Z Lebensm Unters Forsch (1992) 194:216-221
Zeitschrift for
9 Springer-Verlag 1992
Originalarbeit Thermisch induzierter Abbau yon Disaccharid-Amadori-Verbindungen in quasi wasserfreiem Reaktionsmilieu Lothar Kroh 1, Roland Schr6der 2, Clemens Miigge 1, Giinther Westphal ~ und Werner Baltes 2 t Humboldt-Universitfitzu Berlin, Institut ffir Lebensmittelwissenschaftund Mikrobiologie und Institut ffir Analytische Chemie, Invalidenstrasse 42, O-1040 Berlin, Bundesrepublik Deutschland 2 TechnischeUniversit/it Berlin, Institut ffir Lebensmittelchemie, Gustav-Meyer-Allee25, W-1000 Berlin 65, Bundesrepublik Deutschland Eingegangen am 13. August 1991
Heat-induced degradation of disaccharide Amadod compounds under almost water-free reaction conditions Summary. The thermally induced decomposition of disaccharide Amadori compounds has been compared to those of monosaccharide ones under almost water-free conditions. The structure of the synthesized maltulosyl compound has been proved to be 4Cra-D-glucopyranosyl- (l~4)-2C5-fl-D-fructopyranosylglycine by 1Hand ~3C-NMR spectroscopy. The decomposition of Amadofi compounds has been used to study the kinetics of the browning reaction. Compared to fructosylglycine and maltotriulosylglycine, the browning of the disaccharide is faster. Curie point pyrolysis at 300 ~ C and investigation of the pyrolysate by gas chromatography/mass spectrometry have shown that the disaccharide component influences the thermal process. Furanes and furanones have been detected as predominant degradation products, the main one being 2(5H)-furanone. For the first time, we suggest a reaction pathway for the formation of these products via the Maillard reaction which includes 1,6-anhydroglucose.
Zusammenfassung. Untersucht wird der thennisch induzierte Abbau yon Disaccharid-Amadori-Verbindungen in quasi wasserfreiem Reaktionsmilieu. Die Struktur der synthetisierten Maltulosylverbindung wird fiber die Aufnahme yon 1H- und 13C-NMR-Spektren als 4CI-c~-DGlucopyranolsyl-(l --*4)-2Cs-fl-o-fructopyranosylglycin bestimmt. Im Vergleich zum Fructosyl- und Maltotriulosylglycin brfiunt das Disaccharid-Derivat unter den angegebenen Reaktionsbedingungen st/irker. IJber die Curiepunkt-Pyrolyse der Amadori-Verbindungen bei 300 ~ und anschlieBende GC/MS-Analyse der Spaltprodukte werden bevorzugt Furank6rper nachgewiesen, yon denen das 2(5H)-Furanon mengenm/iBig dominiert. Ein ReakOffprint requests to: L. Kroh
tionsweg der Bildung solcher Furanone aus Disacchariden wird vorgeschlagen. Erstmals erfolgt die Einbeziehung von 1,6-Anhydroglucose in die Diskussion zum Verlauf der Maillard-Reaktion.
Einleitung Bei der Verarbeitung von Lebensmitteln werden infolge vorwiegend amylolytischer Prozesse Disaccharide gebildet. Solche Oligosaccharide entstehen vorwiegend aus h6hermolekularen Glycanen bei der Herstellung von Backwaren und Malz oder auch bei der Fermentation yon Kakao. Damit stehen neben Monosacchariden auch reduzierende Disaccharide vom Typ der Maltose ffir eine nichtenzymatische Br/iunung, insbesondere der Maillard-Reaktion, zur Verffigung und sind in den ProzeB der Bildung einer Vielzahl von flfichtigen Verbindungen und Melanoidinen einzubeziehen. Von Interesse ist ffir uns besonders die einleitende Phase der Maillard-Reaktion mit ihrem zentralen Schritt der e-Hydroxycarbonylumlagerung, die im Falle von Aldosen fiber die Amadori-Umlagerung zu 1-Desoxy-l-aminoketosylverbindungen ffihrt. W/ihrend dabei die Struktur und Reaktivit/it von Amadori-Verbindungen aus Monosacchariden relativ gut untersucht sind, [z. B. 1-3] und auch technologisch relevante Ergebnisse vorliegen [4,5], bleiben ffir die Einbeziehung yon Disacchariden in den Verlauf der Br/iunung noch Fragen often. Das betrifft insbesondere die Rolle des terminalen Kohlenhydratrestes ffir den Mechanismus und die Kinetik der Folgereaktionen, die allgemein zur Bildung yon Br/iunungsprodukten ffihren. Ffir unsere Untersuchungen w/ihlten wir die Systelne Glucose/Glycin und Maltose/Glycin aus, die in Form ihrer Amadori-Verbindungen eingesetzt werden. Damit wird gleichzeitig ein ,,reales" Verh/iltnis zwischen Kohlenhydrat- und Aminokomponente yon 1:1 gewfihrleistet. Neben der gezielten Synthese der Disaccharid-Amadori-Verbindungen scheint es uns notwendig, diese strukturell hinreichend genau zu charakterisieren, um m6gli-
217 che Reaktionswege, die sich aus der Struktur ergeben k6nnen, zu diskutieren. Die Reaktivit/it der AmadoriVerbindungen wird unter quasiwasserfreien Reaktionsbedingungen untersucht und anhand der Erfassung der Br/iunung bei 430 nm charakterisiert. O b e r die Curiepunkt-Pyrolyse-Gaschromatographie/Massenspektrometrie werden Aussagen zur thermisch induzierten Spaltung und den Folgeprodukten der Amadori-Verbindungen erwartet.
