Planta (Berl.) 74, 210--227 (1967)

Weitere Untersuchungen zur phytochrominduzierten Akkumulation von Ascorbinsiiure beim Senfkeimling (Sinapis alba L.) PE~E~ SC~OPFE~ Botanisehes Institut der Universit~t Freiburg i.Br. Eingegangen am 24. Dezember 1966

Further Investigation8 on the Phytochrome-Mediated Accumulation o] Ascorbic Acid in the Mustard Seedling (Sinapis alba L.) Summary. The accumulation of ascorbie acid (AS) in the young mustard seedling is greatly increased by the action of the active form of phytochrome (P~a0) (see SC~OPFER, 1966). There is no photosynthesis in continuous far-red light, which was used throughout the experiments. The phytochrome-mediated increase in AS approximately parallels the synthesis of anthocyanin in the seedling, although the onset of AS-accumulation precedes the anthocyanin synthesis by 2--3 hours (Fig. 4 and 5). - - The action of PTa0increases the amount of AS in every part of the seedling (cotyledons, hypocotyl, radicula) (Fig. 1--3). This increase in AS parallels the formation of P~a0 rather than the different growth responses of these organs (enlargement of the cotyledons, inhibition of hypocotyl and radicula lengthening). The lag in AS-accumulation after onset of far-red irradiation is the same in all 3 parts of the seedling (about 1 hour under the experimental conditions; Fig. 4). - - Actinomycin D (10 ~g/ml), which strongly inhibits anthocyanin synthesis (Fig. 9 and 10), has no corresponding effect on PTs0-dependent increase in AS-accumulation (Fig. 7 and 8). This result supports the hypothesis that already active genes are only slightly influenced by aetinomycin D (see LARGE and ~O~R, 1965). I t also shows that, in contrast to its role in anthocyanin synthesis, P?ao probably does not act by initiating "potentially active" genes in the case of ASaccumulation. - - A dark synthesis of anthocyanin in the cotyledons can be obtained by application of AS to the seedlings (Fig. 11). Glucose and sucrose are ineffective in this respect (Table 2). The effect of AS-feeding on anthocyanin synthesis can be inhibited by actinomycin D in very much the same way as light induced anthocyanin synthesis is inhibited (Table 3). - - Also the RNA content of the cotyledons is increased by feeding AS in the dark (Table 4). These results are in line with the earlier suggested hypothesis (see ScttoP~ER, 1966) that increase in AS-accumulation is a very early event in the mediation of some "positive" photoresponses, e.g. anthocyanin synthesis. According to the hypothesis of Mo~rR (1966a, b) it has been concluded that AS functions as a part of the "signal chain" of phytochrome-mediated photomorphogenesis. This "signal chain" is thought to start differential gene activation to bring about "positive" photoresponses. Einleitung I n einer frfiheren A r b e i t (Sc~oPFE~, 1966) w u r d e gezeigt, dai~ d e r Aseorbins/~ure(AS)-Gehalt y o n Senfkeimlingen d u r c h das P h y t o e h r o m s y s t e m g e s t e u e r t w e r d e n k a n n . Die P h o t o s y n t h e s e h a t , z u m i n d e s t b e i m

Phytochrominduzierte Akkumulation yon Ascorbins~ure

211

j u n g e n K e i m l i n g , d e r n o c h a u s r e i e h e n d m i t Stoffwechselreserven v e r s o r g t is~, keine B e d e u t u n g f/it die S t e i g e r u n g des A S - G e h a l t e s d u r c h p h o t o m o r p h o g e n e t i s c h w i r k s a m e s Licht. - - I m Ansehlul3 a n diese B e f u n d e w u r d e die I~Iypothese aufgestellt, d a b A S a n d e r AuslSsung , , p o s i t i v e r " P h o t o m o r p h o s e n (z.B. d e r A n t h o c y a n s y n t h e s e ) d u r c h das physiologisch a k t i v e P h y t o c h r o m (P~s0) k a u s a l b e t e i l i g t ist. Diese Vorstellung k o n n t e b i s h e r n u r d u r c h einige i n d i r e k t e A r g u m e n t e b e g r f i n d e t werden. Die Grundlage der Hypothese bildet die Auffassung, dal3 viele ,,positive" Photomorphosen (d.h. solche phytochromabh~ngigen Reaktionen der Keimlinge, welche durch eine AuslSsung oder Steigerung yon Biosynthesen oder W~chstumsprozessen charakterisiert sind) durch eine differentielle Genaktivierung veranlaBt werden (MOHR, 1966a, b). Danach soll P:s0 mittels einer ,,Signalkette" (wahrscheinIich eine metabolische Sequenz) die Aktivierung yon ,,potentiell aktiven" Genen bewirken, welche ihrerseits die photomorphogenetisehen Reaktionen veranlassen. Diese Vorstellung konnte inzwischen durch viele Daten untermauert werden (z.B. LA~OE u. Mom~, 1965; Mom~ u. Mitarb., 1965; Dtr~sT u. Momr 1966; SO,OrdER, 1967a). I n d e r v o r l i e g e n d e n A r b e i t soll die I t y p o t h e s e - - A S als Glied in d e r , , S i g n a l k e t t e " d e r P h o t o m o r p h o g e n e s e (,,positive" P h o t o m o r p h o s e n ) - d u r c h eine A n z a h l w e i t e r e r E x p e r i m e n t e g e p r i i f t werden. E s w e r d e n d a b e i D a t e n e r h a l t e n , welche diese I t y p o t h e s e st/itzen. Da die Konzentration der Dehydroascorbins~ure dutch PTa0 nicht beebfflul~t wird (sie ist sowohl im Dunkel- als such im Lichtkeimling sehr niedrig; vgl. ScOOPFUl, 1966), konnte im Rahmen dieser Untersuchungen auf ihre Bestimmung verziehtet werden. - - Zur Erzeugung yon PTs0 in den Xeimlingen wurde stets dunkelrotes Dauerlicht (DR) verwendet. Diese Art der Bestrahlung hat sich als besonders g/instig ffir das Studium der intermedi~ren Biochemie der phytoehrominduzierten Photomorphogenese herausgestellt (vgl. Mom~, 1966a). M a t e r i a l und Methoden

