Institut fur Obstbau, Fachbereich 16, Angewandte Biologic, Justus Liebig-Universitat Giepen
FLAVONOIDE IN PRUNUS-CALLUS
Flavonoids in callus tissue of Prunus Von W. FEUCHT
The callus tissue deriving from cambium of Prunus trees preferently accumulates flavans (catechins and leucoanthocyanidins). Flavonol glycosides are found in substantially less amounts, even in those species having comparatively large quantities in the inxact shoot tisstres. These differences between the endogenous glycosides and the aglycones fit well with other experiments in which synthetic catechin and rutin were applied to the callus. Catechin becomes accumulated, rutin in turn is metabolized.
Die Callusgwebe der Prunusgeholze bilden vor allem Flavane. Die Flavonolglykoside treten stark zuriick, auch bei solchen Arten, die in2 intakten Spro/3gewebe vergleicbsweise vie1 bilden. Diese Unterschiede in der endogenen Poolgrofie zwischen Glykosiden und Aglyka werden durch die Versuche mit exogen zugefiihrtem Catechin und Rutin bestatigt. Catechin . kann im Callus gespeichert werden, das Quercetin-Rutinosid dagegen wird abgebaut bzw. oxidiert.
Einleitung Geholze bilden in taxonomischer Hinsicht mehr Flavonel; vor allem polymere Tannine alk krautige Pflanzen (BATE-SMITH1968). Auch bei der Teepflanze (Camellia sinensis) sind Catechine und Falvonole vorherrschend (FORREST und BEND A L L 1969). In Gewebekulturen von Prunusgeholzen, die irn Rahmen wachstumsphysiologischer Untersuchngen durchgefiihrt wurden, treten Flavane und andere Flavonoide auf. Dariiber sol1 im Folgenden berichtet werden. Flavane: Catechine und Flavan-3,4-diole. Flavolane: Oligomere Flavane und Flavan-3,41972). diole (RIBEREAU-GAYON
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Abstract
Flavonoide in Prunus-Callus
113
Material und Methoden
Resultate und Diskussion
.
In der Tab. I sind verschiedene Flavonoide wiedergegeben, die als vorherrschende Substanzen aus dem Callusgewebe einiger Prunus-Arten identifiziert werden konnten. Als monomere Flavane sind Catechin und Epicatechin vertreten. Auch Flavolane treten auf. Sie wurden gemal3 ihrer Mobilitat im Laufmittel I (ButanoV Essigsaure/Wasser) in eine mobile und eine immobile Gruppe getrennt. Die mobilen Substanzen sind weniger polymerisiert als die anderen (GOLDSTEIN und SWAIN1963). Beide oligomeren Flavangruppen enthalten in der Regel 3,4-Diole, da sie mit ButanolIHCl (SWAINund HILLIS1959) Cyanidin bilden. Im kurzwelli-
Tabelle I Vorkommen von Flavonoiden im Callus von Prunusarten Hormone im Nahrmedium: 5 mg/l NAA und 0,05 mgtl BA Cat.
Epi-Cat. mob.
P , avium
P. cerasus P . cerasus S P . fruticosa P . pseudocerasus P . incisa P . wadai X X X = vergleichsweise X = vergleichsweise
P. cerasus S = Selbstung
XX XX XX XX XX XXX XX
grogere Mengen kleinere Mengen
Flavolane immob.
XX X X X
X X
-
X XX X X
x
-
x
XX X
XXX
-
-
-
Flavonolglykoside X X
X XX X
-
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Die Sprol3explantate entstamrnen dem Kambium- und Phloemgewebe reifer einjahriger Triebe. Das Kulturmedium wurde nach MURASHICEund SKOOG(1962), jedoch ohne Agar, zubereitet. Nach lmonatiger Kultur im Dunkeln wurden die Calli mit Methanol extrahiert. Die Vorreinigung der Extrakte erfolgte uber eine Polyamidsaule. Danach lieBen sich die einzelnen Fraktionen mittels Diinnschicht-Zelluloseplatten zweidimensional auftrennen. Die Identifizierung der Flavonoide geschah durch: Co-Chromatographie von Vergleichssubstanzen, verschiedene Farbreaktionen, Spektralphotornetrie und optische Rotationsdispersion. Als sehr selektives Farbreagenz fiir Flavane envies sich nach unseren Erfahrungen das von RITZERTet al. (1972) fiir Catechin angewandte Dimethylaminozimtaldehyd. Sowohl Flavolane als auch Flavane reagieren in intensiven blaulich-grunen Farbtonen. Die iibrigen Phenole aus Prunusgewebe bleiben farblos. Die quantitative Bestimmung erfolgte bei Flavonen und Flavolanen kolorimetisch (FEUCHT und KHAN 1973) und bei Flavonolglykosiden nach WEISSENBOCK et al. (1971).
