T h e o r . Appl. G e n e t . 49 (1977) 95-98

l!

9 by Springer-Verlag 1977

Beitrag zur Genetik der Laktatdehydrogenase Isoenzyme des Rindes K. Frahm,

F . G r a f , H. Kr~iuBlich und L. F u r t m a y r

Institut ffir T i e r z u c h t und T i e r h y g i e n e d e r Universit~it Mfinehen, L e h r s t u h l ftir T i e r z u c h t G e n e t i c s of B o v i n e L a c t a t e D e h y d r o g e n a s e I s o e n z y m e s S u m m a r y . Instead of 5 u s u a l i s o e n z y m e bands of l a c t a t e d e h y d r o g e n a s e 15 bands w e r e found in b l o o d s e r u m of 75 c a t t l e f r o m d i f f e r e n t b r e e d s u s i n g a s p e c i a l s e p a r a t i o n techniqxae of p o l y a c r y l a m i d d i s c e l e c t r o p h o r e s i s . - B e c a u s e LDH-5 r e s o l v e d in a t o t a l of 5 bands it w a s s u g g e s t e d that the 5 LDH i s o e n z y m e s a r e f o r m e d by 3 p o l y p e p tids B A A ' w h i c h a r e u n d e r s e p a r a t e g e n e t i c c o n t r o l . With a s i m p l e g e n e t i c a l t e s t it w a s d e m o n s t r a t e d for the d a i r y h e r d e x a m i n e d ( p < 0,001) that the g e n e s c o n t r o l l i n g B, A and A ' a r e p l a c e d on t h r e e independent l o c i and that t h e r e is no i s o e n z y m e p o l y m o r p h i s m . In 2 of 15 a d d i t i o n a l l y c h e c k e d w a t e r b u f f a l o s no r e s o l v i n g into 15bands w a s r e g i s t r a t e d , that m e a n s that a L D H - p o l y m o r p h i s m p r o b a b l y m a y o c c u r in b u f f a l o s .

Z u s a m m e n f a s s u r ~ . Mit d e r D i s k e l e k t r o p h o r e s e in P o l y a c r y l a m i d w u r d e d i e S e r u m - L a k t a t d e h y d r o g e n a s e des R i n d e s fiber d i e bekannten 5 I s o e n z y m e hinaus in i n s g e s a m t 15 Banden m i t E n z y m a k t i v i t t i t a u f g e t r e n n t . Da das I s o e n z y m LDH-5 5 Banden a u f w e i s t , w e r d e n h i e r die LDH- I s o e n z y m e d u r c h die P o l y p e p t i d e B, A und A ' g e b i l d e t , d i e g e t r e n n t e r g e n e t i s e h e r K o n t r o l l e u n t e r l i e g e n . D u r c h e i n e g e n e t i s c h e U n t e r s u c h u n g konnte fiir die S c h w a r z b u n t h e r d e mit e i n e r I r r t u m s w a h r s c h e i n l i c h k e i t von p < 0,001 f e s t g e s t e l l t w e r d e n , dab die an d e r Ausprt~gung d e r 15 L D H - B a n d e n b e t e i l i g t e n Gene B, A und A' a u f d r e i g e t r e n n t e n G e n l o c i s i t z e n und dab es s i c h h i e r b e i nicht um e i n e n P o l y m o r p h i s m u s h a n d e l t . B e i 2 yon 15 z u s t i t z l i c h u n t e r s u c h t e n W a s s e r b f i f f e l n t r a t k e i n e Aufspaltung in 15 Banden auf, so dab h i e r m S g l i c h e r w e i s e e i n P o l y m o r p h i s m u s v o r l i e g t .