Experimenteller Teil
Synthese der Amadori-Verbindungen. Die Synthese der AmadoriVerbindungen erfolgt fiber eine modifizierte Vorschrift nach [6], bei der unter Anwendung von Natriumdisulfit die Komponenten Zukker und Aminos/iure am RfickfluB bis zur deutlichen Gelbffirbung umgesetzt werden. Nach chromatographischer Trennung an Dowex 50 WX8 (H-Form) die Produkte durch Umffillen reinigen und unter vermindertem Druck trocknen. 1-Desoxy-l-glycino-fructose (Fructosylglycin. Fp.: 166-168 ~ (Z.),
Tabelle 1. 1H- und x3C-NMR-chemische Verschiebungen der Amadori-Verbindungen Fructosylglycin und Maltulosylglycin
c~ fl C1, (2H) C2 C3, (H) C4, (H) C5, (H) C6, (2H) C1, (H') C2', (H') C3', (H') C4', (H') C5', (H') C6', (H')
Maltulosylglycin
Fructosylglycin
d(13C)
d('H)
d('3C)
175,6 54,3 57,7 100,0 74,2 82,2 73,4 68,5 105,6 76,3 76,9 76,3 73,9 65,1
_b 3,67" 3,35" 3,79 3,84 4,18 4,04, 3,74 5,21 (d) 3,55 (d x d) 3,78 (d x d) 3,41 (d x d) 4,15 3,96"
175,6 54,3 57,8 99,9 74,5 73,9 73,5 68,5
b
3,67 a 3,32a 3,75 (d) 3,88 (d x d) 4,02 (d x d x d) 4,01, 3,76
" Mitte AB-System b HD-Austausch
(ber. 40,51; 6,37; 5,91; get'. 40,52; 6,24; 5,93), Ausbeute: 13% (d.Th.).
1-Desoxy-l-glycino-maltulose (Maltulosylglycin). Fp.: 155-157 ~ (Z.), CHN (bet. 42,06; 6,25; 3,50; gel. 42,10; 6,13; 3,69), Ausbeute: 15% (d.Th.)
d(1H)
OH
.o--r4'
CH~OH ~
s/..,..,...,...~ _ j . . . f . ~ C H ^ _ N H C H ~ C O O H u z
I
Lo.
1-Desoxy-l-glycino-maltotriulose ( Maltotriulosylglycin ). Fp.: 188189 ~ (Z.), CHN (ber. 42,74; 6,23; 2,49; gef. 43,58; 6,63; 2,94), Ausbeute: 19% (d.Yh.)
NMR-Untersuchungen. Diese an einem 300 MHz-Ger/it, Bruker (AM 300), durchffihren. Die Proben in DzO 16sen (0,1 mol ffir laC und 0,05 mol ffir 1H) und auf den inneren Standard TSP = 1,7 TMS=0 mg/kg (13C) bzw. TSP=0~TMS=0 mg/kg (1H) beziehen. Zuordnung der laC-Signale durch Aufnahme von DEPT- und CHCORRD-Spektren, die H,H-Konnektivit/iten mit Hilfe doppelquantengefilterter COSY-Experimente (256 x IK Spektren, Hz/ Pt FI,Fz(= 1,3; TRep = 5 S, tUoc=O,1 S; NS =32) bestimmen. Curiepunkt-Pyrolyse - Gaschromatographie/ITD-Massenspektrometrie. Jeweils 10 mg einer Substanz in 1 ml deionisiertem Wasser 16sen, davon 10 #1 (= 100 #g) auf einen zylindrischen Pyrolysetr/iger geben. AnschlieBend das L6sungsmittel durch einen Kaltluftstrom (F6n) entfernen. Die Pyrolysen mit einem Fischer Curie-Punkt Pyrolysator, Mod. 310, durchffihren (Pyrolysetemperatur 300 ~ Pyrolysezeit 10 s). Das Pyrolysat splitlos aufeine DB-210, 0,35 mm iD, 0,5 #m df spfilen, Trfigergas Helium (V = 20 cm/s). Nach 1 min den Split (1:5) wieder 6ffnen. Den Gaschromatograph, Carlo Erba 5360, 5 rain isotherm bei 40 ~ halten und dann mit einer Rate yon 3~ auf 210 ~ heizen. Zuordnung der Substanzen durcri den mittels open-sprit Interface gekoppelten ITD 800 im EI-Modus (Scanbereich 45-249 ainu) anhand von Referenzspektren und bekannten Retentionsdaten. Quantifizierung im CI-Modus (Reaktantgas Methan, Scanbereich 55-350 ainu) durchffihren.