a) Material. ])as relativ homogene Samenmaterial yon Sinapis alba L. stammt aus der dritten Nachzucht (Botanischer Garten Freiburg i.Br., 1964) einer seit 1957 yon M o ~ u. Mitarb. verwendeten Population. b) Bestrahlungsanlage. Die Bestrahlung mit Dunkelrot (DR) erfolgte in dem yon HA~T~A~ entwickelten Standardfeld (~max:740 nm, Halbwertsbreite ca. 100nm, Intensit/~t 2000 erg/cm~.sec~:10%l; vgl. WWlDNX~ u. Mitarb., 1965). c) Anzucht der Keimlinge. Es wurden jeweils 25 Keimlinge in einer Kunststoffdose auf gereinigtem Chromatographiepapier mit Aqua dest. bei 25,0~0,2 ~ C (vgl. MooR, 1966a) bis zu einem Alter yon 36 Std im Dunkeln angezogen. Die Samen wurden vor der Aussaat griindlich mit Aqua dest. gewaschen. d) Inkubation. Zur Applikation yon Actinomycin D (Act) (ein Geschenk yon Merck, Sharp & Dohme, Rahway, N. J./USA), Aseorbins~ure, Glucose und Saccharose ~ (alle p.a., yon der Merck AG, Darmstadt) wurden 36 Std alte, intakte Keimlinge fiir 6 Std in w~l]rigen LSsungen (Aqua bidest.) dieser Substanzen im Bei den Actinomycin D-Experimenten betrug die Intensiti/t 3300 erg/cm 2. sec ~ 10 %. Die Ascorbins~ure-, Glucose- und SaecharoselSsungen wurden mit NaOH auf pit 6,0 eingestellt.

212

P. S c ~ o ~ R :

Dunkelu inkubiert (bei 25,0~ 0,20 C) und anschliel~end fiir weitere 24 Std im Dunkeln gehalten (25,0•176 Die Methode ist im einzelnen bei S~oPFE~ (1967b) besehrieben. Alle Manipulationen fanden in einem griinen Sicherheitslieht (ca. 5--10 erg/cm2. see; vgl. Moa~ u. A r ~ v ~ , 1963) statt. e) $'raktionierung der Keimlinge. Zur Untersuehung der einzelnen Organe wurden die Keimlinge unmittelbar vor der Aufarbeitung in fo]gende drei Fraktionen zerlegt: Laminae der Kotyledonen, Hypokotyl einschliefllieh Plumule und Petioli, Radieula. Die Organe wurden sofort nach dem Absehneiden in vorgekiihlter ttomogenisierfliissigkeit (--750 C; vgl. Sc~oPr~R, 1966) eingefroren. Ein Testversueh ergab, dab durch das Abschneiden praktisch keine AS verlorengeht. f) Ascorbinsgure-Bestimmun9. Es wurde die bei SC~Or~'~R (1966) ausffihrlich beschriebene Methode (photometrische Messung der reduktiven Entf~rbung yon 2,6-Diehlorophenolindophenol dutch AS bei pH 2,3) verwendet. Sie ]iefert recht genaue Werte, wenn eine oxydative Zerst6rung der AS dureh sehonendes Homogenisieren (Luftabsehlul3, intensive Kiihlung) vermieden wird. 9) Anthoeyan-Bestimmung. Der fiir die Bestimmung yon AS hergestellte, metaphosphorsaure Extrakt enth~lt des von bestrahlten Keimlingen gebfldete Anthocyan praktiseh vollst~ndig. Die bei 546 nm gemessene Extinktion des Extraktes (4 em-Cuvette; Vergleiehswert: L6sungsmittel) diente als relatives MaB fiir den Anthoeyangehalt des homogenisierten Materials. Eine Korrektur fiir die Streuung des Extraktes war nieht efforderlieh. h) l~NS-Bestimmung. Der RNS-Gehalt der Kotyledonen wurde nach Extraktion der Nucleins~uren und Abtrennung der DNS nach der yon WwiD~V.~ (1966) modifizierten Methode yon ScrI~I])T u. T~t~_tTSI~R (1945) ermittelt ~. i) Bezugssystem. Die AS- und Anthoeyanwerte sind stets auf die biologisehe Einheit (Keimlingsorgan) bezogen. Dies ist im Augenblick der einzig sirmvolle Bezug ftir die Fragestellung der vorliegenden Arbeit. Man muB dabei jedoch beachten, dub sieh bei Verwendung anderer BezugsgrSBen (z.B. Frischgewicht, Troekengewieht, Proteingehalt) speziell fiir das Hypokotyl wesentlieh h6here relative Werte ffir den AS-Gehalt im DR ergeben, da diese GrSBen fiir das ttypokotyl bestrahlter Keimlinge kleiner sind als bei Dunkelkeimlingen (vgl. Hock u. Mom~, 1965; J~d~oBs, 1966). Der DNS-Gehalt und die Zellzahl bleiben dagegen im Dunkeln wie im Lieht praktiseh konstant (Wv.IDN~g, 1966 bzw. Moor u. P~T]~S, 1960); ein Bezug auf diese beiden GrSBen ergibt daher dieselben relativen Werte wie bei Verwendung der biologischen Einheit. Bei den Kotyledonen erhElt man bei Verwendung aller gebr/iuehlichen Bezugssysteme sehr ~hnliche relative Werte. k) ~'ehlerermittlung. Die in den Tabellen angegebenen Fehlersehranken beziehen sieh auf die Seh~tzung des einfachen mittleren Fehlers des arithmetisehen Mittels. Die Bereehnung effolgte mit I-Iflfe der Wissenschaftliehen Tabellen, Doeumenta Geigy (1960) als Bruehteil des mittleren Extrembereiches. Fiir jeden Kurvenwert wurden 4--8 unabh~ngige Analysen (jeweils Organe yon 23--46 Keimlingen) durchgefiihrt. Dunkel- und DR-Ans~tze wurden stets gleichzeitig bearbeitet; dadureh konnten systematische Fehler innerhalb der einzelnen Versuchseinheiten ausgesehlossen werden.

Experimentelle Daten a) Die 19hytochrominduzierte Akkumulatlon von Ascorbinsiiure und Anthocyan in den einzelnen Organen des Keimlings. D u r c h d u n k e l r o t e s D a u e r l i c h t k a n n d e r A S - G e h a l t des Senfkeimlings wesentlich gesteigert werden. Dieser E f f e k t s e t z t verh/~ltnism~l~ig r a s c h ein, er i s t ca. 2 - - 3 S t d M. W]~Il)~E~ danke ieh herzlieh fiir die Durchfiihrung der l%NS-Analysen.

