TISSUE‐SPECIFIC STEM CELLS    

1

College  of  Pharmacy,  Yonsei  Uni‐ versity,  Incheon,  Korea;  2 Department  of  Medical  Science,  CHA University, Kyunggi‐do, Korea;  3 College of Pharmacy, Ajou Univer‐ sity,  Kyunggi‐do,  Korea;  4 Translational  Research  Center,  Inha University School of Medicine,  Incheon, Korea    Address  correspondence  to:  Jong‐ Hyuk  Sung,  Ph.D,  College  of  Phar‐ macy,  Yonsei  University,  #162‐1,  Songdo‐dong,  Yeonsu‐gu,  Incheon,  406‐840,  Korea,  Tel:  +82‐32‐749‐ 4506, e‐mail: [email protected];  *equal  contribution;  Abbreviation:  ASCs  Adipose‐derived  stem  cells,  PDGF  Platelet‐derived  growth  fac‐ tor,  mtROS  Mitochondrial  reactive  oxygen  species,  mito‐CP  Mito‐ carboxy  proxyl,  Mdivi‐1  Mitochon‐ drial  division  inhibitor‐1,  p66Shc  66‐kDa  Src  collagen  homologue,  BCL2A1  BCL2‐related  protein  A1,  SERPINE1 Serpine peptidase inhibi‐ tor, clade E, member 1, FGF Fibrob‐ last growth factor, HBEGF Heparin‐ binding  EGF‐like  growth  factor,  IL11  Interleukin  11,  INHBA  Inhibin,  beta  A,  LIF  Leukemia  inhibitory  factor,  VEGFA  Vascular  endothelial  growth factor A    Received  June  27,  2014;  accepted  for publication September 14, 2014    ©AlphaMed Press   1066‐5099/2014/$30.00/0    This  article  has  been  accepted  for  publication  and  undergone  full  peer  review  but  has  not  been  through  the  copyediting,  typeset‐ ting,  pagination  and  proofreading  process  which  may  lead  to  differ‐ ences between this version and the  Version  of  Record.  Please  cite  this  article as doi: 10.1002/stem.1865       

Functional Regulation of Adipose‐derived Stem  Cells by PDGF‐D    JI HYE KIM1*, SANG GYU PARK2,3*, WANG‐KYUN KIM1, SUN U. SONG4,  JONG‐HYUK SUNG1    Key words. PDGF‐D • adipose‐derived stem cells • mitogenic effect • para‐ crine effect • mitochondrial ROS generation    ABSTRACT    Platelet‐derived growth factor‐D (PDGF‐D) was recently identified, and acts  as  potent  mitogen  for  mesenchymal  cells.  PDGF‐D  also  induces  cellular  transformation and promotes tumor growth. However, the functional role  of  PDGF‐D  in  adipose‐derived  stem  cells  (ASCs)  has  not  been  identified.  Therefore,  we  primarily  investigated  the  autocrine  and  paracrine  roles  of  PDGF‐D  in  the  present  study.  Furthermore,  we  identified  the  signaling  pathways and the molecular mechanisms involved in PDGF‐D‐induced sti‐ mulation of ASCs. It is of interest that PDGF‐B is not expressed, but PDGF‐D  and PDGF receptor‐β are expressed in ASCs. PDGF‐D showed the strongest  mitogenic effect on ASCs, and PDGF‐D regulates the proliferation and  mi‐ gration of ASCs through the PI3K/Akt pathways. PDGF‐D also increases the  proliferation  and  migration  of  ASCs  through  generation  of  mitochondrial  reactive oxygen species (mtROS) and mitochondrial fission. mtROS genera‐ tion  and  fission  were  mediated  by  p66Shc  phosphorylation,  and  BCL2A1  and  SERPINE1  mediated  the  proliferation  and  migration  of  ASCs.  In  addi‐ tion, PDGF‐D up‐regulated the mRNA expression of diverse growth factors  such  as  VEGFA,  FGF1,  FGF5,  LIF,  INHBA,  IL11  and  HBEGF.  Therefore,  the  preconditioning  of  PDGF‐D  enhanced  the  hair‐regenerative  potential  of  ASCs.  PDGF‐D‐induced  growth  factor  expression  was  attenuated  by  a  pharmacological inhibitor of mitogen‐activated protein kinase pathway. In  summary,  PDGF‐D  is  highly  expressed  by  ASCs,  where  it  acts  as  a  potent  mitogenic  factor.  PDGF‐D  also  up‐regulates  growth  factor  expression  in  ASCs.  Therefore,  PDGF‐D  can  be  considered  a  novel  ASC  stimulator,  and  used  as  a  preconditioning  agent  before  ASC  transplantation.  STEM  CELLS  2014; 00:000–000 