Ergebnisse und Diskussion
S truk tur aufkliirung Als Methode der Wahl bietet sich ffir die Konformationsbestimmung von Kohlenhydratderivaten die all- und ~3C-NMR-Spektroskopie an. Die Analyse der in D 2 0
O
Abb. 1. Strukturformel des Maltulosylglycins
bei 300 M H z aufgenommen N M R - S p e k t r e n ergibt in Ubereinstimmung mit [7] ffir die Struktur des Fructosylglycins eine 2Cs-fl-o-Form, mit einem Anteil der H a u p t k o m p o n e n t e yon ca. 70% an der Isomerenverteilung (vgl. Tabelle 1). Ffir das Maltulosylderivat kann nur anhand der ermittelten 1 H - N M R - D a t e n insbesondere der K o p p lungskonstanten (vgl. Tabelle 2), nicht aber der t3C-Signale [8], eine exakte Strukturzuordnung fiir den terminalen und den umgelagerten Kohlenhydratteil des Disaccharides getroffen werden. Eine a,e-Anordnung der epimeren Protonen ( H I ' H2', J = 4 , 2 Hz) und eine a,a-Anordnung f/Jr die Protonen H 2 ' bis H 5 ' ( J > 8 Hz) sprechen ffir eine 4C~-~-DK o n f o r m a t i o n des terminalen Kohlenhydrates [9]. Die pyranoide Struktur des Ketosylzuckerteils wird durch die Kopplungskonstanten H 3 - H 4 (a,a J = 12,3 Hz) und H4 bis H6 (a,e J < 2 Hz) abgesichert, so dal3 die Struktur der H a u p t k o m p o n e n t e (ca. 70%) 4C~-e-D-Glucopyranosyl(1--*4)2Cs-fl-o-fructopyranosylglycin sicher angegeben werden kann (vgl. Abb. 1). A u f G r u n d der Komplexizit/it des 1H-NMR-Spektrums ist eine konformative Zuordnung der M i n o r k o m ponenten, die im Verh/iltnis von 10% und 20% zur H a u p t k o m p o n e n t e vorliegen, nur mit groBem Aufwand m6glich, so dab bislang d a r a u f verzichtet wurde. Aus diesen Untersuchungen geht hervor, dab der terminale Zucker, der nach den Werten der chemischen Verschiebung nahezu der Struktur der ursprfinglichen Mal-
218 Tabelle2. Ausgew/ihlte Kopplungskonstanten J (H-H, Hz) der Amadori-Verbindungen Fructosylglycin und Maltulosylglycin
Maltulosylglycin H I ' - H 2 ' : 4,2 H2'-H3': 9,7 H3'-H4': 8,3 H4'-H5': 10,2
Fructosylglycin H3-H4: 1 2 , 3 H4-H5: 2,0 H5-H6A: 1,9 H5-H6B: 1,4
H3-H4:9,8 H4-H5:3,3 H5-H6A:2,3 H5-H6B:l,6
tose entspricht, kaum einen EinfluB auf die Konformation des umgelagerten Kohlenhydratteils besitzt. Die chemischen Verschiebungen der Fructosylverbindung weichen in den vergleichbaren Positionen bei identischer Aminokomponente nur unwesentlich vonder des Maltosylderivates ab. Auch die mengenm/il3ige Isomerenverteilung wird durch den zweiten Kohlenhydratrest nicht verfindert. Hier liegt die Schlul3folgerung nahe, dab sich auch eine weitere terminale Kettenverl/ingerung zum Triund weiter zum Oligosaccharid nicht auf die Konformation des umgelagerten Fructosylrestes auswirken sollte.
Briiunungsreaktion der Amadori- Verbindungen Von Amadori-Verbindungen ist bekannt [3], dab sie im Vergleich zur Br/iunung der Edukte eine deutlich gesteigerte Reaktivit/it zur nichtenzymatischen Br/iunung in quasi wasserfreiem Milieu besitzen. Das betrifft nicht nur die Quantit/it an gebildeten Br/iunungsprodukten, sondern auch eine signifikante Temperaturabh/ingigkeit der Reaktion. Die Untersuchungen zur Ermittlung der Br/iunungskinetik der Amadori-Verbindungen in Abh/ingigkeit der Kohlenhydratkomponente wurden bei 120 ~ (+0,5 K) unter freiem Luftzutritt durchgefiihrt und durch Messung der Br/iunungswerte bei 430 nm verfolgt. Dabei konnte anhand der errechneten kB-Werte, h-1 [10] festgestellt werden, dab Maltulosylglycin (k~ = 0,114) nahezu doppelt so stark br/iunt als Fructosylglycin (kB= 0,047) und die Kettenverl/ingerung im Maltotriulosylgycin (k~=0,035) die Br/iunung verringert. Die Produkte sind bei 120 ~ noch vollst/indig wasserl6slich und geringffigige Unterschiede der Schmelzpunkte der Amadori-Verbindungen sollten die Vergleichbarkeit nicht wesentlich beeintr/ichtigen. Die Reaktion ist im Falle des Di- und Trisacccharides durch eine ca. 5-7%ige Freisetzung an Glucose (Enzymelektrode, Glucoseoxidase) durch Spaltung der glycosidischen Bindung begleitet.