114
Planta medica Suppl. 1975
Feucht
Abb. 1 Optische Rotationsdispersionskurve von endogenem Catechin aus Prunus-Callus
Die beiden Catechine kommen in allen untersuchten Prunusarten vor. Demgegeniiber treten die Flavolane nicht allgemein auf - jedenfalls nicht bei der iiblichen Beladungskapazitat der Diinnschichtplatten. Quantitative Bestimmungen beziehen sich vor allem auf die monomeren Catechine. Es konnten zwischen 20-40 mg/100 g Frischgewicht ermittelt werden (Tab. 11). T a b e l l e I1 Gehalt an Catechinen (mg/100g Fr. Subst.) im Callus von Prunus cerasus S Mittelwerte von 3 Wiederholungen rnit jeweils 15 Reagenzglasern. Hormone: 5 mg/l NAA- 0,05 rngll BA Catechinzugabe: 20 mg/l Gewebe
Callus
Behandlung Catechine Flavolane FlavonolGly koside
.
Rinde
Kontrolle
Dl-Catechin
Epicatechin
-
21 18 094
35 39 0,3
37 48 0,s
510 540 270
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gen Spektralbereich bilden die genannten monomeren und oligomeren Stoffe eine Absorptionskurve mit Maxima bei 280 und 240 nm. Sie reagieren mit Vanillin/ Schwefelsaure und ergeben mit Dimethylaminozimtaldehyd intensiv blaulichgriine Farbtone. Eine weitere Moglichkeit der Identifizierung ist durch das stereochemische Verhalten der Flavane gegeben. Sie besitzen am G- und C3-Atom und soweit es sich um Flavan-3,4-diole handelt, auch am C4-Atom asymmetrische Strukturen (RIBEREAU-GAYON, 1972). Diese Substanzen sind optisch aktiv, d.h. sie vermogen die Ebene des polarisierten Lichtes zu drehen. Das Drehvermogen eines Stoffes bei der optischen Rotationsdispersion wird als Cotton-Effekt bezeichnet. Er wurde bei den beiden Catechinen des Callusgewebes ermittelt. Sie zeigen in Methanol einen negativen Cotton-Effekt mit einem Schnittpunkt der anomalen Kurve bei 280 nm. Das entspricht dem Verhalten von Test-Catechin (Abb. 1).
115
Die oligomeren Flavolane, insbesondere die immobilen, lassen sich nur z. T. von den Zelluloseplatten eluieren. Die kolorimetrischen Bestimmungen erbrachten (nicht quantitative) Werte, die etwa in der oben genannten Groi3en.ordnung fiir die Catechine liegen. Gegenuber den Flavanen treten andere Flavanoide und auch phenolische Sauren stark zuruck. Daher bereitete die sichere I d e n t i f i ~ i e r u ngroBe ~ Schwierigkeiten. Rutin la&t sich vor allem aus P. pseudocerrrstrs, wo es starker auftritt, noch spektralphotometrisch nachweisen. Zwei bis drei weitere SubstanZen mit ahnlichen Farbreaktionen sind gleichfalls, auch bei Berucksichtigung der Rf-Werte, als Flavonolglykoside anzusprechen. Sie werden bei optimaler Beladung der Diinnschichtplatten bei den meisten Prunusarten als Flecken gerade noch sichtbar. Im Callus ist die Konzentration der Catechine und Flavolane etwa 25 ma1 geringer als in der intakten Rinde, diejenige der Flavonolglykoside sogar rund '600 ma1 niedriger (Tab. 11). Vermutlich fehlen einige Flavonoide des intakten Gewebes bei den im Dunkeln kultivierten Calli vollig. Die mangelhafte Synthese in vitro der fur die Prunusrinde typischen Quercetin- und Kampferolderivate wird nach den bisherigen Erfahrungen auch durch Licht (Sylvania Gro Lux) nicht verbessert. Auch FORREST (1969) findet beim Callus der Teepflanze trotz mannigfacher Veranderungen der Kulturbedingungen ein relativ enges Spektrum vorwiegend monomerer Catechine. Wird bei Prunus Catechin der Nahrlosung in einer Konzentration von 20 mgll zugegeben, so kann irn Callus eine Anhaufung von Catechin und oligomeren Flavolanen beobachtet werden (Tab. 11). Die Konsenationsprodukte enthalten Flavandiole, d a unter der Einwirkung von Hitze und Saure eine Cyanidinbildung erfolgt. Exogen zugefiihrtes Rutin (20 mg/l) wird im Callusgewebe abgebaut. Die Extraktion liefert grogere Mengen einer Substanz, die mit dem Naturstoffreagenz gelb erscheint und eine eingipflige Spektralkurve mit einem Maximum bei 270 nm erbringt. Diese Kurve entspricht vollkommen der von SOMMER(1959) nach Oxydation des Rutins ermittelten Veranderung in der Absorption (Abb. 2). Das fiir Rutin typische Maximum im langwelligen UV-Bereich bei 360 nm ist vijllig verschwunden. In den Kontrollen tritt diese Substanz nie auf. Demnach diirfte im Callusgewebe der Prunoideen die Phenoloxydase wirksanl sein. Hohere Mengen an Catechin (50 mg/l) fuhren in der T a t haufig zu starker Oxydation.