STEM CELLS 2014;00:00‐00 www.StemCells.com 

©AlphaMed Press 2014 

Functional regulation of ASCs by PDGF‐D 

2   

INTRODUCTION    Adipose‐derived  stem  cells  (ASCs)  are  a  mesenchymal  stem  cell  (MSC)  obtained  from  subcutaneous  adipose  tissue  that  exhibits  wound  healing  and  anti‐wrinkling  effects  on  skin  [1‐3].  Recently,  the  hair  regenerative  potential of  ASCs  has  been  reported  for  secretomes of  ASCs,  which  have  been  found  to  induce  telogen‐to‐ anagen  shifts  in  mice,  while  preconditioning  with  hy‐ poxia  or  vitamin  C  was  observed  to  enhance  the  hair  regenerative potential of ASCs [4, 5]. Of the growth fac‐ tors  secreted,  platelet  derived  growth  factor  (PDGF)  expression  in  ASCs  regulates  hair  follicular  stem  cell  activity and induces the anagen phase of the hair cycle  in  vivo  [6].  In  addition,  local  injection  of  recombinant  PDGF‐A  and  ‐B  also  induce  and  maintain  the  anagen  phase of murine hair follicles [7].   PDGF is one of the growth factors that regulate cell  growth  and  division  [8,  9].  PDGF  is  mitogenic  during  early  developmental  stages,  driving  the  proliferation  and  migration  of  undifferentiated  mesenchyme  and  some progenitor populations [10, 11]. During later ma‐ turation  stages,  PDGF  signaling  has  been  implicated  in  tissue  remodeling  and  cellular  differentiation,  and  in  patterning  and  morphogenesis.  In  particular,  it  plays  a  significant  role  in  blood  vessel  formation.  The  PDGF  signaling network consists of four ligands: PDGF‐A, ‐B, ‐ C, and ‐D. All PDGFs function as disulfide‐linked homo‐ dimers, and PDGF‐A and ‐B can form functional hetero‐ dimers.  The  PDGF  receptor  (PDGFR)  is  classified  as  a  receptor  tyrosine  kinase,  and  two  receptor  types  (i.e.,  PDGFR‐α  and  PDGFR‐β have  been  identified  to  date  [12,  13].  Upon  activation,  PDGFRs  dimerize,  and  are  auto‐phosphorylated on their cytosolic  domains, which  subsequently  activate  signal  transduction  through  the  PI3K  pathway  or  through  the  generation  of  reactive  oxygen  species  (ROS)  [14‐16].  PDGF‐C  and  D  have  re‐ cently  been  identified,  and  PDGF‐D  mediates  its  func‐ tion  through  PDGFR‐β [17,  18].  PDGF‐D forms  only  ho‐ modimers  and  does  not  dimerize  with  the  other  three  family  members.  PDGF‐D  reportedly  induces  cellular  transformation and promotes tumor growth [19].   Because PDGF has a potent mitogenic effect on me‐ senchymal  cells,  there  are  many  reports  on  the effects  of PDGF isoforms and their receptors on MSCs. For ex‐ ample, MSCs are source of PDGF and act as a niche for  hematopoetic  stem  cells  in  bone  marrow  [20].  PDGF‐B  was reported to regulate the proliferation and invasion  of  MSCs  through  ERK  and  Akt  signaling  pathways  [21].  PDGFR‐α has been shown to be involved in the forma‐ tion  of  smooth  muscle  actin  filaments  in  MSCs  [22].  Inhibition  of  PDGFR  by  chemical  inhibitors  regulated  Oct4  and  Nanog  expression,  and  modulated  the  cell  shape  and  the  potency  of  MSCs  [23].  Vascular  endo‐ thelial  growth  factor  (VEGF)  can  signal  through  the  PDGFR in MSCs [24]. In ASCs, PDGF induced the prolife‐ ration  and  migration  of  ASCs  through  c‐Jun  N‐terminal  kinase, and PDGF‐B increased the proliferation and mi‐ www.StemCells.com 