Curiepunkt-Pyrolyse Ffir die Verfolgung der nichtenzymatischen Br/iunung in quasi wasserfreiem Milieu bietet sich neben der Differentialthermogravimetrie [3] besonders die direkte Kopplung der Curiepunkt-Pyrolyse mit der GC/MS an [11]. Letztere gestattet das schlagartige Erhitzen der Proben auf eine gew/ihlte Pyrolysetemperatur, wobei eine thermisch induzierte Fragmentierung ausgel6st wird und die resultierenden Spaltprodukte fiber GC/MS analysiert werden k6nnen. Neben der Zuordnung der so gewonne-
nen Pyrogramme nach der ,,finger-print"-Technik zu bekannten Polysacchariden [12] sind Rfickschliisse auf eine vorgegebene Struktur von hochmolekularen Verbindungen [12,13], aber auch die Untersuchung von thermisch determinierten Reaktionen niedermolekularer Komponenten m6glich [14]. Bei der Interpretation der pyrolytisch gebildeten Verbindungen i st jedoch in jedem Fall die M6glichkeit von Rekombinationsreaktionen der Spaltprodukte in die Diskussion einzuschliel3en. Durch die Wahl einer moderaten Pyrolysetemperatur (300 ~ kann die Bildung yon unspezifischen Aromaten wie Benzol oder Toluol, weitgehend vermieden werden. Die bei der Curiepunkt-Pyrolyse der Amadori-Verbindungen erhaltenen und analysierten Zersetzungsprodukte sind im Vergleich zur Maltose in Tabelle 3 aufgeffihrt. Ein Vergleich der analysierten Verbindungen 1/iBt fiir beide Umlagerungsprodukte ein etwa ~ihnliches Produktspektrum erkennen. Wie erwartet dominieren neben Aceton und Essigs/iure vor allem Sauerstoff- und Stickstoffheterocyclen vom Typ der Furane, Pyrrole und Pyrazine. Unterschiede ergeben sich jedoch in der Konzentration der auftretenden Verbindungen. So werden beispielsweise alkylsubstituierte Pyrazine wie Methyl-, Dimethyl-, Trimethyl- und 2-Ethyl-5(6)-methylpyrazin vermehrt aus der Fructosylverbindung gebildet. Auch die Pyrrole (1- und 2-Acetylpyrrol) zeigen in etwa diese Konzentrationsverteilung. Ftir diese Vergleiche wurde die Gruppe der N-haltigen Heterocyclen nach der Normierung der Flfichenwerte auf 100% betrachtet. Zu betonen ist jedoch, dab bei konstanter Probenmenge das Verh/iltnis von Glucoseeinheiten und Aminos/iure ffir die Bildung der Heterocyclen von ausschlaggebender Bedeutung ist. Dieser Effekt ist nach unseren r auf die st/irkere Fragmentierung der Fructosylverbindung, insbesondere die Freisetzung von Ammoniak zurtickzuffihren [15,16]. In der Rekombination des Ammoniaks mit Carbonylverbindungen der Zuckerfragmentierung (Retro-Aldol-Spaltung, c~-Dicarbonylspaltung) reagieren Diacetyl, Methylglyoxal u. a. zu den genannten Verbindungen [17]. 7-Pyranone, die typischen Abbauprodukte der 1-Desoxydiketosen werden entsprechend der eingesetzten Kohlenhydratkomponente gefunden. Dabei ist Hydroxymaltol das bevorzugte Produkt des Monosaccharidderivates und Maltol wird hier ausschlieglich aus dem Maltulosylamin gebildet, ein Reaktionsverlauf, der typisch ffir w/il3rige Reaktionssysteme [16], aber temperaturabh/ingig auch unter pyrolytischen Bedingungen zu beobachten ist. Unterscheiden mug man dabei einmal zwischen einer vorgeschalteten Spaltung der glycosidischen Bindung, fiber die noch zu sprechen sein wird, und einer intermedi/iren Umwandlung des ersten Kohlenhydratrestes in ein 7-Pyranon und nachfolgende Glykosidspaltung. 3-Desoxydiketose ist der intermedi/ir auftretende Vor1/iufer der in nahezu allen Zuckerabbaureaktionen auftretenden Furane (2-Hydroxymethyl-5-furancarbaldehyd und 2-Furancarbaldehyd). Beide Verbindungen gehen besonders aus Maltose bzw. dem Maltulosylamin hervor. Bekannt ist in diesem Zusammenhang, dab gerade Furancarbaldehyde bevorzugt aus Disacchariden gebildet werden [18], was vermutlich auf die gfinstigere Eliminie-
219 Tabelle 3. Identifizierte V e r b i n d u n g e n der Curiepunkt-Pyrolyse v o n A m a d o r i Verbindungen bei 300 ~ im Vergleich zu Maltose
RI: Retentionsindex nach v.d. D o o l / K r a t z [J C h r o m a t o g r (1963), 11:463] M G : Molektdargewicht !: H a u p t k o m p o n e n t e x-xxx: relative Intensit/itsverteilung sp: n u r in Spuren nachweisbar - : nicht nachweisbar
RI
MG
Name
Maltose
Maltulosylglycin Intensit/it Intensit/it
Fructosylglycin Intensit/it
< < < < <
Zeitschrift for
9 Springer-Verlag 1992