war der NHhrlijsung zugkgeben worden. 210 50
60
70
80
9 0 300
10
20
30 nm
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Flavonoide in Prunus-Callus
116
Feucht
Planta medica Suppl. 1975
Literatur
Amchrift: Prof. Dr. W . Feucht, lnstitut fiir Obstbau der lustus Liebig-Universitiit 63 Giepen, Ludwigstr. 37 11
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BATHE-SMITH, E. C.: J. Linn. Soc. (Bot.) 60,325 (1968) FEUCHT,W. und KAHN,M. Z.: Z. Pfl. Physiol. 69,242 (1973) FORREST,G. I.: Biochem. J. 113,765 (1969) FORREST, G. I. und BENDALL, D. S.: Biochem. J. 113,741 (1969) GOLDSTEIN, J. L. und SWAIN,T.: Phytochemistry, 2,371 (1963) MURASHICE, T. und SKOOG, F.: Physiol. Plantarum, 15,473 (1962) P.: Plant phenolics, Oliver and Boyd, Edinburgh, 1972 RIBEREAU-GAYON, D. D., SELL,H. M. und B u c o v ~ c J.: , J. Amer. Soc. Hort. Sci., 97, 48 RITZERT,R. W., HEMPHILL, (1972) T. und HILLIS,W. E.: J. Sci. Food Agric. 10,63 (1959) SWAIN, SOMMER, E.: Diss. F. U. Berlin (1959) WEISSENBOCK, G., TERINI,G. und REZNIK,H.: 2. Pfl. Physiol. 64, 274 (1971)
FLAVONOIDE IN PRUNUS-CALLUS
Flavonoids in callus tissue of Prunus Von W. FEUCHT
The callus tissue deriving from cambium of Prunus trees preferently accumulates flavans (catechins and leucoanthocyanidins). Flavonol glycosides are found in substantially less amounts, even in those species having comparatively large quantities in the inxact shoot tisstres. These differences between the endogenous glycosides and the aglycones fit well with other experiments in which synthetic catechin and rutin were applied to the callus. Catechin becomes accumulated, rutin in turn is metabolized.
Die Callusgwebe der Prunusgeholze bilden vor allem Flavane. Die Flavonolglykoside treten stark zuriick, auch bei solchen Arten, die in2 intakten Spro/3gewebe vergleicbsweise vie1 bilden. Diese Unterschiede in der endogenen Poolgrofie zwischen Glykosiden und Aglyka werden durch die Versuche mit exogen zugefiihrtem Catechin und Rutin bestatigt. Catechin . kann im Callus gespeichert werden, das Quercetin-Rutinosid dagegen wird abgebaut bzw. oxidiert.
Einleitung Geholze bilden in taxonomischer Hinsicht mehr Flavonel; vor allem polymere Tannine alk krautige Pflanzen (BATE-SMITH1968). Auch bei der Teepflanze (Camellia sinensis) sind Catechine und Falvonole vorherrschend (FORREST und BEND A L L 1969). In Gewebekulturen von Prunusgeholzen, die irn Rahmen wachstumsphysiologischer Untersuchngen durchgefiihrt wurden, treten Flavane und andere Flavonoide auf. Dariiber sol1 im Folgenden berichtet werden. Flavane: Catechine und Flavan-3,4-diole. Flavolane: Oligomere Flavane und Flavan-3,41972). diole (RIBEREAU-GAYON
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Abstract
Flavonoide in Prunus-Callus
113
Material und Methoden
Resultate und Diskussion
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In der Tab. I sind verschiedene Flavonoide wiedergegeben, die als vorherrschende Substanzen aus dem Callusgewebe einiger Prunus-Arten identifiziert werden konnten. Als monomere Flavane sind Catechin und Epicatechin vertreten. Auch Flavolane treten auf. Sie wurden gemal3 ihrer Mobilitat im Laufmittel I (ButanoV Essigsaure/Wasser) in eine mobile und eine immobile Gruppe getrennt. Die mobilen Substanzen sind weniger polymerisiert als die anderen (GOLDSTEIN und SWAIN1963). Beide oligomeren Flavangruppen enthalten in der Regel 3,4-Diole, da sie mit ButanolIHCl (SWAINund HILLIS1959) Cyanidin bilden. Im kurzwelli-
Tabelle I Vorkommen von Flavonoiden im Callus von Prunusarten Hormone im Nahrmedium: 5 mg/l NAA und 0,05 mgtl BA Cat.