PhytochrominduzierteAkkumulationvon Ascorbinsgure

213

vor dem Anlaufen der Anthocyansynthese registrierbar (Sc~oP~'v,R, 1966). - - Im Anschlug an diesen Befund stellt sieh nun die Frage, ob die Bildung yon P780, welehe sehr wahrseheinlieh in allen Geweben des Keimlings in derselben Weise ablguft (Fu:auYa u. HILL~A~r 1964), sieh aueh iiberall in derselben Weise auf den AS-Gehalt auswirkt. Diese Frage ist deshalb yon groger Bedeutung, well PT~0in vielen F/tllen strikt organspezffisehe photomorphogenetisehe Reaktionen auslSst; z.B. wird das Waehstum des Hypokotyls und der Radieula (L/ingenwaehstum) Ip

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Abb. 1 Abb. 2 Abb. 1. Die Abh~tngigkeit des Ascorbins~uregehaltes yon der Bestrahlungszeit in den Kotyledonen. Beginn der Bestrahlung 36 Std nach der Aussaat ( O - - 9 Dunkelrot, e - - e Dunkelkontrolle) Abb. 2. Die Abh~ngigkei~ des Ascorbinsrmregelmltes yon der BestrahlungszeR im Hypokotyl. Beginn der Bestrahlung 36 Std nach der Aussaat ( O - - 9 Dunkelrot, $ - - $ Dunkelkontrolle)

durch P78o gehemmt, w~hrend gleichzeitig das Waehstum der Kotyledonen (Fls gefSrdert wird (vgl. z.B. HOCK u. MotIt~, 1965; MooR, 1966a). Es wurde daher der EinfluB yon DR auf den ASGehalt der einzelnen Organe untersucht, Die Abb. 1--3 zeigen die Zeitabh~ngigkeit der AS-Akkumulation im Dunkeln und im DR fiir Kotyledonen, IIypokotyl und Radicula. Die folgenden Einzelheiten kSnnen aus diesen Kurven abgelesen werden: 1. Alle drei Organe verhalten sich gleichsinnig; der AS-Gehalt wird dureh P~so stets gesteigert. Xhnliche Ergebnisse wurden bereits yon REID (1938) mit Vigna sinensis-Pflanzen, we]ehe im Weiglicht gehalten wurden, erhalten. - - 2, Die Bestrahlung wirkt sich besonders stark in den Kotyledonen aus; diese Organe enthalten im Dunkeln nur relativ wenig AS. Im Hypokotyl und in der Radieula wird dagegen im Dunkeln 15

Planta (Berl.), Bd. 74

214

P. SC~OPFE~:

relativ viel AS gebildet. Die durch Pv3o induzierte Steigerung im ASGehalt ist jedoch, bezogen auf die biologische Einheit, in diesen Organen wesentlich geringer als in den Kotyledonen. - - 3. Die durch PTa0induzierbe Steigerung setzt in allen drei Organen etwa gleichzeitig ein. I n den Kotyledonen betr/~gt die lag-Phase ca. 1 Std. Besonders deutlich wird dies in Abb. 4, da hier durch Differenzbildung systematische Unterschiede zwischen den einzelnen Versuchsreihen eliminiert werden. I m H y p o k o t y l und in der Radicula ist wegen des insgesamt re]ativ ]

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Zeit nach BestrohLungsbeginn (DR)

Zeit nach Bestrahtungsbeginn (DR)

Abb, 3 Abb. 4 Abb. 3. Die Abh~ngigkeit des Ascorbins~uregehaltes yon der Bestrahlungszeit in der Radicula. Beginn der Bestrahlung 86 Std nach der Aussaat ( 9169 Dunkelrot, e - - e Dunkr Abb. 4. Die Steigerung des Ascorbins~uregehaltes dutch Dunkelrot in den Kotyledonen. Beginn der Bestrahlung 86 Std nach der Aussaat

geringen Unterschiedes zwischen Dunkel- und D R - G e h a l t keine so genaue Angabe mSglich. Ein Unterschied in der lag-Phase der drei 0rgane 1/~Bt sich st~tistisch nicht sichern. - - 4. W/s im I t y p o k o t y l und in der Radicula der AS-Gehalt zumindest bis 30 Std nach Bestrahlungsbeginn ( = 66 Std nach der Aussaat) welter ansteigt, erreicht er in den Kotyledonen 21--24 Std nach Bestrahlungsbeginn sein Optimum. Danach setzt wieder eine Verminderung ein. Auch im Dunkeln f/~llt der AS-Gehal~ in den Kotyledonen zu diesem Zeitpunkt ab. Diese Abnahme erfolgt also offenbar unabh/~ngig yon der vorhandenen Menge an AS. Sie kann mit einer - - v o m Phytochromsystem unabh/~ngigen - ~nderung des prim/~ren Differenzierungsmusters (vgl. WAGNER U. MOOR, 1966) gecleutet werden. Eine Steigerung des AS-Gehaltes in der l~adicula (Abb. 3) bleibt erhalten, wenn auf das ebenfalls durch P~a0 etwas gesteigerte Trockengewicht der Radicula (vgl. HOCKu. 1Vioim, 1965) bezogen wird. - - Der Befund, dab auch in der chloroplastenfreien Radicula eine ErhShung des AS-Gehaltes beobachtet werden kann, zeigt, dab die phytochrominduzierte AS-Akkumulation zumindest nicht aus-