Originalarbeit Thermisch induzierter Abbau yon Disaccharid-Amadori-Verbindungen in quasi wasserfreiem Reaktionsmilieu Lothar Kroh 1, Roland Schr6der 2, Clemens Miigge 1, Giinther Westphal ~ und Werner Baltes 2 t Humboldt-Universitfitzu Berlin, Institut ffir Lebensmittelwissenschaftund Mikrobiologie und Institut ffir Analytische Chemie, Invalidenstrasse 42, O-1040 Berlin, Bundesrepublik Deutschland 2 TechnischeUniversit/it Berlin, Institut ffir Lebensmittelchemie, Gustav-Meyer-Allee25, W-1000 Berlin 65, Bundesrepublik Deutschland Eingegangen am 13. August 1991
Heat-induced degradation of disaccharide Amadod compounds under almost water-free reaction conditions Summary. The thermally induced decomposition of disaccharide Amadori compounds has been compared to those of monosaccharide ones under almost water-free conditions. The structure of the synthesized maltulosyl compound has been proved to be 4Cra-D-glucopyranosyl- (l~4)-2C5-fl-D-fructopyranosylglycine by 1Hand ~3C-NMR spectroscopy. The decomposition of Amadofi compounds has been used to study the kinetics of the browning reaction. Compared to fructosylglycine and maltotriulosylglycine, the browning of the disaccharide is faster. Curie point pyrolysis at 300 ~ C and investigation of the pyrolysate by gas chromatography/mass spectrometry have shown that the disaccharide component influences the thermal process. Furanes and furanones have been detected as predominant degradation products, the main one being 2(5H)-furanone. For the first time, we suggest a reaction pathway for the formation of these products via the Maillard reaction which includes 1,6-anhydroglucose.
Zusammenfassung. Untersucht wird der thennisch induzierte Abbau yon Disaccharid-Amadori-Verbindungen in quasi wasserfreiem Reaktionsmilieu. Die Struktur der synthetisierten Maltulosylverbindung wird fiber die Aufnahme yon 1H- und 13C-NMR-Spektren als 4CI-c~-DGlucopyranolsyl-(l --*4)-2Cs-fl-o-fructopyranosylglycin bestimmt. Im Vergleich zum Fructosyl- und Maltotriulosylglycin brfiunt das Disaccharid-Derivat unter den angegebenen Reaktionsbedingungen st/irker. IJber die Curiepunkt-Pyrolyse der Amadori-Verbindungen bei 300 ~ und anschlieBende GC/MS-Analyse der Spaltprodukte werden bevorzugt Furank6rper nachgewiesen, yon denen das 2(5H)-Furanon mengenm/iBig dominiert. Ein ReakOffprint requests to: L. Kroh
tionsweg der Bildung solcher Furanone aus Disacchariden wird vorgeschlagen. Erstmals erfolgt die Einbeziehung von 1,6-Anhydroglucose in die Diskussion zum Verlauf der Maillard-Reaktion.
Einleitung Bei der Verarbeitung von Lebensmitteln werden infolge vorwiegend amylolytischer Prozesse Disaccharide gebildet. Solche Oligosaccharide entstehen vorwiegend aus h6hermolekularen Glycanen bei der Herstellung von Backwaren und Malz oder auch bei der Fermentation yon Kakao. Damit stehen neben Monosacchariden auch reduzierende Disaccharide vom Typ der Maltose ffir eine nichtenzymatische Br/iunung, insbesondere der Maillard-Reaktion, zur Verffigung und sind in den ProzeB der Bildung einer Vielzahl von flfichtigen Verbindungen und Melanoidinen einzubeziehen. Von Interesse ist ffir uns besonders die einleitende Phase der Maillard-Reaktion mit ihrem zentralen Schritt der e-Hydroxycarbonylumlagerung, die im Falle von Aldosen fiber die Amadori-Umlagerung zu 1-Desoxy-l-aminoketosylverbindungen ffihrt. W/ihrend dabei die Struktur und Reaktivit/it von Amadori-Verbindungen aus Monosacchariden relativ gut untersucht sind, [z. B. 1-3] und auch technologisch relevante Ergebnisse vorliegen [4,5], bleiben ffir die Einbeziehung yon Disacchariden in den Verlauf der Br/iunung noch Fragen often. Das betrifft insbesondere die Rolle des terminalen Kohlenhydratrestes ffir den Mechanismus und die Kinetik der Folgereaktionen, die allgemein zur Bildung yon Br/iunungsprodukten ffihren. Ffir unsere Untersuchungen w/ihlten wir die Systelne Glucose/Glycin und Maltose/Glycin aus, die in Form ihrer Amadori-Verbindungen eingesetzt werden. Damit wird gleichzeitig ein ,,reales" Verh/iltnis zwischen Kohlenhydrat- und Aminokomponente yon 1:1 gewfihrleistet. Neben der gezielten Synthese der Disaccharid-Amadori-Verbindungen scheint es uns notwendig, diese strukturell hinreichend genau zu charakterisieren, um m6gli-
217 che Reaktionswege, die sich aus der Struktur ergeben k6nnen, zu diskutieren. Die Reaktivit/it der AmadoriVerbindungen wird unter quasiwasserfreien Reaktionsbedingungen untersucht und anhand der Erfassung der Br/iunung bei 430 nm charakterisiert. O b e r die Curiepunkt-Pyrolyse-Gaschromatographie/Massenspektrometrie werden Aussagen zur thermisch induzierten Spaltung und den Folgeprodukten der Amadori-Verbindungen erwartet.