Epi-Cat. mob.
P , avium
P. cerasus P . cerasus S P . fruticosa P . pseudocerasus P . incisa P . wadai X X X = vergleichsweise X = vergleichsweise
P. cerasus S = Selbstung
XX XX XX XX XX XXX XX
grogere Mengen kleinere Mengen
Flavolane immob.
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Flavonolglykoside X X
X XX X
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Die Sprol3explantate entstamrnen dem Kambium- und Phloemgewebe reifer einjahriger Triebe. Das Kulturmedium wurde nach MURASHICEund SKOOG(1962), jedoch ohne Agar, zubereitet. Nach lmonatiger Kultur im Dunkeln wurden die Calli mit Methanol extrahiert. Die Vorreinigung der Extrakte erfolgte uber eine Polyamidsaule. Danach lieBen sich die einzelnen Fraktionen mittels Diinnschicht-Zelluloseplatten zweidimensional auftrennen. Die Identifizierung der Flavonoide geschah durch: Co-Chromatographie von Vergleichssubstanzen, verschiedene Farbreaktionen, Spektralphotornetrie und optische Rotationsdispersion. Als sehr selektives Farbreagenz fiir Flavane envies sich nach unseren Erfahrungen das von RITZERTet al. (1972) fiir Catechin angewandte Dimethylaminozimtaldehyd. Sowohl Flavolane als auch Flavane reagieren in intensiven blaulich-grunen Farbtonen. Die iibrigen Phenole aus Prunusgewebe bleiben farblos. Die quantitative Bestimmung erfolgte bei Flavonen und Flavolanen kolorimetisch (FEUCHT und KHAN 1973) und bei Flavonolglykosiden nach WEISSENBOCK et al. (1971).
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Planta medica Suppl. 1975
Feucht
Abb. 1 Optische Rotationsdispersionskurve von endogenem Catechin aus Prunus-Callus
Die beiden Catechine kommen in allen untersuchten Prunusarten vor. Demgegeniiber treten die Flavolane nicht allgemein auf - jedenfalls nicht bei der iiblichen Beladungskapazitat der Diinnschichtplatten. Quantitative Bestimmungen beziehen sich vor allem auf die monomeren Catechine. Es konnten zwischen 20-40 mg/100 g Frischgewicht ermittelt werden (Tab. 11). T a b e l l e I1 Gehalt an Catechinen (mg/100g Fr. Subst.) im Callus von Prunus cerasus S Mittelwerte von 3 Wiederholungen rnit jeweils 15 Reagenzglasern. Hormone: 5 mg/l NAA- 0,05 rngll BA Catechinzugabe: 20 mg/l Gewebe
Callus
Behandlung Catechine Flavolane FlavonolGly koside
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Rinde
Kontrolle
Dl-Catechin
Epicatechin
-
21 18 094
35 39 0,3
37 48 0,s
510 540 270
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gen Spektralbereich bilden die genannten monomeren und oligomeren Stoffe eine Absorptionskurve mit Maxima bei 280 und 240 nm. Sie reagieren mit Vanillin/ Schwefelsaure und ergeben mit Dimethylaminozimtaldehyd intensiv blaulichgriine Farbtone. Eine weitere Moglichkeit der Identifizierung ist durch das stereochemische Verhalten der Flavane gegeben. Sie besitzen am G- und C3-Atom und soweit es sich um Flavan-3,4-diole handelt, auch am C4-Atom asymmetrische Strukturen (RIBEREAU-GAYON, 1972). Diese Substanzen sind optisch aktiv, d.h. sie vermogen die Ebene des polarisierten Lichtes zu drehen. Das Drehvermogen eines Stoffes bei der optischen Rotationsdispersion wird als Cotton-Effekt bezeichnet. Er wurde bei den beiden Catechinen des Callusgewebes ermittelt. Sie zeigen in Methanol einen negativen Cotton-Effekt mit einem Schnittpunkt der anomalen Kurve bei 280 nm. Das entspricht dem Verhalten von Test-Catechin (Abb. 1).