Phytochrominduzierte Akkumulation yon Ascorbinss

215

schliel31ich mit der Entwicklung von Plastiden in Zusammenhang gebracht werden kann. In anderen Teilen des Keimlings, vor allem im Palisadenparenchym der Ko~yledonen, werden dagegen im DR rel~tiv grol]e, chloroplasten~hnliche Partikel gebildet [olme naehweisbares Chlorophyll, aber mit zahlreichen Thylakoiden; HXcKz~ (pers6nliche Mitteilung); KAs~I~ u. Mo~, 1967]. Da die Chloroplasten yon Weil~lichtpfl~nzen normalerweise sehr reich an AS sind (z.B. F~A~KE U. H~BE~, 1964), is~ es nieht ausgesch]ossen, dal~ auch in den im DR gebildeten, praktisch chlorophyllfreien Pl~stiden ein gewisser Teil der lohytochrominduzierten AS akkumuliert wird. Aus den bisher dargestellten Daten geht hervor, dal3 die phytochrominduzierte Akkumulation yon AS in den einzelnen Organen nicht mit den unterschiedlichen phytochromabh/ingigen Wachstumsreaktionen des Keimlings korreliert ist. Es ist daher unwahrseheinlieh, dal~ AS speziell eine Funktion als ,,Wachstumshormon" (vgl. T o , z i G u. MAlz~]~, 1961) hat, oder beim Wachstum der Zellwand (vgl. z.B. ME~Tz, 1961) direkt betefligt ist. Die phytoehrominduzierte Akkumulation von Anthocyan in den Kotyledonen und im Hypokotyl verh~lt sieh /ihnlich wie die ASAkkumulation in den entspreehenden Organen (Abb. 5 und 6). Die lag-Phase betr/~gt jedoeh in diesem Fall 3 -4 Std (vgl. M o ~ , 1966a, b). Obwohl die Synthese yon Anthoeyan in den beiden Organen in verschiedenen Geweben abl/iuft (Kotyledonen: Epidermis, Hypokotyl: Subepidermis; vgl. WAGN~ U. MOH~, 1966), zeigen beide K u r v e n prinzipiell denselben Verlauf. Dieses Ergebnis zeig~, dal] der Befund yon GRILLund VINCE (1964) an Keimlingen yon Brassica rapa keine allgemeine Giiltigkeit hat. Diese Autoren geben an, d~l~bei ihrem Objekt die lichtinduzierte Anthoeyansynthese in den Kotyledonen fr~her einsetzt als im Hypokotyl. b) Die Wirk~tng yon Actinomycin D au/ die phytochrominduzierte Akkzemulation von Ascorbins~iure und Anthocyan. Die phytoehromabh/~ngige Anthoeyansynthese des Senfkeimlings kann dutch Act, einen spezifisehen, hochwirksamen Inhibitor der DNS-abh/~ngigen RNSSynthese (z.B. R~IC~, 1966) gehemmt werden, wenn die App]ikation vor Bestrahlungsbeginn erfolgt (LANG]~ u. MOOR, 1965). Dies scheint f/Jr alle ,,positiven" Photomorphosen zu gelten, bei denen das P~80 fiber eine Aktivierung ,,potentiell aktiver" Gene wirksam wird (MoH~ u. Mitarb., 1965; Sc~oP~'~n, 1967 a). Spezie]l bei der Anthocyansynthese konnte gezeigt werden, dab offenbar solehe Gene, welehe zum Zeitpunkt der Aet-Applikation bereits im ~ktiven Zustand vorliegen, gegeniiber Act wenig ,,empfindlich" sind (L~N~]~ no Mo~R, 1965). - - Da AS bereits im Dunkelkeimling in betr/~chtlieher Menge vorhanden ist (Abb. 1--3), kann man erwarten, dal~ diejenigen Gene, welehe die Enzyme der ASSynthese eodieren, gleichfalls sehon im Dunkelkeim]ing aktiv sind und daher dureh relativ niedrige Konzentrationen an Act (z.B. l0 ~zg/ml) nicht mehr bloekiert werden k6nnen. (Es wird dabei vorausgesetzt, dab 15"

216

P. SOHOP~EB: Ip rel:_Einheitan "~ oar

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Abb. 5. Die Abh~ngigkeit des Anthocyangehaltes in den Xotyledonen y o n der Bestrahlm~gszeit. Beginn tier Bestrahlung 36 Std nach der Aussaat ( 9 1 6 9 Dunkelrot, e - - e Dtmkelkontrolle)

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Abb. 6. Die Abh~ngigkeit des Anthocyangehaltes im Hypokotyl yon der Bestrahltmgszeit. Beginn der BestraMung 86 Std nach der Aussaat ( 9 1 6 9 Dunkelrot, I - - e Dunkelkontrolle)

in der untersuchten Entwicklungsphase der Keimlinge keine ]ang]ebigen mRNS-Molekfile und/oder Enzyme ffir die AS-Synthese verantwortlich sind. Diese Annahme ist zwar wahrseheinlieh, aber noch nicht bewiesen.) Die Erwartung wird durch die in Abb. 7 nnd 8 dargestellben Experimente best~tigt. Bei relativ niedrigen Aet-Konzentrationen (z.B. 10 ~g/ml) wird die phy~oehrominduzierte Steigerung im AS-Gehalt der Xeimlinge nur geringfiigig vermindert. Dies grit sowohl fiir die Kotyledonen (Abb. 7) ~ls such fiir das ttypokotyl (Abb. 8). Gleichzeitig wird jedoch die Anthoey~nsynthese in beiden Organen dutch 10 ~g Aet/ml fast roll-

Phytochrominduzierte Akkumulation yon Ascorbins~iure I -

217

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Konzentration an Actinomycin D Abb. 7. Die Wirkung Yon Actinomycin D auf die !ohytochrominduzierte Asoorbins~ure-Akkumulation in den Kotyledonen. Die Keimlinge wurden 36 Std nach der Aussaat for 6 Std im Dunkeln inkubiert und anschlieBend for 2~ Std mit Dunkelrot bestrahlt bzw. im Dunkeln gehalten ( O - - O Dunkelrot, e - - $ Dunkelkontrolle; - - - - W e f t bei Inkubationsbeginn)

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Abb. 8. Die Wirkung yon Actinomycin D auf die phytochrominduzierte Ascorbins~ure-Akkumulation ira ttypokotyl. Die Keimlinge wurden 36 S~d nach der Aussaat ftir 6 S~d im Dunkeln inkubiert un4 anschlie~end fiir 24 Std mit Dunkelro~ bestrahlt bzw. im Dunkeln gehatten ( O - - O Dunkelrot, O - - e Dunkelkontrolle; - - - - W e f t bei Inkubationsbeginn)

st~ndig unterdr~ickt (Abb. 9 und 10). Dasselbe gilt auch ffir einige weitere ,,positive" Photomorphosen ( S c ~ o P s ~ , 1967a). Ans Abb. 7 wird deutlich, dal] erst bei wesentlich hSheren Act-Konzentrationen (40--100 ~g/ml) auch eine tIemmung der AS-Akkumulation einsetzt. Sie betrifft in ~hnlicher Weise Dunkel- nnd DR-Wert (die prozentuale ttemmung liegt in beiden F~tllen in der gleichen GrS~enordnung).