gration  of  ASCs  via  ROS  generation  and  miR‐210  up‐ regulation  [25,  26].  PDGF  was  shown  to  mediate  this  paracrine  effect,  and  PDGF  secreted  from  ASCs  helped  to  maintain  the  hair  cycle  and  induce  anagen  [6].  Tis‐ sue‐resident  ASCs  secreted  PDGF‐D  and  induced  the  epithelial‐mesenchymal transition in breast cancer [27].  Although PDGF and its receptor isoforms play autocrine  and  paracrine  roles  in  ASCs,  the  mechanism  of  action  for ASC regulation has not been fully identified.   Of the PDGF isoforms, the mitogenic effect of PDGF‐ B  has  been  well  reported  in  ASCs.  Although  PDGF‐B  is  exogenous since ASCs do not express PDGF‐B, we found  that  PDGF‐B  exhibits  the strongest effect  on ASC proli‐ feration and migration of all tested growth factors such  as PDGF‐A, PDGF‐B, VEGF, epithelial growth factor, insu‐ lin‐like growth factor, and basic fibroblast growth factor  [26,  28].  In  addition,  pharmacological  inhibition  of  PDGFR‐β  significantly  reduced  the  proliferation  and  migration  of  ASCs  [26].  PDGF‐A,  ‐C,  and  ‐D  are  ex‐ pressed  in  ASCs;  however,  PDGF‐B  is  not  [27].  There‐ fore, we should pay attention to the autocrine and pa‐ racrine  role  of  PDGF‐D  in  ASCs.  PDGF‐D  functions  as  a  potent  transforming  and  angiogenic  growth  factor  via  the  PDGFR‐β  in  cancer  cells  [19].  In  addition,  PDGF‐D  has been shown to increase cell migration and invasion  more  effectively than  PDGF‐B  [29].  However, the  func‐ tional role of PDGF‐D in ASCs has not been fully identi‐ fied,  especially  its  effect  on  growth  factor  secretion.  Therefore,  we  primarily  investigated  the  stimulatory  effect  of  PDGF‐D  on  the  proliferation,  migration  and  growth factor secretion of ASCs. Furthermore, we iden‐ tified  the  signaling  pathways  and  the  molecular  me‐ chanisms involved in PDGF‐induced stimulation of ASCs.    

MATERIALS AND METHODS   

Materials  Human PDGF isoforms (PDGF‐A, B and C) were obtained  from  Sigma‐Aldrich  Co.  (Saint  Louis,  MO,  USA).  Human  PDGF‐D was obtained from R&D systems (Minneapolis,  MN, USA). In the pharmacological inhibition study, vari‐ ous  inhibition  conditions  such  as  LY294002  (PI3K/AKT  inhibitor, Calbiochem, San Diego, CA, USA), U0126 (ERK  inhibitor,  Calbiochem),  cp673451  (PDGFR‐β  inhibitor,  Selleckchem,  Houston,  TX,  USA)  and  Mdivi‐1  (mito‐ chondria  fission  inhibitor,  Enzo  Life  Sciences,  Farming‐ dale,  NY,  USA)  were  used.  Mito‐carboxy  proxyl  (Mito‐ CP,  mtROS  scavenger)  was  synthesized  as  previously  described [30].   Antibodies  recognizing  Akt  (1:4000),  phospho‐Akt  (1:2000),  ERK  (1:4000),  phospho‐ERK  (1:3000)  were  purchased  from  Cell  Signaling  Technology  (Danvers,  MA, USA). p66Shc‐ser34 (1:100 or 1:1000) was purchase  from  Calbiochem.  Horseradish‐peroxidase  (HRP)‐ conjugated  secondary  mouse  antibody  (1:10000)  and  HRP‐conjugated  secondary  rabbit  antibody  (1:1000) 