Experimenteller Teil
Synthese der Amadori-Verbindungen. Die Synthese der AmadoriVerbindungen erfolgt fiber eine modifizierte Vorschrift nach [6], bei der unter Anwendung von Natriumdisulfit die Komponenten Zukker und Aminos/iure am RfickfluB bis zur deutlichen Gelbffirbung umgesetzt werden. Nach chromatographischer Trennung an Dowex 50 WX8 (H-Form) die Produkte durch Umffillen reinigen und unter vermindertem Druck trocknen. 1-Desoxy-l-glycino-fructose (Fructosylglycin. Fp.: 166-168 ~ (Z.),
Tabelle 1. 1H- und x3C-NMR-chemische Verschiebungen der Amadori-Verbindungen Fructosylglycin und Maltulosylglycin
c~ fl C1, (2H) C2 C3, (H) C4, (H) C5, (H) C6, (2H) C1, (H') C2', (H') C3', (H') C4', (H') C5', (H') C6', (H')
Maltulosylglycin
Fructosylglycin
d(13C)
d('H)
d('3C)
175,6 54,3 57,7 100,0 74,2 82,2 73,4 68,5 105,6 76,3 76,9 76,3 73,9 65,1
_b 3,67" 3,35" 3,79 3,84 4,18 4,04, 3,74 5,21 (d) 3,55 (d x d) 3,78 (d x d) 3,41 (d x d) 4,15 3,96"
175,6 54,3 57,8 99,9 74,5 73,9 73,5 68,5
b
3,67 a 3,32a 3,75 (d) 3,88 (d x d) 4,02 (d x d x d) 4,01, 3,76
" Mitte AB-System b HD-Austausch
(ber. 40,51; 6,37; 5,91; get'. 40,52; 6,24; 5,93), Ausbeute: 13% (d.Th.).
1-Desoxy-l-glycino-maltulose (Maltulosylglycin). Fp.: 155-157 ~ (Z.), CHN (bet. 42,06; 6,25; 3,50; gel. 42,10; 6,13; 3,69), Ausbeute: 15% (d.Th.)
d(1H)
OH
.o--r4'
CH~OH ~
s/..,..,...,...~ _ j . . . f . ~ C H ^ _ N H C H ~ C O O H u z
I
Lo.
1-Desoxy-l-glycino-maltotriulose ( Maltotriulosylglycin ). Fp.: 188189 ~ (Z.), CHN (ber. 42,74; 6,23; 2,49; gef. 43,58; 6,63; 2,94), Ausbeute: 19% (d.Yh.)
NMR-Untersuchungen. Diese an einem 300 MHz-Ger/it, Bruker (AM 300), durchffihren. Die Proben in DzO 16sen (0,1 mol ffir laC und 0,05 mol ffir 1H) und auf den inneren Standard TSP = 1,7 TMS=0 mg/kg (13C) bzw. TSP=0~TMS=0 mg/kg (1H) beziehen. Zuordnung der laC-Signale durch Aufnahme von DEPT- und CHCORRD-Spektren, die H,H-Konnektivit/iten mit Hilfe doppelquantengefilterter COSY-Experimente (256 x IK Spektren, Hz/ Pt FI,Fz(= 1,3; TRep = 5 S, tUoc=O,1 S; NS =32) bestimmen. Curiepunkt-Pyrolyse - Gaschromatographie/ITD-Massenspektrometrie. Jeweils 10 mg einer Substanz in 1 ml deionisiertem Wasser 16sen, davon 10 #1 (= 100 #g) auf einen zylindrischen Pyrolysetr/iger geben. AnschlieBend das L6sungsmittel durch einen Kaltluftstrom (F6n) entfernen. Die Pyrolysen mit einem Fischer Curie-Punkt Pyrolysator, Mod. 310, durchffihren (Pyrolysetemperatur 300 ~ Pyrolysezeit 10 s). Das Pyrolysat splitlos aufeine DB-210, 0,35 mm iD, 0,5 #m df spfilen, Trfigergas Helium (V = 20 cm/s). Nach 1 min den Split (1:5) wieder 6ffnen. Den Gaschromatograph, Carlo Erba 5360, 5 rain isotherm bei 40 ~ halten und dann mit einer Rate yon 3~ auf 210 ~ heizen. Zuordnung der Substanzen durcri den mittels open-sprit Interface gekoppelten ITD 800 im EI-Modus (Scanbereich 45-249 ainu) anhand von Referenzspektren und bekannten Retentionsdaten. Quantifizierung im CI-Modus (Reaktantgas Methan, Scanbereich 55-350 ainu) durchffihren.