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Die oligomeren Flavolane, insbesondere die immobilen, lassen sich nur z. T. von den Zelluloseplatten eluieren. Die kolorimetrischen Bestimmungen erbrachten (nicht quantitative) Werte, die etwa in der oben genannten Groi3en.ordnung fiir die Catechine liegen. Gegenuber den Flavanen treten andere Flavanoide und auch phenolische Sauren stark zuruck. Daher bereitete die sichere I d e n t i f i ~ i e r u ngroBe ~ Schwierigkeiten. Rutin la&t sich vor allem aus P. pseudocerrrstrs, wo es starker auftritt, noch spektralphotometrisch nachweisen. Zwei bis drei weitere SubstanZen mit ahnlichen Farbreaktionen sind gleichfalls, auch bei Berucksichtigung der Rf-Werte, als Flavonolglykoside anzusprechen. Sie werden bei optimaler Beladung der Diinnschichtplatten bei den meisten Prunusarten als Flecken gerade noch sichtbar. Im Callus ist die Konzentration der Catechine und Flavolane etwa 25 ma1 geringer als in der intakten Rinde, diejenige der Flavonolglykoside sogar rund '600 ma1 niedriger (Tab. 11). Vermutlich fehlen einige Flavonoide des intakten Gewebes bei den im Dunkeln kultivierten Calli vollig. Die mangelhafte Synthese in vitro der fur die Prunusrinde typischen Quercetin- und Kampferolderivate wird nach den bisherigen Erfahrungen auch durch Licht (Sylvania Gro Lux) nicht verbessert. Auch FORREST (1969) findet beim Callus der Teepflanze trotz mannigfacher Veranderungen der Kulturbedingungen ein relativ enges Spektrum vorwiegend monomerer Catechine. Wird bei Prunus Catechin der Nahrlosung in einer Konzentration von 20 mgll zugegeben, so kann irn Callus eine Anhaufung von Catechin und oligomeren Flavolanen beobachtet werden (Tab. 11). Die Konsenationsprodukte enthalten Flavandiole, d a unter der Einwirkung von Hitze und Saure eine Cyanidinbildung erfolgt. Exogen zugefiihrtes Rutin (20 mg/l) wird im Callusgewebe abgebaut. Die Extraktion liefert grogere Mengen einer Substanz, die mit dem Naturstoffreagenz gelb erscheint und eine eingipflige Spektralkurve mit einem Maximum bei 270 nm erbringt. Diese Kurve entspricht vollkommen der von SOMMER(1959) nach Oxydation des Rutins ermittelten Veranderung in der Absorption (Abb. 2). Das fiir Rutin typische Maximum im langwelligen UV-Bereich bei 360 nm ist vijllig verschwunden. In den Kontrollen tritt diese Substanz nie auf. Demnach diirfte im Callusgewebe der Prunoideen die Phenoloxydase wirksanl sein. Hohere Mengen an Catechin (50 mg/l) fuhren in der T a t haufig zu starker Oxydation.
war der NHhrlijsung zugkgeben worden. 210 50
60
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Flavonoide in Prunus-Callus
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Feucht
Planta medica Suppl. 1975
Literatur
Amchrift: Prof. Dr. W . Feucht, lnstitut fiir Obstbau der lustus Liebig-Universitiit 63 Giepen, Ludwigstr. 37 11
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BATHE-SMITH, E. C.: J. Linn. Soc. (Bot.) 60,325 (1968) FEUCHT,W. und KAHN,M. Z.: Z. Pfl. Physiol. 69,242 (1973) FORREST,G. I.: Biochem. J. 113,765 (1969) FORREST, G. I. und BENDALL, D. S.: Biochem. J. 113,741 (1969) GOLDSTEIN, J. L. und SWAIN,T.: Phytochemistry, 2,371 (1963) MURASHICE, T. und SKOOG, F.: Physiol. Plantarum, 15,473 (1962) P.: Plant phenolics, Oliver and Boyd, Edinburgh, 1972 RIBEREAU-GAYON, D. D., SELL,H. M. und B u c o v ~ c J.: , J. Amer. Soc. Hort. Sci., 97, 48 RITZERT,R. W., HEMPHILL, (1972) T. und HILLIS,W. E.: J. Sci. Food Agric. 10,63 (1959) SWAIN, SOMMER, E.: Diss. F. U. Berlin (1959) WEISSENBOCK, G., TERINI,G. und REZNIK,H.: 2. Pfl. Physiol. 64, 274 (1971)