©AlphaMed Press 2014 

3  were  purchased  from  Cell  Signaling  Technology  (Danv‐ ers, MA, USA).   Human signal transduction pathwayfinder RT2 profi‐ ler  PCR  Array  (PAHS‐041ZD)  and  human  growth  factor  RT2  profiler  PCR  array  (PAHS‐041ZA)  were  obtained  from SABiosciences (Qiagen, Hilden, Germany).    

ASC Culture  Human  ASCs  were  isolated  via  liposuction  of  subcuta‐ neous  fat,  as  described  previously  [1],  after  informed  consent  was  obtained  (Boondang  CHA  hospital,  BD2011‐152D). ASCs were cultured in  Minimum Essen‐ tial  Medium  Alpha  Medium  (α‐MEM,  Hyclone,  Thermo  Scientific, Logan, UT, USA) with 10% fetal bovine serum  (FBS; GIBCO, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 1% penicil‐ lin and streptomycin (GIBCO). ASCs were maintained at  37  °C  in  a  humidified  5%  CO2  incubator,  and  ASCs  at  passage 7‐9 were used in this study. Characterization of  ASCs  was  performed  using  flow  cytometry.  ASCs  were  positive  for  CD44,  CD73,  CD90,  CD105,  HLA‐I,  and  PODXL,  but  were  negative  for  hematopoietic  markers  such  as  CD34  and  CD45  [26,  30].  Multipotent  differen‐ tiation potential was examined as  described previously  [31],  and  ASCs  could  be  differentiated  into  adipocytes,  osteocytes, and chondrocytes.    

Cell proliferation assay 

ASCs were seeded on 48‐well plates at density of 7×103  cells per well. After 24 h, the medium was replaced with  0.2%  FBS  in  α‐MEM.  The  day  following  the  medium  change,  cells  were  treated  with  PDGF  isoforms  (10  ng/ml) or inhibitors (10 μM LY294002, 10 μM U0126, 1  μM  cp673451  and  1  μM  Mdivi‐1)  for  48  h.  Then,  the  medium  was  removed  and  cell  number  was  measured  using  CCK‐8  assay  kit  (Dojindo,  Rockville,  MD,  USA).  Cells were treated with 10% of CCK‐8 solution for 2 h at  37 °C in a humidified 5% CO2 incubator. The absorbance  was  measured  at  450  nm  by  a  microplate  reader  ma‐ chine (Tecan, Gordig, Austria).   In  addition,  the  kinetics  of  cell  proliferation  were  measured using the IncucyteTM (Essen Bioscience, Mich‐ igan,  USA)  live  cell  imaging  system.  ASCs  were  seeded  5 on  six‐well  plates  at  a  density  of  1×10   cells  per  well  with 0.2% FBS in α‐MEM. The following day, cells were  treated  with  PDGF  isoforms  (10  ng/ml)  and  ASCs  were  monitored with Incucyte. Cell confluence was measured  at 4‐h intervals for 72 h.    

Cell migration assay  For  the  migration  assay,  ASCs  were  seeded  on  the  up‐ per  site  of  trans‐well  membrane  plates  (Corning  Inc.,  Corning, NY, USA) at density of 2×104 cells per well. Af‐ ter  2  h,  PDGFs  (10  ng/ml)  or  inhibitors  (10  μM  LY294002,  10  μM  U0126,  1  μM  cp673451  and  1  μM  Mdivi‐1)  in  α‐MEM  medium  containing  0.2%  FBS  were  introduced  on  the  lower  site  of  trans‐well  membrane  plates for 16‐20 h. Then, migrated cells remaining in the  trans‐well membrane were fixed with ice‐cold methanol  www.StemCells.com 