Ergebnisse und Diskussion
S truk tur aufkliirung Als Methode der Wahl bietet sich ffir die Konformationsbestimmung von Kohlenhydratderivaten die all- und ~3C-NMR-Spektroskopie an. Die Analyse der in D 2 0
O
Abb. 1. Strukturformel des Maltulosylglycins
bei 300 M H z aufgenommen N M R - S p e k t r e n ergibt in Ubereinstimmung mit [7] ffir die Struktur des Fructosylglycins eine 2Cs-fl-o-Form, mit einem Anteil der H a u p t k o m p o n e n t e yon ca. 70% an der Isomerenverteilung (vgl. Tabelle 1). Ffir das Maltulosylderivat kann nur anhand der ermittelten 1 H - N M R - D a t e n insbesondere der K o p p lungskonstanten (vgl. Tabelle 2), nicht aber der t3C-Signale [8], eine exakte Strukturzuordnung fiir den terminalen und den umgelagerten Kohlenhydratteil des Disaccharides getroffen werden. Eine a,e-Anordnung der epimeren Protonen ( H I ' H2', J = 4 , 2 Hz) und eine a,a-Anordnung f/Jr die Protonen H 2 ' bis H 5 ' ( J > 8 Hz) sprechen ffir eine 4C~-~-DK o n f o r m a t i o n des terminalen Kohlenhydrates [9]. Die pyranoide Struktur des Ketosylzuckerteils wird durch die Kopplungskonstanten H 3 - H 4 (a,a J = 12,3 Hz) und H4 bis H6 (a,e J < 2 Hz) abgesichert, so dal3 die Struktur der H a u p t k o m p o n e n t e (ca. 70%) 4C~-e-D-Glucopyranosyl(1--*4)2Cs-fl-o-fructopyranosylglycin sicher angegeben werden kann (vgl. Abb. 1). A u f G r u n d der Komplexizit/it des 1H-NMR-Spektrums ist eine konformative Zuordnung der M i n o r k o m ponenten, die im Verh/iltnis von 10% und 20% zur H a u p t k o m p o n e n t e vorliegen, nur mit groBem Aufwand m6glich, so dab bislang d a r a u f verzichtet wurde. Aus diesen Untersuchungen geht hervor, dab der terminale Zucker, der nach den Werten der chemischen Verschiebung nahezu der Struktur der ursprfinglichen Mal-
218 Tabelle2. Ausgew/ihlte Kopplungskonstanten J (H-H, Hz) der Amadori-Verbindungen Fructosylglycin und Maltulosylglycin
Maltulosylglycin H I ' - H 2 ' : 4,2 H2'-H3': 9,7 H3'-H4': 8,3 H4'-H5': 10,2
Fructosylglycin H3-H4: 1 2 , 3 H4-H5: 2,0 H5-H6A: 1,9 H5-H6B: 1,4
H3-H4:9,8 H4-H5:3,3 H5-H6A:2,3 H5-H6B:l,6
tose entspricht, kaum einen EinfluB auf die Konformation des umgelagerten Kohlenhydratteils besitzt. Die chemischen Verschiebungen der Fructosylverbindung weichen in den vergleichbaren Positionen bei identischer Aminokomponente nur unwesentlich vonder des Maltosylderivates ab. Auch die mengenm/il3ige Isomerenverteilung wird durch den zweiten Kohlenhydratrest nicht verfindert. Hier liegt die Schlul3folgerung nahe, dab sich auch eine weitere terminale Kettenverl/ingerung zum Triund weiter zum Oligosaccharid nicht auf die Konformation des umgelagerten Fructosylrestes auswirken sollte.
Briiunungsreaktion der Amadori- Verbindungen Von Amadori-Verbindungen ist bekannt [3], dab sie im Vergleich zur Br/iunung der Edukte eine deutlich gesteigerte Reaktivit/it zur nichtenzymatischen Br/iunung in quasi wasserfreiem Milieu besitzen. Das betrifft nicht nur die Quantit/it an gebildeten Br/iunungsprodukten, sondern auch eine signifikante Temperaturabh/ingigkeit der Reaktion. Die Untersuchungen zur Ermittlung der Br/iunungskinetik der Amadori-Verbindungen in Abh/ingigkeit der Kohlenhydratkomponente wurden bei 120 ~ (+0,5 K) unter freiem Luftzutritt durchgefiihrt und durch Messung der Br/iunungswerte bei 430 nm verfolgt. Dabei konnte anhand der errechneten kB-Werte, h-1 [10] festgestellt werden, dab Maltulosylglycin (k~ = 0,114) nahezu doppelt so stark br/iunt als Fructosylglycin (kB= 0,047) und die Kettenverl/ingerung im Maltotriulosylgycin (k~=0,035) die Br/iunung verringert. Die Produkte sind bei 120 ~ noch vollst/indig wasserl6slich und geringffigige Unterschiede der Schmelzpunkte der Amadori-Verbindungen sollten die Vergleichbarkeit nicht wesentlich beeintr/ichtigen. Die Reaktion ist im Falle des Di- und Trisacccharides durch eine ca. 5-7%ige Freisetzung an Glucose (Enzymelektrode, Glucoseoxidase) durch Spaltung der glycosidischen Bindung begleitet.
