de ces techniques reste encore limitée par le coût élevé des équipements nécessaires et surtout par l’absence de validation prospective des résultats obtenus. Néanmoins, ces techniques ouvrent la voie au développement de « marqueurs » de compétence accessibles en pratique clinique et une fois validées, ces nouvelles approches pourraient améliorer la sélection de l’embryon à transférer et permettre ainsi d’obtenir plus de grossesses après transfert sélectif d’un embryon.

DÉCLARATION D’INTÉRÊTS Les auteurs déclarent ne pas avoir de conflits d’intérêts en relation avec cet article. RÉFÉRENCES [1] Ferraretti AP, Goossens V, Kupka M, Bhattacharya S, de Mouzon J, Castilla JA, et al. European IVF-monitoring (EIM), and Consortium, for The European Society of Human Reproduction and Embryology (ESHRE), ‘‘Assisted reproductive technology in Europe, 2009: results generated from European registers by ESHRE’’. Hum Reprod Oxf Engl 2013;28(9):2318–31. [2] Maheshwari A, Griffiths S, Bhattacharya S. ‘‘Global variations in the uptake of single embryo transfer’’. Hum Reprod Update 2011;17(1):107–20.

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