Functional regulation of ASCs by PDGF‐D  for  20  min.  Fixed  cells  were  stained  using  10%  crystal‐ violet (Sigma‐Aldrich Co.) for 30 min at room tempera‐ ture  and  cells  in  the  membrane  were  counted  by  light  microscopy. The number of migrated cells in a 6.5‐mm  (diameter)  trans‐well  with  an  8.0‐μm  pore  polycarbo‐ nate membrane was also counted.   In  addition,  the  kinetics  of  cell  migration  were  measured using scratch migration assay [32]. ASCs were  seeded  on  6‐well  plates  at  a  density  of  2×105  cells  per  well. After 24 h, wounds  were made using a 200‐μl pi‐ pette tip. Cell migration was determined by microscopy  (Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan) 20 h after wounding.  For evaluation of ASC migration, ten randomly selected  points  along  each  wound  were  marked,  and  the  hori‐ zontal distance of migrating cells from the initial wound  was measured.    

Cellular and mitochondria‐specific ROS gen‐ eration assay  ROS generation was measured using DCF‐DA (Molecular  Probes,  Eugene,  OR,  USA)  as  previously  described  [33,  34].  Similarly,  mtROS  generation  was  measured  using  Mito‐Sox (Molecular Probes). Cells were seeded on 60‐ mm  dishes  in  0.2%  FBS  in  α‐MEM  medium.  Cells  were  co‐treated with PDGF‐D (10 ng/ml) and 5 μM Mito‐Sox  for  2  h  at  37  °C,  incubated  in  complete  darkness,  and  harvested  with  trypsin‐EDTA.  Fluorescence  was  meas‐ ured using a flow cytometer (Becon Dickinson, Franklin  Lakes,  NJ,  USA)  and  fluorescent  images  were  taken  by  confocal  microscope  (Carl  Zeiss,  Oberkochen,  Germa‐ ny).    

Mitochondrial fission staining  ASCs  were  seeded  on  circular  cover  glass  and  treated  with  PDGF‐D  (10  ng/ml)  with  or  without  inhibitors  (Mdivi‐1,  1  μM)  for  72  h.  For  mitochondrial  staining,  cells  were  incubated  with  500  nM  of  MitoTracker  Red  (Molecular Probes) in α‐MEM for 30 min. The morphol‐ ogy of mitochondria and fluorescence intensity of Mito‐ Tracker  Red  were  examined  by  confocal  microscopy  (Carl Zeiss).   For  nuclear  staining,  cells  were  fixed  with  4% para‐ formaldehyde for 15 min and permeabilized using 0.5%  PBS‐T  for  5  min.  Fixed  cells  were  treated  with  DAPI  (Sigma‐Aldrich Co.) for 10 min at room temperature.    

Western blotting  Cell extractions were isolated with SDS lysis buffer. Pro‐ teins  were  separated  by  10%  SDS‐PAGE  gel  and  trans‐ ferred  to  PVDF  membrane  (Millipore,  Bedford,  MA,  USA). The membrane was blocked with 5% non‐fat milk  for 1 h at room temperature and incubated with prima‐ ry  antibody  overnight  at  4  °C.  The  following  day,  the  membrane  was  washed  with  TBS‐T  (0.1%  Tween  20  in  Tris‐buffered  saline)  and  incubated  with  HRP‐ conjugated secondary antibody for 1 hr. The membrane  reacted to ECL solution (Millipore) and was exposed by  X‐ray film (AGFA, Gevaert, Mortsel, Belgium).   ©AlphaMed Press 2014 

Functional regulation of ASCs by PDGF‐D 

4   

Immunostaining of p66Shc‐ser34  For staining of p66Shc‐ser34, ASCs were seeded on cir‐ cular  cover  glass.  The  following  day,  cells  were  incu‐ bated  with  PDGF‐D  (10  ng/ml)  for  30  min.  Then,  cells  were  fixed  with  4%  paraformaldehyde  for  15  min  and  permeabilized  using  0.5%  PBS‐T  for  5  min.  After  wash‐ ing  with  0.1%  PBS‐T,  cells  were  blocked  using  blocking  solution (10% FBS and 0.5% gelatin in PBS) for 30 min.  Primary  antibody  (p66Shc‐ser34)  was  diluted  to  a  con‐ centration of 1:100 and secondary antibody (FITC, Invi‐ trogen) to 1:200. For nuclear staining, cells were treated  with DAPI. Fluorescence signals were detected by fluo‐ rescence confocal microscope.    