Curiepunkt-Pyrolyse Ffir die Verfolgung der nichtenzymatischen Br/iunung in quasi wasserfreiem Milieu bietet sich neben der Differentialthermogravimetrie [3] besonders die direkte Kopplung der Curiepunkt-Pyrolyse mit der GC/MS an [11]. Letztere gestattet das schlagartige Erhitzen der Proben auf eine gew/ihlte Pyrolysetemperatur, wobei eine thermisch induzierte Fragmentierung ausgel6st wird und die resultierenden Spaltprodukte fiber GC/MS analysiert werden k6nnen. Neben der Zuordnung der so gewonne-
nen Pyrogramme nach der ,,finger-print"-Technik zu bekannten Polysacchariden [12] sind Rfickschliisse auf eine vorgegebene Struktur von hochmolekularen Verbindungen [12,13], aber auch die Untersuchung von thermisch determinierten Reaktionen niedermolekularer Komponenten m6glich [14]. Bei der Interpretation der pyrolytisch gebildeten Verbindungen i st jedoch in jedem Fall die M6glichkeit von Rekombinationsreaktionen der Spaltprodukte in die Diskussion einzuschliel3en. Durch die Wahl einer moderaten Pyrolysetemperatur (300 ~ kann die Bildung yon unspezifischen Aromaten wie Benzol oder Toluol, weitgehend vermieden werden. Die bei der Curiepunkt-Pyrolyse der Amadori-Verbindungen erhaltenen und analysierten Zersetzungsprodukte sind im Vergleich zur Maltose in Tabelle 3 aufgeffihrt. Ein Vergleich der analysierten Verbindungen 1/iBt fiir beide Umlagerungsprodukte ein etwa ~ihnliches Produktspektrum erkennen. Wie erwartet dominieren neben Aceton und Essigs/iure vor allem Sauerstoff- und Stickstoffheterocyclen vom Typ der Furane, Pyrrole und Pyrazine. Unterschiede ergeben sich jedoch in der Konzentration der auftretenden Verbindungen. So werden beispielsweise alkylsubstituierte Pyrazine wie Methyl-, Dimethyl-, Trimethyl- und 2-Ethyl-5(6)-methylpyrazin vermehrt aus der Fructosylverbindung gebildet. Auch die Pyrrole (1- und 2-Acetylpyrrol) zeigen in etwa diese Konzentrationsverteilung. Ftir diese Vergleiche wurde die Gruppe der N-haltigen Heterocyclen nach der Normierung der Flfichenwerte auf 100% betrachtet. Zu betonen ist jedoch, dab bei konstanter Probenmenge das Verh/iltnis von Glucoseeinheiten und Aminos/iure ffir die Bildung der Heterocyclen von ausschlaggebender Bedeutung ist. Dieser Effekt ist nach unseren r auf die st/irkere Fragmentierung der Fructosylverbindung, insbesondere die Freisetzung von Ammoniak zurtickzuffihren [15,16]. In der Rekombination des Ammoniaks mit Carbonylverbindungen der Zuckerfragmentierung (Retro-Aldol-Spaltung, c~-Dicarbonylspaltung) reagieren Diacetyl, Methylglyoxal u. a. zu den genannten Verbindungen [17]. 7-Pyranone, die typischen Abbauprodukte der 1-Desoxydiketosen werden entsprechend der eingesetzten Kohlenhydratkomponente gefunden. Dabei ist Hydroxymaltol das bevorzugte Produkt des Monosaccharidderivates und Maltol wird hier ausschlieglich aus dem Maltulosylamin gebildet, ein Reaktionsverlauf, der typisch ffir w/il3rige Reaktionssysteme [16], aber temperaturabh/ingig auch unter pyrolytischen Bedingungen zu beobachten ist. Unterscheiden mug man dabei einmal zwischen einer vorgeschalteten Spaltung der glycosidischen Bindung, fiber die noch zu sprechen sein wird, und einer intermedi/iren Umwandlung des ersten Kohlenhydratrestes in ein 7-Pyranon und nachfolgende Glykosidspaltung. 3-Desoxydiketose ist der intermedi/ir auftretende Vor1/iufer der in nahezu allen Zuckerabbaureaktionen auftretenden Furane (2-Hydroxymethyl-5-furancarbaldehyd und 2-Furancarbaldehyd). Beide Verbindungen gehen besonders aus Maltose bzw. dem Maltulosylamin hervor. Bekannt ist in diesem Zusammenhang, dab gerade Furancarbaldehyde bevorzugt aus Disacchariden gebildet werden [18], was vermutlich auf die gfinstigere Eliminie-
219 Tabelle 3. Identifizierte V e r b i n d u n g e n der Curiepunkt-Pyrolyse v o n A m a d o r i Verbindungen bei 300 ~ im Vergleich zu Maltose
RI: Retentionsindex nach v.d. D o o l / K r a t z [J C h r o m a t o g r (1963), 11:463] M G : Molektdargewicht !: H a u p t k o m p o n e n t e x-xxx: relative Intensit/itsverteilung sp: n u r in Spuren nachweisbar - : nicht nachweisbar
RI
MG
Name
Maltose
Maltulosylglycin Intensit/it Intensit/it
Fructosylglycin Intensit/it
< < < < <