218

P. SC~OPF~R: F 0.~ _

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KonzentraUon an Actinomycin D

Abb. 9. Die Wirkung yon Actinomycin D auf die phytochrominduzierte Anthocyansynthese in den Kotyledonen, Die Keimlinge wurden 36 Std nach der Aussaat ffir 6 Std im Dunkeln inkubiert und anschlieBend fflr 24 Std rait Dunkelrot bes~rahlt bzw. im Dunkeln gehalten (O--O Dunkelrot, e - - e Dunkelkontrolle; - - - - W e r t bei Inkubationsbeginn)

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Konzentration an Actinomycin D Abb. 10, Die Wirkung yon Actinomycin D auf die phytochrominduzierte Anthocyansynthese im Itypokotyl. Die Keimlinge wttrden 36 Std nach der Aussaat ffir 6 Std im Dunkeln inkubiert und anschlie6en4 fiir 24 Std mit Dunkelrot bestrahlt bzw. im Dunkeln gehalten (O--O Dunkelrot, e - - e Dunkelkontrolle; - - - - W e f t bei Inkubationsbeginn)

B e i m t t y p o k o t y l fallen D u n k e l - u n d D l ~ - W e r t m i t s t e i g e n d e r A e t - K o n z e n t r a t i o n e t w a s ab. Dies b e r u h t w a h r s c h e i n l i c h a u f e i n e m ~Tebeneflekt des A c t a u f die s e h r e m p f i n d l i c h e n Ze]len dieses O r g a n s . - - D e r A S - G e h a l t in d e n K o t y l e d o n e n s t e i g t i m D u n k e l n m i t w a c h s e n d e r A c t - K o n z e n t r a t i o n an. Dieser E f f e k t dfirRe d a r a u f b e r u h e n , d a 6 d u t c h eine A c t - b e d i n g t e t t e m m u n g m a n c h e r S y n t h e s e w e g e ein A n s t a u y o n M e t a b o l i t e n in d e n K o t y l e d o n e n e r z e u g t wird, w a s zu e i n e m g e s t e i g e r t e n A b f l u 6 in die n o c h ,,offenen" Stoffwechselwege fiihrt. Die U n w i r k s a m k e i t y o n i 0 ~tg A c t / m l a u f die A S - A k k u m u l a t i o n k a n n n i c h t a u f eine u n z u r e i c h e n d e A u f n a h m e dieser S u b s t a n z w ~ h r e n d der 6 s t i i n d i g e n I n k u b a t i o n zuriickgefiihrt werden. I n k u b i e r t m a n die K e i m l i n g e zus~tzlich wi~hrend der g a n z e n B e s t r a h l u n g s z e i t (24 Std) in der A c t - L S s u n g , so e r g e b e n sieh i m P r i n z i p dieselben E r g e b n i s s e (Tabelle 1),

Phytochrominduzierte Akkumulation von Ascorbinsgure

219

Tabelle 1. Die Wirkung yon Actinomycin D (10 #g/ml) au] die phytochromi~duzierte Ak]cumulation von Anthocyan und Ascorbinsiiure in den Kotyledonen. Inlcubations. art 1: entsprechend Abb. 7--10. Inlcubationsart 2: Den Keimlingen wurden nach 36 Std An]ceimung im Dunlceln die Radicula abgeschnitten. Anschlie/3end wurden sie au/recht in speziellen Plexiglasge/gflen /iir 6 Std in Aqua bidest, und dann in Actinomycin DL6sung bzw. Aqua bidest, in]cubiert (hierbei sind die Keimlinge ganz yon der LSsung umgeben). 6 Std nach Beginn der Actinomycin D-In]cubation begann die 2gstiindige Bestrahlung mit Dunlcelrot. Die KontroUs~itze wurden w~ihrend dieser Zeit im Dun]celn gehalten Inkubation

Anthocyangehal~ rel. Einheiten/Paar Ko~yledonen

Ascorbinsfmregehalt nl~Iol]Paar Kotyledonen

Dunkel

DI~

Dunkel

1. 6 Std vor Bestrahlungsbeginn: Actinomycin D 0,02 4- 0,01 Wasserkontrolle 0,08 4- 0,01

0,114-0,01 0,774-0,01

18,5~ 0,5 33,04-1,0 14,14- 1,1 35,74- 1,9

2. 6 Std vor Bestrahlungsbeginn 4-24 Std im DR: Actinomycin D 0,07 • 0,01 Wasserkontrolle 0,11 4- 0,01

0,12~ 0,02 0,44 4- 0,07

19,7• 35,74-1,5 16,9 • 0,6 35,24- 1,3

DI~

Aus den Daten dieses Absehnittes folgt, dab die Wirkungswelse yon PT~0 bei der AS-Akkumulation im Gegensatz zur Anthoeyansynthese offenbar nieht mit einer Aktivierung ,,potentiell aktiver" Gene gedeutet werden kann. Zum gleiehen Sehlug k a m e n KASEMI~ und MoHg (1967)bei der phytoehrominduzierten Steigerung der Protochlorophyllsynthese. c) Die I n d u k t i o n der Anthocyansynthese durch eine A p p l i k a t i o n von Ascorbinsiiure i m Dunlceln. Wenn AS funktionell eine Position im

t~ahmen der ,,Signalkette" einnimmt, mfil3te es im Experiment mSglich sein, die Wirkung yon P~0 auf die Anthocyansynthese durch eine s Zufuhr yon AS zu ersetzen. Entsprechende Experimente sind allerdings mit gewissen Schwierigkeiten verbunden, da AS nur in sehr geringem Umfang yon den Keimlingen aufgenommen wird. Da aul3erdem AS-LSsungen bei physiologisch vertr/iglicher H+-Konzentration rasch oxydiert werden, muB m a n die Inkubationszeit relativ kurz halten. Als gfinstig erwies sieh eine 6stiindige Inkubation bei 250 C (plt 6,0); unter diesen Bedingungen sind am Ende der Inkubation noch mindestens 90% der eingesetzten AS in der LSsung naehweisbar. Abb. 11 zeigt die Wirkung einer Applikation yon AS anf den Gehalt an Anthoeyan und AS in den Kotyledonen der behandelten Keimlinge. Es wird deutlieh, dab es erst mit relativ hohen Konzentrationen an /~ugerlieh zugefiihrter AS (40--100 ~Mol/ml) gelingt, den AS-Spiegel

220

P. SCHOPFER:

in den Kotyledonen wesentlich zu steigern. Zu ganz i~hnlichen Ergebnissen kam GERhArDT (1964) bei Chorella und einigen anderen Algen. Obwohl es sich bier um relativ hohe Konzentrationen hande]t, zeigen die Keimlinge keinerlei &uBerlich feststellbare Schi~digung; das Wachsturn des Hypokotyls wird jedoch deutlich gehemmt. Erst bei Konzentrationen fiber 150 FMol/ml tritt eine braune Verf~rbung der Keimlinge auf. Anthocyan kann unter diesen Bedingungen nieht beobachtet werden. I