E inleitur~ Seit den A r b e i t e n von M a r k e r t (1963) kann a l s g e s i c h e r t g e l t e n , dab die L a k t a t d e h y d r o g e n a s e t e t r a m e r aus den P o l y p e p t i d e n A und B aufgebaut i s t . Das I s o e n z y m

In T a b e l l e 1 sind die b e i d e n M S g l i c h k e i t e n , d i e z u r Aufspaltung d e r 5 L D H - I s o e n z y m e in i n s g e s a m t 15 B a n den ffihren, g e g e n f i b e r g e s t e l l t . S p a l t e t die LDH-1 in 5 B a n d e n auf, s o l i e g e n die

LDH-1 b e s t e h t aus v i e r B - E i n h e i t e n . E s w i r d in d e r

P o l y p e p t i d e B B ' A v o r , die d u t c h d r e i G e n e k o n t r o l -

k l i n i s c h e n D i a g n o s t i k b e i m M e n s c h e n a l s H-Typ ( H e r z )

liert w e r d e n . Diese Gene bezeichnen w i r ebenfalls mit

b e z e i c h n e t , da es v o r w i e g e n d in d e r H e r z m u s k u l a t u r

B B ' A . B e i s p i e l e daffir fanden B o y e r und M i t a r b e i t e r

v o r k o m m t und s e i n e S e r u m k o n z e n t r a t i o n bei H e r z m u s -

(1963) b e i m M e n s e h e n und Rauch (1968) b e i m P f e r d .

k e l s e h t t d e n a n s t e i g t . LDH-1 w a n d e r t in d e r E l e k t r o -

S p a l t e t d a g e g e n d i e LDH-5 in 5 Banden auf, s o muB

phorese am w e i t e s t e n anodenwttrts. Das Isoenzym

eine Genbeteiligung BAA' angenommen werden. BAA'-

LDH-5 w a n d e r t an l a n g s a m s t e n anodenwfirts und i s t a l s

A u f t r e n n u n g e n w u r d e n , auBer b e i m Rind ( R a u c h 1971),

M-Typ ( M u s k e l ) bekarmt, da e s bee M u s k e l s c h t t d e n

bei d e r F o r e l l e ( G o l d b e r g 1966), bei d e r Maus (Shaw

v e r m e h r t i m m e n s c h l i c h e n Blut e r s c h e i n t . E s i s t aus

und B a r t o 1963) und b e i m M e n s e h e n a f f e n ( S y n e r und

vier A-E inheiten aufgebaut.

G o o d m a n 1966) b e s c h r i e b e n .

D i e t i b r i g e n I s o e n z y m e LDH-2, LDH-3 und LDH-4

Im R a h m e n yon E n z y m u n t e r s u c h u n g e n an H o c h l e i -

s i n d aus A - und B - E i n h e i t e n z u s a m m e n g e s e t z t ( T a b e l -

stungskfihen ffihren w i r aueh d i e d i s k e l e k t r o p h o r e t i -

le 1 ) . Shaw und B a r t o (1963) w i e s e n an M~iusen nach,

s c h e Auftrennung d e r L a k t a t d e h y d r o g e n a s e (LDH) in

dab d i e Ausprttgung d e r P o l y p e p t i d e A und B d u r c h j e

ihre Isoenzyme durch. Unter bestimmten Versuchs-

e i n G e n k o n t r o l l i e r t w i r d . A n s t e l l e d e r 5 Banden k5n-

b e d i n g u n g e n g e l i n g t es uns, d i e LDH fiber d i e b e k a n n -

nen auch 15 Banden m i t Enzymaktivit~it a u f t r e t e n . E s

t e n I s o e n z y m e LDH-1 bis LDH-5 hinaus in i n s g e s a m t

muB dann zus~itzlich zu d e n P o l y p e p t i d e n A und B e i n

15 Banden m i t E n z y m a k t i v i t t i t a u f z u t r e r m e n . B e i m

d r i t t e s P o l y p e p t i d z u r f r e i e n K o m b i n a t i o n mR A und B

Rind konnten 15 Banden b i s h e r n u r yon R a u c h (1971)

vorhanden sein, das ebenfalls durch ein eigenes Gen

in S k e l e t t m u s k e l h o m o g e n a t e n yon 2 H o l s t e i n - F r i e s i a n -

kontrolliert wird.