siRNA transfection  Twenty  nanomolar  mixtures  of  p66Shc  siRNA,  BCL2A1  siRNA  and  SERPINE1  siRNA  (Dharmacon,  Lafayette,  LA,  USA)  were  prepared  with  Lipofectamine  2000  (Invitro‐ gen)  before  cell  trypsinization  step.  Then,  cells  were  seeded  on  6‐well  plates  or  60‐mm  dishes,  and  siRNA  mixtures  were  transfected  into  the  cells  for  48  hrs.  Si‐ lencing was evaluated by quantitative PCR (QPCR), and  significantly  down‐regulated  p66Shc  mRNA  level  (data  not shown).    

RNA isolation and QPCR 

Total RNA was extracted using RNA prep kit (RNeasyTM,  Qiagen)  and  isolated  mRNA  was  reverse‐transcribed  with  a  cDNA  synthesis  kit  (A3500,  Promega,  Madison,  WI,  USA).  cDNA  was  synthesized  from  500  ng  of  total  RNA  by  1000  U  reverse  transcriptase  and  50  ng/μl  oli‐ go(dT)  primers.  Thermal  cycling  took  place  over  35  cycles of 95 °C for 5 min, then 95 °C for 30 sec, 56 °C for  20 sec, 72 °C for 40 sec, and terminated at 72 °C for 5  min.  QPCR  reactions  were  performed  on  a  Step  One  Plus  Real‐Time  PCR  system  (Applied  Biosystems,  Invi‐ trogen) using  SYBR Green PCR Master  Mix (Takara Bio,  Inc., Otsu, Japan). The level of GAPDH was also quanti‐ fied for sample standardization. Analysis of fold change  was calculated by ΔCt value.    

PCR array  For analysis with the human transduction pathwayfind‐ er  RT2  profiler  PCR  array  (signal  transduction  pathway:  PAHS‐041ZD;  growth  factor  pathway:  PAHS‐041ZA),  cells  were  seeded  on  60‐mm  dishes  at  density  of  2.5×105 cells in 0.2% FBS in α‐MEM medium. Total RNA  was harvested with an RNA prep kit (Qiagen) and cDNA  was  synthesized  using  reverse  transcriptase.  Gene  ex‐ pression  was  detected  by  a  PCR  array  kit  according  to  the manufacturer’s instructions (Qiagen).    

Animal experiment  Mice were maintained and anesthetized according to a  protocol approved by the United States Pharmacopoeia  (USP)  and  the  Institutional  Animal  Care  and  Use  Com‐ mittee  of  CHA  University  (IACUC120002).  The  dorsal  www.StemCells.com 

area  of  7‐week‐old  C3H/HeN  mice  in  the  telogen  stage  of the hair cycle was shaved with a clipper and electric  shaver,  with  special  care  taken  to  avoid  damaging  the  bare  skin.  ASCs  (1×104)  or  PDGF‐D‐treated  cells  (24  h  pretreatment  with  10  ng/ml  PDGF‐D  without  FBS,  1×104) were injected into the dorsal skin of shaved mice  [5].  Any  darkening  of  the  skin  (indicative  of  hair  cycle  induction)  was  carefully  monitored  by  photography.  After 15 days, dorsal hair was shaved and its weight was  measured.    

Statistical analysis  Generally, in vitro data were representative of indepen‐ dent experiments performed in triplicate. The statistical  significance of the differences among groups was tested  using one‐way analysis of variance (ANOVA) or the Stu‐ dent’s t‐test. Error bars are indicative of standard devia‐ tion. P‐values  of 

Functional regulation of adipose-derived stem cells by PDGF-D.

Platelet-derived growth factor-D (PDGF-D) was recently identified, and acts as potent mitogen for mesenchymal cells. PDGF-D also induces cellular tran...
2MB Sizes 3 Downloads 4 Views