L

=ar KotytedonenJ

LPoar KotyLedonenJ

18

r

0,15

1E

N D

12 ~

00

lC

sserkontrotte AS WosserkontroU.e Anthocyan

2'0

- /~0

6'0

[~.o,]m,]

100

Konzentration an Ascarbinsi~ure

Abb. 11. Die Steigerung des Anthocyan- und Ascorbins~uregehaltes in den Kotyledonen durch eine Applikation yon Ascorbinsfiure im Dunkelm Die Keimlinge wurden 36 Std nach der Aussaat fiir 6 Std im Dunkeln in einer Ascorbins~ure-L6sung (pH 6,0) inkubiert. Nach sorgf<igem Abwaschen wurden sie anschliel~end fiir weitere 24 Std im Dunkeln gehalten ( e - - e Anthocyan, O--O Ascorbinsaure)

In dem physiologisch vertr&glichen Bercich yon 40--100 FMol AS/ml bewirkt die Inkubation eine Synthcse yon Anthocyan (Abb. 11). Die Steigerung im Anthocy~ngehalt liegt in einer GrSBenordnung, wie man sie aufgrund der aufgenommenen Menge an AS erwarten kann. Die im Vergleieh zu DR relativ geringe Wirkung der Inkubation auf die Anthocyanakkumulation ist offenbar auf die beschri~nkte MSglichkeit zurfickzuffihren, durch eine ~u6erliche Zufuhr den AS-Spiegel in den Kotyledonen ~hn]ieh stark wie durch DI~ zu erhShen. Bci l~otkohlkeim]ingen, welche auch im Dunkeln Anthocyan bilden, f6rdert neben AS auch Saccharose die Anthocyansynthese (KANDELEt% 1960). Beim Senfkeimling dagegen kann jedoch weder mit Glucose noch mit Saccharose eine Wirkung auf die Anthocyansynthese im Dunkeln erzielt wcrden (Tabelle 2).

Phytochrominduzierte Akkumulation von Ascorbins~ure

221

Aueh der AS-Gehalt wird durch diese beiden Zucker praktiseh nieht erhSht. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dab der limitierende F a k t o r der Anthocyansynthese im Dunkelkeimling nicht anf der Ebene der Metaboliten, sondern in der Aktivitgt der beteiligten E n z y m e bzw. Gene zu suchen ist. Bei /ilteren, etiolierten Bl~ttern yon Petroselium kann m a n dagegen die AS-Synthese dureh eine Zuekerzufuhr steigern (AB~G, 1953). Tabelle 2. Die Wirkung einer Applikation von Ascorbinsiiure, Glucose oder Saccharose au/ den Gehalt an Anthocyan und Ascorbinsdgure im Dunkeln. Die Keimlinge wurden 36 Std nach der Aussaat /iir 6 Std im Dunkeln inlcubiert (pH 6,0). Naeh sorg]diltigem Abwaschen wurden sie /i~r weitere 24 Std im Dunkeln gehalten ApplizierteL6sung

Ascorbins~ure 50 ~Mol/ml 100 ~zMol/ml Glucose 50 tzMol/ml 100 9Mol/ml 200 9Moi/ml Saccharose 50 f~Mol/ml 100 ~zMol/ml Wasserkontro]le

Anthocyangehalt tel. Einheiten] Paar Kotyledonen

Aseorbins~uregeha] t nMol/Faar Kotyledonen

0,106 • 0,005 0,144-4-0,004

13,8 ~: 0,8 21,9 :k 0,6

0,077 • 0,008 0,069 i 0,007 0,068 • 0,004

11,0 ~ 0,3 10,8 ~: 0,6 9,8 ~ 0,5

0,062 -4-0,002 0,057 • 0,008 0,075• 0,005

10,4 ~: 0,4 10,6 ~: 0,6 9,7 :~ 0,3

Wenn yon auBen zugeffihrte AS $hnlieh wie P7z0 eine Aktivierung der ffir die Anthocyansynthese verantwortlichen Gene ausl6st, mfiBte m a n erwarten, dab dieser AS-Effekt ebenfalls durch Act gehemmt werden kann. Die in der Tabelle 3 dargestellten Experimente zeigen, dab dies in der T a t m6glich ist. Die Indnktion der Anthocyansynthese (2) wird dureh eine Pr~tinkubation mit Act gehemmt (3, 4, 5). Da Act unter den Bedingungen dieser Experimente offenbar durch die zweite I n k u b a t i o n teflweise aus den Kotyledonen ausgewasehen wird, ist eine h6here Aet-Konzentration fiir eine anniihernd vollst~ndige H e m m u n g erforderlich als unter den Bedingungen der Abb. 5. LANG~ und MoHu (1965) haben gezeigt, da/3 im Zusammenhang mit der An~hoeyansynthese selbst 200 ~zg Act/ml nieht toxiseh wirken; m a n braueht daher bei diesen Experimenten nicht mit st6renden Nebeneffekten zu rechnen. Folgt Act unmittelbar auf AS, so wird ebenfalls nur sehr wenig Anthoeyan gebildet (6). Allerdings muB dies zumindest teilweise darauf zurfickgef/ihrt werden, dab ein Tell der aufgenommenen AS durch die zweite

222

P. SCHOeFER:

Tabelle 3. Die Hemmung der durch eine Ascorbins~iure.AppIikation im Dunkeln induzierten Anthocyansynthese in den Kotyledonen durch Actinomycin D. Die Keimlinge wurden 36 Std nach der Aussaat 2real/i~r 3 Std im DunIceln in~ubiert und anschlie[3end bis zur Auswertung (66 Std nach der Aussaat) im DunIceln gehalten (ira Experiment 8 erfolgte die 1. Inkubation 30 Sld, die 2. Inkubation 39 Std nach der Aussaat). Die Konzentration an Ascorbinsdure betrug 100 #Mol/ml (pH 6,0)

Inkubation

Anthocyangehalt rel. Einheiten/ Paar Kotyledonen

Ascorbins~uregehalt nMol/PaarKoWledonen

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

0,075 =~0,005 0,139:j= 0,012 0,094=[= 0,002 0,016:J= 0,002 0,013 :j=0,001 0,030 ~ 0,002 0,066 ~ 0,014 0,092 :L 0,005

9,7 -4-0,3 20,5-4-1,1 21,6 =j::1,0 24,6~ 1,3 22,7 • 0,9 17,7 :J=1,2 17,0 ::]:3,2 16, 6 • 0,7