Kiihen b e o b a c h t e t w e r d e n . S e r u m w u r d e yon d e r Au-

96

K. F r a h m , et a l . : B e i t r a g z u r G e n e t i k d e r L a k t a t d e h y d r o g e n a s e Tabelle 1. Aufbau d e r L D H - I s o e n z y m e aus den P o l y p e p t i d e n B und A ( 5 B a n d e n ) , B B ' A (15 Banden) und BAA' (15 Banden) 5 Banden

BB ' A 15 Banden

BAA' 15 Banden

BBBB

BBBB

BBBB

(H-Typ)

B B B B' B B B'B' B B'B'B' B'B'B'B'

LDH-2

BBBA (75 Z H-Typ)

BBBA B B B'A B B'B'A B'B'B'A

BBBA B B B A'

LDH-3

BBAA (50 ~ H-Typ)

BBAA B B'A A B'B'A A

BBAA BBAA' B B A'A'

LDH-4

BAAA (25 g H-Typ)

BAAA B'A A A

BAAA BAAA' B A A'A' B A'A'A'

~H-5

AAAA (M-Typ)

AAAA

AAAA AAAA' A A A'A' A A'A'A' A'A'A'A'

Literatur

Markert

B o y e r et a l .

Goldberg

Rauch (1968) Shaw u. Barto

Rauch (1971) Syner u. G o o d m a n (1966)

LDH-I

(1963)

(1963)

(1963)

t o r i n nicht u n t e r s u c h t . In d e r v o r l i e g e n d e n A r b e i t w i r d d i e s e s Aufspaltungsph~inomen eingehend u n t e r s u c h t und eine g e n e t i s c h e U n t e r s u c h u n g d u r c h g e f i i h r t , urn f e s t z u s t e l l e n , ob bei d e r L a k t a t d e h y d r o g e n a s e des Rindes ein Polymorphismus vorliegt. Material B l u t s e r u m p r o b e n s t a n d e n von folgenden R i n d e r n z u r Verfiigung: S c h w a r z b u n t e ( 2 5 ) , F l e c k v i e h (16) und 3 e r s e y - B r a u n v i e h - K r e u z u n g e n ( 1 3 ) . Aus d e m T i e r p a r k H e l l a b r u n n , Mfinchen*: Hauswasserb~iffel, K e rabau (15), Ungarisches Steppenrind (2), Z w e r g - Z e bu ( 2 ) , D a h o m e - Z w e r g r i n d ( 2 ) u n d W a t u s s i ( 3 ) . In d e r S c h w a r z b u n t h e r d e des L e h r - und V e r s u c h s g u t e s O b e r s c h l e i h h e i m , B e t r i e b s e i n h e i t des F a c h b e r e i c h s T i e r m e d i z i n d e r Universit~it Mfinchen, w u r d e eine genetische Untersuchung iiber das Auftreten von L D H Isoenzym-Unterbanden an einem Bullen, 10 Kiihen und deren K~ilbern durchgefiihrt.

(1966)

nung a n die von Dietz und Lubrano (1967) b e s c h r i e b e ne Methode d u r c h g e f i i h r t . Die L D H - I s o e n z y m e l a s s e n s i c h auch ohne S a m m e l g e l a l s 5 d e u t l i e h e , s c h a r f a b g e s e t z t e Ringe a m Rand des k l a r e n , z y l i n d r i s c h e n P A A - G e l s d a r s t e l l e n . Bei d e r q u a n t i t a t i v e n A u s w e r t u n g w e r d e n d i e s e Binge v o m D e n s i t o m e t e r als B a n d e n g e m e s s e n und d e s h a l b auch iibl i c h e r w e i s e so g e n a n n t . Die Tabelle 2 enth~ilt A n g a b e n z u r E l e k t r o p h o r e setechnik. E s wurde der Routinemethode, mit der sich 5 B a n d e n d a r s t e l l e n l a s s e n , die von uns a b g e w a n d e l t e Methode g e g e n i i b e r g e s t e l l t , die eine w e i t e r g e h e n d e Aufspaltung in 15 B a n d e n e r m S g l i c h t . D i e s e Aufspaltung in 15 Banden fanden w i r bei f r i s c h e n S e r e n , so dab eine A r t e f a k t b i l d u n g d u r c h E i n f r i e r e n und Auf~auen o d e r d u r c h unsachgem~iBe Lagerung ausgeschlossen werden kann. Da die LDH-5 in d e n S e r e n u n t e r s c h i e d l i c h s t a r k a u f t r i t t und es bei d e n h i e r b e s p r o c h e n e n U n t e r s u c h u n g e n nicht u m e i n e q u a n t i t a t i v e A u s w e r t u n g ging, w u r d e n die Gele i n d i v i d u e l l angef~irbt, da heiBt, d e r F~irbevorgang w u r d e u n t e r b r o c h e n , w e n n die Banden d e u t l i c h s i c h t b a r w a r e n oder w e n n die U n t e r g r u n d f ~ i r bung zu stark wurde.

Methodik d e r D i s k e l e k t r o p h o r e s e Die v e r t i k a l e D i s k e l e k t r o p h o r e s e in P o l y a c r y l a m i d und die a n s c h l i e B e n d e F ~ r b u n g d e r G e l e w u r d e n in A n l e h -

E r ~ e b n i s s e und D i s k u s s i o n Bei a l l e n 75 H a u s r i n d e r n zeig~e s i c h nach d e m A n f ~ r -

* H e r r n D r . W i e s n e r und H e r r n D r . W i i n s c h m a n n , T i e r p a r k H e l l a b r u n n , d a n k e n w i r a n d i e s e r Stelle fiir die gro~z~igige U n t e r s t f i t z u n g .

ben d e r G e l e , dab die f i b l i c h e r w e i s e v o r h a n d e n e n 5 L D H - I s o e n z y m b a n d e n a u f g e s p a l t e n w a r e n , und z w a r

K. F r a h m , et a l . : B e i t r a g z u r G e n e t i k d e r L a k t a t d e h y d r o g e n a s e

97

Tabelle 2. A n g a b e n z u r E t e k t r o p h o r e s e t e c h n i k 5 Bar,d e n

15 Bar, den

Trenngel (PAA) Gell~inge Polymerisationszeit S a c c h a r o s e l S s u n g 40 7~ig S e r u m m e n g e ur.verdfinnt Puffer Tris-Glycin Konstante Stromst~rke Trennzeit F~rbezeit W a n d e r u n g s s t r e c k e (LDH- 1)

7,5 ~ 100 m m 60 m i n 30 ~1 10 ~1 DH 8 , 3 2,5 mA/Gel 120 rain 30 rain 23 m m

5,5 7~ 120 m m 60 m i n 30 ~1 20 ~1 pH 8,3 2, 5 m A / G e l 210 m i n 45-60 rain 90 m m

Ger~te

E lektrophoreseapparatur DEA 90, WTW W e i l h e i m Stromkonstantgerit (Desaga, Heidelberg)

LDH-1 i n I Bande ( k e i n e A u f s p a l t u n g ) , LDH-2 i n 2 B a n d e n , LDH-3 in 3 B a n d e n , LDH-4 in 4 B a n d e n und LDH-5 i n 5 B a n d e n . Links l a s s e n s i c h 5 d e u t l i c h e P e a k s e r k e n n e n , d e r hSchste ist das I s o e n z y m LDH-1, d a s a m w e i t e s t e n z u r Anode g e w a n d e r t i s t . Rechts ist die Aufspaltung i n 15 B a n d e n d e u t l i c h e r k e n n b a r . Da die LDH-5 5 B a n d e n a u f w e i s t , s t e h e n h i e r z u r Bildung d e r 15 B a n d e n die 3 P o l y p e p t i d e B, A und A ' z u r Verfiigung ( T a b . l ) , die g e t r e n n t e r g e n e t i s c h e r Kontrolle unterliegen. Ffir die Bildung d e r 15 B a n d e n s i n d zwei g e n e t i s c h e Modelle d e n k b a r : 1. Modell: Zwei G e n o r t e s t e h e n ffir die d r e i Gene B, A und A' z u r Verffigung, und z w a r e i n G e n o r t fiir B und e i n G e n o r t fiir A o d e r A ' . Die T i e r e mit 15 B a n d e n h a b e n den Genotyp B B A A ' , b i l d e n zwei G a m e t e n -

Abb. I . P h e r o g r a m m d e r L D H - I s o e n z y m e

a r t e n (BA und BA' ) und s i n d fiir das M e r k m a l 15LDH-Banden h e t e r o z y g o t . Bei e i n e r P a a r u n g yon Tie-

Zur Beantwortur~ der Frage, ob das M e r k m a l 15-

r e n mit 15 B a n d e n i s t e i n e M e n d e l - A u f s p a l t u n g i n d e r

L D H - B a n d e n bei Rindern homozygot oder heterozygot

F 1 - G e n e r a t i o n i m V e r h ~ l t n i s vor. 1 (BBAA) : 2

auftritt, wurde in der Schwarzbuntherde des Lehr-und

(BBAA') : 1 (BBA'A') zuerwarten.