6 Std H~O 3 Std H~O ~- 3 Std AS 3 Std Act (10 ~g/ml) d- 3 Std AS 3 Std Act (50 ~g/ml) -t- 3 Std AS 3 Std Act (100 gg/ml) d- 3 Std AS 3 Std AS d- 3 Std Act (10 ~g/ml) 3 Std AS -4-3 Std H20 3 Std AS -4-6 Std Luft-~ 3 Std Act (10 f~g/ml)

I n k u b a t i o n wieder ausgewaschen wird (wahrscheinlich sind davon in besonderem Mal~ die anthocyanbildenden Epidermiszellen der Kotyledonen betroffen) (7). L i ~ t m a n jedoch die aufgenommene AS einige Zeit einwirken, indem m a n die Keimlinge zwischen den beiden Inkubationen fiir 6 Std in der Keimdose im Dunkeln htilt, so k a n n der AS-Effekt durch Act nur noch partiell gehemmt werden (8). Auch in diesem Fall wird ein Teil der aufgenommenen AS bei der zweiten I n k u b a t i o n wieder ausgewaschen. Wtihrend der 6stfindigen Pause zwischen den beiden Inkubationen wird kein Anthocyan gebildet. Offenbar hat jedoch in dieser Zeitspanne die aufgenommene AS Reaktionen ausgelSst, welche durch Act nicht mehr vSllig verhindert werden kSnnen. Zum selben Ergebnis k o m m t man bei der Induktion der Anthocyansynthese durch P730; auch in diesem Fall kann die Wirkung yon D R nach 6 Std nnr noch partiell durch Act gehemmt werden (LANGE U. Motif, 1965). d) Die ErhShung des RNS-Gehaltes durch eine A T p l i k a t i o n yon Ascorbins~ure i m Dun/celn. Bei der Photomorphogenese der Kotyledonen

des Senfkeimlings finder ein Anstieg im RNS-Gehalt dieser Organe start. Dieser Anstieg wird ebenfalls dutch Pvso veranlal~t ( W ~ I D ~ n u. Mitarb., 1965). - - Wenn AS ein Glied der ,,Signalkette" der phytochrominduzierten Photomorphogenese darstellt, mii[~te es mSglich sein, den RNSGehalt der Kotyledonen durch eine Applikation yon AS im Dunkeln tihnlich wie durch PTs0 zu beeinflussen. Die Tabelle 4 zeigt, dai~ auch diese Voraussage verifiziert werden kann. Dutch eine 6stiindige I n k u b a tion bei einer AS-Konzentration yon 100 ~Mol/ml, welche unter diesen Bedingungen eine optimale Anthocyansynthese hervorruft (Abb. 11),

Phytochrominduzierte Akkumul~tion yon Ascorbins~ure

223

Tabelle 4. Die Steigerung des RNS-Gehaltes der Kotyledonen dutch elne Applikation yon Ascorbinsiiure (100 ttMol/ml; pH 6,0) im Dunkeln. Die Keimlinge wurden 36 Std nach der Aussaat ]i~r 6 Std im Dunlceln inkubiert. Nach sorg/~iltigem Abwaschen wurden 8ie /iir weitere 24 Std im Dun]celn gehalten. Es wurden 2 v611ig unabMingige Experimente mit ]e 2real ~ Proben du~'chge/iihrt. Jeder Weft repriisentiert den Mittelwert yon 46 Kotyledonenpaaren

Experiment 1

Experiment 2

)Iittelwert

Applikationyon Ascorbinsaure DigI~NS[ ~aar Kotyledonen

Wasserkontrone ~zgI~NS/ Paar Kotyledonen

48,5 46,0 48,3 47,5 51,5 47,5 49,9 47,0

43,8 40,9 44,0 43,7 42,8 43,7 43,5 42,6

48,3 ~ 0,6

43,1 ~ 0,4

kann der RNS-Gehalt der Kotyledonen um 12% gesteigert werden. Diese Steigerung liegt in einer Gr61~enordnung, wie man sie aufgrund der aufgenommenen Menge an AS erwarten kann.

Diskussion Alle dargestellten Daten stehen im Einklang mit der Hypothese, daB AS eine Funktion im Rahmen der ,,Signalkette" der phytoehrominduzierten Photomorphogenese besitzt. I m einzelnen sollen die fo]genden Punkte herausgehoben werden: ~) Der AS-Gehalt wird in allen Teilen (wahrseheinlieh in allen Zellen) des Keimlings dutch den EinfluB von Pw0 gesteigert (Abb. 1--3). Dieser Phytochromeffekt ist also weitgehend unabhi~ngig yon den untersehiedliehen Wachstumsreaktionen der einzelhen Org≠ die Jxnderungen im AS-Gehalt folgen vielmehr den J~nderungen im Phytoehromsystem. b) Die phytochrominduzierte ASAkkumulation hat eine verhiiltnism~13ig kurze lag-Phase (ca. 1 Std; Abb. 4). Dies ist die kiirzeste lag-Phase yon allen positiven, phytochromabh~ngigen Reaktionen, welehe bisher beim Senfkeimling unter vergleiehbaren Bedingungen gefunden wurden, c) Act beeintr~ehtigt in einer Konzentration, welehe die Anthoeyansynthese fast v611ig hemmt (10 ~g/ml; Abb. 9 und 10), die phytoehrominduzierte AS-Akkumulation nut geringfiigig (Abb. 7 und 8). Daraus kann man bei Beriicksichtigung der spezifisehen Wirkungsweise von Act den SehluB ziehen, dab diejenigen Gene, welehe die Enzyme der AS-Synthese eodieren, bereits im Dunkelkeimling im aktiven Zustand vorliegen. Diese ,,positive" Photomorphose