Versuchsgutes OberschleiJ~heim eine genetische Un-

D e r Genotyp BBAA b e w i r k t e b e n s o wie d e r G e n o typ B B A ' A ' die A u s b i l d u n g yon 5 B a n d e n , w a h r e n d b e i m Genotyp BBAA' 15 B a n d e n a u f t r e t e n . Somit w e r -

tersuchur~ angestellt. Es wurden 10 Ktthe mit 15 Banden herausgesucht, die alle von einem Bullen gedeckt worden waren, der

d e n in d e r F 1 - G e n e r a t i o n 50 ~ d e r T i e r e 5 B a n d e n und

ebenfalls 15 Banden hatte. Alle I0 K~ilber, die aus die-

50 7~ 15 B a n d e n a u f w e i s e n .

sen Paarungen fielen, wiesen ebenfalls 15 ]Banden auf.

2. Modell: E s s i n d 3 G e n o r t e ffir die Gene B, A und

Daraus kann mit einer Ausss4~esicherheit yon 99, 9

A' v o r h a n d e n . Die T i e r e mit 15 B a n d e n h a b e n d e n G e -

fiir die untersuchte Population geschlossen werden:

notyp B B A A A ' A ' und b i l d e n n u r e i n e G a m e t e n a r t ,

1. Die Laktatdehydrogenase-lsoenzyme

LDH-I bis

r ~ m l i c h B A A ' . D e s h a l b w e i s e n a l l e Nachkommer. i n

L D H - 5 werden durch 3 Gene kontrolliert, die auf ge-

d e r F 1 - G e n e r a t i o n 15 B a n d e n a u f ur.d s i n d fiir das

trennten Loci sitzen.

Merkmal homozygot.

2. Ein Polymorphismus

liegt nieht vor.

98

K. Frahm,

et al. : Beitrag zur Genetik der Laktatdehydrogenase

Untersuchun~en an primitiven Hausrindern

Literatur

Z u r Kl~irung d e r F r a g e , ob auch bei p r i m i t i v e n H a u s -

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r i n d e r n die b e o b a c h t e t e n 15 B a n d e n a u f t r e t e n , w u r d e z u s ~ t z l i c h S e r u m yon 24 R i n d e r n v e r s c h i e d e n e r R a s s e n ( s i e h e M a t e r i a l ) d i s k e l e k t r o p h o r e t i s c h aufget r e n n t . Alle u n t e r s u c h t e n p r i m i t i v e n H a u s r i n d e r w i e s e n 15 Banden auf bis auf 2 d e r 15 W a s s e r b f i f f e l , die n u r 5 B a n d e n h a t t e n . E ine g e n e t i s c h e E rkl~irung flit den Befund bei d i e s e n 2 W a s s e r b i i f f e l n k a n n z u r Z e i t noch nicht g e g e b e n w e r d e n , da e i n e U n t e r s u c h u n g , wie w i r s i e a n den S c h w a r z b u n t e n R i n d e r n d u r c h g e fdhrt h a b e n , w e g e n d e r g e r i n g e n v o r h a n d e n e n T i e r z a h l e n nicht mSglich i s t . M S g l i c h e r w e i s e liegt bei diesen Wasserbiiffeln ein echter Polymorphismus vor. E s ist b e a b s i c h t i g t , in s l ~ t e r e U n t e r s u c h u n g e n W i l d r i n d e r mit e i n z u b e z i e h e n , u m v i e l l e i c h t f e s t s t e l len zu k 5 n n e n , ob das G e n A' b e i d i e s e n s c h o n v o r h a n d e n ist oder ob es e r s t zu e i n e m s p ~ t e r e n Z e i t p u n k t der Evolution aufgetreten ist.

E i r ~ e g a r ~ e n a m 18. J u n i 1976 A n g e n o m m e n d u r c h F . Mechelke

Anschrift der V e r f a s s e r : I n s t i t u t fiir T i e r z u c h t und T i e r h y g i e n e d e r Universit~it Mfinchen, L e h r s t u h l ffir Tierzucht D - 8000 Miinchen (G e r m a n y / B R D )