224

P. Sc~oPF~:

wird also im Gegensatz zur Anthocyansynthese nicht durch eine Aktivierung ,,potentiell aktiver" Gene veranlal~t, d) Die Anthocyansynthese kann in einem gewissen Umfang aueh im Dunkeln ablaufen, wenn dem Keimling AS yon auBen zugeffihrt wird (Abb. ll). Dieser Effekt kann nicht einfach auf eine Zufuhr yon Kohlenhydraten zurfickgeffihrt werden (Tabelle 2). Gegenfiber Act verh~lt sieh die unter dem Einflul~ applizierter AS im Dunkeln induzierte Anthoeyansynthese ganz ~hnlich wie die phytochrominduzierte Anthocyansynthese; in beiden F~llen kann die Akkumulation durch Act vor der Induktion weitgehend gehemmt werden, naeh einigen Stunden jedoch nur noch partiell (Tabelle 3 bzw. LAI~]~ u. MOHI~, 1965). - - A l l e diese Daten kann man yon einer Substanz erwarten, welehe bei der Aktivierung der ,,potentie]l aktiven" Gene der Anthoeyansynthese im Senfkeimling kausal beteiligt, oder wenigstens eng damit gekoppelt ist. Der Befund, dal~ aueh die ,,positive" Photomorphose ,,Steigerung des l~lqS-Gehaltes" dureh eine Applikation yon AS ausgelSst werden kann (Tabelle 4), weist darauf bin, dal~ die postulierte Funktion der AS nieht auf die Anthoeyansynthese beschrgnkt ist, sondern eine allgemeinere Bedeutung ffir die differentielle Genaktivierung hat. Daffir sprieht such die Beobaehtung, dal~ die ,,0ffnung des Hypokotylhakens", eine weitere ,,positive" Photomorphose des Senfkeimlings (ScltOpS]~lZ, 1967a), dutch die AS-Applikation signifikant gesteigert werden kann. Auch bei niederen Pflanzen fSrdert AS d~s Wachstum und eine Reihe yon Syntheseleistungen (z.B. NAGVlB, 1965). - - Bei der Metamorphose yon Insekten scheint AS eine l~olle ffir die Entwicklung der Adultorgane zu spielen (SAx~A, 1966). - - J~FFREY U. MAI~TIN(1966) kolmten zeigen, dab bei isolierten, embryonalen tIiihnchenknochen Wachstum, DNS-, RNS- und Proteinsynthese yon der Versorgung mit AS abhgngen. - - Diese Beipiele zeigen, dul3 nicht nur bei den hSheren Pflanzen eine Beziehung zwischen AS und genabhgngigen Entwicklungsprozessen bes~eht. Die Fr~ge, wie P7a0 die Akkumulation yon AS beeinfluSt, kann zur Zeit noeh nieht beantwortet werden. Dies ist vor allem dadurch bedingt, d a ] e s his heute noeh vSllig ungeld~rt ist, fiber welehe Prim~trreaktion das P730 die ,,Signalkette" in Betrieb setzt. Am einfaehsten erseheint im Moment die MSgliehkeit, dal~ P730 direkt die Konzentration eines Metaboliten ver~ndert, was dann naeh einiger Zeit (vielleieht fiber einige Zwisehensehritte) zu einer Steigerung der AS-Akkumulation ffihrt. Mo~II~ (1966b) hat die Vermutung ausgesprochen, dal~ P7s0 primer die Aktivit~t der ,,aktiven", ffir die AS-Synthese verantwortlichen Gene steigert, welehe eine fibergeordnete l%olle als ,,Regulatorgene" haben und ihrerseits dureh eine Steigerung der AS-Akkumulation die ,,potentiell aktiven" Gene aktivieren. Auch diese M6glichkeit mul] man bei weiteren Experimenten im Auge behalten.

Phytochrominduzierte Akkumulation yon Ascorbinsgure

225

Zusammenfassung Die Ascorbins/~ure-Akkumulation des Senfkeimlings (Sinapi8 alba L.) wird in allen Organen (Kotyledonen, Hypokotyl, l~adic~la) dureh Phytoehrom gesteigert, obwohl gleiehzeitig das Waehstum der Kotyledonen gef6rdert, das des tIypokotyls und der Radieula dagegen gehemmt wird. Dutch Actinomyein D (10 ~zg/ml) wird die phytoehromhlduzierte Ascorbins/iure-Akkumulation nur geringffigig beeintrgehtigt, wahrend die phytoehrominduzierte Anthoeyansynthese fast v611ig gehemmt wird. Dutch eine Applikation yon Aseorbinsaure kann eine Anthoeyansynthese im Dunkeln hervorgerufen werden. Dieser Effekt kann dureh Actinomyein D ganz /ihnlieh wie der des Phytoehroms auf die Anthocyansynthese gehemmt werden. Aul3erdem kann die RNS-Nettosynthese dutch eine Applikation yon Aseorbinsgure im Dunkeln gesteigert werden. Diese Daten werden als weitere tIinweise ftir die tIypothese angesehen, dal~ Aseorbinsiture bei der Veranlassung maneher ,,positiver" Photomorphosen (z.B. der Anthoeyansynthese) durch Phytoehrom kausal beteiligt oder wenigstens eng damit gekoppelt ist. Herrn Prof. Dr. It. Moa~ bin ieh fiir die grogzfigige l~'Srderung dieser Arbeit zu groBem Dank verpflichtet. Die Experimente zur Wirkung yon applizierter Ascorbinsgure wurden yon Herin U. Se~uLz im Rahmen einer Zulassungsarbeit durchgeffihrt. Fiir wertvolle 2~r mSchte ieh auBerdem Fraulein I. RlSSLA~D und Herrn 1%.ESO~ENB~trCa danken. - - Die Arbeit wurde durch Saehbeihilfen der Deutsehen Forschungsgemeinschaft und der Stiftung Volkswagenwerk (an Prof. Mo~) unterstiitzt. Literatur Ae~Re, B.: On the effect of different sugars upon the ascorbic acid content of detached leaves. Kungl. LantbrukshSgskoIans Ann. 20, 125--138 (1953). Documenta Geigy: Wissenschaftliche Tabellen, 6. Aufl. Basel: J. 1%. Geigy AG 1960. Dv~sT, F., and H. Memo: Phytochrome-mediated induction of enzyme synthesis in mustard seedlings (SinaTis alba L.). Naturwissenschaften 53, 531--532 (1966). FRA~K~, W., u. U. ItE]~E~: Uber die quantitative Verteilung der Ascorbinsgure innerhalb der Pflanzenzelle. Z. Naturforsch. 19b, 1146--1149 (1964). Fv~uYA, M., and W. S. I-I~L~A~: Observations on spectrophotometricMly assayable phytochrome in rive in etiolated Pisum seedlings. Planta (Berl.) 63, 31-42 (1964). G]~RJ~D:r, B. : Untersuchungen fiber Beziehungen zwischen Ascorbinsgure und Photosynthese. Planga (Ber].} 61, 101--129 (1964). GaILL, 1%, and D. VI~cE: Anthoeyanin formation in turnip seedlings (Brassica rapa L.): Evidence for two light steps in the biosynthetic pathway. Planta (BEE.) 63, 1--12 (1964). HocK, B., u. I-L M o ~ : Nine quantitative Analyse yon Wachstumsvorgiingen im ZusammerLhang mit der Photomorphogencse yon Senfkeimlingen (Sinapis alba L.). Planta (Berl.) 65, 1--16 (1965).

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